Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65730

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

W tym artykule

Podsumowanie

Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.

Streszczenie

Fizjologiczne funkcje komórek eukariotycznych opierają się głównie na energii dostarczanej głównie przez mitochondria. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z chorobami metabolicznymi i starzeniem się. Fosforylacja oksydacyjna odgrywa decydującą rolę, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy energetycznej. PBMC zostały zidentyfikowane jako minimalnie inwazyjna próbka do pomiaru funkcji mitochondriów i wykazano, że odzwierciedlają stany chorobowe. Jednak pomiar funkcji bioenergetycznych mitochondriów może być ograniczony przez kilka czynników w próbkach ludzkich. Ograniczeniami są ilość pobranych próbek, czas pobierania próbek, który często jest rozłożony na kilka dni, oraz lokalizacje. Kriokonserwacja pobranych próbek może zapewnić spójne pobieranie i pomiar próbek. Należy dołożyć starań, aby mierzone parametry były porównywalne między kriokonserwowanymi a świeżo przygotowanymi komórkami. Tutaj opisujemy metody izolowania i kriokonserwacji PBMC z próbek ludzkiej krwi w celu analizy bioenergetycznej funkcji mitochondriów w tych komórkach. Kriokonserwacja PBMC zgodnie z opisanym tutaj protokołem wykazuje jedynie niewielkie różnice w liczbie komórek i żywotności, poziomie trifosforanu adenozyny i zmierzonej aktywności łańcucha oddechowego w porównaniu ze świeżo pobranymi komórkami. Do opisanych preparatów potrzeba tylko 8-24 ml krwi ludzkiej, dzięki czemu możliwe jest wieloośrodkowe pobieranie próbek podczas badań klinicznych i określenie ich bioenergetyki na miejscu.

Wprowadzenie

Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs) są używane do różnych zastosowań w wielu dziedzinach nauki, w tym do badania zagadnień immunologicznych i bioenergetycznych, takich jak te związane z procesami starzenia lub chorobami zwyrodnieniowymi1,2. PBMC mają niejednorodny skład i składają się z limfocytów (limfocytów B, limfocytów T i komórek NK), monocytów i komórek dendrytycznych. Komórki czasami wykazują duże indywidualne różnice i różnice w obrębie badanego, dlatego wymagane są ustandaryzowane procedury postępowania z tymi komórkami. Ważne parametry, takie jak żywotność i czystość izolacji, są podstawowymi wymaganiami dotyczącymi obchodzenia się z nią i dodatkowo wpływają na nie czynniki środowiskowe, takie jak czas pobrania, poziom melatoniny, to, czy badany jest na czczo i inne3,4.

Na podstawie badań nad bioenergetyką PBMC, opisujemy tutaj metodę izolacji, krioprezerwacji i hodowli PBMC, która jest odpowiednia również dla innych metod. Podczas gdy biopsja mięśni jest uważana za złoty standard metabolizmu energii mitochondrialnej5, badanie komórek krwi jest szybką, minimalnie inwazyjną procedurą. Ponadto coraz więcej badań sugeruje, że zmiany w funkcji mitochondriów w procesie starzenia się i choroby Alzheimera (AD) zachodzą nie tylko w mózgu, ale także na peryferiach6,7,8,9,10. Metoda ta pozwala również na badanie innych schorzeń i chorób, w tym cukrzycy i otyłości11,12,13. Można analizować wzorce ekspresji genów u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym lub funkcję immunologiczną i ogólnie na nią wpływy14,15,16.

PBMCs zazwyczaj polegają na fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w celu wytworzenia trifosforanu adenozyny (ATP)17,18. W związku z tym PBMC obejmują szeroki zakres zastosowań jako substytuty. W poprzednich raportach metabolizm energetyczny PBMC był wykorzystywany do rozwiązywania dysfunkcji narządów, takich jak wczesna niewydolność serca19, wstrząs septyczny20 lub różnice związane z płcią4 w funkcji mitochondriów. Uogólniona metoda krioprezerwacji, izolacji i hodowli PBMC miałaby zalety w zakresie porównywalności wyników uzyskanych w różnych instytutach. Istnieje wiele różnic w protokołach dla każdego kroku21,22, celem tej metody jest zapewnienie wytycznych dla pomiarów bioenergetycznych w PBMC.

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru parametrów bioenergetycznych w PBMCs. Wyjaśniamy metody izolacji, kriokonserwacji i pomiaru bioenergetyki PBMC z ludzkiej krwi. Metoda ta może być stosowana do określania parametrów bioenergetycznych u pacjentów i oceny ich w kontekście klinicznym. Aby zastosować te pomiary, naukowcy potrzebują dostępu do populacji pacjentów, od której można pobrać świeże próbki krwi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły opisane w niniejszym manuskrypcie dotyczące pobierania krwi, izolacji i analizy zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Przeglądową (Institutional Review Board) na Uniwersytecie w Gießen w Niemczech. Uzyskano zgodę pacjentów na włączenie ich próbek do badania. Wszystkie etapy izolacji i hodowli komórkowej są przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Wenopunkcja

  1. Przygotować cały sprzęt niezbędny do pobrania krwi, w tym spray do dezynfekcji, jałowy tampon, kaniulę do pobierania krwi z rurką 80 mm i multiadapterem, stazę/mankiet ciśnieniowy oraz probówki Monovette 9 mL z heparyną litową.
    UWAGA: Jako antykoagulant skuteczny jest również EDTA.
  2. Pobrać krew z najbardziej odpowiedniej żyły ramiennej, zazwyczaj z vena mediana cubiti lub vena cephalica.
  3. Założyć stazę/mankiet ciśnieniowy z lekkim naciskiem, około 80 mm/Hg.
  4. Zdezynfekować rękawiczki oraz miejsce wkłucia za pomocą sprayu odkażającego zawierającego alkohol. Pozostawić zdezynfekowane miejsce wkłucia do wyschnięcia.
  5. Żyły uwidaczniają się pod wpływem nacisku mankietu. Wprowadzić igłę (średnica zewnętrzna kaniuli 21G / 0.8 mm, długość 19 mm) pod kątem 15°-20° do żyły, starając się unikać urazów i minimalizując sonnowanie.
  6. Pobrać krew przy użyciu odpowiedniego systemu do 4 probówek zawierających 9 mL krwi (pobranie więcej niż 7-8 probówek jest problematyczne dla jednego eksperymentatora w zakresie prawidłowej izolacji).
  7. Po pobraniu krwi umieścić probówki w ciemności na 5 min, aby zapewnić jednorodną antykoagulację.

2. Izolacja PBMC

  1. Przygotuj wszystkie niezbędne roztwory zgodnie z poniższym opisem.
  2. Doprowadzić do temperatury pokojowej (20-25 °C).
  3. Przygotować płodową surowicę bydlęcą (FBS) w temperaturze pokojowej oraz zachować jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 50 ml z FBS na lodzie. Dla każdej próbki krwi wymagane jest 2 ml FBS.
  4. Przechowywać pojemnik do mrożenia w temperaturze 4 °C oraz schłodzić wcześniej probówki kriogeniczne w temperaturze 4 °C.
  5. Podgrzać pożywkę do hodowli komórkowej do 37 °Cpożywka składa się z RPMI 1640 z dodatkiem 50 ml FBS oraz penicyliny 50 J/ml i streptomycyny 50 J/ml. Roztwór ten można przechowywać w 3 °C do 2 miesięcy.
  6. Do sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 mL dodać 8 mL DPBS. Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodać 15 mL medium do izolacji limfocytów (medium jest światłoczułe, należy je dodać przed rozpoczęciem izolacji).
  7. Należy dodać 8 ml krwi do 8 ml DPBS, a następnie ostrożnie wymieszać za pomocą plastikowej pipety Pasteura o objętości 3 ml.
  8. Ostrożnie nanieś warstwę mieszaniny krwi i DPBS na wierzch medium do izolacji limfocytów, używając do tego plastikowej pipety Pasteura o objętości 3 ml. Aby nanieść pierwszą warstwę na medium, przechyl probówkę. 20°-30°co spowoduje mniejszą penetrację mieszaniny krwi z PBS do warstwy medium.
  9. Ostrożnie nanieś mieszaninę krwi z PBS na medium do izolacji limfocytów, prowadząc strugę po ściance probówki. Zachowaj stałą prędkość, aby zapewnić jednostajny przepływ krwi.
  10. W następnym kroku powoli ustaw probówkę w pozycji pionowej; pozostałą krew należy ostrożnie nanieść po ściance probówki na warstwę krwi.
  11. Wiruj przez 10 min przy 1000 x g g w temperaturze pokojowej w wirówce z rotorem z koszykami w wariancie wahadłowym, z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu mieszanina krwi i PBMC rozdziela się na cztery warstwy. Górna warstwa składa się z osocza i płytek krwi, druga warstwa to warstwa PBMC, po której następuje warstwa medium do izolacji limfocytów, a w dolnej warstwie znajdują się erytrocyty i granulocyty. Poszczególne warstwy przedstawiono w Rysunek 1.
  12. Usuń 2/3rd warstwy osocza za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  13. Za pomocą pipety o objętości 1 ml pobierz PBMC z warstwy medium do izolacji limfocytów, uważając, aby do próbki nie dostało się medium.
  14. Umieść końcówkę 1 mm nad warstwą PBMC. Warstwy PBMC nie należy przebić, w przeciwnym razie medium przepłynie nad komórkami. Ssanie pipety przyciąga PBMC do tego punktu, co umożliwia ich wielokrotne pobranie z tego miejsca.
    UWAGA: Aby zmaksymalizować liczbę zebranych PBMC, pod koniec procedury należy sprawdzić, czy na powierzchni pozostały jeszcze komórki, i spróbować je również zebrać. W celu ustabilizowania probówki można postawić ją na podłożu.
  15. Przenieś PBMC krok po kroku do nowej probówki o pojemności 50 ml, aż do całkowitego zebrania warstwy. Dolej DPBS do poziomu 25 ml, aby wypłukać medium do izolacji limfocytów oraz pozostałe zanieczyszczenia.
  16. Wirować przez 10 min przy 100 x g g w temperaturze pokojowej z włączonymi hamulcami. Usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej lub podobnego urządzenia, uważając, aby nie uszkodzić granulatu komórkowego.
  17. Resuspender osad w 1 ml DPBS i uzupełnić DPBS do poziomu 25 ml. Powtórzyć proces płukania jeszcze raz, a następnie resuspender w medium odpowiednim dla kolejnych etapów.

Schemat wirowania w gradiencie gęstości z warstwami: osocze, PBMC, Histopaque, erytrocyty.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie wirowania w gradiencie gęstości w celu zilustrowania poszczególnych warstw. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Kriokonserwacja

  1. Schłodzić pojemnik do zamrażania do 4 °C, a FBS schłodzić na lodzie.
  2. Resuspendować osad PBMC w 1 mL FBS za pomocą pipety 1 mL; FBS powinien być w temperaturze pokojowej.
  3. Wymieszać DMSO z uprzednio schłodzonym FBS na lodzie w stosunku 1:5, tak aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 20%, a następnie umieścić mieszaninę FBS:DMSO z powrotem na lodzie. Roztwór należy zawsze przygotować na świeżo.
  4. Przenieść zawiesinę komórek PBMC w FBS do odpowiednio oznakowanych krioprobek o pojemności 2 mL. Należy użyć jednej krioprobek na każdą probówkę z materiałem. Dostosować liczbę komórek do zakresu od 1 x 107 do 5 x 107 na mL. Do oznaczenia liczby komórek i ich żywotności należy użyć automatycznego licznika komórek.
  5. Do probówki dodawać kroplami za pomocą pipety 1 mL 1 mL mieszaniny FBS:DMSO, w tempie około 1-2 kropli na s. Dodawanie kroplowe zapewnia ciągłe i spójne mieszanie.
  6. Umieścić probówki w schłodzonym pojemniku do zamrażania. Pojemnik do zamrażania umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 24 h. Pojemnik do zamrażania zapewnia kontrolowane chłodzenie w tempie -1 °C na min.
  7. Wyjąć probówki z zamrażarki -80 °C. Po wyjęciu z zamrażarki przechowywać probówki w fazie gazowej ciekłego azotu. Należy udokumentować miejsce przechowywania każdej próbki.

4. Rozmrażanie

  1. Przygotować wszystkie niezbędne roztwory: pożywkę do hodowli komórek RPMI 1640 z 50 mL FBS oraz penicyliną 50 U/mL i streptomycyną 50 U/mL. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 3°C do 2 miesięcy.
  2. Podgrzać pożywkę do hodowli komórek do temperatury 37 °C. Do sterylnych probótek stożkowych o pojemności 50 mL dodać 3 mL podgrzanej pożywki.
  3. Wyjąć próbkę z pojemnika z ciekłym azotem. Rozmrozić próbki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez ok. 3,5 min; wyjąć z łaźni wodnej niezwłocznie po stopieniu ostatniego kryształka lodu. W probówce powinien być wciąż widoczny kawałek lodu wielkości łebka szpilki.
    UWAGA: DMSO jest szkodliwe dla PBMC, dlatego należy pracować jak najszybciej.
  4. Pobrać mieszaninę komórki:FBS:DMSO za pomocą pipety 1 mL z krioprobówki. Połączyć próbki PBMC z pożywką do hodowli komórek w przygotowanych probówkach 50 mL. Przepłukać probówki 5 mL pożywki w trzech krokach: 2 mL, 2 mL i 1 mL.
  5. Przenieść pożywkę do probówek. Zabieg ten wykonuje się w celu przeniesienia ewentualnych pozostałości komórek. Wirować przez 10 min przy 100 x g w temperaturze pokojowej.
  6. Odlać nadsącz i dodać 1 mL pożywki odpowiedniej do planowanego zastosowania. Komórki są gotowe do dalszych doświadczeń.
    UWAGA: Jednak w przypadku testów funkcjonalnych na komórkach świeżych lub mrożonych, po izolacji limfocytów w pożywce izolacyjnej lub rozmrożeniu komórek często zaleca się okres odpoczynku w inkubatorze (zazwyczaj przez noc).

5. Hodowla komórkowa

  1. Po izolacji lub rozmrożeniu hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2/95% powietrza.
  2. Resuspendować komórki w 1 mL pożywki RPMI uzupełnionej o 10% FBS, penicylinę 50 U/mL i streptomycynę 50 U/mL. W zależności od dalszego zastosowania istnieje wiele możliwości; traktować komórki zgodnie z wymaganiami konkretnych analiz.
  3. Do ogólnego przechowywania stosować sterylne 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych i zbierać komórki po okresie odpoczynku. Przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej za pomocą pipety 1 mL do dołka i dodać 4 mL pożywki do hodowli komórkowej.
    UWAGA: Ilość izolowanych PBMC znacznie różni się w zależności od osobnika; jeden dołek z 5 mL pożywki do hodowli komórkowej jest wystarczający dla każdych 8 mL izolowanej krwi. Jednakże w przypadku izolacji PBMC z warstwy leukocytarnej (buffy coat), ilość PBMC jest znacznie wyższa niż w próbkach krwi pełnej, w związku z czym komórki należy podzielić na kilka dołków.
  4. Pozostawić komórki na 24 h w wilgotnej atmosferze z dodatkiem 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Inkubację tę przeprowadza się zarówno dla komórek świeżo izolowanych, jak i dla komórek kriokonserwowanych.

6. Analiza ATP

  1. Resuspenduj rozmrożone PBMC w 1 mL pożywki RPMI uzupełnionej o 10% FBS, penicylinę 50 U/mL oraz streptomycynę 50 U/mL.
  2. Pobierz próbkę i określ liczbę komórek, a następnie przeprowadź różnicowanie komórek żywych i martwych przy użyciu błękitu trypanowego. Pobierz 10 µL resuspendowanych komórek i zmieszaj z 90 µL pożywki do hodowli komórkowej. Następnie pobierz 10 µL i zmieszaj z 10 µL błękitu trypanowego. Umieść komórki w komorze licznikowej lub w automatycznym liczniku komórek i określ liczbę komórek żywych/martwych.
  3. Przenieś 100 µL komórek o gęstości 1 x 105 komórek/100 µL na dołek w białej polistyrenowej płytce 96-dołkowej.
  4. Pozostaw komórki na 24 h w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Wyznacz stężenia ATP za pomocą testu ATP.
    1. Wykorzystaj emisję światła, która powstaje podczas reakcji ATP z lucyferyną. Emitowane światło można ocenić za pomocą czytnika płytek. Wyjmij płytki z inkubatora i pozostaw je na 15 min, aby ostygły do temperatury pokojowej. Zlizuj komórki i pozostaw je na 5 min. Następnie dodaj do komórek odczynik monitorujący i dokonaj pomiaru zgodnie z instrukcjami producenta. Do wyznaczenia poziomu ATP należy użyć standardu wewnętrznego.

7. Respirometria wysokiej rozdzielczości

  1. Włącz oksygraf wysokiej rozdzielczości i pozostaw go do rozgrzania na 30 min.
  2. Poddaj komórki działaniu preparatów zgodnie z protokołem opisanym na Rysunku 1. Przygotuj wszystkie niezbędne roztwory stokowe zgodnie z Tabelą 1.
  3. Pipetuj 2,1 mL buforu do respiracji (Tabela 1) do obu komór oksygrafu wysokiej rozdzielczości i mieszaj bufor w sposób ciągły za pomocą magnetycznego mieszadła znajdującego się w komorach (750 rpm) w temperaturze 37 °C przez 30 min, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu z polarygraficznego czujnika tlenu.
    UWAGA: W komorach oksygrafu zużycie tlenu w czasie rzeczywistym (strumień) oraz nasycenie tlenem w komorze są mierzone za pomocą polarygraficznych elektrod tlenowych. Należy przeprowadzić kalibrację tła, aby uniknąć szumów i zapewnić wiarygodność wyników.
  4. Wykonaj kalibrację powietrzną polarygraficznego czujnika tlenu zgodnie z protokołami producenta23.
  5. Resuspenduj wyizolowane PBMC w 1 mL medium do respiracji mitochondrialnej (MIR05, którego skład przedstawiono w Tabeli 1) i rozcieńcz do stężenia 8 x 106 komórek/mL.
  6. Po kalibracji powietrznej odessaj medium do respiracji z komory oksygrafu i dodaj 2,1 mL zawiesiny komórkowej do każdej komory respirometru. W razie potrzeby w trakcie pomiaru ponowne natlenienie komór (patrz: Otwórz w punkcie h na Rysunku 2); nasycenie tlenem w komorach nie powinno spaść poniżej 100 µM.
  7. Zamknij komory, wkładając zatyczki; komory są zaprojektowane do objętości 2,0 mL. Odessaj wypływającą zawiesinę komórkową.
  8. Mieszaj zawiesinę komórkową w sposób ciągły w temperaturze 37 °C za pomocą mieszadła magnetycznego (750 rpm) znajdującego się w komorze. Odczekaj około 20 min, aż uzyskano stabilny sygnał. Wyznacz respirację endogenną ((a) na Rysunku 2).
  9. Aby wyznaczyć aktywności poszczególnych kompleksów łańcucha oddechowego, wstrzyknij substraty i inhibitory respiracji mitochondrialnej przez tytanowe porty wtryskowe zatyczek. Stosuj następujące stężenia końcowe w komorze.
  10. Aby zniszczyć błony komórkowe, dodaj 5 µL 8,1 mM digitoniny przez tytanowy port wtryskowy zatyczki komory, aby usunąć substraty naiwne (b) na Rysunku 2, podczas gdy błony mitochondrialne pozostaną nienaruszone.
  11. Dodaj substraty: 2 M glutaminianu i 800 mM jabłczanu przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min.
    UWAGA: Można również zastosować dodatkowe substraty, takie jak pirogronian.
  12. Dodaj 8 µL 500 mM difosforanu adenozyny (ADP) przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (d) na Rysunku 2.
  13. Dodaj 20 µL 1 M bursztynianu przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (e) na Rysunku 2.
  14. Tytruj 1 M karbonylocyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP) stopniowo w dawkach 0,5 µL do momentu, w którym nie nastąpi już dalszy wzrost. Odczekaj 2-4 min, aż sygnał się ustabilizuje (f) na Rysunku 2. Gdy nie nastąpi dalszy wzrost respiracji, przejdź do następnego kroku.
    OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność podczas pracy z FCCP, ponieważ stwarza on zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  15. Dodaj 5 µL 0,1 mM rotenonu przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (g) na Rysunku 2.
    OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność podczas pracy z rotenonem, ponieważ stwarza on zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  16. Dodaj 1 µL 4 mg/mL oligomycyny przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (h) na Rysunku 2.
    OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność podczas pracy z oligomycyną, ponieważ jest to trucizna stanowiąca zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  17. Dodaj 1 µL 5 mM antymycyny A przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (i) na Rysunku 2.
    OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność podczas pracy z antymycyną A, ponieważ jest to trucizna stanowiąca zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  18. Podczas oceny pomiaru, w celu wykluczenia zużycia tlenu przez enzymy niezaangażowane w fosforylację oksydacyjną, odejmij wartości dla antymycyny A od wszystkich pozostałych zmierzonych wartości.
  19. Dodaj 200 mM dichlorowodorku N,N,N',N'-tetrametylometalo-p-fenylendiaminy (TMPD; donator elektronów) i 800 mM askorbinianu, aby utrzymać TMPD w stanie zredukowanym. Wstrzyknij substraty przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min (j) na Rysunku 2.
  20. TMPD ulega autooksydacji, dlatego należy odjąć wynikające z tego zużycie tlenu od wartości zmierzonej dla Kompleksu IV.
  21. Dodaj NaN3 ≥ 100 mM przez port wtryskowy zatyczki komory i rejestruj respirację do momentu uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min w celu zahamowania aktywności kompleksu IV; pozostaje jedynie autooksydacja TMPD.
    OSTRZEŻENIE: Zachowaj ostrożność podczas pracy z azotkiem sodu, ponieważ jest to trucizna stanowiąca zagrożenie dla zdrowia ludzi.

Schemat oddychania komórkowego przedstawiający zmiany stężenia O₂ w różnych stanach metabolicznych; analiza strumienia.
Rycina 2: Schematyczny przebieg strumienia O2. Przedstawiono schematyczny przebieg strumienia tlenu. Krzywa została podzielona na różne fazy po dodaniu inhibitorów i substratów od a do k. a: oddychanie endogenne; b: komórki permeabilizowane; c: rozprzęgane oddychanie kompleksu I; d: sprzężone oddychanie kompleksu I; e: OXPHOS; f: maksymalna rozprzęgana aktywność CI i CII; g: rozprzęgane oddychanie kompleksu II; h: oddychanie przeciekowe (leak respiration); i: oddychanie resztkowe; j: CIV(U) rozzprzęgane oddychanie i autooksydacja TMPD; k: autooksydacja TMPD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

8. Aktywność syntazy cytrynianowej

  1. Zmierz aktywność syntazy cytrynianowej jako oddzielny parametr i wykorzystaj ją do normalizacji pomiarów z wysokorozdzielczego oksygrafu.
  2. Resuspenduj wyizolowane PBMC w 1 mL medium do oddychania mitochondrialnego (MIR05) i rozcieńcz do stężenia 8 x 106 komórek/mL.
  3. Zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze −80 °C do momentu przeprowadzenia doświadczeń lub w celu pomiaru świeżych komórek.
  4. Przygotuj wszystkie niezbędne roztwory: bufor trietanoloaminowy HCl 0,1 M pH 8,0, bufor Tris-HCl 1,0 M pH=8,1, Triton X-100 10%, szczawiooctan 10 mM w buforze trietanoloaminowym HCl 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM w buforze Tris-HCl 1,0 M pH=8,1, acetylo-CoA 12,2 mM w podwójnie destylowanej H2O.
  5. Przygotuj medium reakcyjne (Tabela 1) zawierające 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoesan) (DTNB; 0,1 mM), acetylo-koenzym A (0,31 mM), EDTA (50 µM), trietanoloaminę HCl (5 mM) i Tris HCl (0,1 M).
  6. Przygotuj odczynik startowy (Tabela 1) z 0,5 mM szczawiooctanu rozpuszczonego w podwójnie destylowanej H2O.
  7. Rozmroź próbki na lodzie, ponieważ syntaza cytrynianowa jest niestabilna w przypadku zbyt szybkiego rozmrażania.
  8. Dodaj 40 µL próbek do płytki 96-dołkowej na lodzie, a następnie dodaj 110 µL medium reakcyjnego za pomocą wielokanałowej pipety.
  9. Wygrzej medium reakcyjne i próbkę w inkubatorze do 30 °C przez 5 min. Wygrzej odczynik startowy w łaźni wodnej do 30 °C przez 5 min.
  10. Dodaj 50 µL odczynnika startowego do każdego dołka za pomocą wielokanałowej pipety. Zmierz absorbancję w temperaturze 30 °C przy długości fali 412 nm przez 20 min za pomocą czytnika płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Żywotność i liczba komórek
Aby uzyskać pomyślną izolację i kriokonserwację, liczba oraz żywotność komórek powinny być jak najwyższe. Przed i po kriokonserwacji komórki są przeliczane, a ich żywotność jest określana w celu zapewnienia zdrowia i jakości komórek. Rycina 3 stanowi reprezentacyjną ilustrację PBMC przed i po kriokonserwacji, gdzie liczba i żywotność komórek prawie się nie różnią. Wskazuje to na skuteczną izolację i przechowywanie PBMC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia sposób izolacji i kriokonserwacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej w sposób odpowiedni do analiz bioenergetycznych. Opisana metoda daje możliwość delikatnego izolowania PBMC w dużych ilościach, o wysokiej żywotności i wystarczającej liczbie komórek do pomiarów bioenergetycznych. Ma to tę wadę, że nawet przy minimalnych przerwach dochodzi do długich izolacji, ale późniejsza kriokonserwacja pozwala na niezależny od czasu pomiar bioenergetyki. Dzięki tej metodzie próbki mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować zespołowi klinicznemu Szpitala Uniwersyteckiego Giessen-Marburg za pobranie krwi. Praca ta została sfinansowana przez uniwersytet Justusa Liebiga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 M bufor trietanoloamino-HCl (pH = 8,0)Przygotowanysamodzielnie-0,5
M bufor trietanoloaminy-HClPrzygotowanysamodzielnie-1,0
M bufor tris-HCl (pH = 8,1)Przygotowanysamodzielnie-1,01
mM DTBBPrzygotowanysamodzielnie-10
% Triton X-100Przygotowanysamodzielnie-10
mM szczawiacetatPrzygotowaniewłasne-14
– 20 G sterylnych igieł do pobierania krwi Multi Adapter Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37% HClCarl Roth GmbH & Co. KG-70
% Etanol (EtOH)Samodzielnie
Aplikacja do trzustkiA3753
ADPSigma-AldrichA5285
Chusteczki nasączone alkoholem ( 70% alkohol izopropylowy)
Antimycyna ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)Z MilliQ Academic (własnej roboty)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Roztwór seperacyjnyBiochrom6115
Biologiczny szafa bezpieczeństwa MSC Advantage ThermoFisher Scientific Inc.
Karbonylocyjanid-p-trifluorometoksy-fenylohydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Licznik komórek TC20 Automatyczny licznik komórekWirówka Bio-Rad
Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórekBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninaSigma-Aldrich37008
Dimetylosulfoksydek (DMSO)Merck102952
Spray
Rękawiczki jednorazowe lateksowe, guma lub winyl.
Dyslikty (12,5 ml) DistriTipsGilsonF164150
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS; 10x)Gibco (Thermo Scientific)15217168
Etanol (EtOH 100%)Carl ROTH GmbH & Co. KG9065.3
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma-AldrichF9665
Frezer (-80° C)Thermo Fisher Scientific Inc.
GlutaminianSigma-AldrichG1626
Uchwyt/adapter 
Inkubator Midi 40 CO2Thermo Fisher Scientific Inc.
Strzykawka iniekcyjnaHamilton
MalateSigma-AldrichM-1000
MIR05Samodzielnie przygotowany-Mr
. Mroźny pojemnik do zamrażaniaThermo Fisher Scientific Inc.
Czytnik wielofunkcyjny CLARIOstarBMG Labtech
Lokalizator zbiorników azotu 6 plusThermo Fisher Scientific Inc.
OligomycynaSigma-AldrichO4876
SzczawiooctanSigma-Aldrich-Oxygraph-2k
Orobororus Instrumenty
Penicylina-StreptomycynaPAA15140122
Pipety Wydajność Pipetor 10 μ L, 100 μ L, 1000 μ LVWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)Gibco (Thermo Scientific)11530586
RotenonSigma-AldrichR8875
SacharozaCarl ROTH GmbH & Co. KG9286.2
Azydek soduSigma-AldrichS2002
BursztynianSigma-AldrichS2378
Tetrametylofenylendiamina (TMPD)Sigma-AldrichT3134
Opaska uciskowa / Mankiet
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-Aldrich108382
Triton X-100Sigma-Aldrich108643
TrypanblauBiochromT6146
Pompa próżniowaVaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
Kąpiel wodna WNB22Memmert GmbH & Co. KG
przygotowany-Acetylo-CoA do dezynfekcji10110051do pomiaru ciśnienia krwi

Bibliografia

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34(2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949(2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236(2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309(2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229(2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985(2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30(2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriokonserwacja PBMCbioenergetyka mitochondrialnafosforylacja oksydacyjnaizolacja limfocytówżywotność komórekprzetwarzanie próbek krwiaktywność łańcucha oddechowegoautomatyczny licznik komórekkriokonserwacja z DMSO
Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.