Artykuł metodologiczny

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

DOI:

10.3791/65730

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Institute of Nutritional Sciences, Justus-Liebig-University of Giessen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologiczne funkcje komórek eukariotycznych opierają się głównie na energii dostarczanej głównie przez mitochondria. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z chorobami metabolicznymi i starzeniem się. Fosforylacja oksydacyjna odgrywa decydującą rolę, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy energetycznej. PBMC zostały zidentyfikowane jako minimalnie inwazyjna próbka do pomiaru funkcji mitochondriów i wykazano, że odzwierciedlają stany chorobowe. Jednak pomiar funkcji bioenergetycznych mitochondriów może być ograniczony przez kilka czynników w próbkach ludzkich. Ograniczeniami są ilość pobranych próbek, czas pobierania próbek, który często jest rozłożony na kilka dni, oraz lokalizacje. Kriokonserwacja pobranych próbek może zapewnić spójne pobieranie i pomiar próbek. Należy dołożyć starań, aby mierzone parametry były porównywalne między kriokonserwowanymi a świeżo przygotowanymi komórkami. Tutaj opisujemy metody izolowania i kriokonserwacji PBMC z próbek ludzkiej krwi w celu analizy bioenergetycznej funkcji mitochondriów w tych komórkach. Kriokonserwacja PBMC zgodnie z opisanym tutaj protokołem wykazuje jedynie niewielkie różnice w liczbie komórek i żywotności, poziomie trifosforanu adenozyny i zmierzonej aktywności łańcucha oddechowego w porównaniu ze świeżo pobranymi komórkami. Do opisanych preparatów potrzeba tylko 8-24 ml krwi ludzkiej, dzięki czemu możliwe jest wieloośrodkowe pobieranie próbek podczas badań klinicznych i określenie ich bioenergetyki na miejscu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs) są używane do różnych zastosowań w wielu dziedzinach nauki, w tym do badania zagadnień immunologicznych i bioenergetycznych, takich jak te związane z procesami starzenia lub chorobami zwyrodnieniowymi1,2. PBMC mają niejednorodny skład i składają się z limfocytów (limfocytów B, limfocytów T i komórek NK), monocytów i komórek dendrytycznych. Komórki czasami wykazują duże indywidualne różnice i różnice w obrębie badanego, dlatego wymagane są ustandaryzowane procedury postępowania z tymi komórkami. Ważne parametry, takie jak żywotność i czystość izolacji, są podstawowymi wymaganiami dotyczącymi obchodzenia się z nią i dodatkowo wpływają na nie czynniki środowiskowe, takie jak czas pobrania, poziom melatoniny, to, czy badany jest na czczo i inne3,4.

Na podstawie badań nad bioenergetyką PBMC, opisujemy tutaj metodę izolacji, krioprezerwacji i hodowli PBMC, która jest odpowiednia również dla innych metod. Podczas gdy biopsja mięśni jest uważana za złoty standard metabolizmu energii mitochondrialnej5, badanie komórek krwi jest szybką, minimalnie inwazyjną procedurą. Ponadto coraz więcej badań sugeruje, że zmiany w funkcji mitochondriów w procesie starzenia się i choroby Alzheimera (AD) zachodzą nie tylko w mózgu, ale także na peryferiach6,7,8,9,10. Metoda ta pozwala również na badanie innych schorzeń i chorób, w tym cukrzycy i otyłości11,12,13. Można analizować wzorce ekspresji genów u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym lub funkcję immunologiczną i ogólnie na nią wpływy14,15,16.

PBMCs zazwyczaj polegają na fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w celu wytworzenia trifosforanu adenozyny (ATP)17,18. W związku z tym PBMC obejmują szeroki zakres zastosowań jako substytuty. W poprzednich raportach metabolizm energetyczny PBMC był wykorzystywany do rozwiązywania dysfunkcji narządów, takich jak wczesna niewydolność serca19, wstrząs septyczny20 lub różnice związane z płcią4 w funkcji mitochondriów. Uogólniona metoda krioprezerwacji, izolacji i hodowli PBMC miałaby zalety w zakresie porównywalności wyników uzyskanych w różnych instytutach. Istnieje wiele różnic w protokołach dla każdego kroku21,22, celem tej metody jest zapewnienie wytycznych dla pomiarów bioenergetycznych w PBMC.

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru parametrów bioenergetycznych w PBMCs. Wyjaśniamy metody izolacji, kriokonserwacji i pomiaru bioenergetyki PBMC z ludzkiej krwi. Metoda ta może być stosowana do określania parametrów bioenergetycznych u pacjentów i oceny ich w kontekście klinicznym. Aby zastosować te pomiary, naukowcy potrzebują dostępu do populacji pacjentów, od której można pobrać świeże próbki krwi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły opisane w tym manuskrypcie dotyczące pobierania, izolacji i analizy krwi zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie w Giessen, Niemcy. Uzyskano zgodę pacjentów na włączenie ich próbek do badania. Wszystkie etapy izolacji i hodowli komórkowej odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Nakłucie żyły

  1. Przygotuj cały sprzęt potrzebny do pobrania krwi, w tym spray do dezynfekcji, sterylny wacik, kaniulę do pobierania krwi z rurką 80 mm i adapterem wielofunkcyjnym, opaskę uciskową/mankiet do pomiaru ciśnienia krwi, Monovette 9 mL litowo-heparynę.
    UWAGA: EDTA jako antykoagulant jest również skuteczny.
  2. Zbierz krew z najbardziej odpowiedniej żyły ramienia, zwykle żyły środkowej łokcia lub żyły głowowej.
  3. Założyć opaskę uciskową/mankiet do pomiaru ciśnienia krwi o lekkim ciśnieniu, około 80 mm/Hg.
  4. Zdezynfekuj rękawice i miejsce nakłucia środkiem dezynfekującym w sprayu zawierającym alkohol. Pozostaw zdezynfekowane miejsce wkłucia do wyschnięcia na powietrzu.
  5. Żyły wystają z powodu nacisku mankietu ciśnieniowego. Włóż igłę (średnica kaniuli (zewnętrzna) 21 g / 0,8 mm, długość 19 mm) pod kątem 15°-20° żyły, starając się uniknąć urazu i zminimalizować sondowanie.
  6. Pobrać krew za pomocą odpowiedniego systemu, 4 probówki zawierające 9 ml krwi (więcej niż 7-8 probówek jest problematycznych dla jednego eksperymentatora do prawidłowego wyizolowania).
  7. Po pobraniu krwi umieść probówki w ciemności na 5 minut, aby zapewnić równomierną antykoagulację.

2. Izolacja PBMC

  1. Przygotuj wszystkie potrzebne rozwiązania zgodnie z poniższym opisem.
  2. Doprowadzić zbilansowany roztwór soli Dulbecco (DPBS; stężenie 1x) i pożywkę do izolacji limfocytów (1,077 g/ml) do temperatury pokojowej (20-25 °C).
  3. Przygotuj płodową surowicę bydlęcą (FBS) w temperaturze pokojowej i trzymaj jedną sterylną stożkową probówkę o pojemności 50 ml z FBS na lodzie. Na każdą próbkę krwi wymagane są 2 ml FBS.
  4. Przechowywać pojemnik do zamrażania w temperaturze 4 °C i wstępnie schłodzić krioprobówki w temperaturze 4 °C.
  5. Ciepła pożywka do hodowli komórkowej do 37 °C, pożywka składa się z RPMI 1640 z 50 ml FBS i penicyliny 50 U/ml streptomycyny 50 U/ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 3 °C przez okres do 2 miesięcy.
  6. Dodać 8 ml DPBS do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml pożywki do izolacji limfocytów w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (podłoże jest wrażliwe na światło, dodaj je przed rozpoczęciem izolacji).
  7. Dodać 8 ml krwi do 8 ml DPBS i ostrożnie wymieszać z plastikową pipetą Pasteura o pojemności 3 ml.
  8. Delikatnie ułóż warstwę mieszanki krwi/DPBS za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml na pożywce do izolacji limfocytów. Aby nałożyć pierwszą warstwę na podłoże, należy przechylić probówkę o 20°-30°, co spowoduje mniejsze przenikanie mieszaniny krew-PBS do warstwy podłoża.
  9. Ostrożnie nałożyć mieszaninę krwi i PBS na boczną ściankę probówki na podłoże do izolacji limfocytów. Używaj stałej prędkości, aby utrzymać stały przepływ krwi.
  10. W następnym kroku powoli ustaw probówkę w pozycji pionowej, pozostałą krew ostrożnie nakłada się na boczną ściankę probówki na warstwę krwi.
  11. Wirować przez 10 minut przy 1000 x g w temperaturze pokojowej w wirówce z wirnikiem wahliwym z wyłączonymi hamulcami. Po odwirowaniu mieszaninę krwi i PBMC rozdziela się na cztery warstwy. Górna warstwa składa się z osocza i płytek krwi, druga warstwa to warstwa PBMC, następnie warstwa pożywki do izolacji limfocytów, a na końcu erytrocyty i granulocyty w dolnej warstwie. Poszczególne warstwy są wyświetlane w Rysunek 1.
  12. Usuń 2/3 warstwy plazmy za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
  13. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml zebrać PBMC na warstwie pożywki do izolacji limfocytów, uważając, aby do próbki nie dostało się żadne podłoże.
  14. Umieść końcówkę 1 mm nad warstwą PBMC. Warstwy PBMC nie należy nakłuwać, w przeciwnym razie podłoże będzie przepływać po komórkach. Zasysanie pipety ciągnie PBMC do tego punktu, dzięki czemu można je w tym momencie zebrać kilka razy.
    UWAGA: Aby zmaksymalizować liczbę zebranych PBMC, pod koniec procedury poszukaj reszty na powierzchni i spróbuj zebrać tam również komórki. Aby ustabilizować procedurę, rurkę można umieścić na powierzchni.
  15. Przenoś PBMC krok po kroku do nowej probówki o pojemności 50 ml, aż nioska zostanie całkowicie zebrana. Dodać DPBS do oznaczenia 25 ml, zmyć pożywkę do izolacji limfocytów i inne pozostałości.
  16. Wirować przez 10 minut przy 100 x g w temperaturze pokojowej z włączonymi hamulcami. Usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej lub podobnego urządzenia, uważając, aby nie uszkodzić osadu komórkowego.
  17. Zawiesić osad w 1 ml DPBS i dodać DPBS do oznaczenia 25 ml. Powtórzyć mycie jeszcze raz, a następnie ponownie zawiesić w podłożu odpowiednim do kolejnych kroków.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie wirowania w gradiacji gęstości w celu zilustrowania różnych warstw. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Kriokonserwacja

  1. Schłodzić pojemnik do zamrażania do 4 °C, ostudzić FBS na lodzie.
  2. Ponownie zawiesić granulat PBMC w 1 ml FBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml, FBS powinien mieć temperaturę pokojową.
  3. Wymieszaj DMSO ze wstępnie schłodzonym FBS na lodzie 1:5, końcowe stężenie 20% DMSO, a następnie umieść mieszaninę FBS: DMSO z powrotem na lodzie. Zawsze przygotowuj roztwór na świeżo.
  4. Przenieś zawiesinę komórek PBMC w FBS do dobrze oznakowanych krioprobówek o pojemności 2 ml. Użyj jednej krioprobówki na probówkę zbiorczą. Dostosuj liczbę komórek w zakresie od 1 x 107 do 5 x 107 na ml. Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić liczbę komórek i żywotność.
  5. Dodaj 1 ml mieszaniny FBS: DMSO kroplami za pomocą pipety o pojemności 1 ml, około 1-2 krople na s, do probówki. Dodawanie kroplami prowadzi do ciągłego i spójnego mieszania.
  6. Umieść probówki we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieścić pojemnik do zamrażania w zamrażarce w temperaturze -80 °C na 24 godziny. Pojemnik do zamrażania zapewnia kontrolowane chłodzenie do -1 °C na minutę.
  7. Wyjmij probówki z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Po wyjęciu z zamrażarki należy przechowywać probówki w fazie gazowej ciekłego azotu. Należy udokumentować miejsce każdej próbki.

4. Rozmrażanie

  1. Przygotuj wszystkie potrzebne roztwory: Pożywka do hodowli komórkowych RPMI 1640 z 50 ml FBS i penicyliną 50 U/ml, streptomycyną 50 U/ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 3°C do 2 miesięcy.
  2. Wstępnie ogrzać pożywkę do hodowli komórkowych do temperatury 37 °C. Dodać 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  3. Usunąć próbkę ze zbiornika ciekłego azotu. Próbki rozmrażać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez ok. 3,5 minuty, wyjąć z łaźni wodnej, gdy tylko topnieje ostatni lód. Kawałek lodu wielkości główki od szpilki powinien być nadal widoczny w tubie.
    UWAGA: DMSO jest szkodliwe dla PBMC działa tak szybko, jak to możliwe.
  4. Usuń komórkę: FBS: DMSO wymieszaj pipetą 1 ml z krioprobówki. Zmieszać próbki PBMC z pożywką do hodowli komórkowych w przygotowanych probówkach o pojemności 50 ml. Przepłukać probówki 5 ml pożywki hodowlanej w trzech etapach po 2 ml, 2 ml i 1 ml.
  5. Przenieś pożywkę do probówek. Odbywa się to w celu przeniesienia ewentualnych pozostałości komórkowych. Wirować przez 10 minut przy 100 x g w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml pożywki odpowiedniej do planowanego użycia. Komórki są gotowe do kolejnych eksperymentów.
    UWAGA: Jednak w przypadku testów funkcjonalnych na świeżych lub mrożonych komórkach, okres odpoczynku w inkubatorze (zwykle przez noc) jest często zalecany po izolacji opartej na pożywce do izolacji limfocytów lub rozmrożeniu komórek.

5. Hodowla komórkowa

  1. Po wyizolowaniu lub rozmrożeniu komórek hodowlanych przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2/95% powietrzu.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS, penicyliną 50 U/ml, streptomycyną 50 U/ml. Do dalszego wykorzystania istnieje wiele możliwości, traktuj komórki zgodnie z potrzebami do testów.
  3. Do ogólnego przechowywania należy używać sterylnych 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych i pobierać komórki po okresie spoczynku. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej za pomocą pipety o pojemności 1 ml do studzienki i dodać 4 ml pożywki do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Ilość wyizolowanych PBMC różni się znacznie u poszczególnych osób, jedna studzienka z 5 ml pożywki do hodowli komórkowych wystarcza na każde 8 ml wyizolowanej krwi. Jednak podczas izolowania PBMC z kożuchów ilość PBMC jest znacznie wyższa niż w próbkach krwi pełnej, dlatego komórki należy podzielić na kilka dołków.
  4. Pozostawić komórki na 24 godziny w wilgotnej atmosferze uzupełnionej 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Inkubację tę przeprowadza się dla świeżo wyizolowanych komórek, a także dla komórek kriokonserwowanych.

6. Test ATP

  1. Zawiesić rozmrożone PBMC w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS, penicyliną 50 U/ml, streptomycyną 50 U/ml.
  2. Pobrać próbkę i określić liczbę komórek, a następnie przeprowadzić rozróżnianie żywych i martwych organizmów za pomocą błękitu trypanowego. Pobrać 10 μl z zawieszonych komórek i wymieszać z 90 μl pożywki do hodowli komórkowych. Następnie weź 10 μl i wymieszaj z 10 μl błękitu trypanowego. Umieść komórki w komorze zliczania komórek lub automatycznym liczniku komórek i określ liczbę żywych/martwych komórek.
  3. Płytkę 100 μl komórek o gęstości 1 x 105 komórek/100 μl na studzienkę w 96-dołkowej białej płytce polistyrenowej.
  4. Pozostawić komórki na 24 godziny w wilgotnej atmosferze uzupełnionej 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Oznaczyć stężenia ATP za pomocą testu ATP.
    1. Użyj emisji światła, która występuje, gdy ATP jest połączone z lucyferyną. Emitowane światło może być analizowane za pomocą czytnika płytek. Wyjmij płytki, aby inkubator ostygł do temperatury pokojowej przez 15 minut. Zlizuj komórki i pozostaw je na 5 minut. Następnie nałóż odczynnik monitorujący na ogniwa i zmierz zgodnie z instrukcjami producenta. Do określenia poziomu ATP stosuje się wzorzec wewnętrzny.

7. Respirometria o wysokiej rozdzielczości

  1. Włącz oksygram o wysokiej rozdzielczości i pozwól mu się rozgrzać przez 30 minut.
  2. Traktuj komórki zgodnie z protokołem opisanym w Rysunek 1. Przygotować wszystkie potrzebne zapasy jak w tabeli 1.
  3. Pobrać pipetę z 2,1 ml buforu oddechowego (Tabela 1) do obu komór oksygraficznych o wysokiej rozdzielczości i mieszać bufor w sposób ciągły za pomocą mieszadła magnetycznego znajdującego się w komorach (750 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż do uzyskania stabilnego sygnału strumienia tlenu z polarograficznego czujnika tlenu.
    UWAGA: W komorach oksygramu mierzy się zużycie tlenu w czasie rzeczywistym (strumień) oraz nasycenie komory tlenem za pomocą polarograficznych elektrod tlenowych. Kalibrację tła należy przeprowadzić, aby uniknąć szumów tła i zapewnić wiarygodne wyniki.
  4. Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznego czujnika tlenu zgodnie z protokołami producenta23.
  5. Zawiesić wyizolowane PBMC w 1 ml mitochondrialnego podłoża do oddychania (MIR05; skład przedstawiono w Tabeli 1) i rozcieńczyć do 8 x 106 komórek/ml.
  6. Po kalibracji powietrza należy odessać medium oddechowe z komory oksygraficznej i dodać 2,1 ml zawiesiny komórek do każdego pochylenia respirometru. Jeśli zajdzie taka potrzeba podczas pomiaru, należy ponownie natlenić komory (patrz Otwarte w punkcie h w Rysunek 2), nasycenie komór tlenem nie powinno spaść poniżej 100 μM.
  7. Zamknij komory, wkładając korki, komory są zaprojektowane tak, aby pomieścić objętość 2,0 ml. Odessać powstającą zawiesinę komórkową.
  8. Zawiesinę komórkową należy mieszać w sposób ciągły w temperaturze 37 °C za pomocą mieszadła magnetycznego (750 obr./min) umieszczonego w komorze. Odczekaj około 20 minut, aż uzyskany zostanie stabilny sygnał. Określ oddychanie endogenne ((a) w Rysunek 2).
  9. Aby określić różne złożone czynności łańcucha oddechowego, wstrzyknąć substraty i inhibitory oddychania mitochondrialnego przez tytanowe porty iniekcyjne korków. Użyć następującego stężenia końcowego w komorze.
  10. Aby przerwać błony komórkowe, dodaj 5 μl 8,1 mM digitoniny, przez tytanowy port iniekcyjny korka komory, aby usunąć naiwne substraty (b) w Rysunek 2, podczas gdy błony mitochondrialne pozostają nienaruszone.
  11. Dodać substraty 2 M glutaminianu i 800 mM jabłczanu przez otwór wtryskowy korka komory i rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 min.
    UWAGA: Możliwe jest również użycie dodatkowych podłoży, takich jak pirogronian.
  12. Dodać 8 μl 500 mM difosforanu adenozyny (ADP) przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (d) w Rysunek 2.
  13. Dodać 20 μl 1 M bursztynianu przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (e) w Rysunek 2.
  14. Miareczkować 1 M p-trifluorometoksyfenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP) stopniowo w ilości 0,5 μl do momentu, w którym nie następuje dalszy wzrost. Poczekaj 2-4 minuty, aż sygnał ustabilizuje się (f) w Rysunek 2. Gdy nie nastąpi dalsze zwiększenie oddychania, przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z FCCP, ponieważ stanowi on zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  15. Dodać 5 μl 0,1 mM rotenonu przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (g) w Rysunek 2.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z rotenonem, ponieważ stanowi on zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  16. Dodać 1 μl oligomycyny o stężeniu 4 mg/ml przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (h) w Rysunek 2.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z oligomycyną, ponieważ jest to trucizna, która stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  17. Dodać 1 μl 5 mM antymycyny A przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddychanie aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (i) w Rysunek 2.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z antymycyną A, ponieważ jest to trucizna, która stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi.
  18. Oceniając przebieg w celu wykluczenia zużycia tlenu przez enzymy niebiorące udziału w fosforylacji oksydacyjnej, odejmij wartości antymycyny A od wszystkich innych zmierzonych wartości.
  19. Dodać 200 mM DICHLOROWODORKU N,N,N',N'-tetrametylo-p-fenylenodiaminy (TMPD; dawca elektronów) i 800 mM askorbinianu, aby utrzymać TMPD w stanie zredukowanym. Wstrzyknąć substraty przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach (j) w Rysunek 2.
  20. TMPD podlega autooksydacji, więc odejmij wynikowe zużycie tlenu od wartości zmierzonej w kompleksie IV.
  21. Dodać NaN3 ≥ 100 mM przez otwór iniekcyjny korka komory i rejestrować oddech aż do uzyskania stabilnego sygnału. Sygnał stabilizuje się po 2-4 minutach, aby zahamować złożoną aktywność dożylną, pozostaje tylko autooksydacja TMPD.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z azydkiem sodu, ponieważ jest to trucizna, która stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematyczny przebieg strumienia O2. Pokazano schematyczny przebieg strumienia tlenu. Krzywa jest podzielona na różne fazy po dodaniu inhibitorów i substratów od a-k. a: oddychanie endogenne; b: komórki przepuszczalne; c: niesprzężony kompleks I oddychania; d: sprzężony kompleks I oddychania; e: OXPHOS ; f: maksymalna niesprzężona aktywność CI i CII ; g: oddychanie niesprzężone kompleksu II; H: oddychanie nieszczelne; i: oddychanie resztkowe; j: CIV(U) niesprzężone oddychanie i autooksydacja TMPD; k: autooksydacja TMPD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Aktywność syntazy cytrynianu

  1. Zmierz aktywność syntazy cytrynianu jako oddzielny parametr i użyj go do normalizacji pomiarów oksygrafu o wysokiej rozdzielczości.
  2. Ponownie zawiesić wyizolowany PBMC w 1 ml mitochondrialnej pożywki oddechowej (MIR05) i rozcieńczyć do 8 x 106 komórek/ml.
  3. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia eksperymentów lub zmierzenia świeżych komórek.
  4. Przygotuj wszystkie potrzebne roztwory: 0,1 M bufor HCl trietanoloaminy pH 8,0, 1,0 M bufor Tris-HCl pH = 8,1, 10% Triton X-100, 10 mM szczawiooctan w 0,1 M bufor HCl trietanoloaminy pH 8,0, 1,01 mM DTNB w 1,0 M Bufor Tris-HCl pH = 8,1, Acetylo-CoA 12,2 mM w podwójnie destylowanymH2O.
  5. Przygotować pożywkę reakcyjną (tabela 1) zawierającą 5,5'-ditio-bis-(kwas 2-nitrobezoesowy) (DTNB; 0,1 mM), acetylokoenzym A (0,31 mM), EDTA (50 μM), HCl trietanoloaminy (5 mM) i Tris HCl (0,1 M).
  6. Przygotować odczynnik wyjściowy (tabela 1) z 0,5 mM szczawiooctanu rozpuszczonego w podwójnie destylowanymH2O.
  7. Rozmrażaj próbki na lodzie, ponieważ syntaza cytrynianu jest niestabilna, jeśli jest rozmrażana zbyt szybko.
  8. Dodać 40 μl próbek do 96-dołkowej płytki na lodzie, a następnie dodać 110 μl pożywki reakcyjnej za pomocą multipipety.
  9. Ogrzewać pożywkę reakcyjną i próbkę w inkubatorze do temperatury 30 °C przez 5 minut. Odczynnik wyjściowy podgrzewać w łaźni wodnej do temperatury 30 °C przez 5 minut.
  10. Dodać 50 μl odczynnika wyjściowego za pomocą pipety wielopipetowej do każdego dołka. Mierzyć absorbancję w temperaturze 30 °C przy długości fali 412 nm przez 20 minut za pomocą czytnika płytek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotność i liczba komórek
Aby osiągnąć pomyślną izolację i krioprezerwację, liczba komórek i żywotność powinny być jak najwyższe. Przed i po kriokonserwacji komórki są liczone, a ich żywotność jest określana w celu zapewnienia zdrowia i jakości komórek. Rysunek 3 jest reprezentatywną ilustracją PBMC przed i po krioprezerwacji, liczba komórek i żywotność prawie się nie różnią. Wskazuje to na udaną izolację i zachowanie PBMC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia sposób izolacji i kriokonserwacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej w sposób odpowiedni do analiz bioenergetycznych. Opisana metoda daje możliwość delikatnego izolowania PBMC w dużych ilościach, o wysokiej żywotności i wystarczającej liczbie komórek do pomiarów bioenergetycznych. Ma to tę wadę, że nawet przy minimalnych przerwach dochodzi do długich izolacji, ale późniejsza kriokonserwacja pozwala na niezależny od czasu pomiar bioenergetyki. Dzięki tej metodzie próbki mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować zespołowi klinicznemu Szpitala Uniwersyteckiego Giessen-Marburg za pobranie krwi. Praca ta została sfinansowana przez uniwersytet Justusa Liebiga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 M bufor trietanoloamino-HCl (pH = 8,0)Przygotowanysamodzielnie-0,5
M bufor trietanoloaminy-HClPrzygotowanysamodzielnie-1,0
M bufor tris-HCl (pH = 8,1)Przygotowanysamodzielnie-1,01
mM DTBBPrzygotowanysamodzielnie-10
% Triton X-100Przygotowanysamodzielnie-10
mM szczawiacetatPrzygotowaniewłasne-14
– 20 G sterylnych igieł do pobierania krwi Multi Adapter Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37% HClCarl Roth GmbH & Co. KG-70
% Etanol (EtOH)Samodzielnie
Aplikacja do trzustkiA3753
ADPSigma-AldrichA5285
Chusteczki nasączone alkoholem ( 70% alkohol izopropylowy)
Antimycyna ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)Z MilliQ Academic (własnej roboty)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Roztwór seperacyjnyBiochrom6115
Biologiczny szafa bezpieczeństwa MSC Advantage ThermoFisher Scientific Inc.
Karbonylocyjanid-p-trifluorometoksy-fenylohydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Licznik komórek TC20 Automatyczny licznik komórekWirówka Bio-Rad
Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórekBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninaSigma-Aldrich37008
Dimetylosulfoksydek (DMSO)Merck102952
Spray
Rękawiczki jednorazowe lateksowe, guma lub winyl.
Dyslikty (12,5 ml) DistriTipsGilsonF164150
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS; 10x)Gibco (Thermo Scientific)15217168
Etanol (EtOH 100%)Carl ROTH GmbH & Co. KG9065.3
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sigma-AldrichF9665
Frezer (-80° C)Thermo Fisher Scientific Inc.
GlutaminianSigma-AldrichG1626
Uchwyt/adapter 
Inkubator Midi 40 CO2Thermo Fisher Scientific Inc.
Strzykawka iniekcyjnaHamilton
MalateSigma-AldrichM-1000
MIR05Samodzielnie przygotowany-Mr
. Mroźny pojemnik do zamrażaniaThermo Fisher Scientific Inc.
Czytnik wielofunkcyjny CLARIOstarBMG Labtech
Lokalizator zbiorników azotu 6 plusThermo Fisher Scientific Inc.
OligomycynaSigma-AldrichO4876
SzczawiooctanSigma-Aldrich-Oxygraph-2k
Orobororus Instrumenty
Penicylina-StreptomycynaPAA15140122
Pipety Wydajność Pipetor 10 μ L, 100 μ L, 1000 μ LVWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)Gibco (Thermo Scientific)11530586
RotenonSigma-AldrichR8875
SacharozaCarl ROTH GmbH & Co. KG9286.2
Azydek soduSigma-AldrichS2002
BursztynianSigma-AldrichS2378
Tetrametylofenylendiamina (TMPD)Sigma-AldrichT3134
Opaska uciskowa / Mankiet
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-Aldrich108382
Triton X-100Sigma-Aldrich108643
TrypanblauBiochromT6146
Pompa próżniowaVaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
Kąpiel wodna WNB22Memmert GmbH & Co. KG
przygotowany-Acetylo-CoA do dezynfekcji10110051do pomiaru ciśnienia krwi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34(2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949(2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236(2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309(2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229(2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985(2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30(2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kriokonserwacja PBMCbioenergetyka mitochondrialnafosforylacja oksydacyjnaizolacja limfocyt wywotno kom rekprzetwarzanie pr bek krwiaktywno a cucha oddechowegoautomatyczny licznik kom rekkriokonserwacja z DMSO

Powiązane artykuły