Artykuł metodologiczny

Śledzenie rozsiewu komórek nowotworowych z przerzutów do płuc za pomocą fotokonwersji

DOI:

10.3791/65732

⸱

7 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę badania redystrybucji komórek nowotworowych z przerzutów do płuc z wykorzystaniem protokołu chirurgicznego selektywnej fotokonwersji przerzutów do płuc, a następnie identyfikacji zaczerwienionych komórek nowotworowych w narządach trzeciego rzędu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty - ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się raka - są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Chociaż przerzuty są powszechnie uważane za jednokierunkowy proces, w którym komórki z guza pierwotnego rozprzestrzeniają się i zasiewają przerzuty, komórki nowotworowe w istniejących przerzutach mogą również ponowniesię rozprzestrzeniać i powodować nowe zmiany w miejscach trzeciorzędowych w procesie znanym jako "przerzuty z przerzutów" lub "wysiewanie przerzutów do przerzutów". Wysiewanie przerzutów do przerzutów może zwiększyć obciążenie przerzutami i obniżyć jakość życia i przeżycie pacjenta. Dlatego zrozumienie procesów stojących za tym zjawiskiem ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia strategii leczenia pacjentów z rakiem z przerzutami.

Niewiele wiadomo na temat siewu od przerzutów do przerzutów, częściowo z powodu ograniczeń logistycznych i technologicznych. Badania nad wysiewem przerzutów do przerzutów opierają się przede wszystkim na metodach sekwencjonowania, które mogą nie być praktyczne dla naukowców badających dokładny czas wysiewu przerzutów do przerzutów lub co im sprzyja lub zapobiega. Podkreśla to brak metodologii, które ułatwiałyby badanie wysiewu z przerzutów do przerzutów. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy - i opisujemy tutaj - mysi protokół chirurgiczny do selektywnej fotokonwersji przerzutów do płuc, umożliwiając specyficzne oznaczanie i śledzenie losu komórek nowotworowych zaczerwienionych z płuc do miejsc trzeciorzędowych. Według naszej wiedzy jest to jedyna metoda badania redystrybucji komórek nowotworowych i wysiewu przerzutów do przerzutów z płuc, która nie wymaga analizy genomicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem1. Rak z przerzutami powstaje, gdy komórki z guza pierwotnego rozprzestrzeniają się po całym ciele i namnażają się w klinicznie wykrywalne guzy w odległych narządach2,3.

Chociaż przerzuty są powszechnie uważane za jednokierunkowy proces, w którym komórki nowotworowe rozprzestrzeniają się z guza pierwotnego i kolonizują odległe organy4, coraz więcej dowodów klinicznych i eksperymentalnych sugeruje, że w grę wchodzi bardziej złożony, wielokierunkowy proces. Wykazano, że krążące komórki nowotworowe mogą ponownie zasiać nowotwór pierwotny (jeśli nadal jest na miejscu)5,6,7,8,9, a komórki nowotworowe z istniejących ognisk przerzutowych mogą przemieszczać się do miejsc trzeciorzędowych i powodować nowe zmiany10,11,12,13. Rzeczywiście, dowody z ostatnich analiz genomicznych sugerują, że niektóre zmiany przerzutowe powstają nie z guza pierwotnego, ale z innych przerzutów - zjawisko znane jako "przerzuty-z-przerzutów" lub "przerzuty-do-przerzutów"14,15,16. Wysiewanie przerzutów do przerzutów może utrwalić proces chorobowy nawet po usunięciu guza pierwotnego, zwiększając obciążenie przerzutami oraz obniżając jakość życia i przeżycie pacjenta. Dlatego zrozumienie procesów stojących za wysiewaniem przerzutów do przerzutów ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia strategii leczenia pacjentów z chorobą przerzutową.

Pomimo potencjalnie poważnych implikacji klinicznych, niewiele wiadomo na temat siewu od przerzutów do przerzutów, częściowo z powodu ograniczeń logistycznych i technologicznych. Badania na ludziach są ograniczone ze względu na niedostatek próbek klinicznych. Resekcja kliniczna i biopsja zmian przerzutowych są rzadkie, podobnie jak biopsja pozornie zdrowych narządów, w których mogą się pojedyncze rozsiane komórki nowotworowe. Oznacza to, że badania na ludziach są zazwyczaj możliwe tylko przy użyciu próbek autopsyjnych od osób, których pierwotne guzy są nadal na miejscu lub zostały wcześniej wycięte, ale nadal są dostępne dla badaczy. Gdy takie próbki są dostępne, należy przeprowadzić analizy progresji raka przy użyciu metod sekwencjonowania14. Jednak masowe sekwencjonowanie dopasowanych guzów pierwotnych i przerzutów nie ma czułości potrzebnej do kompleksowego śledzenia linii. Na przykład masowe sekwencjonowanie jednej zmiany może ujawnić subklon, który jest niewykrywalny w żadnej z dopasowanych zmian. W tym przypadku nie byłoby możliwe określenie pochodzenia tego subklonu. Mógł być obecny w guzie pierwotnym lub innym przerzucie z częstością poniżej granicy wykrywalności lub mógł powstać po początkowej kolonizacji zmiany przerzutowej, w której został znaleziony. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek zapewnia zwiększoną czułość, ale jego wysoki koszt ogranicza zastosowanie tej techniki na dużą skalę. Retrospektywny charakter tych badań oznacza również, że dostarczają one ograniczonego wglądu w przejściowe zdarzenia przerzutowe i krajobraz choroby w różnych punktach czasowych.

W modelach zwierzęcych, najnowsze osiągnięcia technologiczne pozwalają teraz na prospektywne mapowanie filogenetyczne z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową17,18,19,20. Techniki te wykorzystują edycję genomu CRISPR/Cas9 do inżynierii komórek za pomocą ewoluującego kodu kreskowego - dziedzicznych mutacji, które kumulują się z czasem. Po sekwencjonowaniu można prześledzić pochodzenie każdej komórki na podstawie profilu mutacji jej kodu kreskowego17,18,19,20. Rzeczywiście, taka technologia jest już wykorzystywana do mapowania wysiewu przerzutów do przerzutów. W niedawnym artykule Zhang i wsp. wykazali, że komórki raka piersi i prostaty w przerzutach do kości redystrybuują się z kości do nasion wtórnych przerzutów w wielu narządach21.

Chociaż te nowatorskie metody mają ogromny potencjał do generowania szczegółowych, wysokorozdzielczych map filogenetycznych progresji raka, są one wysoce niepraktyczne dla osób badających dokładny czas wysiewu przerzutów do przerzutów oraz co je promuje lub zapobiega. Wypełnienie tych luk w wiedzy ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia naszej wiedzy i leczenia raka z przerzutami, ale zauważalny jest brak technologii ułatwiających takie badania. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy niedawno - i prezentujemy tutaj - nową technikę, która pozwala nam specyficznie oznaczać komórki nowotworowe poprzez fotokonwersję w miejscu przerzutów (płuca), a następnie ponownie identyfikować je w narządach trzeciego rzędu. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy niedawno, że komórki raka piersi redystrybuują się z przerzutów do płuc i nasienia narządów trzeciorzędowych13. Technika ta może być również wykorzystana do określenia czasu zdarzeń redystrybucji w wąskim oknie i ilościowego określenia zaczerwienionych komórek nowotworowych, ułatwiając badanie organotropizmu komórek zaczerwienionych i tego, co promuje/zapobiega redystrybucji.

Podczas gdy fotokonwersja i lokalnie indukowane systemy cre/lox, które trwale zastępują jedno białko fluorescencyjne innym, były wcześniej używane do oznaczania i śledzenia komórek nowotworowych11,22,23, o ile nam wiadomo, żadne podejście do czasoprzestrzennego oznaczania komórek nowotworowych nie zostało zoptymalizowane pod kątem celowania w płuca - jedno z najczęstszych miejsc przerzutów wśród mężczyzn i kobiet, u których zdiagnozowano jakiekolwiek z 14 najczęstszych nowotworów24. Każdy typ komórek rakowych i dowolny protokół generowania przerzutów do płuc może być stosowany w naszej procedurze, co czyni ją szeroko przydatną dla badaczy przerzutów. Wszystkie komórki rakowe wykorzystywane do generowania przerzutów do płuc powinny wyrażać białko fotokonwertowalne lub fotoprzełączalne, a naukowcy mogą wybrać, które białko użyć w oparciu o swoje specyficzne potrzeby i zasoby. W tym badaniu użyliśmy komórek raka piersi 6DT1, które stabilnie wyrażały fotokonwertowalne białko fluorescencyjne zielono-czerwone Dendra2 (komórki 6DT1-Dendra2)25 oznaczone histonem H2B. Wstrzyknęliśmy 5,0 × 104 komórki 6DT1-Dendra2 do czwartej poduszeczki tłuszczowej sutka samic myszy Rag2-/-. Guzy pierwotne były wyczuwalne palpacyjnie między 12 a 16 dniem po wstrzyknięciu i nie były wycinane przez cały czas trwania eksperymentu. Samoistne przerzuty do płuc rozwijały się między 19 a 26 dniem po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Operacje fotokonwersji przeprowadzono między 26 a 29 dniem po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Myszy zostały uśmiercone w ciągu 72 godzin po operacji z powodu obciążenia przerzutami do płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym z uprzednią zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Albert Einstein College of Medicine.

Przed operacją, przerzuty do płuc mają być generowane u myszy przy użyciu komórek rakowych, które wyrażają fotokonwertowalne/fotoprzełączalne białko; opublikowano kilka protokołów generowania przerzutów do płuc26,27,28.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Przygotuj odrębne obszary robocze do przygotowania myszy (usuwanie włosów i intubacja), operacji i rekonwalescencji.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie.
    UWAGA: Ponieważ w tej operacji stosuje się technikę opartą tylko na końcówkach, do ponownej sterylizacji narzędzi do kolejnych zabiegów można użyć sterylizatora gorących kulek.
  3. Włącz podgrzewaną platformę chirurgiczną i pozwól jej osiągnąć i ustabilizować się w temperaturze 37-40 °C.
  4. Wywołać znieczulenie 5% izofluranem, a następnie obniżyć izofluran do 3%. Testy szczypania palców u nóg należy wykonywać okresowo przez cały czas trwania zabiegu, aby ocenić adekwatność znieczulenia.
  5. Umieść znieczuloną mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowa. Usuń włosy z lewej górnej części klatki piersiowej/bocznej części ciała (patrz Rysunek 1A), nakładając krem do depilacji na ten obszar. Zwilż kawałek gazy lub ręcznika papierowego wodą i wytrzyj włosy oraz krem do depilacji. Powtarzaj w razie potrzeby, aż wszystkie włosy zostaną usunięte z pola operacyjnego.
    UWAGA: Nie pozostawiaj kremu do depilacji na myszy dłużej niż 20 sekund, ponieważ może to uszkodzić skórę.
  6. Zawiąż podwójny węzeł ~ 3 mm powyżej podstawy cewnika 22 G za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Zostaw ogony o długości 2 cali.
  7. Zaintubuj mysz za pomocą tego cewnika, jak opisano wcześniej29,30. Aby potwierdzić pomyślną intubację, przymocuj bańkę do napełniania na końcu cewnika i delikatnie ściśnij.
    UWAGA: Myszy, które zostały pomyślnie zaintubowane, doświadczą obustronnego unoszenia klatki piersiowej przy ściśnięciu opuszki.
  8. Mocno zamocuj jedwabny szew 2-0 wokół pyska myszy podwójnym węzłem, aby utrzymać cewnik intubacyjny na miejscu.

2. Operacja odsłonięcia płuc

UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy operacji (Rysunek 1), w tym fotokonwersję, w kapturze lub komorze laminarnej, aby uniknąć zanieczyszczenia pola operacyjnego.

  1. Umyj ręce mydłem antyseptycznym i załóż nowe sterylne rękawiczki.
    UWAGA: Ponieważ w tej operacji stosuje się technikę opartą wyłącznie na końcówkach, można również używać rękawiczek niesterylnych. Zaleca się odkażanie niesterylnych rękawiczek środkiem dezynfekującym na bazie alkoholu.
  2. Przygotować dawkę 0,1 mg/kg buprenorfiny (0,03 mg/ml) i wstrzyknąć podskórnie w celu znieczulenia.
    UWAGA: Multimodalna analgezja, w tym miejscowe blokery bólu i niesteroidowe leki przeciwzapalne, powinny być stosowane w połączeniu z buprenorfiną, jeśli nie oczekuje się, że będą one ingerować w biologię będącą przedmiotem zainteresowania.
  3. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
  4. Umieść mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej na podgrzewanej platformie chirurgicznej.
  5. Podłączyć respirator do cewnika intubacyjnego. Należy uważać, aby cewnik trzymał się stabilnie, ponieważ nawet niewielkie ruchy mogą zakłócić umieszczenie cewnika i prowadzić do słabej wentylacji.
  6. Obserwuj stabilne, kontrolowane przez respirator, obustronne unoszenie i opadanie klatki piersiowej.
  7. Przymocuj kończyny do platformy operacyjnej za pomocą taśmy do etykietowania. Ustabilizuj pole operacyjne, umieszczając kolejny kawałek taśmy wzdłuż grzbietu myszy i mocując skórę grzbietową i sierść do platformy chirurgicznej (Rysunek 1A).
  8. Otwórz wysterylizowane narzędzia chirurgiczne.
  9. Nałóż roztwór chlorheksydyny na skórę myszy, aby wysterylizować miejsce operowane.
  10. Zidentyfikuj obszar ~7 mm na lewo od mostka i ~7 mm powyżej brzegu podżebrowego. Podnieś skórę nad tym obszarem za pomocą kleszczy i wykonaj okrągłe nacięcie ~10 mm za pomocą ostrych nożyczek do mikropreparowania, uważając, aby przeciąć tylko skórę.
  11. Usuń tkankę miękką z klatki piersiowej (Rysunek 1B). Kauteryzuj wszystkie główne naczynia na obu końcach za pomocą pisaka do kauteryzacji.
    UWAGA: Oprócz wycięcia całej tkanki miękkiej znajdującej się pod 10-milimetrowym okrągłym nacięciem w skórze, usunięcie dodatkowej niemięśniowej tkanki miękkiej z obwodu ułatwia przyszłe etapy zabiegu.
  12. Jedną ręką użyj kleszczy, aby podnieść 6. lub 7. żebro. Drugą ręką użyj pojedynczego ostrza nożyczek do mikropreparowania - ustawionego pod kątem równoległym do ściany klatki piersiowej, zaokrągloną krawędzią skierowaną w dół - i ostrożnie przebij 6. lub 7. mięsień międzyżebrowy, aby wejść do jamy klatki piersiowej (Rysunek 1C). W razie potrzeby delikatnie obróć nożyczki i wytnij, aby wykonać nacięcie ~10 mm w przestrzeni międzyżebrowej, uważając, aby nie dotknąć tkanki płucnej i nie przeciąć żeber.
  13. Delikatnie odprowadź sprężone powietrze w kierunku nacięcia międzyżebrowego, aby zwiększyć przestrzeń między płucami a ścianą klatki piersiowej. Wypuść powietrze najpierw na nadgarstek lub dłoń, aby znaleźć odpowiednią siłę przepływu i oczyść dyszę z wszelkich zanieczyszczeń, a następnie w krótkich seriach w miejscu nacięcia, aby zapobiec uszkodzeniu płuc.
  14. Jedną ręką użyj kleszczy, aby podnieść 6. lub 7. żebro. Drugą ręką przytrzymaj zwijacz zamknięty i włóż go do nacięcia międzyżebrowego. Ustaw ostrza zwijacza tak, aby były równoległe do ściany klatki piersiowej, uważając, aby nie dotykać samego płuca (Rysunek 1D).
  15. Gdy zwijacz znajdzie się na miejscu, powoli zwolnij uchwyt, pozwalając zwijaczowi otworzyć się i odsłonić płuco (Rysunek 1E). Rysunek 2A pokazuje reprezentatywne obrazy odsłoniętych przerzutów do płuc przed fotokonwersją, w tym jak wyglądają gołym okiem, oraz w kanałach fluorescencyjnych FITC (zielony, niefotokonwertowany) i TRITC (czerwony, fotokonwertowany) podczas korzystania z oświetlenia szerokokątnego.

3. Fotokonwersja przerzutów do płuc

UWAGA: Szczegóły i warianty następujących kroków można znaleźć w Dyskusji.

  1. Delikatnie nanieść 2-3 krople sterylnego PBS ogrzanego do 37 °C na odsłoniętą tkankę płucną, aby zapobiec wysuszeniu.
  2. Umieść kawałek sterylnej folii aluminiowej z małym wycięciem na myszy. Umieść wycięcie bezpośrednio nad odsłoniętą tkanką płucną i dopasuj je tak, aby odsłonić tylko otwartą część klatki piersiowej i kilka milimetrów otaczającej tkanki miękkiej i skóry, aby zapewnić fotokonwersję tylko odsłoniętego płuca.
  3. Umieść pudełko z wycięciem na myszy i folii aluminiowej. Upewnij się, że wycięcie znajduje się bezpośrednio nad odsłoniętym płucem.
  4. Umieść lampę fotokonwersyjną bezpośrednio nad wycięciem na pudełku (Rysunek 1F).
  5. Włącz lampę fotokonwersyjną i pozwól na 6 minut ciągłego oświetlenia odsłoniętej tkanki płucnej.
    UWAGA: Monitoruj parametry życiowe myszy za pomocą programów monitorowania fizjologicznego na respiratorze.
  6. Po fotokonwersji wyłącz lampę i zdejmij lampę, pudełko i maskę z folii aluminiowej z myszy.

4. Procedura zamykania ściany klatki piersiowej

  1. Powtórz krok 2.13, aby oddzielić płuco od ściany klatki piersiowej.
  2. Ostrożnie chwyć uchwyt zwijacza i ściśnij, aby zamknąć ostrza.
  3. Wymanewruj zamknięty retraktor z przestrzeni międzyżebrowej, uważając, aby nie dotknąć tkanki płucnej.
  4. Używając jedwabnego szwu 5-0, zamknij nacięcie międzyżebrowe prostym ciągłym wzorem szwu, który obejmuje żebro po obu stronach nacięcia (Ryc. 1G). Mocno naciągnąć szew, aby upewnić się, że krawędzie rany są apozycyjne i przywrócić integralność ściany klatki piersiowej (Rysunek 1H). Uważaj, aby nie zacisnąć szwu zbyt mocno, ponieważ może to spowodować rozerwanie mięśni międzyżebrowych.
  5. Zabezpiecz szew, zawiązując ze sobą dwa końce szwu 4x. Przytnij ogony szwu jak najbliżej węzła.
  6. Zamknij skórę zszywkami chirurgicznymi.
  7. Usunąć nadmiar powietrza z klatki piersiowej za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 28 G. Zlokalizuj wyrostek mieczykowaty dotykowo i włóż igłę tuż poniżej, przesuwając się w kierunku lewego ramienia, aby wejść do jamy klatki piersiowej przez przeponę. Cofnąć strzykawkę do ~1 ml; Wyjmij igłę z myszy i spuść powietrze ze strzykawki. Powtórz ten proces 3-4x.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przebić żadnych narządów wewnętrznych. Ponadto ważne jest, aby użyć strzykawki o pojemności 1 ml i powtórzyć procedurę 3-4 razy, zamiast używać strzykawki o większej objętości i próbować usunąć całe powietrze na raz. Użycie strzykawki o większej objętości może spowodować zbyt duże podciśnienie w klatce piersiowej i doprowadzić do rozdęcia i uszkodzenia tkanki płucnej.
  8. Wyłącz izofluran.
  9. Kontynuuj wentylację 100% tlenem, aż mysz wykaże oznaki przebudzenia.
  10. Gdy mysz wykaże oznaki przebudzenia, odłącz cewnik intubacyjny od respiratora, przetnij szew wokół pyska i ekstubuj mysz.
  11. Odklej mysz i przenieś ją do czystej klatki umieszczonej ~ 2 stopy poniżej lampy grzewczej. Monitoruj aż do całkowitego wyzdrowienia. Jeśli mysz wykazuje oznaki trudności w oddychaniu lub braku mobilności, znieczul ją 5% izofluranem przez 5 minut, zapewnij odpowiednie znieczulenie, obserwując utratę odruchów po uszczypnięciu palca u nogi i poddaj eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  12. Gdy mysz całkowicie wybudzi się ze znieczulenia i zacznie się poruszać, przygotuj kolejną dawkę 0,1 mg/kg buprenorfiny i wstrzyknij ją podskórnie w celu znieczulenia pooperacyjnego.
  13. Po operacji upewnij się, że myszy są trzymane indywidualnie. Podać antybiotyki do wody pitnej (enrofloksacyna, końcowe stężenie 0,4 mg/ml).
  14. W ciągu 3 dni po operacji sprawdzaj mysz dwa razy dziennie pod kątem oznak niepokoju. W celu leczenia bólu należy podawać 0,1 mg/kg buprenorfiny (0,03 mg/ml) podskórnie co 4-6 godzin. Poddaj mysz eutanazji, jeśli wykazuje oznaki infekcji, unieruchomienia lub trudności w oddychaniu. Po trzecim dniu myszy można badać raz dziennie.

5. Przetwarzanie próbek i wykrywanie fotokonwertowanych komórek za pomocą oczyszczania tkanek

  1. Między 3 a 5 dniami (lub pożądanym czasem) po operacji fotokonwersji znieczulij mysz 5% izofluranem, zmniejsz izofluran z 5% do 2,5% po indukcji, zapewnij odpowiednie znieczulenie, obserwując utratę odruchów po uszczypnięciu palca u nogi i wykonaj końcową perfuzję przezsercową za pomocą 10 ml PBS o temperaturze pokojowej, a następnie 10 ml 4% paraformaldehydu schłodzonego do 4 °C, jak opisano wcześniej31.
  2. Zbierz interesujące Cię organy i oczyść je optycznie zgodnie z wcześniejszym opisem31.
  3. Zobrazuj oczyszczone tkanki za pomocą mikroskopu z arkuszem światła, jak opisano wcześniej31. Alternatywnie, umieść oczyszczone tkanki w naczyniu ze szklanym dnem i zobrazuj w kanałach FITC i TRITC, aby uwidocznić zielone (niefotokonwertowane) i czerwone (fotokonwertowane) komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego, wirującego dysku lub wielofotonowego.

6. Przetwarzanie próbek i wykrywanie fotoprzekształconych komórek za pomocą dezagregacji tkanek

  1. Znieczulić mysz 5% izofluranem przez 5 minut, zapewnić odpowiednie znieczulenie, obserwując utratę odruchów po uszczypnięciu palca u nogi i poświęcić przez zwichnięcie szyjki macicy 3-5 dni po fotokonwersji.
  2. Zbierz i przetraw interesujące nas narządy, jak opisano wcześniej13.
  3. Umieść strawione tkanki na płytkach i umieść je w inkubatorze, aby przylegały przez noc, jak opisano wcześniej13.
  4. Następnego dnia zobrazuj platerowane komórki w kanałach FITC i TRITC, aby zobrazować zielone (niefotokonwertowane) i czerwone (fotokonwertowane) komórki, jak opisano wcześniej13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etapy operacji opisane w tym protokole są zilustrowane w Rysunek 1. Krótko mówiąc, mysz jest znieczulana, a włosy są usuwane z lewej klatki piersiowej. Mysz jest następnie intubowana i wentylowana, co pozwala myszy na otrzymywanie tlenu, gdy klatka piersiowa jest otwarta. Tkanka miękka jest usuwana w celu odsłonięcia klatki piersiowej i wykonuje się nacięcie w6 lub 7 mięśniu międzyżebrowym. Retraktor jest wprowadzany do wyłomu międzyżebrowego i uwalniany w celu rozciągn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisano protokół chirurgiczny selektywnej fotokonwersji komórek nowotworowych w płucach. Technika ta umożliwia naukowcom selektywne oznaczanie komórek nowotworowych w płucach i śledzenie ich losu poprzez ich ponowną identyfikację w całym ciele w późniejszym czasie, ułatwiając badanie przerzutów z przerzutów do płuc. Korzystając z tego protokołu, możliwe było uwidocznienie fotokonwertowanych komórek w mózgu, wątrobie i niefotokonwertowanym prawym płucu myszy, które przeszły operację z fotokonwersją, co ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Wade'owi Kobie za pomoc w mikrotomografii komputerowej (S10RR029545), Verze DesMarais i Hillary Guzik z Analytical Imaging Facility za ich szkolenie i pomoc w mikroskopii, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, stypendium podoktorskie Sir Henry'ego Wellcome'a (221647/Z/20/Z) oraz nagrodę METAvivor Career Development Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zasilacz 0-30 V, 0-3 AMPJA9616 PS
12 VDC, 1,2 A Nieregulowany zasilacz wtykowyMPJA17563 PD
28 G 1 mL BD Strzykawka insulinowaBD329410
400 nm lampa z diodami elektroluminescencyjnymiLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Lampa do fotokonwersji, zbudowana na zamówienie (poszczególne części znajdują się poniżej)
Pleciony jedwabny szew 5-0 z igłą tnącą RB-1Ethicon, Inc.774B
9 cm jedwabny krawat 2-0Ethicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (enrofloksacyna)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntybiotyk stosowany w wodzie pitnej
BuprenorfinaHospira0409-2012-32przeciwbólowe
(wiązki kablowe) 2.5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
Roztwór chlorheksydynyDurvet7-45801-10258-3Chlorheksydyna Roztwór dezynfekujący
Kanister ze sprężonym powietrzemFalconDPSJB-12
Extra Fine Micro Nożyczki preparacyjne 4" Proste Ostre/Ostre 24 mmRoboz ChirurgiczneRS-5912Ostre mikro nożyczki preparacyjne
Oświetlacz światłowodowyO.C. White CompanyFL3000Używany podczas intubacji myszy
Zestaw do kauteryzacji GeminiAparat Harvarda726067Długopis do kauteryzacji
Germinator 500CellPoint ScientificGER  5287-120VSterylizator koralików
Kleszcze GraefeRobozRS-5135
Diody LED dużej mocy - jednokolorowe ultrafioletowe 90 watówMouserLZP-D0UA00
Lampa grzewcza na podczerwieńBraintree ScientificHL-1
Izofluran SOL 250 mL PVLCovetrus29405Waporyzator znieczulający
izofluranemSurgiVetVCT302
Uchwyt na igłę Jacobson z zamkiemKalson SurgicalT1-140
Taśma do etykietowaniaFisher ScientificS68702
Reflektory oświetleniowe LED CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PINMouser928-C11395TM
Długie aplikatory z bawełnianą końcówkąMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4 / Celeron do 3,4 GHz / Łożysko kulkowe / Rdzeń miedziany / Wentylator chłodzący procesorCompUSA#S457-1023
Mikronożyczki preparacyjne 4" Proste /Roboz ChirurgiczneRS-5980mikro nożyczki preparacyjne
Respirator mysiKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair Emulsja do depilacjiAmazonB001RVMR7KKrem do depilacji
Personnet mini retraktorRobozRS-6504Retraktor
Fosforan buforowany solą fizjologiczną 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005lentiwirus Dendra2
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Smar do oczu
Stanowisko do intubacji gryzoniBraintree ScientificRIS 100
Żarówka do napełniania płuc dla małych zwierzątAparat Harvarda72-9083
Wielofunkcyjna platforma chirurgiczna SurgiSuite dla myszy, z ociepleniemKent ScientificSURGI-M02Podgrzewana platforma chirurgiczna
Przewody pomiarowe 48" PRZEWÓD POMIAROWY BANAN -Przewody pomiarowe Mouser565-1440-48-0
48" PRZEWÓD POMIAROWY BANAN - CzerwonyMouser565-1440-48-2
Cewnik dotchawiczy Cewnik Exelint International2674622 G
System zamykania ran zestaw weterynaryjnyClay AdamsIN015Weterynaryjny zestaw do zszywania chirurgicznego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  5. Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).
  6. Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
  7. Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  8. Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
  9. Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
  10. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  11. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  12. Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).
  13. Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).
  14. Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
  15. Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
  16. Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944(2017).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804(2018).
  19. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907(2016).
  20. Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499(2017).
  21. Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
  22. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  23. Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
  24. Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
  25. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  26. Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  27. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
  28. Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
  29. Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  30. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  31. Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419(2022).
  32. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  33. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  34. Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
  35. Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
  36. Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
  37. Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
  38. Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
  39. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
  40. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
  41. Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
  42. Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
  43. Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154(2020).
  44. Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przerzuty do p uczasiew przerzutowytechnika fotokonwersjiledzenie kom rek nowotworowychnowotw r z przerzutamiznakowanie Dendra2obrazowanie in vivoprotok chirurgicznyekspozycja na wiat o niebieskie

Powiązane artykuły