Artykuł metodologiczny

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65738

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Keenan Research Centre for Biomedical Science of St. Michael’s Hospital, 3Sickkids Research Institute, The Hospital for Sick Children, 4BARLO MS Centre, St. Michael’s Hospital, 5Women’s College Research Institute, Women’s College Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Streszczenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest powszechnym modelem immunologicznym stwardnienia rozsianego (MS). Choroba ta może być wywołana u gryzoni przez aktywne uodparnianie składnikami białkowymi osłonki mielinowej i kompletnego adiuwanta Freunda (CFA) lub przez transfer komórek efektorowych T specyficznych dla mieliny od gryzoni zaszczepionych białkiem mieliny/CFA do gryzoni wcześniej nieleczonych. Nasilenie EAE jest zwykle oceniane na 5-punktowej skali klinicznej, która mierzy stopień paraliżu wstępującego, ale skala ta nie jest optymalna do oceny stopnia wyzdrowienia z EAE. Na przykład wyniki kliniczne pozostają wysokie w niektórych modelach EAE (np. model EAE indukowany peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny [MOG]) pomimo ustąpienia stanu zapalnego. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić ocenę kliniczną o ocenę histologiczną EAE, która zapewnia również środki do badania mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).

Tutaj przedstawiono prosty protokół do przygotowania i barwienia rdzenia kręgowego i odcinków mózgu myszy oraz do oceny stanu zapalnego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w rdzeniu kręgowym. Metoda oceny nacieku leukocytów w rdzeniu kręgowym może być również stosowana do oceny stanu zapalnego mózgu w EAE. Opisano również protokół pomiaru rozpuszczalnego światła neurofilamentu (sNF-L) w surowicy myszy za pomocą testu drobnocząsteczkowego (SIMOA), który dostarcza informacji zwrotnych na temat zakresu ogólnego uszkodzenia OUN u żywych myszy.

Wprowadzenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najczęstszym mysim modelem ludzkiej choroby demielinizacyjnej, stwardnienia rozsianego (MS)1. Klasyczna patologia zapalna SM, w tym naciekanie IFN-γ (gamma) i limfocytów pomocniczych T wytwarzających IL-172, naciek zapalnych monocytów3, powstawanie okołonaczyniowych i podoponowych zapalnych zmian demielinizacyjnych4, oraz występowanie uszkodzenia aksonów4 w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), obserwuje się również w EAE5,6,7,8,9. Podobieństwo w mechanizmach immunologicznych między EAE i SM sprawiło, że EAE jest odpowiednim modelem przedklinicznym do testowania skuteczności i mechanizmów działania wielu zatwierdzonych terapii immunologicznych SM, w tym natalizumabu, fingolimodu, fumaranu dimetylu i octanu glatirameru (recenzja w1,5). Niektóre schematy EAE modelują inne aspekty postępującej patologii stwardnienia rozsianego poza uszkodzeniem aksonów, w tym rozwój zapalenia podoponowego w mózgu, przewlekłą demielinizację, zanik rdzenia kręgowego, synapsę i utratę neuronów6,10,11,12. W związku z tym EAE ma zastosowanie do badań przesiewowych skuteczności terapii neuroprotekcyjnych w SM.

EAE jest indukowane u gryzoni na wiele sposobów. Aktywna immunizacja jest najpowszechniejszą metodą indukcji i polega na immunizacji gryzoni antygenami mielinowymi (całymi białkami lub peptydami) zemulgowanymi w CFA uzupełnionymi zabitymi termicznie Mycobacterium tuberculosis13. W zależności od szczepu myszy, toksyna krztuścowa (PTX) jest również podawana w 0 i 2 dniu szczepienia w celu zwiększenia penetracji choroby13. EAE może być również indukowany przez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla mieliny uzyskanych od myszy z rdzeniem mielinowym/CFA do zdrowych myszy14 lub może rozwijać się spontanicznie u myszy z nadekspresją receptorów limfocytów T specyficznych dla głównych antygenów mielinowych5.

nasilenie i postęp choroby EAE są zwykle oceniane za pomocą dyskretnej 5-punktowej skali klinicznej: 1 – wiotkość ogona, 2 – osłabienie kończyn tylnych lub stóp, 3 – całkowity paraliż jednej lub obu kończyn tylnych, 4 – osłabienie kończyn przednich, 5 – konające lub martwe13. Ten kliniczny system punktacji jest solidny w dokumentowaniu postępu paraliżu wstępującego, który występuje na początku choroby, ale jest mniej czuły w uchwyceniu zakresu powrotu do zdrowia po atakach zapalnych OUN. Na przykład zarówno myszy, które poruszają się z trudnościami, jak i myszy, które poruszają się łatwo, ale wykazują słabość chwytania stóp, otrzymują wynik 2 w skali EAE. Wyniki mogą pozostać wysokie w fazie poostrej EAE ze względu na obecność trwałego uszkodzenia lub utraty aksonów, nawet pomimo ustąpienia odpowiedzi zapalnej9. Podjęto wiele prób opracowania bardziej wyrafinowanych systemów punktacji, testów behawioralnych, pomiarów siły kończyn tylnych i siły chwytu oraz systemów monitorowania w podczerwieni, aby lepiej uchwycić różnice w deficytach klinicznych w EAE9,16,17,18; Jednak te bardziej skomplikowane pomiary punktacji nie rozróżniają udziału stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek w leżących u podstaw deficytów neurologicznych. W związku z tym złotym standardem podejścia do oceny nasilenia EAE jest przeprowadzenie zarówno oceny klinicznej, jak i histologicznej.

Tutaj opisany jest protokół dotyczący preparowania i osadzania próbek rdzenia kręgowego i mózgu myszy w parafinie w sposób, który oddaje stochastyczny proces powstawania zmian, który występuje w EAE. Przedstawiono również protokół barwienia skrawków za pomocą Luxol fast blue (LFB), pierwotnie stworzonego przez Kluvera i Barrera19, który wykrywa mielinę w OUN. Skrawki są albo barwione samym LFB (do analizy demielinizacji), albo są barwione przeciwwagowo hematoksyliną i eozyną (H&E), aby pomóc w wizualizacji i ocenie zmian zapalnych. Dostarczono również protokoły do ilościowego określenia obecności całkowitej liczby leukocytów (CD45), utraty mieliny i liczby uszkodzonych aksonów (SMI-32) w rdzeniu kręgowym przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał, technik immunohistochemicznych (IHC) i publicznie dostępnego oprogramowania. Protokół stosowany do ilościowego oznaczania leukocytów w rdzeniu kręgowym może być również stosowany do ilościowego oznaczania leukocytów w mózgu.

Ocena histologiczna utraty i uszkodzenia aksonów w mózgu jest stosunkowo trudniejsza niż w rdzeniu kręgowym, ponieważ drogi istoty białej mózgu nie biegną równolegle do siebie. Pomiar światła neurofilamentów w surowicy (sNF-L) okazał się obiecującym biomarkerem uszkodzenia neuronów w MS20,21. Ostatnie badania rozszerzyły tę technologię na EAE22,23,24. W tym miejscu przedstawiono metodę pomiaru światła neurofilamentów w surowicy (sNF-L) u żywych myszy za pomocą testu drobnocząsteczkowego (SIMOA). Ta metoda wymaga tylko niewielkiej ilości surowicy i można ją wykonać na żywych myszach w ciągu zaledwie pół dnia, zapewniając szybką informację zwrotną na temat tego, jak testowana terapia wpływa na ogólne uszkodzenie OUN. Wszystkie opisane tutaj metody można zastosować do myszy dowolnej płci lub szczepu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami użytkowania zwierząt zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Unity Health w Toronto, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Upewnij się, że podczas zabiegów laboratoryjnych nosisz fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i okulary.

1. Pobieranie i naprawianie mózgu i rdzenia kręgowego

  1. Poddać mysz eutanazji zgodnie z polityką instytucjonalną. Połóż mysz na brzuchu na stole sekcyjnym i odetnij głowę nożyczkami chirurgicznymi (tnąc w dół).
  2. Za pomocą kleszczyków Adson (w ręce niedominującej) chwyć skórę na czubku głowy myszy. Następnie wykonaj 2,5 cm nacięcie w skórze na czubku głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  3. Użyj palców, aby popchnąć skórę na głowie na boki, aby uwidocznić leżącą pod spodem czaszkę.
  4. Ustabilizuj głowę myszy, chwytając oczodoły standardowymi kleszczami Adson.
  5. Używając cienkich nożyczek (ręka dominująca), wykonaj małe nacięcia w czaszce wzdłuż linii środkowej od kręgosłupa szyjnego do opuszki węchowej.
    UWAGA: Umieść tylko kilka milimetrów końcówek nożyczek pod czaszką na raz, aby uniknąć uszkodzenia leżącego pod spodem mózgu.
  6. Użyj kleszczy Adson z zębami, aby odbić czaszkę na boki, aby odsłonić leżący pod spodem mózg.
  7. Trzymaj głowę ręką niedominującą. Trzymając nożyczki zamknięte (ręka dominująca), zgarnij rdzeń kręgowy z kręgosłupa szyjnego i delikatnie wypchnij mózg z czaszki, przecinając nerwy czaszkowe.
  8. Umieść mózg w stożkowej probówce zawierającej 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny, która jest oznaczona identyfikatorem zwierzęcia.
  9. Naciąć futro wzdłuż linii środkowej tułowia myszy od szyi do ogona.
  10. Użyj palców, aby popchnąć skórę na boki, aby uwidocznić kręgosłup.
  11. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć w dół kręgosłup na poziomie, na którym kości udowe przyczepiają się do biodra.
  12. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć ścianę ciała po każdej stronie kręgosłupa od biodra do szyi. Przytnij wszelkie przyczepione narządy.
  13. Umieść kręgosłup zawierający rdzeń kręgowy w tej samej probówce z formaliną, która zawiera mózg. Pozwól mózgowi i kręgosłupowi się utrwalić przez 5-7 dni.
    UWAGA: Czas mocowania jest ważny. Niektóre przeciwciała nie będą działać, jeśli tkanka jest nadmiernie utrwalona. Jeśli tkanka jest niedostatecznie ustabilizowana, trudno jest wyciągnąć rdzeń kręgowy z kręgosłupa w kroku 2.

2. Przetwarzanie rdzenia kręgowego i mózgu

UWAGA: Następujące kroki odbywają się w dygestorium. Przed rozpoczęciem należy przygotować czyste szalki Petriego o wymiarach 2 x 10 cm, kolbę Erlenmeyera wyposażoną w lejek wyłożony bibułą filtracyjną, dwa skalpele (jeden do cięcia kości i jeden do cięcia tkanek OUN), bibułę do soczewek, ołówek, kasety do zatapiania oraz słoiki na próbki wstępnie napełnione 10% formaliną.

  1. Za pomocą nożyczek wytnij mały kawałek papieru do soczewek (o tej samej szerokości, ale dwukrotnie większej długości niż kaseta) i umieść go na jednej szalce Petriego.
  2. Oznacz plastikową kasetę identyfikatorem próbki za pomocą ołówka.
  3. Wlej rurkę zawierającą nieruchomy mózg i kręgosłup do lejka. Przenieś kręgosłup i mózg na pustą szalkę Petriego.
    UWAGA: Zużyta formalina przefiltruje się do kolby Erlenmeyera i może być ponownie użyta w kroku 2.13.
  4. Grubo podziel mózg na sześć koronalnych części za pomocą skalpela. Wykonaj jedno cięcie ogonowe do móżdżku, jedno w środku móżdżku, jedno tylko rostralne do móżdżku i dwa nacięcia w pozostałym rostralnym mózgu, tworząc 3 dodatkowe plasterki koronalne o równej grubości.
  5. Za pomocą kleszczy przenieś próbki mózgu na połowę papieru do soczewek na szalce Petriego.
  6. Przetnij rdzeń kręgowy na trzy części za pomocą skalpela: pierwsze cięcie wykonuje się na dole klatki piersiowej, a drugie tuż poniżej krzywizny w odcinku szyjnym kręgosłupa.
  7. Za pomocą tego samego skalpela przyciąć część kręgosłupa krzyżowego na końcu ogonowym, aż będzie można uwidocznić rdzeń kręgowy.
  8. Podnieś kręgosłup piersiowy (ręka niedominująca). Trzymaj kleszcze Adson z mocno zamkniętymi zębami (ręka dominująca) i delikatnie wepchnij koniec kleszczy w mniejszy otwór kręgosłupa delikatnym ruchem skręcającym. Sznur powinien wychodzić z drugiego końca.
    UWAGI: Każdy instrument z zaokrąglonym końcem, który jest wielkości rdzenia kręgowego, będzie działał w tym celu. Jeśli rdzeń kręgowy nie wyskakuje naturalnie, nie należy go zmuszać. Zamiast tego użyj cienkich nożyczek, aby przyciąć kości wzdłuż boku kręgosłupa i odbić je otwarte, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Alternatywnie, napraw rdzeń kręgowy i mózg na kilka dodatkowych dni w formalinie; Jednak ten sam czas wiązania powinien być stosowany do wszystkich próbek, aby uniknąć wprowadzania zmienności w barwieniu przeciwciał.
  9. Podnieś standardowe kleszcze Adson (ręka dominująca). Nadal trzymając fragment rdzenia kręgowego mniej dominującą ręką, użyj kleszczy, aby delikatnie wyciągnąć wyłoniony rdzeń z kolumny. Umieść fragment rdzenia kręgowego na szalce Petriego zawierającej papier do soczewek.
  10. Powtórz ten proces dla odcinków odcinka lędźwiowego/krzyżowego i szyjnego.
  11. Podziel trzy części rdzenia kręgowego (szyjny, piersiowy, lędźwiowy/krzyżowy) na mniejsze części przekroju poprzecznego za pomocą skalpela. Wytnij co najmniej 15 segmentów, z których każdy powinien mieć mniej niż 2 mm grubości.
    UWAGA: Upewnij się, że segmenty są krótsze niż szerokie, co ułatwi opadanie odcinków w przekroju podczas procesu osadzania w kroku 3.
  12. Ułóż kawałki rdzenia kręgowego na tej samej połowie papieru do soczewek, na którym znajdują się fragmenty mózgu. Złóż papier do soczewek, aby ułożyć na nim kawałki chusteczek i umieść go w oznaczonej kasecie.
    UWAGA: Papier do soczewek zapobiega wydostawaniu się małych kawałków tkanki z kasety podczas przetwarzania.
  13. Przenieś kasetę do słoika na próbkę zawierającego formalinę pochodzącą z recyklingu lub świeżą.
  14. Powtórz kroki 2.1–2.13 dla pozostałych próbek.
  15. Po 5-7 dniach od utrwalenia przenieść kasety z pojemnika na próbkę do pierwszej kąpieli formalinowej w automatycznym procesorze tkanek (patrz tabela materiałów). Uruchomić procesor tkanek na noc zgodnie z programem opisanym w Tabeli Uzupełniającej 1. Próbki trzyma się w ciepłym wosku parafinowym do momentu osadzenia.

3. Osadzanie i wycinanie odcinków mózgu i rdzenia kręgowego

  1. Przenieść kasety z procesora do ciepłej komory przetrzymywania stacji zatapiania parafiny (patrz Tabela materiałów).
  2. Osadź przekroje poprzeczne rdzenia kręgowego i mózgu każdej myszy w pojedynczym bloku parafiny w następujący sposób (Rysunek 1):
    1. Najpierw wlej wosk parafinowy tylko po to, aby pokryć dno formy. Za pomocą cienkich kleszczy umieść kawałki przekroju poprzecznego mózgu i rdzenia kręgowego w parafinie na dnie formy.
    2. Przenieś formę na powierzchnię chłodzącą na kilka sekund, aby zamocować kawałki mózgu i rdzenia kręgowego na miejscu. Przenieś formę z powrotem na rozgrzaną powierzchnię i napełnij ją do góry gorącą parafiną.
    3. Umieść pokrywę kasety (oznaczoną identyfikatorem próbki) na wierzchu formy. Wlej więcej parafiny na pokrywę kasety. Przenieś formę do stacji chłodzącej, aby wosk stężał (schładzać przez 30–60 min).
      UWAGA: Osadzanie odcinków rdzenia kręgowego wymaga praktyki. Aby zwiększyć sukces, używaj krótszych odcinków rdzenia kręgowego (<2 mm), ponieważ są one bardziej podatne na upadek w przekroju. Lupy chirurgiczne do oczu mogą być noszone, aby pomóc odróżnić, czy fragmenty rdzenia kręgowego są w przekroju poprzecznym.
    4. Zamontuj blok parafinowy na mikrotomie obrotowym. Przycinaj blok, aż w sekcji parafinowej pojawią się interesujące tkanki.
    5. Przeciąć 5 μM wstęg z odcinków każdego bloku i przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.
    6. Zbierz sekcje na szkiełkach i umieść je w szklanym stojaku na slajdy.
    7. Pieczemy kawałki w temperaturze 37 °C w suchym piekarniku przez noc. Chłodne szkiełka przed przystąpieniem do barwienia.

4. De-parafinizacja i ponowne uwodnienie skrawków w ramach przygotowań do barwienia

UWAGA: Kroki są wykonywane w dygestorium. Przed rozpoczęciem przygotuj kąpiele z rozpuszczalnikami. Przygotuj 5 L 1x PBS (1 L ddH2O, 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4; pH = 7,4) z 0,05% Tween-20 (PBS-T) dla wszystkich etapów prania.

  1. Odparafinować poprzez umieszczenie szkiełek w dwóch kolejnych kąpielach ksylenu lub rozpuszczalnika na bazie ksylenu lub rozpuszczalnika na bazie ksylenu na wytrząsarce na 5 minut każda, z delikatnym mieszaniem.
  2. Uwodnić tkanki, przenosząc szkiełka przez kolejne kąpiele malejącej zawartości procentowej etanolu: 2 x 100% etanolu (5 min każda), 2 x 95% etanolu (3 min każda) i 1 x 70% etanolu (3 min). Trzymaj 95% etanolu do barwienia LFB i ponownie nawodnij do 70% etanolu i utrzymuj PBS-T do immunohistochemii (IHC).

5. LFB dla mieliny z H&E

  1. Przygotować roztwór 0,1% LFB (0,2 g LFB, patrz tabela materiałów, 200 ml 95% etanolu, 0,5 ml lodowatego kwasu octowego). Wymieszać i przefiltrować do kolby Erlenmeyera. Przechowywać w ciemnej butelce do czasu użycia.
  2. Przenieś skrawki z 95% etanolu do szklanego stojaka na szkiełka, który umieszcza się w naczyniu barwiącym zawierającym LFB. Przykryj naczynie i uszczelnij folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.
  3. Inkubować sekcje w temperaturze 56 °C w piecu przez noc (maksymalnie 16 godzin).
  4. Następnego ranka przenieś szkiełka do wanny ddH2O i przytrzymaj.
  5. W międzyczasie przygotuj (1) świeży 0,05% roztwór węglanu litu (0,05 g węglanu litu, 100 ml ddH2O); (2) Roztwór eozyny Y (dodać 2 g soli eozyny do 40 ml ddH20 i mieszać do rozpuszczenia, a następnie wymieszać ze 160 ml 95% etanolu).
    1. Przygotuj następujące kąpiele: 1 x węglan litu, 3 x 70% etanol, 3 x 95% etanol, 2 x 100% etanol, 3 x ddH20. Kąpiele należy umieszczać w kolejności użycia (patrz tabela uzupełniająca 2).
  6. Postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w Tabeli Uzupełniającej 2.
  7. Po wyschnięciu szkiełek uwidocznij zmiany demielinizacyjne pod mikroskopem.

6. LFB dla mieliny bez H&E

  1. Wykonaj tę procedurę barwienia w celu analizy mieliny.
    UWAGA: Procedura jest identyczna z krokiem 5 (patrz Tabela uzupełniająca 2), ale ma skrócony przepływ pracy. Po kroku 4 kontynuuj procedurę, zaczynając od kroku 10.

7. Pobieranie antygenu i gaszenie peroksydazy w przypadku barwień immunohistochemicznych (IHC)

UWAGA: Przed rozpoczęciem przygotuj 100 ml nadtlenku wodoru w metanolu (1 część 30% roztworu nadtlenku wodoru w 9 częściach 100% metanolu, w dygestorium). Przygotować 1 l 10 mM buforu cytrynianowego z Tween-20 (2,94 g cytrynianu trisodowego, rozpuszczonego w 1 l ddH20 w zlewce na płytce mieszającej, doprowadzić pH do 6,0 i dodać 500 μl Tween-20). Przygotuj PBS-T (patrz krok 4). Wszystkie mycia wykonuje się w kąpielach PBS-T z delikatnym mieszaniem (na wytrząsarce), chyba że wskazano inaczej.

  1. Ugasić endogenną peroksydazę, umieszczając szkiełka w 3% nadtlenku wodoru w metanolu na 15 minut (w dygestorio). Umyj szkiełka dwukrotnie w PBS-T (2 minuty każda).
  2. Przenieść szkiełka do metalowego uchwytu szkiełka i umieścić w 1 l buforu cytrynianowego w szybkowarze. Uszczelnij pokrywę i dodaj gumowy korek na górze otworu wylotowego pary.
  3. Gotuj na wysokich obrotach w kuchence mikrofalowej, aż pojawi się żółta wypustka na szybkowarze, wskazująca, że osiągnięto maksymalne ciśnienie. Gotuj przez dodatkowe 5 minut pod maksymalnym ciśnieniem, a następnie wyjmij szybkowar z kuchenki mikrofalowej za pomocą rękawic ochronnych.
  4. Rozhermetyzować przez usunięcie korka. Zdjąć pokrywkę i pozostawić szkiełka do ostygnięcia w buforze cytrynianowym przez 20 minut, a następnie przejść do żądanej metody barwienia.
    UWAGA: Podczas wypuszczania pary odsuń się, ponieważ może to spowodować oparzenia.

8. Immunohistochemia CD45

UWAGA: Ta metoda IHC służy do wizualizacji infiltrujących leukocytów. Etapy blokowania awidyny/biotyny są łączone z etapami inkubacji przeciwciał blokujących i pierwotnych.

  1. Przygotować bufor blokujący (2% BSA, 2% surowica królicza w 1x PBS).
  2. Przenieś szkiełka do szklanej tacki na szkiełka i umyj dwukrotnie PBS-T (2 minuty każde). Przygotować awidynę/roztwór blokujący (4 krople/ml awidyny w 2% BSA/2% surowicy króliczej w 1 x PBS, patrz Tabela Materiałów).
  3. Osusz nadmiar PBS-T wokół tkanki za pomocą bibułki laboratoryjnej. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj okrąg wokół tkanki i umieść szkiełko w wilgotnej komorze.
  4. Nanieść roztwór awidyny/blokujący na każdą sekcję (400 μl/szkiełko).
  5. Przykryj wilgotną komorę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie przygotuj przeciwciało anty-CD45 (Tabela uzupełniająca 3) w buforze blokującym zawierającym biotynę (4 krople/ml biotyny, 2% BSA/2% surowicy króliczej w 1x PBS).
  6. Sklep roztwór blokujący z szkiełka na niestrzępiącą się chusteczkę laboratoryjną. Przetrzyj tkankę za pomocą chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar płynu.
  7. Umieść szkiełko z powrotem w wilgotnej komorze. Dodać 400 μl roztworu przeciwciała CD45 (patrz tabela materiałów) na sekcję. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w przykrytej wilgotnej komorze.
  8. Następnego dnia odcedź przeciwciało pierwotne i przemyj szkiełka 3 x w PBS-T (5 min każda).
  9. Osuszyć obszar wokół sekcji za pomocą niestrzępiącego się laboratorium, a następnie dodać 400 μl przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie 1:200 w buforze blokującym) na każdą sekcję. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. W międzyczasie przygotuj odczynnik ABC (patrz Tabela materiałów), dodając 2 krople odczynnika A do 5 ml 1x PBS i wymieszaj. Dodaj 2 krople odczynnika B do tego samego roztworu i wymieszaj (przygotuj ~30 min przed użyciem).
  11. Umyj szkiełka w 3 zmianach po 1x PBS-T (5 min każda) i umieść szkiełka w wilgotnej komorze.
  12. Dodać 400 μl odczynnika ABC do sekcji. Przykryj wilgotną komorę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Umyj szkiełka w 3 zmianach po 1x PBS-T (5 min każda). W międzyczasie należy przygotować odpowiednią ilość roztworu DAB w pokrytej folią probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
  14. Weź jeden slajd i skup się na przekroju rdzenia kręgowego pod mikroskopem. Dodaj 400 μl DAB do szkiełka i uruchom stoper laboratoryjny.
  15. Wizualizuj sekcję podczas jej rozwoju i zatrzymaj timer, gdy leukocyty są brązowe. Przenieść szkiełko do kąpieli ddH20, aby zatrzymać reakcję. Trzymaj w wodzie przez 5 minut. Ten sam czas wywoływania jest używany dla pozostałych slajdów.
    UWAGA: DAB jest czynnikiem rakotwórczym. Odpady DAB i ddH2O po DAB należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
  16. Przeciwbarwienie szkiełkuje hematoksyliną Mayera przez ~ 4-10 min (patrz tabela uzupełniająca 2). Płucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
  17. Odwodnić w 95% etanolu (1 x 3 min), a następnie w absolutnym 100% etanolu (2 x 3 min każdy).
  18. Przenosząc się do dygestoriów, przenieś szkiełka do ksylenu lub rozpuszczalnika zastępującego ksylen na 5 minut. Szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1-2 dni w dygestorium.
    UWAGA: Jeśli używasz ksylenu, używaj podwójnych rękawiczek i kleszczy do obsługi szkiełek podczas nakrywania, ponieważ jest on toksyczny i może rozpuścić rękawice.
  19. Wyczyść szkiełka za pomocą ksylenu i zeskanuj za pomocą skanera do slajdów przy 20-krotnym powiększeniu.

9. SMI-32 IHC do uszkodzenia aksonów

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje mysie przeciwciało SMI-32, które reaguje przeciwko ciężkiemu neurofilamentowi niefosforylowanemu, który może gromadzić się w uszkodzonych aksonach25. Ponieważ to przeciwciało zostało wyhodowane u myszy i wykrywa antygen myszy, zaleca się użycie zestawu Mouse on Mouse (MOM). W tej procedurze etap blokowania awidyny/biotyny jest wykonywany jako etap odrębny od inkubacji przeciwciał pierwotnych. Przed rozpoczęciem tego protokołu należy odparafinować, ponownie uwodnić, wygasić aktywność endogennej peroksydazy i przeprowadzić pobieranie antygenu zgodnie z opisem w kroku 4 i kroku 7.

  1. Umyj sekcje dwukrotnie za pomocą 2 x PBS-T (2 min każdy). Usuń nadmiar płynu wokół skrawków za pomocą chusteczki laboratoryjnej i narysuj okrąg wokół tkanek za pomocą hydrofobowego pisaka.
  2. Dodaj 400 μl buforu blokującego (2% (w/v) koziej surowicy w 1x PBS-T) z awidyną (4 krople/ml) do sekcji. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zanurz szkiełka dwukrotnie w 1x PBS-T. Dodać 400 μl buforu blokującego z biotyną (4 krople/ml) do szkiełka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Myć szkiełka w 1 x kąpieli PBS-T przez 2 minuty. W międzyczasie przygotuj odczynnik blokujący MOM, dodając 2 krople roztworu podstawowego (patrz Tabela Materiałów) do 2,5 ml 1x PBS.
  5. Dodać 400 μl odczynnika MOM na sekcję. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1x kąpieli PBS-T przez 2 minuty. W międzyczasie przygotuj rozcieńczalnik MOM, dodając 300 μl roztworu podstawowego koncentratu białkowego do 3,75 ml 1x PBS.
  7. Dodać 400 μl rozcieńczalnika MOM i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie rozcieńczyć przeciwciało SMI-32 (patrz Tabela materiałów) w rozcieńczalniku MOM.
  8. Stuknąć rozcieńczalnik ze szkiełek i dodać 400 μl roztworu przeciwciała SMI-32 na sekcję. Przykryj wilgotną komorę i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Myć szkiełka dwukrotnie w 1x kąpieli PBS-T przez 2 minuty, każde z delikatnym mieszaniem. W międzyczasie rozcieńczyć odczynnik roboczy MOM przeciwko mysim IgG w rozcieńczalniku (10 μl bulionu w 2,5 ml rozcieńczalnika).
  10. Dodać 400 μl odczynnika roboczego przeciw mysim IgG na szkiełko. Inkubować przez 10 minut.
  11. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1x kąpieli PBS-T przez 2 minuty każda. Kontynuuj barwienie, postępując zgodnie z krokami opisanymi w protokole barwienia CD45 (kroki 8.11 – 8.19).

10. Punktacja LFB i H&E na obecność zmian demielinizacyjnych

UWAGA: Poniżej znajduje się podejście analityczne, które można zastosować w celu uzyskania szybkiego wglądu w nasilenie demielinizacji stanu zapalnego. Analizę tę przeprowadza się na odcinkach rdzenia, z których pobiera się próbki na różnych poziomach (szyjny, piersiowy i lędźwiowy, co najmniej 3 odcinki na poziom). Zapoznaj się z atlasem mózgu Allena, aby uzyskać informacje o rdzeniu kręgowym myszy26, aby pomóc w określeniu anatomicznego poziomu rdzenia kręgowego. Ta analiza wymaga plików TIFF. Jeśli zeskanowane obrazy są w formacie .czi, postępuj zgodnie z instrukcjami w Tabeli uzupełniającej 4, aby przekonwertować pliki czi na pliki TIFF.

  1. Otwórz obraz TIFF sekcji, która ma być analizowana, przeciągając i upuszczając plik do ImageJ. Obserwuj przekrój rdzenia kręgowego w 4 ćwiartkach: grzbietowym, lewym bocznym, prawym bocznym i przednim (Rysunek 2A, B).
  2. Wynik za obecność zmian demielinizacyjnych w każdym kwadrancie, jak pokazano w Rysunek 2.
    UWAGA: Obecność zmiany powoduje wynik 1 w tym kwadrancie, co daje w sumie 4 możliwe punkty na sekcję. Wynik 1 jest przyznawany nawet wtedy, gdy w kwadrancie występuje wiele zmian chorobowych.
  3. Zsumuj wszystkie punkty dla każdej myszy i podziel przez całkowitą liczbę kwadrantów, z których pobrano próbki, aby uzyskać frakcję kwadrantów ze zmianami podoponowymi.

11. Obliczanie ułamka powierzchni barwienia LFB w istocie białej rdzenia kręgowego

UWAGA: Ta analiza mierzy procentowy udział powierzchni istoty białej rdzenia kręgowego, która jest zabarwiona LFB.

  1. Otwórz sekcję poplamioną LFB zapisaną jako plik TIFF, przeciągając/upuszczając plik do ImageJ.
  2. Kliknij Obraz > Wpisz > 8-bitowy, aby utworzyć obraz w skali szarości. Kliknij Obraz> dostosować > próg. Przesuń dolny suwak w taki sposób, aby czerwona nakładka obejmowała wszystkie ciemne obszary (mielinę) widziane gołym okiem (Rysunek 2C–E). Kliknij Zastosuj.
  3. Kliknij Analizuj narzędzia > > Zarządzanie ROIr, aby otworzyć Menedżera ROI.
  4. Wybierz narzędzie do rysowania wielokątów na pasku narzędzi ImageJ. To narzędzie do rysowania pozwala obrysować obszar rdzenia kręgowego za pomocą myszy komputerowej.
  5. Nakreśl grzbietowy obszar rdzenia kręgowego i dodaj wielokąt do Menedżera ROI, klikając t na klawiaturze.
  6. Nakreśl przednio-boczny obszar istoty białej rdzenia kręgowego i dodaj wielokąt do menedżera ROI.
    UWAGA: Podczas śledzenia należy wykluczyć duże naczynia krwionośne, rozdarcia w tkance, artefakty i obszary przylegające do rogu grzbietowego (Rysunek 2A, strzałka B), które zwykle są mniej zmielinizowane. Zachowaj jak największą dokładność podczas trasowania, ponieważ dodanie zbyt dużej ilości białego tła zniekształci wyniki.
  7. Kliknij Analizuj > ustaw pomiary i wybierz Ułamek powierzchniowy.
  8. Kliknij Mierz w Menedżerze ROI. Spowoduje to podanie ułamka zarysowanego obszaru, który jest zabarwiony LFB.
  9. Z nowo utworzonego pola wyników skopiuj wartości do programu Excel i zamknij okno obrazu. Oblicz średnią powierzchnię frakcji procentowej zabarwionej dla obszaru grzbietowego i brzuszno-bocznego. Uśrednij je, aby uzyskać wartość dla tej sekcji.
  10. Powtórz kroki 11.1–11.9 dla odcinka szyjnego, piersiowego i lędźwiowego (N = 3/poziom/mysz).
  11. Oblicz średnią procentową frakcję mieliny dla wszystkich sekcji dla każdej myszy. Procentową demielinizację szacuje się, odejmując % barwienia obszaru od 100.

12. Analiza liczby komórek CD45+ i jajowatych aksonów SMI-32+

  1. Przeciągnij i upuść poplamiony obraz TIFF CD45 lub SMI-32 do ImageJ. Kliknij Analizuj > ustaw skalę > globalną > OK, aby ustawić pasek skali na wszystkich obrazach. Zwróć uwagę, że odbywa się to tylko dla pierwszego obrazu.
  2. Wybierz narzędzie do rysowania wielokątów i obrysuj szarą materię za pomocą myszy komputerowej. Kliknij Analizuj > Mierz i zapisz wyniki w Excelu jako "Obszar istoty szarej".
  3. Gdy narysowany wielokąt nadal znajduje się na obrazie, usuń szarą materię z obrazu, klikając Delete (klawiatura). To działanie pozostawia do analizy tylko istotę białą.
  4. Obrysuj cały odcinek rdzenia kręgowego za pomocą narzędzia do rysowania wielokątów. Wyklucz wszelkie obszary tkanki, których brakuje lub są uszkodzone.
  5. Kliknij Analizuj > Mierz i zapisz wyniki jako "Całkowita powierzchnia tkanki" w pliku Excel.
  6. Kliknij na Obrazek > Kolor > Dekonwolucja kolorów. Z listy rozwijanej wektorów wybierz opcję H DAB. Pojawią się trzy nowe okna – zachowaj brązowe okno (kanał DAB) i usuń inne okna obrazów.
  7. Kliknij Obraz> Dostosuj > próg. Przesuń dolny suwak, aby ustawić próg obrazu tak, aby czerwona nakładka przechwytywała taką samą ilość brązowych zabarwień wykrytych przez oko. Kliknij Zastosuj.
  8. Kliknij Process > binary > Watershed. Na tym etapie porównaj oryginalny obraz i obraz binarny, aby upewnić się, że są zgodne.
  9. Kliknij Analizuj > Analizuj cząstki. Wybierz Pokaż nakładkę i zmodyfikuj ustawienia: Rozmiar = 5 - 150 μm2, Okrągłość = 0,4 – 1. Kliknij OK.
    UWAGA: Te ustawienia pozwalają na uwzględnienie pojedynczych komórek i małych grup komórek, które nie zostały podzielone za pomocą funkcji Zlewnia, a nie wykluczenie ich z analizy.
  10. W oknie wyników zapisz ostatnią liczbę w skrajnej lewej kolumnie w programie Excel, która reprezentuje całkowitą liczbę cząstek. Następnie należy obliczyć powierzchnię istoty białej (całkowita powierzchnia tkanki – powierzchnia istoty szarej w mm2). Wyraź całkowitą liczbę cząstek na obszar istoty białej (liczba/mm2).
  11. Powtórz kroki dla każdego zapisanego obrazu RGB. Po przeanalizowaniu wszystkich odcinków rdzenia kręgowego dla jednej myszy, uśrednij liczbę cząstek na mm2 tkanki dla tej myszy.
    UWAGA: Przepływ pracy używany do analizy leukocytów rdzenia kręgowego można również zastosować do regionów mózgu.

13. Pomiar sNF-L za pomocą testu SIMOA

  1. Pobrać 100–200 μl krwi od żywych myszy przez krwawienie z odpiszczeli za pomocą kapilarnych probówek mikrotainerowych lub przez nakłucie serca za pomocą strzykawki i igły 25 G (procedura końcowa). W tym drugim przypadku przenieś krew do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Pozwól krwi krzepnąć w temperaturze pokojowej przez 30–60 minut.
  3. Odwirować próbki o masie 2660 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odpipetować górną frakcję (surowicę) do nowej probówki do mikrowirówki. Serum należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.
  4. Przygotowanie: Przed użyciem odczekać, aż kalibratory i urządzenia kontrolne (zestaw do oznaczania światła NF, patrz tabela materiałów) ogrzeją się do temperatury pokojowej przez 1 godzinę. Wyjmij substrat enzymatyczny (RGP) z lodówki i umieść w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na co najmniej 30 minut, wirując co 10 minut.
  5. Próbki surowicy rozmrozić na lodzie. Po rozmrożeniu delikatnie zwirować próbki i odwirować przy 10000 x g przez 5 minut, aby
    6. rozdrobnić wszelkie zanieczyszczenia.
  6. Załaduj płytkę: Zakręć kalibratory i elementy sterujące. Załaduj kalibratory w dwóch egzemplarzach, kontrole w dwóch egzemplarzach, a próbki surowicy w dwóch egzemplarzach na 96-dołkową płytkę dostarczoną z zestawem. Próbki surowicy rozcieńcza się w stosunku 1:3 rozcieńczalnikiem znajdującym się w zestawie. Uszczelnij płytę.
  7. Włącz maszynę SIMOA (patrz tabela materiałów) w kolejności komputera, programu, a następnie maszyny. Zezwól maszynie na zainicjowanie i uruchomienie konserwacji na początku dnia.
  8. Wiruj koraliki magnetyczne przez 30 sekund.
  9. Załaduj odczynniki na ekranie, klikając dwukrotnie pozycję stojaka, w której ma zostać umieszczona butelka z odczynnikiem, a następnie zeskanuj kod kreskowy butelki.
  10. Umieść koraliki magnetyczne w pozycji wstrząsania na stojaku (pozycje 1–3).
  11. Kontynuuj, ładując detektor, odczynnik SBG i odczynnik RGP do urządzenia.
  12. Kliknij ustawienia w oprogramowaniu. Upewnij się, że tryb próbki jest na płycie. Na karcie uruchamiania instalacji nazwij eksperyment.
  13. Przypisz dołki na płytce do kalibratorów w następujący sposób: Kliknij w studzienkę, a następnie wybierz test. Wybierz opcję kalibruj A, a następnie kliknij rosnąco. Podświetl dołki A1-8, a następnie kliknij repliki (2), aby przypisać współrzędne kalibratorów, które mają być uruchomione w dwóch egzemplarzach. Uruchom przy użyciu schludnego protocol.
    UWAGA: Zapoznaj się z certyfikatem analizy (strona internetowa producenta), aby uzyskać stężenia każdego kalibratora dla każdego konkretnego numeru partii. Po przypisaniu studzienek nie jest możliwe opuszczenie tego ekranu bez utraty pracy, dopóki płyta nie zostanie zablokowana na miejscu.
  14. Przypisz próbki, wykonując poniższe czynności:
    1. W prawym dolnym rogu ekranu kliknij przycisk, aby przypisać próbki. Zaznacz studzienki, w których mają znajdować się próbki.
    2. Zaznacz z listy test, który ma zostać przeprowadzony, wybierz liczbę powtórzeń i określ wbudowane rozcieńczenie 4x.
    3. Gdy studzienki są nadal podświetlone, wprowadź prefiks dla identyfikatora próbki i numeru początkowego, a następnie kliknij przycisk generuj, aby utworzyć sekwencyjne identyfikatory dla próbek. Powtórzyć kroki dla próbek kontrolnych.
  15. Załaduj płytkę do uchwytu na talerz (A1 do A12).
  16. W interfejsie ekranu kliknij na Gotowe próbki programowania i przejdź do zakładki Zasoby systemowe. Sprawdź, czy wszystkie pojemniki na odczynniki są pełne, a pojemniki na odpady puste.
  17. Kliknij Uruchom.
  18. Po zakończeniu przebiegu sprawdź krzywą kalibracyjną w zakładce "Redukcja danych", wybierając nazwę testu i płytki.
  19. Przejdź do "Historia uruchamiania" i użyj filtrów, aby znaleźć ostatni przebieg. Wybierz pozycję uruchom, a następnie wszystkie wyniki. Kliknij eksport i zapisz plik .csv. Kliknij raport, a następnie wybierz raport kalibracji wsadowej i wybierz ostatnie uruchomienie. Wyświetl podgląd raportu i wyeksportuj go.
  20. Uruchom konserwację na koniec dnia zalecaną przez producenta. Wyłącz program, komputer, a następnie komputer.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne barwienia IHC i histochemiczne, z przykładami zarówno ostrych (lewo) jak i starszych zmian EAE (prawo). Reprezentatywne barwienie CD45 z przeciwbarwieniem hematoksyliną pokazano na Rysunku 3A,B. Rysunek 3C–F przedstawia przykłady barwienia LFB z (Rysunek 3C,D) lub bez (Rysunek 3E,F) przeciwbarwieniem H&E. Chociaż hematoksylina nie jest specyficzna dla komórek odpornościowych, jądra komórek odpornościowych barwią się ciemniej i można je odróżnić od komórek rezydentnych OUN. Rysunek 3G,H pokazuje reprezentatywne barwienie aksonów SMI-32+, przeciwbarwionych hematoksyliną. Zauważalny jest zwiększony obraz tego barwienia w starszych zmianach EAE.

Uszkodzenia dróg zmielinizowanych występują najczęściej w rdzeniu kręgowym w aktywnym modelu mysim EAE i są głównym czynnikiem prowadzącym do paraliżu w tej chorobie7,9. W związku z tym w analizach histologicznych priorytetowo traktuje się ocenę obecności stanu zapalnego i uszkodzeń tkanek w rdzeniu kręgowym. Ogniska EAE występują sporadycznie w różnych obszarach (przednim, bocznym lub grzbietowym) (Rycina 2A,B) oraz na różnych poziomach (krzyżowym, lędźwiowym, piersiowym, szyjnym) rdzenia kręgowego. Opisana metoda zatapiania zapewnia odpowiednie pobranie próbek z ognisk w całym rdzeniu. Zatapia się więcej przekrojów, niż jest analizowanych, ponieważ niektóre z nich mogą ulec uszkodzeniu podczas obróbki lub krojenia. Aby zapewnić reprezentatywność próbkowania, dla każdej myszy analizuje się minimum 3 reprezentatywne przekroje na poziomach szyjnym, piersiowym i lędźwiowym rdzenia kręgowego. Tożsamość każdego preparatu pozostaje utajniona, aby osoba przeprowadzająca analizę nie była stronnicza podczas wyboru reprezentatywnych przekrojów do badania.

Aby szybko uzyskać wgląd w różnice w ciężkości histologicznej EAE, można ocenić obecność podomóżówkowych zmian demielinizacyjnych w kwadrantach rdzenia kręgowego na wybranych przekrojach (Rysunek 2A,B). Jest to szybka metoda, którą można przeprowadzić na obrazach zeskanowanych lub przy użyciu mikroskopu świetlnego. Analiza ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć różnice w histologicznej ciężkości EAE między grupami, gdy w jednej grupie EAE przebiega ciężko, a w drugiej łagodnie. Na przykład w eksperymencie przedstawionym na Rysunku 4, EAE wywołano u samic myszy typu dzikiego (WT) oraz myszy z delecją OGR1 (OGR1 KO) przy użyciu MOG p35-55/CFA oraz PTX. Myszy w grupie WT rozwinęły ciężką postać EAE z całkowitym paraliżem, podczas gdy w grupie z nokautem OGR1 rozwinęła się łagodna postać choroby. Różnica ta w ocenie klinicznej odpowiadała różnicy w odsetku kwadrantów z obecnością zmian podomóżówkowych (Rysunek 4C).

Ważne jest, aby uzupełnić ocenę zmian demielinizacyjnych o procentowy udział powierzchni barwienia mieliny, aby uchwycić zakres utraty mieliny i/lub zmielinizowanych aksonów podczas ataku autoimmunologicznego. W przykładzie na Rysunku 4 procentowy udział mieliny różnił się również znacząco pomiędzy myszami OGR1 a myszami WT (Rysunek 4D). Procentowy udział mieliny wykazuje również istotną korelację z skumulowanym wynikiem EAE u myszy z EAE (Rysunek 4E), a zatem stanowi dobrą miarę ogólnego uszkodzenia tkanki w tej chorobie. Należy zauważyć, że niniejszy protokół nie rozróżnia intensywności barwienia mieliny. Jeśli jest to pożądany wynik, należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne na białka mieliny, takie jak białko proteolipoidalne lub podstawowe białko mieliny, i zmierzyć intensywność tego barwienia.

W przypadku, gdy EAE przebiega ciężko w obu grupach porównawczych, większa frakcja ćwiartek rdzenia kręgowego będzie zawierać zmiany zapalne/demielinizacyjne. W takiej sytuacji bardziej czułym podejściem do oceny stanu zapalnego jest zliczenie liczby leukocytów CD45+ na mm2 istoty białej (patrz reprezentacyjne barwienie na Rysunku 3A). Klon przeciwciała CD45 opisany w niniejszym protokole wykrywa wszystkie infiltrujące leukocyty i barwi jedynie nieliczne mikrogleje, które wykazują upregulację ekspresji CD45 w EAE (patrz otwarta strzałka na Rysunku 3B), i dlatego jest użyteczny w ocenie infiltracji obwodowych komórek odpornościowych.

W dłuższych badaniach EAE (>20 dni) zaleca się przeprowadzenie analizy uszkodzeń aksonów. Barwienie SMI-32 w przekrojach rdzenia kręgowego jest czułą metodą wykrywania uszkodzonych aksonów. Choć stan zapalny w rdzeniu kręgowym z czasem ustępuje, a oszczędzone aksony mogą ulec remielinizacji, przeżyłe aksony wykazują zróżnicowany stopień uszkodzeń resztkowych9 (Rysunek 3G,H). Na przykład w modelu EAE indukowanym MOG p35-55 u myszy C57BL6/J stopień uszkodzenia i utraty aksonów jest głównym czynnikiem wpływającym na wyniki kliniczne po ustąpieniu procesu zapalnego9. Rysunek 5 przedstawia przykład takiego zjawiska w eksperymencie EAE przeprowadzonym na samcach i samicach myszy WT oraz myszach z deficytem genu nazywanego receptorem aktywowanym przez proliferatory peroksysomów delta (PPAR-delta) w komórkach szeregu mieloidalnego (LysMCre: Ppardfl/fl). U samców myszy WT odzyskały sprawność kończyn tylnych, natomiast wyniki kliniczne pozostały wysokie w grupie samców LysMCre: Ppardfl/fl. Z kolei w eksperymencie na samicach obie grupy badawcze przez cały czas wykazywały wysokie wyniki. Na pierwszy rzut oka wynik ten sugerował, że PPAR-delta wywiera specyficzny dla płci efekt w EAE; jednak ocena patomorfologiczna rdzenia kręgowego wykazała, że myszy obu płci w grupie LysMCre: Ppardfl/fl miały zwiększone uszkodzenia aksonalne w porównaniu z odpowiednikami WT (Rysunek 5B). Efekt genotypu w wynikach klinicznych prawdopodobnie nie został zaobserwowany u samic, ponieważ samice WT miały tendencję do wykazywania zwiększonych uszkodzeń aksonalnych, co przejawiało się w postaci chronicznych deficytów neurologicznych.

W tym samym eksperymencie stwierdzono, że u samic myszy LysMCre: Ppardfl/fl występuje bardziej rozległa infiltracja limfocytów T w móżdżku, co stanowi przykład użyteczności oceny stanu zapalnego mózgu w modelu EAE. W EAE zapalenie mózgu występuje głównie w móżdżku i pniu mózgu (Rysunek 6A,D,G), ale może być również widoczne w oponach mózgowych (widoczne pod hipokampem na Rysunku 6C), w pobliżu komór (Rysunek 6F) oraz w innych szlakach istoty białej, w tym w nerwie wzrokowym i ciele modzelowatym (Rysunek 6B,E). Ocena stanu zapalnego mózgu jest przeprowadzana w określonym obszarze mózgu (np. w istocie białej móżdżku) poprzez zliczenie liczby komórek CD45 na mm2 obszaru tkanki, stosując tę samą metodologię, która została opisana w protokole dla rdzenia kręgowego. W przedstawionej tutaj metodzie sekcji cięcie wykonuje się w połowie móżdżku, co pozwala na uzyskanie perspektywy móżdżku i pnia mózgu, jak pokazano na Rysunku 6A.

Pomiar sNF-L przy użyciu testu SIMOA stał się użytecznym markerem biologicznym do oceny postępującego uszkodzenia aksonów oraz odpowiedzi na terapię w rzutowo-remisyjnej postaci SM20,21,27,28. Ten sam zestaw do testu SIMOA, który jest stosowany do pomiaru sNF-L u ludzi, można wykorzystać do pomiaru sNFL u myszy22,23,24. Aby zbadać skuteczność tego testu w wykrywaniu uszkodzeń aksonów w modelu EAE, zmierzono poziom sNF-L u samic myszy C57BL6/J w punkcie końcowym eksperymentu EAE, a następnie porównano te wartości z poziomami u zdrowych myszy kontrolnych tej samej płci, u których nie wystąpiło EAE. Stwierdzono, że myszy z EAE miały znacznie wyższe poziomy sNF-L niż myszy zdrowe (Rycina 7A), a poziomy te korelowały z gęstością aksonów SMI-32+ w rdzeniu kręgowym (Rycina 7B). W porównaniu z histologiczną oceną uszkodzeń aksonów, test SIMOA jest szybszy (czas od pobrania krwi z myszy do uzyskania wyników wynosi nieco ponad pół dnia), a tym samym zapewnia szybką informację zwrotną na temat działania leczenia u żywych myszy. Test ten ma również tę zaletę, że odzwierciedla uszkodzenia aksonów zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w mózgu.

Przeszkło histologiczne z barwionymi przekrojami tkanek; analiza mikroskopowa; przygotowanie badania tkanek.
Rysunek 1: Reprezentatywny blok parafinowy z przekrojami mózgu i rdzenia kręgowego. 5 coronalnych przekrojów mózgu oraz przekroje poprzeczne rdzenia kręgowego (o grubości 1,5–2 mm) są zatopione w jednym bloku, aby umożliwić ich jednoczesne cięcie. Należy zatopić co najmniej 15 przekrojów rdzenia kręgowego, co pozwoli na odpowiedni dobór sekcji do analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza histologiczna, przekroje poprzeczne rdzenia kręgowego, schemat barwionych struktur komórkowych, badanie naukowe.
Rycina 2: Ocena stanu zapalnego opon mózgowo-rdzeniowych oraz procentowej powierzchni mieliny na poziomie piersiowym rdzenia kręgowego. (A,B) przedstawiają obrazy rdzenia kręgowego z odcinka piersiowego samicy myszy C57BL6/J z indukowanym MOG p35-55 EAE, barwionym LFB/H&E. Przedstawiono metodę wizualizacji kwadrantów oraz przykłady zmian demielinizacyjnych (obrysowane linią przerywaną). Mysz na obrazie A posiada zmiany demielinizacyjne zlewające się w 4 z 4 kwadrantów, podczas gdy u myszy na obrazie B zajęty jest 1 z 4 kwadrantów. Mysz na obrazie B wykazuje pewien stan zapalny w pozostałych kwadrantach, jednak nie przerodził się on w zmianę zlewającą się i w związku z tym nie został ujęty w ocenie. (C–E) Przykład obrazu LFB oraz obrazu w skali szarości i obrazu po progowaniu w programie ImageJ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna tkanek rdzenia kręgowego; barwienia CD45, LFB/Eozyna, SMI-32; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 3: Przekroje rdzenia kręgowego barwione CD45, LFB H&E, LFB i SMI-32. Przykłady wczesnej (A,C,E,G) i późnej (B,D,F,H) zmiany podomózgówkowej w rdzeniu kręgowym barwione przeciwciałem CD45 (A,B), LFB/H&E (C,D), samym LFB (E,F) oraz przeciwciałem SMI-32 (G,H). Czarne strzałki wskazują przykłady komórek zabarwionych odpowiednim przeciwciałem. Białe strzałki wskazują domniemaną mikrogleję, która została zabarwiona jako CD45+. Pasek skali = 50 µm. Rysunek przedstawia reprezentatywne barwienie zmian w rdzeniu kręgowym samicy myszy C57BL6/J podczas EAE i podkreśla, jak patologia może różnić się w zależności od przekroju rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy i wyniki badań nad stwardnieniem rozsianym; analiza demielinizacji, oceny kliniczne, mikroskopia.
Rycina 4: Zastosowanie oceny zmian chorobowych oraz procentu demielinizacji w modelu EAE. Przedstawiono przykład eksperymentu EAE, w którym samice myszy z niedoborem genu receptora sprzężonego z białkiem G raka jajnika 1 (OGR1) na tle C57BL6/J rozwijały łagodniejszy klinicznie przebieg EAE niż samice myszy C57BL6/J typu dzikiego (WT). EAE indukowano poprzez immunizację MOG p35-55/CFA oraz PTX, a stan myszy oceniano zgodnie z następującą skalą kliniczną: 1 = paraliż ogona, 2 = osłabienie kończyn tylnych i stóp, 3 = paraliż kończyn tylnych, 4 = osłabienie kończyn przednich, 5 = stan agonalny. (A) Średnia + SEM ocen klinicznych myszy w czasie. (B) Przykład barwienia LFB/H&E w brzusznej części rdzenia kręgowego. Pasek skali = 50 µm. (C) Średnia + SEM procentu kwadrantów zawierających zmiany demielinizacyjne. (D) Średnia + SEM procentu demielinizacji w każdej grupie. (E) Wyniki innego eksperymentu w modelu EAE indukowanego MOG p35-55 u myszy C57BL6/J, w którym sumaryczne oceny EAE poszczególnych myszy z 30 dni obserwacji skorelowano z procentem demielinizacji w rdzeniu kręgowym. Korelacje wyznaczono testem Spearmana. Panele (A–D) zostały zaadaptowane z pracy Souza C et al.29. Dane w (E) są danymi oryginalnymi. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe wyników klinicznych i stanu zapalnego; Ppard^fl/fl vs. LysM^cre:Ppard^fl/fl; Analiza samców/samic.
Rysunek 5: Zastosowanie barwienia SMI-32 w celu zrozumienia wpływu genotypu na kliniczny fenotyp EAE. Rysunek ten przedstawia przykład eksperymentu EAE, w którym samce i samice myszy typu dzikiego (noszące allel floxowany Ppard) oraz myszy z mutacją Ppard specyficzną dla komórek mieloidalnych (LysMCre: Ppardfl/fl) na tle C57BL6/J zostały zimmunizowane MOG p35-55/CFA i PTX, a następnie obserwowane przez 45 dni. (A) przedstawia średnie + SEM wyników klinicznych myszy. (B) przedstawia średnie + SEM wyników oceny histologicznej liczby aksonów SMI-32+ w rdzeniu kręgowym, % kwadrantów z uszkodzeniami podoponowymi, procent kwadrantów z mankietami naczyniowymi oraz liczbę uszkodzeń CD3 w móżdżku na mm2 tkanki. Eksperyment ten wykazał wpływ genotypu na barwienie SMI-32. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Drohomyrecky. et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat neuroanatomiczny przedstawiający obszary mózgu: nerwy wzrokowe, hipokamp, pień mózgu, móżdżek.
Rysunek 6: Przykłady barwienia CD45+/hematoksyliną w koronalnych przekrojach mózgu w modelu EAE indukowanego MOG p35-55 u samic myszy C57BL6/J. Zmiany CD45+ zaznaczono kolorem brązowym. (A) Zmiany CD45+ w pniu mózgu w przekrojach koronalnych. Pasek skali = 150 μm. (B–G) Przykłady zmian CD45+ w nerwach wzrokowych (B), wyrostkach oponowych pod hipokampem (C), pniu mózgu (D), ciele modzelowatym (E), przyśrodkowej części habenuli w pobliżu komory (F) oraz w móżdżku (G). Pasek skali: (B–G) = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza poziomu sNfL w EAE; wykres rozrzutu pokazuje korelację z liczbą aksonów, wartość p 0,044.
Rysunek 7: Poziomy sNF-L w surowicy w EAE indukowanym MOG p35-55. (A) Poziomy NFL w surowicy pobranej od samic myszy kontrolnych i myszy z EAE w punkcie końcowym jednego eksperymentu. Dane analizowano przy użyciu dwustronnego testu Manna-Whitneya. (****wartość p < 0,0001). (B) Przekroje rdzenia kręgowego pobrano w punkcie końcowym i zabarwiono SMI-32. Wyznaczono liczbę komórek pozytywnych na obszar tkanki istoty białej i skorelowano ją z poziomem NF-L w surowicy w punkcie końcowym przy użyciu testu Spearmana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Opis kąpieli stosowanych w obróbce tkanek. Kasety są automatycznie przemieszczane przez te serie kąpieli za pomocą automatycznego procesora. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Etapy barwienia Luxol Fast Blue oraz hematoksyliną i eozyną. W tabeli tej przedstawiono kolejność kroków w protokole barwienia Luxol Fast Blue oraz hematoksyliną i eozyną. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Przeciwciała użyte do barwienia immunohistochemicznego. Opisano przeciwciała wykorzystane w niniejszym protokole, a także takie, które mogą posłużyć do dalszych badań nad stanem zapalnym, mikrogleozą i astrogliozą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Konwersja plików .czi do formatu TIFF. Należy pamiętać, że optymalne jest użycie obrazów o wysokiej rozdzielczości, jednak w przypadku ograniczeń pamięci operacyjnej komputera można zapisać obrazy o średniej rozdzielczości. Niezbędne jest stosowanie obrazów o tej samej rozdzielczości we wszystkich analizach. Należy również zauważyć, że ostatnim obrazem w serii jest etykieta preparatu. Aby zapewnić zaślepienie analizy, należy unikać odczytywania etykiety.30,31 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Barwienie histologiczne rdzenia kręgowego jest ważnym narzędziem w ocenie ciężkości choroby EAE, szczególnie w przypadkach, gdy występują różnice między grupami leczonymi w zakresie powrotu do zdrowia w fazie ostrej choroby. Barwienie pod kątem infiltracji komórek odpornościowych (CD45), mieliny (LFB) i uszkodzenia aksonów (SMI-32) pomaga scharakteryzować podstawową przyczynę zmienionych wyników klinicznych u myszy. Opisany tutaj protokół barwienia histologicznego zapewnia perspektywę stanu zapalnego, a także zakresu uszkodzenia mieliny i aksonów. Co więcej, przedstawione wyniki potwierdzają, że pomiar sNF-L jest metodą oceny zakresu ogólnego uszkodzenia neuronów w EAE.

Krytycznymi parametrami tej analizy jest zapewnienie, że badacze są ślepi na tożsamość odcinków i że na każdym poziomie rdzenia kręgowego u różnych myszy pobierane jest równoważne próbkowanie. Dzieje się tak, ponieważ nasilenie stanu zapalnego może być większe na niższych poziomach rdzenia. Kolejnym krytycznym parametrem jest wielkość grup eksperymentalnych. Rdzenie kręgowe i mózgi są zwykle pobierane od 6-8 myszy na grupę w punkcie końcowym, aby zobaczyć znaczące różnice między grupami z leczeniem lub genotypami o umiarkowanych rozmiarach efektu. Ważne jest również, aby upewnić się, że wybrane myszy, po uśrednieniu, mają reprezentatywne średnie wyniki całej grupy. Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów, częstym problemem napotykanym przez osoby, które nie mają doświadczenia z protokołem, jest to, że rdzeń kręgowy jest zamocowany na niezbyt długi czas i nie jest łatwo wytłoczony z kręgosłupa. W takim przypadku rdzeń kręgowy można ręcznie wyciąć z kolumny, przycinając wzdłuż wyrostków kolczystych za pomocą cienkich nożyczek i otwierając kolumnę, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Alternatywnie, tkanki można utrwalić przez kilka dodatkowych dni bez ingerencji w powodzenie barwienia przeciwciałami. Opisane tutaj klony przeciwciał działają w tkance utrwalonej do 2 tygodni w formalinie.

Osadzanie fragmentów rdzenia kręgowego wymaga umiejętności i praktyki. Zaleca się noszenie lup ocznych i skierowanie lampy na stację osadzania, aby lepiej zobaczyć, czy sekcje spadają w przekroju, czy w przekroju wzdłużnym. Utrzymywanie długości kawałków rdzenia kręgowego na poziomie mniejszym niż 2 mm podczas wbijania brutto pomoże im spaść w przekroju. Innym częstym problemem napotykanym przez mniej doświadczonych użytkowników jest to, że LFB odparowuje podczas nocnej inkubacji, pozostawiając połowę szkiełka poplamioną, a połowę niezabarwioną. Aby uniknąć parowania, szklane naczynie do barwienia należy uszczelnić folią termoplastyczną, a następnie folią. Jeśli dojdzie do parowania, a sekcje są nierównomiernie zabarwione, zaleca się całkowite odniebieszczenie szkiełek węglanem litu i ponowne zabarwienie ich w LFB przez noc. Innym częstym problemem jest to, że użytkownicy nie usuwają w pełni niebieskiej istoty szarej po LFB. Bardzo ważne jest, aby zbadać poszczególne sekcje pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnięto wystarczającą ilość odniebieszczenia przed przystąpieniem do innych kroków w protokole. Ponadto, mimo że barwienia IHC CD45 i SMI-32 działają solidnie, nadal ważne jest, aby rozwiązywać problemy ze stężeniami przeciwciał we wstępnych eksperymentach dla każdej otrzymanej nowej partii przeciwciał. Można to zrobić, testując różne stężenia przeciwciała na odcinku kontroli pozytywnej (rdzeń kręgowy EAE). Barwienie po raz pierwszy powinno również obejmować kontrolę ujemną, która składa się z samego przeciwciała drugorzędowego bez dodatku przeciwciała pierwszorzędowego. Wreszcie, w analizie obrazu bardzo ważne jest, aby określić progi poszczególnych obrazów, ponieważ barwienie może być nierówne na slajdach lub sekcjach.

Protokół ten korzysta z ogólnodostępnego oprogramowania. Jeśli ktoś nie ma dostępu do procesora, urządzenia do osadzania lub mikrotomu, kroki te można wykonać w szpitalnym rdzeniu patologicznym, który oferuje te usługi. Ponadto, jeśli nie masz dostępu do skanera slajdów, możesz użyć mikroskopu świetlnego, który jest wyposażony w kamerę wideo, aby zapisać obrazy TIFF rdzenia kręgowego lub obszarów mózgu. W przypadku przepływu pracy opartego na mikroskopie uchwyć skrawki LFB lub LFB/H&E przy małej mocy (40-krotne powiększenie), a w przypadku barwienia CD45 i SMI-32 zobrazuj co najmniej cztery okna, które są wyśrodkowane w brzusznej, grzbietowej i bocznej części rdzenia kręgowego (powiększenie 200x dla CD45 i powiększenie 400x dla SMI-32). Na tych obrazach można przeprowadzić analizę obrazu w celu ilościowego określenia barwienia w podobny sposób, jak opisano.

Decyzja o tym, jakie podejście histologiczne należy zastosować w celu uzyskania oceny EAE, zależy od tego, jak bardzo wyniki kliniczne różnią się między grupami. Na przykład, jeśli istnieją drastyczne różnice w wyniku klinicznym EAE (jedna grupa otrzymała EAE, a druga nie), zwykle odnosi się to do różnic w zapaleniu o podłożu obwodowym. W takim przypadku ocena pod kątem obecności zmian demielinizacyjnych na skrawkach wybarwionych LFB/H&E jest wystarczająca i ujawni różnice między grupami. Jeśli grupy są bardziej podobne pod względem wyniku klinicznego na początku, a zamiast tego występują różnice w zakresie wyzdrowienia klinicznego (np. eksperyment na rycinie 5A), najlepiej jest zastosować pełny histologiczny przepływ pracy, który jest tutaj opisany, w tym ocenę stanu zapalnego mózgu w pniu mózgu i móżdżku, aby rozróżnić, czy różnice w przewlekłości choroby odnoszą się do różnic w stanie zapalnym lub uszkodzeniu tkanek. Jeśli różnice w stanie zapalnym zostaną znalezione zgodnie z oceną zliczając CD45, można przeprowadzić dalsze badania IHC w celu barwienia limfocytów T (anty-CD3), naciekających monocytów/makrofagów (Mac3) i mikrogleju (Iba-1/TMEM119) (zalecane klony przeciwciał znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 3). Aktywacja mikrogleju znajduje odzwierciedlenie we wzroście intensywności barwienia Iba-1 na podwójnie znakowanym mikrogleju Iba-1 + TMEM-19 + i zwiększonej retrakcji procesów mikrogleju, które można ocenić za pomocą analizy Sholla na sekcjach32. Co więcej, techniki takie jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek mogą być stosowane do przeprowadzenia głębszej charakterystyki częstotliwości i fenotypu populacji immunologicznych w mózgu i rdzeniu kręgowym.

Liczenie aksonów SMI-32+ jest czułą metodą wykrywania uszkodzeń aksonów w EAE32,33 i MS34. SMI-32, który wykrywa nieufosforylowaną formę ciężkiego lub średniego neurofilamentu gromadzącego się w cebulkach końcowych przeciętych neuronów. Alternatywą dla wykrywania uszkodzonych aksonów jest barwienie białkiem prekursorowym amyloidu (APP), które może gromadzić się w aksonach w wyniku zakłóconego transportu aksonów33. Wzór barwienia dla SMI-32 i APP, chociaż oba odzwierciedlają uszkodzenie aksonów, zazwyczaj nie nakładają się na siebie, co wskazuje, że wykrywają różne patologie33. Można również uzupełnić histologiczne pomiary uszkodzenia aksonów, mierząc sNF-L, który jest szybką i czułą miarą trwającego uszkodzenia aksonów zarówno w rdzeniu kręgowym, jak i w mózgu. Ma to tę zaletę, że można to zrobić w pół dnia u żywych myszy. Wadą tej metody jest to, że zestawy są drogie, a maszyna jest wysoce wyspecjalizowana. Firma sprzedająca zestaw sNF-L oferuje opłatę za serwis dla tych, którzy nie mają dostępu do maszyny SIMOA. Alternatywą dla oceny uszkodzenia aksonów jest ocena utraty aksonów poprzez zliczenie aksonów w zabarwionych na niebiesko toluidynie odcinkach rdzenia kręgowego12 lub zliczenie wiązek neurofilamentów wykrytych przez SMI-31 w obszarach istoty białej rdzenia kręgowego32. Oba te podejścia są bardziej pracochłonne niż pomiar SMI-32 lub sNF-L.

Jeśli wyniki kliniczne EAE różnią się między grupami, ale ocena stanu zapalnego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów nie ujawnia różnic między grupami, przydatne może być barwienie w celu aktywacji astrocytów za pomocą GFAP (patrz Tabela uzupełniająca 3 dla zalecanego klonu przeciwciała). Aktywacja astrocytów wiąże się ze wzrostem barwienia GFAP i wykazano, że koreluje to z progresją EAE w niektórych modelach EAE, w tym przewlekłym EAE u szczura DA35.

Podsumowując, protokół ten opisuje metody i zapewnia przepływ pracy analizy w celu przeprowadzenia oceny histologicznej EAE.

Oświadczenia

Shannon Dunn konsultuje się z FSD Lucid Psycheceuticals.      

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Raymondowi Sobelowi (Uniwersytet Stanforda) za pokazanie nam swojej metody na utwardzanie i naprawianie odcinków mózgu i rdzenia kręgowego. Dziękujemy Kyle'owi Robertonowi i Milanowi Ganguly'emu z Toronto Centre for Phenogenomics za poznanie metody osadzania i za wycięcie tak wielu odcinków naszego mózgu i rdzenia kręgowego. Dziękujemy dr Matthew Cussickowi i dr Robertowi Fujinami (University of Utah) za podzielenie się swoimi protokołami oceny zapalenia podoponowego i okołonaczyniowego w rdzeniu kręgowym. Dziękujemy Shalinie Ousman za podzielenie się klonem przeciwciała CD45. Dziękujemy firmie Xiofang Lu za szkolenie w zakresie procesora tkanek i stacji do osadzania tkanek oraz konserwację tego sprzętu w Centrum Badawczym Badań Biomedycznych Keenan w Szpitalu św. Michała. Prace te były wspierane przez grant biomedyczny z MS Canada (dla SED). Carmen Ucciferri jest stypendystką rządu Kanady. Nuria Alvarez-Sanchez jest wspierana przez stypendium podoktorskie Keenan.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaSigma AldrichHT501128-4LSłuży do mocowania rdzenia kręgowego i próbek mózgu
1000 ml Szklana zlewkaPyrex1000
15 ml Falcon TubeStarstedt62.554.100Mocowanie i przechowywanie rdzenia kręgowego i mózgu
250 mL Kolba ErlenmeyeraPyrex4980
500 ml Szklana zlewkaPyrex1003
92 mm x 16 mm Szalki PetriegoStarstedt82-1473-001Stosowany w procedurze udrażniania tkanek
95% alkohol etylowyAlkohole komercyjneP016EA95Etapy odwodnienia i nawodnienia
Zestaw ABC Elite VectorLabratoriesPK6100Używany do znakowania immunohistochemicznego
Aqua Hold 2 PAP PenCole ParmerUZ-75955-53Służy do rysowania wokół skrawków tkanek w barwieniu immunohistochemicznym
Zestaw blokujący awidin / biotynęVector LabratoriesSP-2001
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoDowolna
biotynylowana królicza anty-szczurza IgGWektor LabratoryBA-4000Używany do barwienia CD45
C57BL6 / J MyszyJackson LaboratoryStock # 664Te myszy były używane w eksperymentach pokazane na papierze.
WirówkaThermo Fisher ScientificSorvall ST Plus
CitriSolvFisher Scientific04-355-121Służy do usuwania wosku. Jest alternatywą dla ksylenu
DAB KitVector LabratoriesSK-4100Służy do rozwoju w immunohistochemii
ddH2O-
Jednorazowy skalpelMagnaM92-10Używany do obrzydliwego rdzenia kręgowego i mózgu
DWK Life Sciences (Wheaton) szklane naczynie do barwieniaParmerUZ-48585-60Służy do barwienia histochemicznego i płukania
Stojak do barwienia szkła DWK Life Sciences (Wheaton)Cole Parmer10061392Używany do immunohistochemii i histochemii
Eosin YBioshop173772-87-1Plamy cytoplazma
Pióra Mikrotomy OstrzaFisher Scientific12-634-1CSłuży do cięcia parafiny
Bibuła filtracyjnaWhatman1001110Służy do filtrowania formaliny (podczas obrzydliwości) i luxol fast blue
Drobne nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14160-10Służy do wycinania mózgu i czaszki
DymionDowolna
Gibco DPBSFisher Scientific14190944
Lodowaty kwas octowyBioShopACE333.4Stosowany w procedurze szybkiego barwienia luxol
Blue Pojemniki histologiczne HistoplexStarplex Naukowy565-060-26Mocowanie rdzenia kręgowego i mózgu
Nadtlenek wodoruFisher ChemicalsH325-500Służy do usuwania endogennej peroksydazy w tkance
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Kimtech ScienceKimberly Clark Professional34155Używany do immunohistochemii
Papier do soczewekVWR52846-001Służy do wychwytywania gatunków rdzenia kręgowego w kasecie podczas przetwarzania Mikroskop
świetlnyDowolna
węglanów lituSigma Aldrich554-13-3Odniebieczanie po szybkim barwieniu luxolem
Luxol niebieskiSigma Aldrich1328-51-4Plamy CNS mielina
MOM Zestaw do immunodetekcjiWektorowe labustoryBMK-2202Używany do Plama SMI-32
MetanolFisher ChemicalsA454.2Używany do utrwalania
Mikroskopia elektronowaHematoksyliny MayeraNauki 26381-02Plamy jądra
Kleszcze Micro-Adson z zębamiFine Science Tools11027-12Służy do odbijania czaszki podczas sekcji
Mikrowirówka EppendorfModel 5417R
Rurki kapilarne Microvette CB 300 ZStarstedt16.440.100Używany do pobierania krwi
Szkło osłonowe MicrscopeFisher Scientific12545AUżywany do szkiełek nakrywkowych
Mini ShakerVWR12620-938Używany do produkcji
NF Light KitQuanterix103186Ten zestaw może być używany do wykrywania rozpuszczalnego neurofilamentu u myszy lub człowieka w surowicy
Rękawice nitryloweVWR76307-462Bezpieczeństwo
Normalna surowica koziaVector LabratoriesS-1000Odczynnik blokujący
Normalna surowica królikaVector LabratoriesS-5000Odczynnik blokujący
Kasety tkankowe OmniSetteFisher ScientificM4935FSSłuży do osadzania rdzenia kręgowego i mózgu
Pipeta i końcówki p1000 różne
pipety i końcówki p200różne
stacje zatapiania parafinyLeica BiosystemsModel EG1160
Medium do infiltracji/osadzania tkanek ParaplastLeica Biosystems39601006Służy do osadzania rdzenia kręgowego i mózgu
Montaż Permount MediumFisher ChemicalsSP15-100Służy do montażu szkiełek nakrywkowych na szkiełkach
pH-metrFisher Scientific13636AB315BSłuży do pHing
Plastikowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-20Służy do pHing
Chlorek potasuBioShop7447-40-7Służy do produkcji PBS
Fosforan potasu MonobasicBioShop7778-77-0Używany do produkcji
szybkowaruNordic WareTender Cooker
Oczyszczone szczury anty-mysie CD45Vector Labratory553076Wykrywa leukocyty
Odczynnik alkoholowy 100%VWR89370-084Etapy odwadniania i nawadniania
Odczynnik alkoholowy 70%VWR64-17-5Odwodnienie i Etapy nawadniania
Mikrotom obrotowyLeica BiosystemsModel RM2235
Maszyna SimoaQuanterixHD-X
ZeissAxioScan.Z1
Mysie przeciwciało IgG1 SMI-32Biolegend801701Wykrywa uszkodzone aksony
Chlorek soduBioShop7647-14-5Służy do produkcji PBS
Fosforan sodu dwuzasadowy Bioshop7558-79-4Służy do produkcji PBS
Standardowe kleszcze AdsonNarzędzia do nauki precyzyjnej11150-10Używany do etapów preparacji
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Służy do pobierania skrawków
Chirurgiczne twarde cięciaFine Science Tools14110-15Służy do przecinania kręgosłupa, ściany ciała i skóry
Procesor tkanekLeica BiosystemsModel TP1020
Cytrynian trójsoldowyThermo Fisher Scientific03-04-6132Używany do pobierania antygenu
Tween-20BioBasic9005-64-5Używany do mycia sekcji
Uszczelka płytowa X-P Pierce XP-100Excel Scientific12-140Używany do testu sNF-L
XyleneFisher Chemicals1330-20-7Służy do usuwania wosku i oczyszczania sekcji
LejekCole ParmerRK-63100-64Służy do filtrowania formaliny przed zabrudzeniem tkanki
Mieszaj płytkęDowolnaSłuży do sporządzania roztworów
PiekarnikDowolnaSłuży do wypalania skrawków tkanek po cięciu
ParafilmBemis13-374-10Służy do uszczelniania naczynia barwiącego LFB
Kuchenka mikrofalowaDowolnaCzas może się różnić w zależności od modelu mikrofalowego
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Aldrich9048-46-8Służy do wytwarzania buforu blokującego
1,5 ml Probówki do mikrowirówekFisher Scientific05-408--129Służy do przechowywania próbek surowicy myszy
VortexDowolnySłuży do przygotowania próbek do testu sNF-L
Łaźnia wodnaDowolnaSłuży do podgrzewania substratu enzymatycznego do oznaczania sNF-L
Cole PBS Skaner slajdów

Bibliografia

  1. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  2. Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
  3. Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
  4. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
  5. Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  8. Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
  9. Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
  10. Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).
  11. Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
  12. Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
  13. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  14. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  15. Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
  16. Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).
  17. Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866(2022).
  18. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194(2019).
  19. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
  20. Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
  21. Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
  22. Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431(2021).
  23. Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).
  24. Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).
  25. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  26. Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
  27. Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
  28. Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
  29. D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).
  30. Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
  31. Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
  32. Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425(2021).
  33. Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
  34. Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
  35. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena demielinizacjihistologia rdzenia kr gowegozapalenie m zgulekki a cuch neurofilamentuinfiltracja leukocyt wzatapianie w parafinieocena kliniczna
Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.