Tutaj prezentujemy protokół oceny nocycepcji u myszy zakażonych Trypanosoma evansi, używając elektronicznego aparatu von Freya jako narzędzia, mierzącego mechaniczne progi tylnej łapy i wnętrzności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektroniczny von Frey związany ze skalą grymasu myszy do oceny allodynii i bólu u myszy zakażonych Trypanosoma evansi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Patogeneza chorób zakaźnych jest nadal skomplikowanym obszarem do zbadania. Przebieg kilku objawów klinicznych, takich jak allodynia i ból, można zaobserwować u zwierząt domowych. Jednak wiedza o ich szlakach i prawidłowe leczenie wymagają kontrolowanych eksperymentów, z których wiele wykorzystuje się na zwierzętach laboratoryjnych. Pomiar zmian w progach mechanicznych tylnej łapy i wnętrzności jest przydatną techniką obserwacji zmian w percepcji bólu u gryzoni. Odpowiedź na wycofanie może być najpierw mierzona w testach wyjściowych, co zapewnia lepszą kontrolę grup eksperymentalnych. Kolejne badania można wykonać po wywołaniu infekcji i dodaniu leków do protokołu. Zastosowanie elektronicznego aparatu von Freya w połączeniu z użyciem skali twarzy do obserwacji zmian podobnych do bólu pozwala na prostą, precyzyjną i spójną ocenę allodynii i bólu u myszy. W związku z tym eksperymenty wykorzystujące obecną metodologię w przypadku zakażenia Trypanosoma evansi stanowią użyteczną metodę oceny allodynii i bólu u zwierząt zakażonych laboratoryjnie, która może być zastosowana do konwencjonalnego leczenia zwierząt gospodarskich.
Wprowadzenie
Trypanosoma evansi jest czynnikiem etiologicznym choroby zwanej w Ameryce Południowej "surra" lub "mal-das-cadeiras"1,2. Często dotyka koniowatych i bydła, ale także dzikiej fauny, przenoszony przez hematofagiczne nietoperze, tabanidy i ukąszenia much stomoxes1,3. Surra jest poważną chorobą zwierząt domowych, która może być śmiertelna w przypadku braku odpowiedniego leczenia, wykazując niespecyficzne objawy kliniczne, takie jak niedokrwistość, utrata apetytu i masy ciała, osłabienie mięśni i poronienia, które mogą się różnić w zależności od gospodarza i regionu geograficznego2,4,5,6.
Ekspresja allodynii i bólu u zakażonych zwierząt w trakcie choroby to wciąż nowy temat2,7. Chęć zrozumienia patogenezy stojącej za tymi objawami jest ważnym krokiem w kierunku poprawy i udoskonalenia obecnie stosowanego leczenia poprzez dodanie skutecznych leków przeciwbólowych do klasycznego protokołu trypanobójczego5,6. W tym scenariuszu możliwość replikacji choroby przy użyciu modelu mysiego stanowi zaletę, ponieważ myszy można łatwo trzymać w kontrolowanym środowisku w laboratorium, a zatem uzyskują wyniki, które są bardziej spójne niż eksperymenty terenowe z udziałem zwierząt gospodarskich.
Mechaniczny próg jest powszechnie uzyskiwany przy użyciu elektronicznego aparatu von Freya (EvF) do oceny allodynii w ogromnej liczbie eksperymentów2,8,9. To urządzenie służy do oceny wrażliwości tkanek na stymulację mechaniczną: gdy aparat dotknie łapy zwierzęcia, przez końcówkę o pojemności 20-200 μl przymocowaną do urządzenia, rejestrowana jest siła, z jaką zwierzę wycofuje łapę.
Gryzonie są zwykle używane jako standardowe zwierzęta w tych eksperymentach, a większość wyników jest ekstrapolowana na inne gatunki, ponieważ większość badanych chorób pochodzi od innych gatunków, w których trudno byłoby przeprowadzić kontrolowane badania. Co więcej, allodynia i ból są ze sobą ściśle powiązane. Zastosowanie specjalnej skali twarzy do oceny bólu u zakażonych myszy odgrywa ważną rolę jako adiuwant potwierdzający obecność bólu w przebiegu infekcji T. evansi2,10.
W tym protokole demonstrujemy nowy model do oceny allodynii i bólu u myszy eksperymentalnie zakażonych T. evansi, wykazując wysoką korelację między zmiennymi, udowadniając tym samym, że jest to silny model. Co więcej, wymaga to niewielkiej liczby badaczy do przeprowadzenia całej procedury, co zmniejsza ryzyko ingerencji człowieka podczas eksperymentu. Umożliwia to również badaczowi odtworzenie choroby docelowej podczas ostrego przebiegu i dodanie kilku różnych leków terapeutycznych do projektu eksperymentalnego, uzyskując w ten sposób spójne wyniki w krótkim czasie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na 10-tygodniowych dorosłych samicach szwajcarskich myszy (35-55 g). Zwierzęta trzymano w klatkach polisulfonowych (3-5 zwierząt w klatce) w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (21 ± 1 °C), 12 godzinach światła / 12 godzin ciemności oraz standardowej karmę laboratoryjnej i wodzie ad libitum. W każdym teście do każdej grupy przydzielono dziesięć zwierząt, aby zademonstrować spójne efekty leczenia farmakologicznego. Projekt eksperymentalny został przedłożony i zatwierdzony przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Stanowego Santa Catarina (CEUA) (numer protokołu: 6019201123). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Research Council dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie i inokulacja Trypanosoma evansi
UWAGA: Noś jednorazowy fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maskę i ochronę oczu podczas pracy z zakażonymi próbkami krwi, odczynnikami i innymi związkami chemicznymi.
- Włączyć wyposażenie łaźni wodnej i ustawić je na stałą temperaturę 37 °C.
- Wyjąć probówkę do mikrowirówki zawierającą pozostałą próbkę krwi z ultrazamrażarki (-80 °C). Umieść go w łaźni wodnej, aż krew się roztopi.
UWAGA: Ten sam izolat powinien być użyty do zakażenia wszystkich myszy w każdej grupie różnych eksperymentów, aby utrzymać równą liczbę dróg krwi. - Użyć soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,1 M) zawierającej 60% D-(+)-glukozy (pH 7,4) w celu przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania (10:1 v v) aż do uzyskania 1 × 104 trypanosomów na 0,1 ml. Określ liczbę komórek pasożyta poprzez ręczne liczenie komórek za pomocą komory Neubauera na mikroskopie z soczewką obiektywową 100x2.
- Zaszczepić 0,1 ml rozcieńczonego roztworu krwi (grupa zakażona) lub tę samą objętość w 0,9% nośniku soli fizjologicznej (grupa kontrolna), dootrzewnowo, używając igły 26 G 1/2" połączonej ze strzykawką insulinową.
2. Konfiguracja i obsługa elektronicznego aparatu von Freya
UWAGA: Bądź ostrożny w kwestii zapisywania uzyskanych danych. Niektóre urządzenia EvF posiadają specjalne programy do przesyłania uzyskanych danych z aparatury do innych urządzeń elektronicznych, takich jak komputery, tablety czy smartfony.
- Włącz aparat EvF. Upewnij się, że sprzęt jest dobrze naładowany przed rozpoczęciem eksperymentu, obserwując poziom naładowania baterii wyświetlany na ekranie urządzenia i ładując go w razie potrzeby.
- Podłącz aparat EvF do wybranego urządzenia elektronicznego za pośrednictwem Wi-Fi, aby przesłać i zapisać uzyskane dane.
- Włóż końcówkę polipropylenową o pojemności 10 μl do stożka aparatu EvF i ustaw odczyt na zero (0,00 g), naciskając przycisk z symbolem łapy.
- Zauważ, że po zbadaniu ocenianej tkanki, maksymalne zastosowane ciśnienie jest pokazane na wyświetlaczu aparatu EvF. Następnie przenieś go do wybranego urządzenia elektronicznego, naciskając przycisk z symbolem anteny, aby zapewnić bezpieczne nagrywanie.
- Zresetuj odczyt do zera i przygotuj się do wykonania nowego pomiaru, po prostu ponownie naciskając przycisk z symbolem łapy.
3. Ogólne uwagi dotyczące oceny progów mechanicznych
- Wykonuj wszystkie eksperymenty w cichym pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą 21 °C i cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności, i pamiętaj, aby przestrzegać cyklu okołodobowego myszy, wykonując wszystkie oceny o tej samej porze dnia2.
- Niech ta sama osoba wykona zarówno podstawową, jak i eksperymentalną ocenę progów mechanicznych, aby zmniejszyć błąd systematyczny i zapewnić spójność pomiaru; upewnij się, że eksperymenty są zaślepione.
- Umieść każdą mysz delikatnie w osobnej komorze wykonanej z polimetakrylanu metylu (PMMA) z perforowaną górą umieszczoną na stojaku podłogowym z siatki o powierzchni 5 mm²2,8.
- Pozwól myszom zaaklimatyzować się przez 30 minut w komorach PMMA przed oceną zarówno podstawowych, jak i eksperymentalnych progów mechanicznych2.
- Umieść siatkowy stojak podłogowy na wygodnej wysokości (na stabilnej powierzchni), aby zwierzęta były dostępne ze wszystkich stron. Upewnij się, że brzuch i wszystkie cztery łapy myszy są łatwo dostępne przez otwory w podłodze z siatki.
- Przykryj stałą powierzchnię używaną do przydzielenia komór materiałem chłonnym do wchłaniania lub zbierania mikcji i kału. Upewnij się, że ramiona badacza mogą swobodnie poruszać się pod komorami podczas obsługi aparatu EvF.
4. Wyjściowa ocena progu mechanicznego i reakcja myszy na bodźce
- Aby uzyskać pomiary brzucha, podziel brzuch na trzy wirtualne części (obszar czaszki, średni i ogonowy). Wybierz obszar czaszki (anatomicznie zawierający wątrobę) jako standardową tkankę docelową do mechanicznej oceny progu allodynii trzewnej. Do pomiarów łapy wybierz odpowiednią tylną łapę w celu standaryzacji.
- Wykonaj pomiar wyjściowy od każdej myszy na 48 godzin przed zakażeniem. Aby to zrobić, umieść myszy w komorach zawierających, przygotuj aparat EvF i użyj obu rąk, aby powoli podnieść sondę, aby stymulować docelową tkankę.
- Stopniowo zwiększaj nacisk na tkankę, aż mysz wyrazi zachowanie nocyceptywne. Aby ocenić prawą tylną łapę, poszukaj chowania łapy, lizania łapy lub skakania na czterech łapach2,8,9. Aby uzyskać ocenę trzewną, poszukaj ostrego cofnięcia brzucha, natychmiastowego lizania lub drapania badanego miejsca lub skakania na czterech łapach2,11.
- Zapisz uzyskaną wartość, przenosząc dane do wybranego urządzenia elektronicznego zawierającego określony program EvF lub zapisując je w dzienniku ocen. Zresetuj wyświetlacz do zera i powtórz proces cztery razy, aby uzyskać pięć pomiarów8.
UWAGA: Weź pod uwagę tylko trzy podobne pomiary, aby oszacować wartość średnią2 - Zmierz próg mechaniczny myszy znajdującej się w sąsiedniej komorze, aż każda mysz zostanie zbadana pięć razy i uzyska średnią wartość dla każdego zwierzęcia.
- Powtórz pomiary podstawowe 24 godziny później i wyklucz myszy ze średnimi wartościami poniżej 3,00 g lub z różnicami między pomiarami podstawowymi większymi niż 2,00 g2,8,
UWAGA: W każdym eksperymencie dla każdej myszy musi zostać wybrana tylko jedna tkanka docelowa, aby zwierzęta nie przyzwyczaiły się do bycia sondowanym, ponieważ liczba ocen byłaby znacznie wyższa w krótkim czasie.
5. Eksperymentalna ocena progu mechanicznego prawej tylnej łapy i allodynii trzewnej
- Oceń próg mechaniczny prawej tylnej łapy lub allodynii trzewnej 1 godzinę po infekcji do oceny dnia 0.
- Powtarzaj procedurę co 24 godziny przez 5 dni po zakażeniu.
UWAGA: jeśli istnieje leczenie, które ma być zastosowane, wybierz odpowiedni punkt czasowy w projekcie eksperymentalnym. - Przywróć myszy do ich oryginalnych klatek, aby zapobiec walce zwierząt ze sobą, z dostępem do standardowej karmy laboratoryjnej i wody ad libitum po zakończeniu pomiarów.
- Wykonaj test normalności, aby sprawdzić rozkład normalny danych i dalszą odpowiednią analizę statystyczną zebranych danych.
6. Ocena skali grymasu myszy
- Upewnij się, że każda mysz jest dobrze widoczna, gdy znajduje się w komorze przechowawczej i zbadaj każdą mysz przed eksperymentem, aby upewnić się, że nie ma żadnych zmian na kończynach, brzuchu lub twarzy i nie ma zmian w sierści.
- Obserwuj obszar orbity myszy. Sklasyfikuj otwarte oczy jako brak bólu (wynik 0), podczas gdy oczywisty ból może być reprezentowany, gdy mysz zamyka oczy (wynik 2).
- Obserwuj nos myszy. Sklasyfikuj normalny nos jako brak bólu, podczas gdy obecność wybrzuszenia na grzbiecie nosa oznacza oczywisty ból.
- Obserwuj policzki myszy. Klasyfikuj normalne policzki jako brak bólu, podczas gdy obecność wybrzuszenia na obu policzkach oznacza oczywisty ból.
- Obserwuj położenie uszu myszy. Sklasyfikuj zaokrąglone uszy jako brak bólu, podczas gdy uszy obracające się na zewnątrz lub do tyłu, z dala od twarzy, w spiczastym kształcie, reprezentują oczywisty ból. Przestrzeń między uszami zwiększa się wraz z oceną bólu.
- Obserwuj wąsy myszy. Sklasyfikuj wąsy z ich naturalną krzywizną w dół jako brak bólu, podczas gdy wąsy, które są albo odciągnięte do policzka, albo pociągnięte do przodu, reprezentują oczywisty ból.
- Ponieważ wrodzone zachowania, takie jak samodzielna pielęgnacja, mogą zakłócać wyraz twarzy, nie traktuj ich jako zachowań związanych z bólem8. Poczekaj, aż mysz zatrzyma to zachowanie przed każdą oceną jednostki akcji.
- Wykonaj test normalności, aby sprawdzić rozkład normalny danych i dalszą odpowiednią analizę statystyczną zebranych danych.
UWAGA: Pod koniec wszystkich eksperymentów myszy zostały humanitarnie poddane eutanazji przy użyciu ketaminy (90 mg / kg) i ksylazyny (7,5 mg / kg), wstrzykiwanych dootrzewnowo. Po osiągnięciu potwierdzonego planu głębokiego znieczulenia, zostały one poddane zwichnięciu szyjki macicy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obniżenie progu mechanicznego w wyniku zakażenia T. evansi oceniane za pomocą elektronicznego aparatu von Frey na prawej tylnej łapie oraz w tkankach trzewnych
Eksperyment przeprowadzono w ciągu 5 dni, zgodnie z wcześniejszymi danymi dotyczącymi dostępnej próbki T. evansi2. U zakażonych myszy zaczęto obserwować istotną różnicę w progu mechanicznym prawej tylnej łapy w 3. dniu po zakażeniu, a wartość ta pozostawała istotnie niższa niż w grupie kontrolnej przez...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowym krokiem w eksperymentach z udziałem zakażonych zwierząt jest kontrola poziomu parazytemii. Różne szczepy T. evansi mogą zachowywać się w różny sposób u myszy, prowadząc od ostrych do przewlekłych infekcji 2,4,5,6. Ponadto zmiany dawki zakażenia mogą skrócić lub wydłużyć czas przeżycia myszy. Dlatego zaleca się uzyskanie krzywej przeżycia przed eksperymentami, aby określić pra...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Uniwersytetowi Stanowemu Santa Catarina za wsparcie finansowe, Laboratorium Farmakologii za zwierzęta i przestrzeń oraz Laboratorium Biochemii Hemopasożytów i Wektorów za kriokonserwowaną próbkę krwi zakażonej T. evansi użytą w tych eksperymentach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła 26 G 1/2" sprzężona ze strzykawką insulinową | TKL | 80288090100 | Służy do infundowania roztworów na zwierzętach laboratoryjnych |
| Akcesoria do analgezymetru von Freya | INSIGHT | EFF 303 | Skrzynka hermetyczna z obsługą cyfrowej oceny analgezymetru |
| D-(+)-Glukoza | SIGMA-ALDRICH | G7021 | Monosacharyd, który jest głównym źródłem energii w postaci ATP dla organizmów żywych |
| Cyfrowy analgezymetr | INSIGHT | firmy Frey Wi-Fi | Von Frey Wi-Fi to przenośne urządzenie służące do oceny wrażliwości tkanek na bodźce mechaniczne |
| Gilson typ 10 i mikro; L końcówka polipropylenowa | CRALPLAST | 18261 | Polipropylen do stosowania w aparaturze elektronicznej von Freya, zalecany do oceny allodynii tylnej łapy |
| Laboratoryjna łaźnia wodna | INSTRUMENT BĘDĄCY | BW-22P | Służy do podgrzewania substancji ciekłych i półstałych zawartych w odpowiednich odbiornikach do określonej temperatury |
| Solak buforowany fosforanami | SIGMA-ALDRICH | 806552 | Zbilansowany bufor roztworu soli stosowany do różnych zastosowań w hodowlach komórkowych |
| Myszy szwajcarskie (Mus musculus) od zwierząt obu płci | UFSC | Webster | Laboratory wykorzystywanych do kontrolowanych eksperymentów |
| Trypanosoma evansi kriiokonserwowana próbka | UDESC-Próbka | używana do zakażenia wszystkich myszy, scedowana przez Laboratorium | |
| Biochemii Hemopasożytów i WektorówUniwersalny typ 10 i mikro; L końcówka polipropylenowa | CRALPLAST | 18171 | Polipropylen do stosowania w elektronicznym aparacie von Freya, zalecany do oceny allodynii trzewnej |
Bibliografia
- Desquesnes, M., et al. Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Research International. 2013, 194176(2013).
- Cipriani, D. S., et al. Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition. Experimental Parasitology. 247, 108477(2023).
- Paim, F. C., et al. Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi. Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).
- Gillingwater, K., et al. In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).
- Dkhil, M. A., et al. Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation. Frontiers in Microbiology. 13, 833520(2022).
- Dkhil, M. A., et al. Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis. Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).
- Martins de Moraes, C., et al. Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 102 (561-562), 159-163 (2007).
- Martinov, T., et al. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of Visualized Experiments. 82, e51212(2013).
- Rodríguez-Angulo, H., et al. Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease. Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7, 447-449 (2010).
- Eijkelkamp, N., et al. Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).
- Mekata, H., et al. Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi. Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).
- Mukaka, M. M. Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Schober, P., et al. Correlation coefficients: appropriate use and interpretation. Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).
- Kamidi, C. M., et al. Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice. Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).
- Mekata, H., et al. Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).
- Silva, A. S., et al. Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood. Ciência Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).
- Silva, A. S., et al. Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi. Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).
- Diógenes, A. K. L., et al. Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain. Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
