Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Summary

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Abstract

Fotometria masowa to wszechstronna technologia pomiaru masy, która umożliwia badanie oddziaływań biomolekularnych i tworzenia złożonych kompleksów w roztworze bez etykiet. Fotometria masowa jest ogólnie przystosowana do analizy próbek w zakresie stężeń 100 pM-100 nM. Jednak w wielu systemach biologicznych konieczne jest mierzenie bardziej skoncentrowanych próbek w celu zbadania oddziaływań o niskim powinowactwie lub przejściowych. Tutaj demonstrujemy metodę, która skutecznie rozszerza zakres stężeń próbek, które można analizować za pomocą fotometrii masowej, od nanomolowych do kilkudziesięciu mikromolowych.

W tym protokole, fotometria masowa jest połączona z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania powstawania kompleksów białkowych w roztworze w zakresie stężeń mikromolowych. Dzięki systemowi mikrofluidycznemu użytkownicy mogą utrzymywać próbkę w pożądanym wyższym stężeniu, a następnie rozcieńczać ją do zakresu nanomolowego - na kilka milisekund przed pomiarem fotometrii masy. Ze względu na szybkość rozcieńczania, dane uzyskuje się przed przesunięciem równowagi próbki (tj. dysocjacją kompleksu).

Technika ta jest stosowana do pomiaru interakcji między przeciwciałem immunoglobuliny G (IgG) a receptorem Fc u noworodka, pokazując tworzenie kompleksów wysokiego rzędu, które nie były mierzalne za pomocą statycznych pomiarów fotometrycznych masy.

Podsumowując, połączenie fotometrii masowej i mikrofluidyki umożliwia charakteryzowanie próbek w zakresie stężeń mikromolowych i jest biegłe w pomiarze oddziaływań biomolekularnych o słabszym powinowactwie. Możliwości te mogą być stosowane w wielu kontekstach - w tym w opracowywaniu i projektowaniu bioterapeutyków - umożliwiając dokładne scharakteryzowanie różnych interakcji białko-białko.

Introduction

Interakcje białko-białko podkreślają większość funkcji komórkowych, od regulacji immunologicznej po replikację i translację DNA. W związku z tym w naukach przyrodniczych istnieje fundamentalna potrzeba zbadania szerokiego zakresu interakcji w różnych heterogenicznych kompleksach, które są powszechnie tworzone. Jednak ich wykrywanie, charakteryzacja i kwantyfikacja są często trudne, szczególnie w przypadku interakcji o niskim powinowactwie¹.

Testy immunoprecypitacji są często używane do wykrywania oddziaływań o wysokim powinowactwie, ale dla interakcji o niskim powinowactwie i przejściowych wykrycie jest w dużej mierze niewykonalne². Można również stosować techniki fluorescencyjne, ale wymagają one potencjalnie uciążliwego dodawania etykiet fluorescencyjnych². Cryo-EM może zapewnić migawkę strukturalną i całościowy odczyt kompleksów białkowych utworzonych z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ale zazwyczaj wymaga również pracy w stężeniach, które są zbyt niskie, aby obrazować interakcje o niskim powinowactwie. Cryo-EM niesie ze sobą również wyzwania związane z kosztami, dostępnością, przygotowaniem próbki i czasem analizy³.

Dodatkowo, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) stał się popularnym sposobem ilościowego określania interakcji białko-białko, chociaż wymaga immobilizacji białka, co może wpływać na równowagę wiązania i powodować zmienne szybkości, zmniejszając w ten sposób dokładność pomiaru^4,5. Obejmuje również kilka etapów testu przed zebraniem i analizą danych⁶.

Fotometria masowa to technika jednocząsteczkowa, która została wykorzystana do analizy interakcji białko-białko5^,6,7. Jego działanie polega na pomiarze masy pojedynczych cząsteczek lub kompleksów na podstawie światła, które rozpraszają, gdy lądują na powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego⁸. Pomiary fotometrii masowej zostały wykorzystane do ilościowego określenia powinowactwa wiązań na podstawie względnej obfitości partnerów wiążących i kompleksów, które tworzą⁵. Niemniej jednak, podobnie jak w przypadku innych technik jednocząsteczkowych, stężenie mierzonej próbki powinno być zazwyczaj mniejsze niż 100 nM. Jeśli stężenie jest wyższe, cząsteczki lądujące na powierzchni szkła będą nakładać się przestrzennie, co spowoduje niską jakość danych⁷. W związku z tym słabsze oddziaływania (K_D ~mikromolowe), które dysocjują przy tych niższych stężeniach, nie mogą być wiarygodnie zmierzone, ponieważ nie jest możliwe zaobserwowanie niezbędnej mieszaniny gatunków niezwiązanych i związanych⁵.

Tutaj opisujemy podejście, które pokonuje to ograniczenie w oparciu o nowe sprzężone urządzenie do mikrofluidyki do masowej fotometrii. W szczególności system mikrofluidyczny jest używany w połączeniu z fotometrem masy, aby skutecznie rozszerzyć zakres oddziaływań, które można określić ilościowo za pomocą fotometrii masowej. Wykazano, że mikrofluidyka oferuje szereg możliwości badania interakcji białko-białko, w tym szybkie rozcieńczanie w celu wykrycia słabych oddziaływań^1,9. Opisany tutaj system działa poprzez szybkie rozcieńczenie próbki do 10 000 razy na chipie mikroprzepływowym i natychmiastowe przelanie jej przez obszar obserwacji chipa, umożliwiając rozpoczęcie pomiaru fotometrii masowej w ciągu 50 ms od momentu, gdy cząsteczki rozpoczęły proces rozcieńczania¹⁰. Rozcieńczenie następuje, gdy próbka i bufor są połączone w odwróconym mieszaczu zaworu Tesli na chipie, przy czym względne natężenia przepływu dwóch roztworów określają ilość występującego rozcieńczenia (patrz krok 8 protokołu). Natężenie przepływu można kontrolować za pomocą oprogramowania do sterowania mikroprzepływowego. Zmiana natężenia przepływu może zmienić względną populację gatunku, ponieważ może wpłynąć na liczbę lądowań na powierzchni szkła, co jest mierzone przez fotometr masy.

Szybkość procesu jest na tyle duża, że pomiar może zostać zakończony, zanim integralność interakcji zostanie zakłócona (więcej szczegółów znajdziesz również w Dyskusji). Można to zrozumieć poprzez krótkie spojrzenie na teorię reakcji pierwszego rzędu, gdzie . Stała szybkości do przodu (asocjacyjna) wynosi k_f, stała szybkości wstecz (dysocjacji) wynosi k_b, a stała dysocjacji równowagi (K_D) jest zdefiniowana jako

K_D = k_b / _{k f}

Dla wiązania białek, k_f jest generalnie ograniczony przez dyfuzję reagentów¹¹ i tak jest ograniczony do zakresu 10^{6-10 7 M-1}·^s-1. Ponieważ zakres jest ograniczony, reakcja o niskim powinowactwie (K_D ~ mikromolowe) będzie miała k_b ≈ 1 ^s-1. Oznacza to, że k_b = k_f · K_D = (10^{6 M-1}·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, z okresem półtrwania kompleksu około 0,7 s^11,12.

Nasz przykładowy system to wiązanie przeciwciała monoklonalnego IgG trastuzumabu z rozpuszczalną domeną receptora IgG noworodkowego receptora Fc (FcRn), które są znanymi partnerami oddziałującymi¹³. Wcześniej opublikowane dane uzyskane przy użyciu samej konwencjonalnej fotometrii masowej (tj. z ręcznym rozcieńczeniem próbek) wykazały, że białka tworzą wiele gatunków. Monomery FcRn, dimery FcRn i niezwiązane IgG były wyraźnie widoczne, podczas gdy kompleksy IgG-FcRn (w stosunku 1:1 i 1:2) również zostały wykryte (przy pH 5,0), ale tylko z bardzo niską obfitością⁵. Obserwacja ta nasuwa pytanie, czy tworzenie się kompleksu IgG-FcRn może być wyraźniej wykryte, jeśli jest mierzone w wyższym stężeniu. Rzeczywiście, połączenie fotometrii masowej z opisanym tutaj podejściem do szybkiego rozcieńczania dostarczyło bardziej wiarygodnych dowodów na tworzenie się kompleksów poprzez wzrost mierzonych przez nie cząstek.

Opisany tutaj protokół masowej fotometrii i mikrofluidyki umożliwia scharakteryzowanie powstawania kompleksów o_{K D} aż do zakresu mikromolowego. Empiryczne określenie K_D będzie wymagało dalszej poprawy dokładności czujnika przepływu, stabilności pompy, zmian między wiórami i lokalizacji pomiaru w oknie obserwacyjnym, ponieważ wszystkie te czynniki wpłynęłyby na czas od rozcieńczenia próbki do pomiaru.

To samo podejście można zastosować do zbadania wiązania między jakimikolwiek rozpuszczalnymi białkami, pod warunkiem, że mają one różne masy cząsteczkowe (oddzielone co najmniej 25 kDa), które mieszczą się w zakresie odpowiednim do analizy za pomocą fotometru masowego (30 kDa do 6 MDa). Uzyskane spostrzeżenia mogą być pomocne w badaniach w różnych kontekstach - od uzyskania mechanistycznego zrozumienia funkcji komórkowych po projektowanie nowych leków bioterapeutycznych.

Protocol

1. Przygotowanie instrumentów i uruchomienie oprogramowania

1. Włącz fotometr masy i pozostaw go włączony na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów.
   UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ przyrząd musi osiągnąć stałą temperaturę. Niepozostawienie włączonego fotometru masy na 1 godzinę może prowadzić do przesunięcia masy, a tym samym niedokładnych wyników.
2. Włącz stół antywibracyjny, włączając zasilanie i naciskając przycisk izolacji (pod fotometrem masy). Wibracje ograniczają wydajność przyrządu do fotometrii masowej, dlatego stół antywibracyjny jest ważny, aby zapewnić maksymalną czułość instrumentu. Włącz skrzynkę mikrofluidyczną.
3. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i oprogramowanie sterujące mikrofluidyką. Włącz sprężarkę powietrza.

2. Przygotowanie próbek białka, buforu i roztworów czyszczących

1. Dodaj 200 ml buforu PBS (pH 7,4) do czystej butelki o pojemności 200 ml i 200 ml buforu PBS (pH 5,0) do drugiej butelki o pojemności 200 ml.
   UWAGA: W następnych krokach butelki o pojemności 200 ml będą musiały zostać podłączone do czujnika jednostki przepływu "L". Użyj buforu pH 7,4 PBS do pomiaru kalibracyjnego i buforu pH 5,0 PBS do pomiaru próbki.
2. W probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml wymieszaj IgG (2 μM) i FcRn (20 μM) w stosunku 1:10, uzyskując całkowitą objętość 60 μl.
   1. Roztwory podstawowe dla FcRn i IgG wynoszą odpowiednio 91,9 μM i 13,5 μM. Przygotować reakcję, mieszając 9 μl podstawowej IgG + 13 μl wyjściowej FcRn + 38 μl PBS (pH 5,0, temperatura pokojowa [RT]) w probówce wirówkowej do całkowitej objętości 60 μL. Końcowe stężenia dla dwóch reagentów wynosiły 2 μM dla IgG i 20 μM dla FcRn. Utrzymuj wszystkie zapasy białka na lodzie przez cały ten proces.
3. Do kolejnej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml wlej 20 μl kalibru β-amylazy o stężeniu 20 μM.
   1. Na przykład, aby przygotować zastosowany tutaj kaliber β-amylazy, postępuj zgodnie z procedurą opisaną w 2.3.1.1-2.3.1.2.
      1. Zawiesić 20 mg proszku β-amylazy w fiolce w 3,57 ml PBS (5% glicerolu), co odpowiada 5,6 mg/ml i stężeniu molowemu 100 μM (ponieważ masa cząsteczkowa wynosi 56 kDa).
      2. Aby rozcieńczyć do 20 μM, należy połączyć 200 μl 100 μM podstawowego z 800 μl PBS (pH 7,4, RT) w probówce wirówkowej o pojemności 1 ml.
4. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut
   UWAGA: Przygotowanie próbki i rozcieńczeń kalibru należy rozpocząć po włączeniu fotometru masowego. W tym eksperymencie próbki inkubowano przez 120 minut.
5. W trzech probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml podwielokrotność: 50 ml PBS (pH 7,4) - roztwór czyszczący 1 (CS1), 50 ml 0,5 M NaOH - roztwór czyszczący 2 (CS2) i 50 ml 100% IPA - roztwór czyszczący 3 (CS3).

3. Konfiguracja eksperymentalna

1. Aby załadować próbkę i kaliber, umieść probówkę wirówki kalibru w pozycji 4, a probówkę wirówki do próbek w pozycji 5 pudełka mikrofluidyki (Rysunek 1).
2. Aby załadować roztwory czyszczące, umieść CS1, CS2 i CS3 w pozycjach 1, 2 i 3 pudełka mikrofluidyki (Rysunek 1).
   UWAGA: Roztwór próbek, calibrant i roztwory czyszczące są podłączone do przełącznika wielofunkcyjnego (przełącznika m). Przełącznik m jest podłączony do czujnika jednostki przepływu "S".
3. Nakręcić nakrętkę łączącą się z przewodem buforowym do butelki z buforem o pojemności 200 ml (pH 7,4).
   UWAGA: Przewód buforowy jest podłączony do zaworu odcinającego, który jest podłączony do czujnika jednostki przepływu "L". Zawór odcinający zapobiega efektom zasysania, które mogą wystąpić po zatrzymaniu przepływu bufora. Zasysanie może prowadzić do zanieczyszczenia buforu z rozcieńczonego płynu resztkowego powracającego do zbiornika buforowego.
4. Umieść chip mikrofluidyczny na płytce przygotowawczej.
   Wciśnij drugi koniec rurki czujnika jednostki przepływu "S" do "Wlotu próbki" pierwszego kanału w chipie mikroprzepływowym (Rysunek 1). Linia próbkowania jest kompletna.
5. Wciśnij drugi koniec rurki czujnika jednostki przepływu "L" do "wlotu bufora" pierwszego kanału w chipie mikroprzepływowym ( Rysunek 1). Linia bufora jest kompletna.
6. Aby zebrać odpływ, wepchnij rurkę do "Wylotu" pierwszego kanału w chipie mikroprzepływowym; ustaw drugi koniec tak, aby spływał do pojemnika lub zlewki (Rysunek 1).

4. Gruntowanie linii próbki i bufora za pomocą bufora

1. Otwórz ręczny zawór odcinający na przewodzie buforowym.
2. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką ustaw natężenie przepływu w przewodzie buforowym na 1000 μl/min i upewnij się, że ciśnienie w przewodzie buforowym nie przekracza 110 mbar (Rysunek 2). Przepływ rozpocznie się automatycznie w linii bufora (Rysunek 1).
   UWAGA: Jeśli ciśnienie w przewodzie buforowym przekracza 110 mbar, może to być spowodowane przepływem powietrza przez czujnik przepływu. Jeśli ciśnienie nie wróci do normy w ciągu kilku sekund, może dojść do zablokowania (zwykle z powodu ściśniętych przewodów na połączeniach). W takim przypadku należy zatrzymać przepływ i sprawdzić połączenia w przewodzie buforowym, zaczynając od zaworu odcinającego.
3. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką wybierz pozycję 1 przełącznika m (odpowiadającą buforowi PBS), a następnie ustaw natężenie przepływu w przewodzie próbkowania na 8 μl/min i upewnij się, że ciśnienie w przewodzie próbki nie przekracza 350 mbar. Przepływ rozpocznie się automatycznie w linii próbkowania (Rysunek 1).
4. Użyj końcówki pipety (lub innego miękkiego elementu z tworzywa sztucznego), aby delikatnie docisnąć od góry w pobliżu pęcherzyków uwięzionych w chipie, aby usunąć pęcherzyki powietrza i upewnić się, że zostały one usunięte przez wylot.
   UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszystkie bąbelki w sekcjach 'mikser' i 'obszar obserwacji' (Rysunek 1) używanego kanału. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno, ponieważ może to spowodować uszkodzenie chipa.

5. Umieszczenie chipa mikroprzepływowego na masowym fotometrze i znalezienie ogniska

1. Nałóż kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu na obiektyw masowego fotometru.
2. Umieść chip mikroprzepływowy na uchwycie fotometru masowego z "wlotem próbki" skierowanym do góry i przytrzymaj go przymocowany do stage clamps (Rysunek 1). Upewnij się, że wszystkie połączenia przewodów pozostają podłączone.
3. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, przesuń stolik, aby upewnić się, że "Obszar obserwacji" kanału 1 jest wyrównany z celem (Rysunek 1).
4. Zamknij pokrywę masowego fotometru i naciśnij opcję Droplet-Dilution Find Focus w oprogramowaniu do akwizycji danych.
5. Sprawdź biały pierścień ostrości w lewym dolnym rogu oprogramowania do akwizycji danych (Rysunek 3). Przerwy w pierścieniu wskazują na obecność pęcherzyka powietrza w olejku immersyjnym; Usuń to, zwiększając prędkość stolika do maksimum i delikatnie przesuwając stolik na boki.
6. Po zakończeniu ustawiania ostrości odczekaj 2-3 minuty przed wykonaniem pierwszego nagrania. Następnie naciśnij przycisk Record, aby zarejestrować pomiar trwający 1 minutę i upewnij się (obserwując pomiar), że nie pojawiają się żadne zanieczyszczenia.
   UWAGA: Zanieczyszczenia mogą znajdować się na powierzchni szkła lub w buforze. Wartość ostrości w oprogramowaniu do akwizycji danych powinna wynosić powyżej 4,5%.

6. Kalibracja fotometrii masowej

1. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką przełącz przełącznik m w pozycję 4 (odpowiadającą kalibrowi) i upewnij się, że natężenie przepływu w linii próbki jest ustawione na 8 μl/min, a ciśnienie w przewodzie próbki nie przekracza 350 mbar (Rysunek 2).
   1. Kaliber rozpocznie przepływ przez chip. Odczekaj około 1.5-2.5 minuty (lub do momentu, gdy kaliberat będzie stale widoczny w oprogramowaniu do akwizycji danych). Czas może się różnić w zależności od długości rurki linii próbkowania.
2. Gdy kalibert jest stale obserwowany (tj. liczba zdarzeń jest wystarczająca do dokładnego pomiaru fotometrii masy), w oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką zmniejsz natężenie przepływu do 0,5 μl/min - docelowy poziom rozcieńczenia dla tego eksperymentu.
   UWAGA: Rozpoczęcie od wyższego natężenia przepływu po prostu skraca czas potrzebny na dotarcie kalibru do chipa.
3. Upewnij się, że na powierzchni pomiarowej nie ląduje "za mało" lub "za dużo" cząsteczek (Rysunek 4).
   1. Jeśli gęstość zdarzenia lądowania nie jest "idealna" (Rysunek 4), zmień natężenie przepływu w oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką. Jeżeli gęstość zdarzeń jest zbyt niska, należy zwiększać natężenie przepływu próbki, aż do zaobserwowania dobrze oddzielonych zdarzeń lądowania (ale nie należy przekraczać 8 μl/min). Jeśli jest zbyt wysoka, zmniejsz natężenie przepływu próbki (ale nie należy schodzić poniżej 0,1 μl/min).
   2. Jeśli objętość kalibru jest mała w probówce na próbkę, zmień pozycję przełącznika m na linię PBS pH 7,4 (pozycja 1), aby uniknąć wstrzykiwania powietrza.
4. Naciśnij przycisk nagrywania i wykonaj pomiar 60 sekund. Zapisz plik w wybranym folderze.
   UWAGA: Oprogramowanie do akwizycji danych tworzy pliki z rozszerzeniem .mp.

7. Czyszczenie linii próbkowania i zatrzymywanie przepływu

1. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką przełącz się na pozycję 2 przełącznika m i zmień ciśnienie próbki na 800 mbar (Rysunek 2). Przepłukać system roztworem CS2 (NaOH) przez 4 minuty.
2. Przełącz na pozycję 3 przełącznika m i przepłucz system za pomocą CS3 (IPA) przez 4 minuty.
3. Przełącz na pozycję 1 przełącznika m i przepłucz system za pomocą CS1 (PBS) przez 4 minuty.
4. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką zatrzymaj cały przepływ, ustawiając ciśnienie w przewodzie próbkowania i przewodzie buforowym na 0 i wyłącz zawór buforowy.
5. Odłącz wiór od stolika i umieść go z powrotem na płycie przygotowawczej. Odłącz wszystkie rurki i umieść sample końcówka rurki w butelce na odpady. Wyczyść obiektyw izopropanolem i chusteczkami.

8. Pomiar próbki fotometrii masowej

1. Odkręcić nakrętkę podłączoną do butelki z buforem o pojemności 200 ml (pH 7,4) i przykręcić ją do butelki z buforem o pojemności 200 ml (pH 5,0).
2. Powtórz kroki 3.4-5.6, ale użyj drugiego kanału układu zamiast pierwszego.
3. W oprogramowaniu sterującym mikrofluidyką przełącz przełącznik m w pozycję 5 (odpowiadającą próbce), ustaw natężenie przepływu w linii próbki na 8 μl/min i upewnij się, że ciśnienie w przewodzie próbki nie przekracza 350 mbar (rysunek 2).
4. Powtórzyć kroki 6.2-6.4, aby zmierzyć próbkę.
   1. Aby obliczyć natężenia przepływu do użycia, należy upewnić się, że różnica w natężeniu przepływu odpowiada pożądanemu współczynnikowi rozcieńczenia próbki. Na przykład, aby osiągnąć rozcieńczenie 2000x, natężenia przepływu różnią się o współczynnik 2000; natężenie przepływu bufora wynosi 1000 μl/min, a natężenie przepływu próbki wynosi 0,5 μl/min. Pod koniec eksperymentu zawsze pozostawiaj linie czyste, postępując zgodnie z protokołem czyszczenia.

9. Analiza danych

1. Po zakończeniu zbierania danych uruchom oprogramowanie do analizy danych (Rysunek 5).
2. Kliknij ikonę plusa (+) w lewym górnym rogu i wybierz plik .mp calibrant. Oprogramowanie rozpocznie analizę załadowanego pliku. W zależności od wielkości i liczby pomiarów może to potrwać kilka minut
   1. Nie należy analizować plików .mp w oprogramowaniu do analizy danych podczas pozyskiwania danych za pomocą oprogramowania do akwizycji danych, ponieważ może to obniżyć jakość pozyskiwanych danych.
3. Naciśnij przycisk Utwórz wzorcowanie masy (w prawym dolnym rogu). Otworzy się okno dialogowe z tabelą wypełnioną wartościami kontrastu dopasowanych szczytów.
4. Zmień wartości na znane wartości masy dla dopasowanych pików (dla β-amylazy wartości te wynoszą 56 kDa, 112 kDa i 224 kDa) i naciśnij przycisk Zapisz. Nowo utworzony plik kalibracyjny (rozszerzenie .mc) pojawi się w panelu Wzorcowanie masy (lewy dolny róg oprogramowania do analizy danych) (Rysunek 6).
5. Kliknij ikonę plusa (+) w lewym górnym rogu i wybierz przykładowy plik .mp.
6. Aby utworzyć histogram masy, jak pokazano w Rysunek 5, przejdź do zakładki Analiza, wybierz tryb Histogram i opcję Wykres masowy. W razie potrzeby dostosuj szerokość pojemnika, limity masy i inne parametry.
7. W razie potrzeby dostosuj wykres w zakładce Rysunki przed wyeksportowaniem figur i/lub zapisaniem całego obszaru roboczego jako pliku .dmp.

Results

Fotometria masowa została użyta do zmierzenia interakcji między przeciwciałem monoklonalnym IgG trastuzumabem a rozpuszczalną domeną receptora IgG noworodkowego Fc (FcRn). Mieszaninę dwóch białek w stosunku 1:10 (w stężeniu 2 μM dla IgG i 20 μM dla FcRn) rozcieńczono ręcznie odpowiednio do 10 nM i 20 nM w PBS.

Krok rozcieńczania jest konieczny, ponieważ fotometria masowa, technika pomiaru masy pojedynczej cząsteczki, może analizować tylko próbki w zakresie 100 pM-100 nM. Próba pomiaru próbek o stężeniach spoza tego zakresu może zagrozić dokładności wyników (Rysunek 4). Ten eksperyment nie jest uwzględniony w tym protokole, ponieważ został opisany wcześniej^5,6.

W histogramach masowych tworzonych w eksperymencie masowej fotometrii, siła sygnału rozpraszania (lub 'kontrastu') dla każdego zdarzenia lądowania jest wykreślana na osi x, a następnie przekształcana na masę cząsteczkową za pomocą kroku kalibracji kontrastu masy. Tymczasem oś y wskazuje liczbę cząsteczek zliczonych o danej masie (lub kontraście). Dlatego pik wskazuje na obecność populacji cząsteczek w zakresie mas cząsteczkowych pokazanych na osi x. Liczba zdarzeń (liczb), które składają się na szczyt, odzwierciedla wielkość tej populacji.

Pomiar fotometrii masowej z ręcznym rozcieńczeniem dał wynik histogramu masy, gdzie dwa największe piki, oparte na oczekiwanej masie cząsteczkowej białek, odpowiadały niezwiązanym monomerom FcRn (~50 kDa) i monomerom przeciwciał IgG (~150 kDa) (Rysunek 7). Podobnie jak w przypadku poprzednio opublikowanych danych z fotometrii masowej⁵, gatunki niezwiązane były widoczne, podczas gdy piki w zakresach mas, które odpowiadałyby kompleksom, były znacznie mniej widoczne.

Eksperyment został powtórzony przy użyciu systemu mikrofluidycznego do szybkiego rozcieńczania mieszaniny do wymaganego stężenia bezpośrednio przed pomiarem fotometrii masy. Podejście to umożliwiło wykrycie dodatkowych kompleksów o niskim powinowactwie, które mogły ulec dysocjacji na etapie ręcznego rozcieńczania. Aby uzyskać ten sam współczynnik rozcieńczenia 2000x, który zastosowano w eksperymencie ręcznego rozcieńczania, mieszaninę próbek w stosunku 1:10 (o stężeniu 2 μM dla IgG i 20 μM dla FcRn) przepłynęto na chip mikroprzepływowy z szybkością 0,5 μL/min, wraz z buforem PBS (pH 5,0) z szybkością przepływu 1 ml/min. Aby upewnić się, że białka nie uległy degradacji w czasie pomiaru, IgG (2 μM) i FcRn (20 μM) mierzono pod przepływem systemu mikroprzepływowego po 120 minutach inkubacji próbek. Indywidualne pomiary kontrolne nie wykazały degradacji białek (rysunek uzupełniający 1)

Dla próbki, która została poddana szybkiemu rozcieńczeniu, ponownie można było zaobserwować piki odpowiadające monomerom FcRn (53 kDa), dimerom FcRn (97 kDa) i monomerom IgG (148 kDa). Również wyraźnie zaobserwowano dwa dodatkowe piki przy 196 kDa i 251 kDa, odpowiadające kompleksom IgG-FcRn ze stechiometrią 1:1 i 1:2 (Ryc. 7). Oczekiwane masy dla tych dwóch kompleksów wynosiły odpowiednio 200 kDa i 250 kDa. Zmienność pomiaru masy mieści się w granicach błędu pomiaru dla fotometru masowego użytego w tym badaniu wynoszącego ±5%¹⁴ (2% dla kompleksu 1:1 i 0,4% dla kompleksu 1:2).

Obecność tych kompleksów tylko w szybko rozcieńczonej próbce jest zgodna z ideą, że mają one tendencję do dysocjacji przy niższych stężeniach, z szybkością, która jest szybka w stosunku do procesu ręcznego rozcieńczania, ale powolna w stosunku do procesu szybkiego rozcieńczania osiągniętego za pomocą systemu mikrofluidycznego¹⁵.

Rysunek 1: Połączenie mikrofluidyki z fotometrią masy. (A,B) Pole mikrofluidyki używane w tym protokole, widziane z przodu (A) i (B) od góry. Roztwory czyszczące umieszcza się w pozycjach 1-3, a próbki i kalibranty w pozycjach 4-6. Wszystkie rozwiązania są podłączone do przełącznika m, który jest podłączony do czujnika jednostki przepływu "Small". (C) Przegląd całego systemu. Komputer (u góry po lewej) jest podłączony do skrzynki mikrofluidycznej (pokazanej obok bufora i probówek z próbkami) oraz fotometru masowego (na dole po prawej), w którym znajduje się chip mikrofluidyczny. Monitor małego natężenia przepływu (FRMS) monitoruje przepływ przez linię próbkowania, podczas gdy monitor dużego natężenia przepływu (FRML) monitoruje przepływ buforowy. Rurki przewodu próbki i bufora łączą się z kanałem na chipie mikrofluidycznym, umieszczonym wewnątrz fotometru masy. (D) Każdy chip ma trzy kanały. FRMS jest podłączony do wlotu próbki, a FRML do wlotu bufora. Obszar mieszalnika to miejsce, w którym odbywa się szybkie rozcieńczanie próbki, podczas gdy obszar obserwacji to miejsce, w którym wykonywane są pomiary fotometrii masowej. Wylot jest monitorowany przez dodatkowy czujnik przepływu, aby upewnić się, że nie ma wycieków w chipie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Oprogramowanie sterujące mikroprzepływami. Za pomocą tego oprogramowania można ustawiać i monitorować natężenia przepływu, przewody ciśnieniowe systemu mikroprzepływowego oraz położenie przełącznika wielofunkcyjnego (przełącznika m). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Identyfikacja obecności pęcherzyków w oleju. Przykłady z oprogramowania do akwizycji danych pokazują wyraźny, nieprzerwany pierścień ostrości (po lewej) i "złamany" pierścień, wskazujący na obecność pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne przykłady stężeń próbek, w których liczba zdarzeń lądowania cząsteczek jest zbyt mała, idealna lub zbyt duża. Cząsteczki lądujące na powierzchni obszaru obserwacji w chipie mikrofluidycznym pojawią się jako ciemne plamy w ratiometrycznym widoku obrazu fotometrii masy. Optymalnie, pożądane stężenie powinno umożliwić idealną gęstość zdarzeń lądowania, które mają miejsce podczas pozyskiwania danych (środek). Jeżeli gęstość zdarzenia lądowania jest zbyt niska (góra, 'Za mało'), nie można przeprowadzić dokładnej analizy statystycznej danych z fotometrii masowej. Jeśli jest zbyt wysoka (na dole, "Za dużo"), cząsteczki lądowania będą nakładać się przestrzennie, co spowoduje niską jakość danych. Obrazy te zostały wykonane za pomocą oprogramowania do akwizycji danych za pomocą masowego fotometru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zrzut ekranu oprogramowania do analizy danych dla masowej fotometrii. Tutaj można załadować pliki .mp wyeksportowane z oprogramowania do akwizycji danych w celu analizy danych. Na podstawie przetworzonych danych można generować dane liczbowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zrzut ekranu z kalibracji kontrastu masy dla tego eksperymentu. Użytym kalibrem była β-amylaza, o której wiadomo, że tworzy trzy gatunki: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) i tetramer (224 kDa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Histogramy mas ujawniają tworzenie się kompleksów dopiero po szybkim rozcieńczeniu próbki. Histogramy mas i odpowiadające im najlepiej dopasowane rozkłady Gaussa przedstawiono dla pomiarów próbek zawierających IgG i FcRn po ręcznym rozcieńczeniu (kolor pomarańczowy) lub szybkim rozcieńczeniu za pomocą układu mikrofluidycznegoHC (kolor niebieski). Etykiety mas wskazują, że średnie wartości z krzywych Gaussa pasują do histogramów masy zmierzonych po szybkim rozcieńczeniu. Po ręcznym rozcieńczeniu obserwowano piki odpowiadające monomerom FcRn (52 kDa, mierzone przy ręcznym rozcieńczeniu) i monomerom IgG (152 kDa). Po szybkim rozcieńczeniu, oprócz monomerów FcRn i IgG, wyraźnie zaobserwowano również piki odpowiadające dimerom FcRn i kompleksom IgG-FcRn o stechiometrii 1:1 i 1:2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dane uzupełniające Rysunek 1: Pomiary fotometryczne próbek kontrolnych po szybkim rozcieńczeniu nie wykazują degradacji białka. (A) Histogram masy i najlepiej dopasowany rozkład Gaussa dla próbki tylko FcRn. Początkowe stężenie próbki przed szybkim rozcieńczeniem wynosiło 20 μM, a natężenie przepływu ustawiono na 0,5 μl/min. Można było zaobserwować piki masy odpowiadające monomerom FcRn (53 kDa) i dimerom FcRn (97 kDa). (B) Histogram masy i najlepiej dopasowany rozkład Gaussa tylko dla próbki IgG (Herceptin). Początkowe stężenie próbki przed szybkim rozcieńczeniem wynosiło 2 μM, a natężenie przepływu ustalono na 1 μl/min. Można było zaobserwować pojedynczy pik masy odpowiadający monomerowi IgG (155 kDa). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Wykorzystuje fotometr masowy sprzężony z systemem mikroprzepływowym o szybkim rozcieńczeniu. Fotometria masowa jest bezznacznikowym, bioanalitycznym narzędziem, które może niezawodnie mierzyć masę cząsteczkową w roztworze dla biomolekuł¹⁶, dla tych w zakresie od 30 kDa do 6 MDa. Ponieważ fotometria masowa jest techniką jednocząsteczkową, która analizuje próbki jedna po drugiej, jest ona na ogół ograniczona do próbek w zakresie stężeń 100 pM-100 nM. Powyżej tego zakresu cząsteczki lądujące na powierzchni szkła będą nakładać się przestrzennie, co spowoduje słabą jakość danych; Poniżej tego zakresu uzyskuje się zbyt mało danych, aby przeprowadzić rzetelną analizę⁷. Ważną konsekwencją jest to, że może to ograniczyć badanie interakcji białek do tych, które tworzą mieszaninę gatunków związanych i niezwiązanych w tym zakresie.

W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy krok po kroku protokół korzystania z systemu mikrofluidyki do szybkiego rozcieńczania w celu skutecznego rozszerzenia zakresu stężeń próbek, które można poddać fotometrii masowej. Rozcieńczając próbkę na chipie mikroprzepływowym, a następnie przepływając ją przez okno obserwacyjne detektora w ciągu 50 ms, system wychwytuje kompleksy obecne w nierozcieńczonej próbce, zanim równowaga interakcji się zmieni. Próbka jest w sposób ciągły dostarczana do detektora podczas poszczególnych pomiarów. W tych warunkach 95% kompleksu pozostanie nienaruszone podczas pomiaru próbki, nawet w przypadku oddziaływań o niskim powinowactwie - z_{K D} rzędu mikromolowców i szybkością dysocjacji tak szybko, jak 1 ^s-1.

Można to obliczyć w następujący sposób: dla reakcji z szybkością forward k_f i szybkością wsteczną k_b,

W stanie równowagi stężenia wszystkich trzech gatunków (A, B i kompleksu AB) pozostają stałe, więc i . Przy konserwatywnym założeniu, że perturbacja (rozcieńczenie, w tym przypadku) może spowodować dysocjację kompleksu, ale reakcja naprzód (asocjacyjna) nie zachodzi, termin k_f [A] [B] można traktować jako nieistotny i można dokonać następującego uproszczenia:

Całkowanie daje następujące wyrażenie dla stężenia kompleksu w czasie po zaburzeniu równowagi:

Frakcja kompleksu, która pozostaje związana w czasie t po zaburzeniu równowagi, jest zatem:

Przy = 50 ms, dla reakcji z k_b ≈ 1 ^s-1, frakcja graniczna wynosi 0,95 lub 95%^11,12.

Zastosowano tutaj i wcześniej⁵ fotometrię masową w celu zbadania wiązania przeciwciała monoklonalnego IgG trastuzumabu z rozpuszczalną domeną FcRn. Doniesiono, że dwaj partnerzy wiążący wiążą się z powinowactwem nanomolowym przy kwaśnym pH¹⁷. Fotometria masowa została wykorzystana do jakościowej oceny obfitości kompleksów powstałych w czasie, gdy partnerzy wiążący mieli pH 5,0, a próbki szybko rozcieńczono przez dodatkowy układ mikroprzepływowy. Procedura została zoptymalizowana pod kątem konkretnej interakcji białko-białko w oparciu o wcześniej zgłoszone wyniki⁵. Ta sama procedura może być wykorzystana do badania innych interakcji, pod warunkiem, że użytkownicy mają wcześniejszą wiedzę lub optymalizują warunki eksperymentalne dla danego systemu, takie jak do użycia, początkowe stężenie białka, oczekiwana stechiometria i ilość inkubacji potrzebna do osiągnięcia równowagi przez interakcję.

Gdy mieszanina IgG-FcRn była rozcieńczana ręcznie, trudno było wykryć obecność kompleksów IgG-FcRn, mimo że wiadomo, że białka te oddziałują^{ze sobą 5}. W niniejszej pracy wykazano, że podejście oparte na szybkim rozcieńczaniu skutkuje znacznie zwiększoną ilością tych kompleksów. Dla tej samej próbki, gdy zastosowano szybkie rozcieńczenie, wyraźnie zaobserwowano zarówno kompleksy FcRn-IgG 1:1, jak i kompleksy 2:1 FcRn-IgG. Te różnice w tworzeniu kompleksów pokazują znaczenie badania systemów interakcji biomolekularnych w szerokim zakresie stężeń.

Ponadto wyniki te pokazują również, że łatwo jest wykorzystać mikrofluidykę z analizą pojedynczych cząsteczek do wychwytywania słabych oddziaływań - wypełniając znaczną lukę w metodzie. Połączenie mikrofluidyki o szybkim rozcieńczeniu z fotometrią masową oferuje atrakcyjne korzyści ze względu na zalety fotometrii masowej jako techniki analitycznej. Oznacza to, że fotometria masowa nie wymaga etykiet, wymaga minimalnego przygotowania próbki, a pomiary wykonuje się w roztworze. Dla tego protokołu kolejną kluczową zaletą fotometrii masowej jest jej zdolność do rozróżnienia i ilościowego określenia wszystkich powstałych gatunków (pod warunkiem, że mają one wyraźną masę >30 kDa). Jest to przeciwieństwo na przykład SPR, który może mierzyć szybkość wiązania i rozwiązywania, ale nie może łatwo dostarczyć informacji stechiometrycznych⁸.

W przypadku tego protokołu, a także bardziej ogólnych eksperymentów z fotometrią masową, pomocnych jest kilka kwestii. Po pierwsze, końcowe stężenie białka powinno mieścić się w limicie tego, co może zmierzyć fotometria masowa (100 pM-100 nM). Początkowe stężenie inkubacji powinno również mieścić się w zakresie układu mikroprzepływowego (do 90 μM) i teoretycznie powinno być powyżej rzeczywistego_{K D} oddziaływania¹⁰. Zalecanym punktem wyjścia jest stosunek mieszaniny stężeń 1:1 między oddziałującymi gatunkami przy stężeniu μM. Stosunek ten można by wtedy zmienić na 1:2, 1:5 lub, jak w przypadku tej interakcji, 1:10. Jeśli nie ma wcześniejszych informacji na temat interakcji białkowych, użytkownik musiałby zoptymalizować eksperyment, zaczynając od wysokiego stężenia (zalecane 20 μM) dla każdego partnera, aby określić, czy powinowactwo składników mieści się w zakresie stężeń utrzymywanych przez przedstawioną metodę (tj. powstają kompleksy). Optymalizacja może również obejmować wybór innych warunków buforowych w celu promowania interakcji lub miareczkowanie jednego ze składników interakcji w celu określenia właściwych proporcji mieszania. Po ich ustaleniu możliwa jest optymalizacja stężeń i przepływów, aby zapewnić optymalne warunki dla badania i metody, np. zmniejszenie stężeń w celu umożliwienia lepszej rozdzielczości pików.

Po drugie, aby pomyślnie powtórzyć ten eksperyment, należy zminimalizować zanieczyszczenia. Typowymi źródłami zanieczyszczeń, o których wiadomo, że niekorzystnie wpływają na pomiary fotometrii masowej, są inne białka lub resztki komórkowe pozostałe po oczyszczeniu, niefiltrowane, detergenty tworzące micele (jeśli występują w zbyt wysokim stężeniu) oraz zawierające wysokie stężenia soli, glicerolu lub innych składników. Jak omówiono w powyższym Protokole, pęcherzyki w układzie mikrofluidycznym powinny zostać usunięte. Pęcherzyki mogą tworzyć się w systemie rurek lub jeśli próbki mają wysokie napięcie powierzchniowe i są podatne na tworzenie się piany. W olejku immersyjnym mogą również tworzyć się pęcherzyki, które można wykryć za pomocą pierścienia ostrości (rysunek 3). Jeżeli pęcherzyków nie można usunąć za pomocą czynności opisanych w protokole, innym rozwiązaniem jest odgazowanie próbki za pomocą eksykatora i pompy próżniowej, pozostawiając próbkę pod zmniejszonym ciśnieniem na kilka minut. Nie zaleca się wirowania lub potrząsania wysoce skoncentrowanymi roztworami białkowymi, ponieważ działania te mogą sprzyjać tworzeniu się pęcherzyków.

Podczas gdy pomiar jednej konkretnej interakcji białko-białko jest tutaj pokazany, ten sam protokół można zastosować do innych układów interakcji białko-białko bez znaczącej modyfikacji. Kolejnym przyszłym kierunkiem tego protokołu byłoby wykorzystanie pomiarów do obliczenia wartości K_D dla zidentyfikowanych kompleksów, jak to zostało opisane w innym miejscu w kontekście fotometrii masowej ^5,7. Podczas gdy we wcześniejszych badaniach wykorzystano dane z eksperymentów obejmujących ręczne rozcieńczanie i silniejsze interakcje, zasada analizy może być łatwo zastosowana w tym kontekście - pod warunkiem wdrożenia dalszych ulepszeń w urządzeniu mikroprzepływowym (takich jak zwiększona dokładność czujnika przepływu i stabilność pompy).

Poza interakcjami białko-białko prawdopodobnie pojawią się szersze zastosowania połączonej fotometrii masowej i mikrofluidyki o szybkim rozcieńczeniu. Fotometria masowa może być stosowana do oceny czystości, agregacji i jednorodności próbki^18,19; badanie oligomeryzacji białek²⁰, montażu makromolekularnego²¹ lub polimeryzacji²²; i w innych obszarach. Analiza fotometrii masowej wykracza również poza białka; Został wykorzystany do badania interakcji między kwasami nukleinowymi a białkami²³, cząstkami wirusowymi²⁴ i nanocząstkami²⁵. Protokół ten opisuje zatem ważne zastosowanie połączonego systemu mikrofluidyki fotometrii masowej - umożliwia on bezpośredni pomiar słabych oddziaływań białko-białko na poziomie pojedynczych cząsteczek i kompleksów. Wartość obecnej aplikacji jest wysoka, ponieważ otwiera możliwość prostego scharakteryzowania interakcji, które na ogół były trudne do zbadania - z uwzględnieniem krytycznych obszarów terapeutycznych. To połączone podejście może również posłużyć jako podstawa do szerszego zakresu badań próbek o stężeniach do kilkudziesięciu mikromolowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Oprogramowanie do akwizycji danych	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Oprogramowanie do analizy danych	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Fotometr masowy	Refeyn	TwoMP
Skrzynka mikrofluidyczna	System Refeyn	MassFluidix HC
Układ mikrofluidyczny	Refeyn	MassFluidix HC
Oprogramowanie sterujące mikrofluidyką	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, z batatów	Sigma	A8781