Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Adrianna Maria Piasek; Iryna Levkovych; Paulina Musolf; Hanna Chmielewska; Aneta Ścieżyńska; Anna Sobiepanek

doi:10.3791/65773

Artykuł metodologiczny

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

DOI:

10.3791/65773

⸱

20 października 2023

Adrianna Maria Piasek^*¹ , Iryna Levkovych^*¹ , Paulina Musolf¹ , Hanna Chmielewska¹ , Aneta Ścieżyńska² , Anna Sobiepanek¹

¹Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology, Faculty of Chemistry, Warsaw University of Technology, ²Department of Histology and Embryology, Medical University of Warsaw

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na złożoną strukturę i ważne funkcje skóry, jest to interesujący model badawczy dla przemysłu kosmetycznego, farmaceutycznego i medycznego. W Unii Europejskiej obowiązuje całkowity zakaz testowania produktów kosmetycznych i ich składników na zwierzętach. W przypadku medycyny i farmaceutyków ta możliwość również jest stale ograniczana. Zgodnie z zasadą 3R coraz powszechniejsze staje się testowanie pojedynczych związków, jak i całych formulacji na sztucznie stworzonych modelach. Najtańsze i najczęściej stosowane są modele 2D, które składają się z monowarstwy komórki, ale nie odzwierciedlają rzeczywistych interakcji między komórkami w tkance. Chociaż dostępne na rynku modele 3D zapewniają lepsze odwzorowanie tkanki, nie są one wykorzystywane na dużą skalę. Dzieje się tak dlatego, że są one drogie, czas oczekiwania jest dość długi, a dostępne modele często ograniczają się tylko do tych typowo używanych.

Aby przenieść prowadzone badania na wyższy poziom, zoptymalizowaliśmy procedury różnych preparatów 3D modeli skóry. Opisane procedury są tanie i proste w przygotowaniu, ponieważ mogą być stosowane w wielu laboratoriach oraz przez badaczy o różnym doświadczeniu w hodowlach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra jest ciągłą strukturą z wielokomórkowymi interakcjami, które świadczą o prawidłowym funkcjonowaniu i homeostazie tego złożonego organu. Zbudowany jest z morfologicznie różnych warstw: warstwy wewnętrznej - skóry właściwej, a warstwy zewnętrznej - naskórka. Na wierzchu naskórka dodatkowo wyróżniamy warstwę rogową naskórka (składającą się ze spłaszczonych martwych komórek – korneocytów), która zapewnia największą ochronę przed środowiskiem zewnętrznym. Do najważniejszych funkcji biernych i czynnych skóry należą: ochrona organizmu przed czynnikami zewnętrznymi, udział w procesach immunologicznych, wydzielanie, resorpcja, termoregulacja i wyczuwanie^1,²^,³. Ponieważ jest uważany za jeden z największych narządów w organizmie, nie da się uniknąć kontaktu z różnymi patogenami, alergenami, chemikaliami, a także promieniowaniem ultrafioletowym (UV). W związku z tym jest zbudowany z wielu typów komórek o określonych funkcjach. Głównymi typami komórek obecnych w naskórku są keratynocyty (prawie 90% wszystkich komórek, pełniących funkcje strukturalne i immunologiczne w głębszych partiach naskórka, ale które później przechodzą proces keratynizacji, aby przekształcić się w korneocyty w górnej warstwie naskórka), melanocyty (tylko 3%-7% populacji komórek naskórka, które wytwarzają pigment ochronny przed promieniowaniem UV melaninę) oraz komórki Langerhansa (z układu odpornościowego). W przypadku skóry właściwej głównymi komórkami są fibroblasty (wytwarzające czynniki wzrostu i białka), komórki dendrytyczne i komórki tuczne (oba typy komórek układu odpornościowego)⁴^,⁵^,⁶. Ponadto skóra jest wyposażona w kilka białek zewnątrzkomórkowych (takich jak kolagen typu I i IV, fibronektyna i laminina; Rysunek 1) oraz włókna białkowe (kolagen i elastyna), które zapewniają specyficzną strukturę skóry, ale także zachęcają do wiązania komórek, adhezji komórek i innych interakcji7.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający strukturę skóry. W budowie skóry wyróżniono cztery podstawowe typy komórek występujące w poszczególnych jej warstwach oraz wyróżniono białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta figura została utworzona za pomocą MS PowerPoint. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Bezpieczeństwo kosmetyków i produktów farmaceutycznych jest bardzo ważną kwestią, a ochrona zdrowia konsumentów i pacjentów jest priorytetem⁸. Jeszcze do niedawna miało to gwarantować liczne testy, w tym badania prowadzone na zwierzętach. Niestety, często wymagały one użycia drastycznych metod, powodując ból i cierpienie u zwierząt wykorzystywanych do celów badawczych (często myszy, szczury i świnie). W 1959 r. wprowadzono Zasady Humanitarnej Techniki Eksperymentalnej (zasada 3R): (1 - Wymiana) zastąpienie zwierząt w badaniach modelami in vitro, in sillico lub ex vivo, (2 - Redukcja) zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych do badań, oraz (3 - Udoskonalenie) poprawa dobrostanu zwierząt, które są nadal potrzebne do badań i jednocześnie ulepszenie opracowanych metod alternatywnych⁹. Ponadto w Unii Europejskiej (UE) testowanie kosmetyków na zwierzętach jest regulowane przez prawo. Od 11 września 2004 roku wszedł w życie zakaz stosowania produktów kosmetycznych testowanych na zwierzętach. 11 marca 2009 roku UE zakazała testowania składników kosmetycznych na zwierzętach. Sprzedaż produktów kosmetycznych wykonanych z nowo przetestowanych składników na zwierzętach była zabroniona; Jednak testowanie produktów na zwierzętach pod kątem złożonych problemów zdrowotnych u ludzi, takich jak toksyczność po podaniu wielokrotnym, toksyczność reprodukcyjna i toksykokinetyka, było nadal dopuszczalne. Od 11 marca 2013 r. w UE nielegalna jest sprzedaż kosmetyków, których gotowy produkt lub jego składniki były testowane na zwierzętach¹⁰. Dlatego obecnie w kosmetologii badania prowadzone są na trzech poziomach: in vitro (komórki), ex vivo (prawdziwe tkanki) oraz in vivo (ochotnicy)¹¹. W przypadku produktów farmaceutycznych nadal istnieje potrzeba przeprowadzania testów na zwierzętach; Jest jednak znacznie zredukowany i ściśle kontrolowany¹².

Jako metody alternatywne do testów na zwierzętach i do wstępnej oceny skuteczności nowego składnika aktywnego, stosuje się hodowle komórek skóry in vitro. Izolacja różnych typów komórek skóry i ich hodowla w sterylnych warunkach laboratoryjnych pozwala ocenić bezpieczeństwo i toksyczność substancji czynnych. Linie komórkowe skóry są również powszechnie uznawanymi modelami do badań, ponieważ komórki są sprzedawane przez certyfikowane firmy, a wyniki mogą być porównywalne w różnych laboratoriach. Badania te są zwykle wykonywane na prostych modelach 2D monokultur komórek ludzkiej skóry. Niektóre z bardziej zaawansowanych modeli to ich kokultury (takie jak keratynocyty z fibroblastami i keratynocyty z melanocytami), a także modele trójwymiarowe, w tym kultury (sfery) bez rusztowań i oparte na rusztowaniach odpowiedniki skóry naskórka, skóry właściwej, a nawet pełnogrube substytuty skóry¹³. Warto wspomnieć, że poza tym ostatnim rodzajem (odpowiedniki skórne) pozostałe nie są dostępne na rynku, a w razie potrzeby naukowiec musi je przygotować we własnym zakresie.

Mimo że wiele z tych modeli zostało utrzymanych i jest obecnie rutynowo sprzedawanych (Tabela 1), ciągle potrzebne są dodatkowe modele, aby sprawdzić większość wyników. W związku z tym nowo opracowane modele powinny lepiej odtwarzać rzeczywiste interakcje zachodzące w ludzkim ciele. Gdy do utworzenia takich modeli wykorzystuje się mieszaninę komórek różnych typów, można osiągnąć reprodukcję wielokomórkowego aspektu tkanki in vivo. W rezultacie powstaje kultura organotypowa (Rysunek 2).

	Nazwa	Opis
Skóra normalna	EpiSkin	Zrekonstruowany naskórek ludzki - Keratynocyty na błonie kolagenowej
	SkinEthic RHE	Zrekonstruowany naskórek ludzki - Keratynocyty na membranie poliwęglanowej
	SkinEthic RHE-LC	Ludzki model naskórka Komórki Langerhansa - Keratynocyty i komórki Langerhansa na membranie poliwęglanowej
	SkinEthic RHPE	Zrekonstruowany ludzki pigmentowany naskórek - Keratynocyty i Melanocyty na membranie poliwęglanowej
	T-Skin	Zrekonstruowany model skóry człowieka o pełnej grubości - keratynocyty na warstwie fibroblastów, które były hodowane na membranie poliwęglanowej
	Model skórki Phenion FT	Keratynocyty i fibroblasty w hydrożelu
Skóra z chorobą	Model skóry czerniaka FT	Normalne keratynocyty i fibroblasty pochodzenia ludzkiego z ludzką linią komórkową czerniaka złośliwego A375
	Model tkanki łuszczycy	Normalne ludzkie keratynocyty i fibroblasty

Tabela 1: Najpopularniejsze komercyjne odpowiedniki skóry dla różnych badań.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Złożoność różnych modeli in vitro. Związek między złożonością różnych modeli in vitro w celu odtworzenia organizmu a rzeczywistymi interakcjami zachodzącymi bezpośrednio w ludzkim ciele. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie zestawu "Mikrobiologia i hodowla komórkowa" firmy Servier Medical Art firmy Servier (https://smart.servier.com/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Jednym z najważniejszych ograniczeń komercyjnych odpowiedników jest dostępność tylko bardzo ogólnych modeli badawczych z kilkoma typami komórek (zazwyczaj 1-2, rzadko 3). Jednak w skórze jest o wiele więcej komórek, a ich wzajemne oddziaływanie może zapewnić lepszą lub gorszą tolerancję różnych składników¹⁴. Brak niektórych składników immunologicznych może obniżyć jego wartość w kilku rodzajach badań, w tym w immunoterapii. Jest to poważny problem, ponieważ czerniak jest zagrażającym życiu nowotworem skóry ze względu na wczesny początek przerzutów i częstą oporność na zastosowane leczenie¹⁵. Aby ulepszyć model sztucznej skóry, naukowcy próbują ustalić kokulturę komórek odpornościowych z liniami komórkowymi i organoidami¹⁶ i jest to uważane za duże ulepszenie badanych modeli. Na przykład komórki tuczne biorą udział w wielu procesach fizjologicznych (gojenie się ran, przebudowa tkanek) i patologicznych (zapalenie, angiogeneza i progresja guza) w skórze¹⁷. Tym samym ich występowanie w modelu może znacząco zmienić odpowiedź modelu na badany związek. Wreszcie, wciąż brakuje wielu informacji związanych ze skórą, które można odkryć tylko poprzez przeprowadzenie badań podstawowych. Dlatego tak ważne jest tworzenie i udoskonalanie różnych modeli sztucznej skóry (tabela 2). W tym artykule przedstawiono kilka procedur tworzenia zaawansowanych modeli skóry, w tym kulek i odpowiedników skóry.

Model skóry in vitro	Próba odtworzenia interakcji zachodzących w tkance	Przykłady użytych ogniw
Hodowla komórkowa 2D lub 3D	Naskórek	Keratynocyty
		Melanocyty
		Keratynocyty + Melanocyty
	Skóra właściwa	Fibroblasty
		Tuczne
		Fibroblasty + Komórki tuczne
	Skóra	Keratynocyty + Fibroblasty
		Keratynocyty + Komórki tuczne
		Melanocyty + Fibroblasty
		Melanocyty + Komórki tuczne
		Keratynocyty + Fibroblasty + Melanocyty
		Keratynocyty + Fibroblasty + Komórki tuczne

Tabela 2: Przykłady mieszaniny typów komórek do odtwarzania tkanki skórnej w kulturach 2D i 3D.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (KB/7/2022). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników biorących udział w badaniu.

UWAGA: Opisane procedury zaawansowanego przygotowania modelu skóry mogą być wykonywane przy użyciu zarówno dostępnych na rynku pierwotnych komórek skóry i linii komórkowych, jak i przy użyciu pierwotnych komórek wyizolowanych od pacjentów. Ogniwa komercyjne są dostarczane z odpowiednimi dokumentami, a ich wykorzystanie w badaniach dla większości krajów nie wymaga żadnych dodatkowych zgód. Jednak w niektórych krajach jest to obowiązkowe, dlatego należy to sprawdzić z regulaminem Lokalnej Komisji Etycznej. Jeśli w badaniu mają zostać wykorzystane pierwotne komórki wyizolowane od pacjentów, najpierw badanie musi zostać zatwierdzone przez Lokalną Komisję Etyczną i musi być przeprowadzone zgodnie z ich ścisłymi wytycznymi. Ponadto należy uzyskać pisemną świadomą zgodę od wszystkich dawców tkanek skóry. Izolacja pierwotnych komórek skóry nie była tematem tego artykułu, ale przykładowe procedury izolacji można znaleźć w: Kosten et al. (keratynocyty)¹⁸, Ścieżyńska et al. (melanocyty)¹⁹, Kröger et al. (fibroblasty i komórki tuczne)²⁰. Większość normalnych komórek skóry i linii komórkowych ma poziom bezpieczeństwa klasy BSL1; Nie powodują żadnych zagrożeń. Jednak używany sprzęt laboratoryjny musi spełniać normy dotyczące hodowli komórek zwierzęcych i ludzkich w kontrolowanych warunkach.

1. Hodowla komórek skóry

UWAGA: Hodowle komórek skóry muszą być przeprowadzane w kolbach przeznaczonych dla komórek przylegających lub zawiesinowych (w zależności od typu komórki) w temperaturze 37 °C i zawartości dwutlenku węgla 5% w inkubatorze. Czynności związane z ich uprawą i wykorzystaniem do badań wymagają sterylnych warunków i muszą być wykonywane w komorze laminarnej po ekspozycji na promienie ultrafioletowe C (UVC) przez 15-30 min. Uzyskanie zawiesin komórkowych, które są następnie wykorzystywane do tworzenia dwu- i trójwymiarowych modeli, wymaga wdrożenia procedur w zależności od typu komórki (dla komórek adherentnych, takich jak keratynocyty, fibroblasty i melanocyty - krok 1.1, dla nieprzylegających komórek tucznych - krok 1.2)(Rysunek 3). Dla różnych rozmiarów kolb hodowlanych, objętości wszystkich odczynników (takich jak pożywka, sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub roztwór trypsyny) użytych w opisanych metodach są wymienione w tabeli 3. Parametry zależne od rodzaju komórek (np. stężenie i skład odczynników, metoda wirowania itp.) są posortowane w tabeli 4. Zagęszczenie komórek użyte do wysiewu przedstawiono w tabeli 5. Wszystkie te tabele znajdują się na końcu tej sekcji.

figure-protocol-1
Rysunek 3: Hodowla komórek przylegających i nieprzylegających. Ogólna procedura krok po kroku hodowli komórek przylegających i nieprzylegających (liczby odpowiadają opisom kroków 1.1 i 1.2). Figura została stworzona za pomocą programu MS PowerPoint. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uzyskiwanie zawiesiny komórek adherentnych
1. Wyjąć pożywkę z kolby hodowlanej.
2. Delikatnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, Tabela 3).
3. Dodać roztwór trypsyny w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (roztwór trypsyna-EDTA, tabela 3). Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i kontrolować odrywanie się komórek od powierzchni pod mikroskopem optycznym.
4. Zawiesić oderwane komórki w co najmniej podwójnej ilości pożywki o pełnym wzroście lub neutralizatora trypsyny, aby dezaktywować trypsynę (2:1) (objętości patrz Tabela 3, a odczynniki patrz Tabela 4). Ilościowo przenieść zawartość kolby do probówki o pojemności 15 ml.
5. Pobrać niewielką objętość (20 μl) zawiesiny komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i policzyć komórki za pomocą hemocytometru ręcznego lub automatycznego.
6. Odwirować probówkę (parametry w tabeli 4), usunąć większość supernatantu i ponownie zawiesić osad komórkowy w niewielkiej ilości pozostałej cieczy. Następnie dodać wystarczającą ilość świeżej pożywki, aby uzyskać objętość wstępnego odwirowania (objętość w tabeli 3), jeśli gęstość komórek jest odpowiednia do wysiewu lub ponownego obliczenia wymaganej objętości nowej pożywki.
  UWAGA: Niektóre komórki, takie jak melanocyty, są bardzo wrażliwe na wirowanie, dzięki czemu unika się konieczności ponownego ich odwirowania w krótkim czasie.
7. Przygotować zawiesinę komórek o wymaganej gęstości (komórki/ml, gęstość komórek w tabeli 5) do doświadczenia (mono- lub wielokulturowe 2D/3D komórek skóry).
  UWAGA: Jeśli komórki mają być dalej hodowane, należy zwrócić 5 000-8 000 komórek/ml do nowej kolby i dodać świeżą pożywkę (objętość w Tabeli 3).
Uzyskiwanie zawiesiny komórek nieprzylegających
1. Usunąć pożywkę z zawiesiną komórkową z kolby hodowlanej i przenieść ilościowo do probówki o pojemności 15 ml.
2. Pobrać niewielką objętość (20 μl) zawiesiny komórek do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru ręcznego lub automatycznego.
3. Odwirować probówkę (parametry w tabeli 4), usunąć większość supernatantu i ponownie zawiesić komórki w niewielkiej ilości pozostałej cieczy. Następnie dodać świeżą pożywkę, aby uzyskać objętość wstępnego odwirowania (jak wskazano w tabeli 3), jeśli gęstość komórek jest odpowiednia do wysiewu lub ponownego obliczenia wymaganej objętości nowej pożywki.
4. Przygotować zawiesinę komórkową o wymaganej gęstości (komórki na ml, jak zasugerowano w Tabeli 5) do eksperymentu (mono- lub wielokulturowe 2D/3D komórek skóry).
  UWAGA: Jeśli komórki mają być dalej hodowane, należy zwrócić 5 000-8 000 komórek/ml do nowej kolby i dodać świeżą pożywkę.

	25 cm² kolby hodowlane	75 cm² kolby hodowlane
Pożywka hodowlana [ml]	4–5	8–12
PBS [ml]	5	10
Trypsyna–EDTA [ml]	0,5–1	1–2
Podłoże neutralizujące [ml]	1–2	2–4

Tabela 3: Ilości odczynników używanych podczas hodowli i przygotowania zawiesin komórkowych.

Monokultura komórek skóry	trypsyna	Dezaktywator trypsyny	Wirowania	Średni typ dla monokultury 2D
Keratynocyty	0.25%	z neutralizatorem trypsyny	300 x g, 5 min, RT	Pożywka do wzrostu keratynocytów 2
Fibroblasty	0.25%	ze średnim	300 x g, 5 min, RT	DMEM, 10% FBS
Melanocyty	0,025%	z neutralizatorem trypsyny	300 x g, 3 min, RT	Medium 254, Suplement na wzrost ludzkich melanocytów bez PMA-2
Tuczne	Nie jest wymagane	Nie jest wymagane	300 x g, 3 min, RT	IMDM, 10% FBS, 1% aminokwasów endogennych, 226 μM α-monotioglicerol

Tabela 4: Trypsynizacja, parametry wirowania i rodzaj pożywki zależą od typu komórki.

Typ modelu		Gęstość komórek [komórka/ml]
2D	Jednowarstwowy	Fibroblasty	2 x 10⁵
		Tuczne
		Keratynocyty
		Melanocyty
3D	Kula (metoda wiszącego upuszczania)	Fibroblasty	5 x 10⁵
		Tuczne
		Keratynocyty
		Melanocyty
		Mieszanka komórek
	Kula (metoda ograniczania adhezji komórek)	Fibroblasty	2 x 10⁵
		Tuczne
		Keratynocyty
		Melanocyty
		Mieszanka komórek
	Odpowiednik	Fibroblasty	1 x 10⁵
		Tuczne	1 x 10⁴
		Keratynocyty	8 x 10⁵
		Melanocyty	5 x 10⁴

Tabela 5: Gęstość zasiewu komórek dla różnych typów modeli skóry.

2. Przygotowanie kulek komórek skóry

UWAGA: Aby stworzyć kule, użycie metody wiszącego kropli jest opisane w kroku 2.1 (Rysunek 4), podczas gdy podejście skoncentrowane na ograniczaniu adhezji komórek jest pokazane w kroku 2.2 (Rysunek 5). Niemniej jednak, ponieważ kule są bardzo małe i mogą być niestabilne, działania wykonywane tymi metodami wymagają cierpliwości, delikatności i powolnych działań.

Metoda wisząca
1. Użyj odpowiedniej gęstości komórek, aby osiągnąć pożądany rozmiar kuli (zalecana gęstość komórek 5 x 10⁵ komórek/ml, tabela 5).
2. Odpipetować 20 μl zawiesiny komórek na pokrywie szalki Petriego lub płytki wielodołkowej (Rysunek 4A).
3. Przykryj naczynie/talerz dolną częścią i delikatnie je odwróć (wiszące krople zostaną automatycznie utworzone na pokrywkach, Rysunek 4B).
4. Napełnić szalkę Petriego/studzienki płytki sterylnym roztworem wody/PBS, aby uniknąć parowania pożywki z kropelek.
5. Inkubować kropelki przez 48-72 h w temperaturze 37 °C.
  UWAGA: Grawitacja ciągnie komórki w dół, a brak dostępnej powierzchni zapobiega przyczepianiu się komórek do naczynia i sprzyja agregacji komórek. Jednak niektóre typy komórek mogą wymagać dłuższej inkubacji.
6. Przed wykonaniem następnego kroku napełnij studzienki nowej płytki (lub użyj starej płytki usuniętą wodą/PBS ze studzienek) pełnym podłożem wzrostowym (100 μl).
  UWAGA: Przed następnym krokiem weź końcówki o pojemności 200 μl, usuń 1/5 każdego końca końcówki i wysterylizuj przed użyciem.
7. Przenieś kulki komórkowe do dołków płytki wielodołkowej za pomocą sterylnych końcówek pipet z odciętym końcem. Weź końcówki o pojemności 200 μl, usuń 1/5 każdego końca końcówki i wysterylizuj przed użyciem (Rysunek 4C).
  UWAGA: Ten krok może być trudny, ponieważ przepływ cieczy podczas przewracania naczynia/talerza może uszkodzić kulki.
8. Inkubować przeniesione kulki przez 1 dzień na płytce wielodołkowej w temperaturze 37 °C przed wykonaniem jakichkolwiek dalszych eksperymentów (na przykład dodawanie związków, testy cytotoksyczności, wprowadzenie kulek do równoważników) (Rysunek 4D).
Metoda ograniczania adhezji komórek
1. Przed wysiewem komórek przykryj studzienki płytki dolnej U roztworem środka powierzchniowo czynnego (np. Pluronic F-127, glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy)²¹. Przygotować i dodać 100 μl 1% roztworu środka powierzchniowo czynnego w PBS do każdej studzienki. Inkubować płytkę z roztworem przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (Rysunek 5A-C). W razie potrzeby należy przechowywać płytkę dłużej, ale utrzymywać poziom płynu, dodając więcej buforu PBS.
2. Przygotować zawiesinę komórek o pożądanej gęstości komórek w 50 μl na studzienkę (zalecana gęstość komórek podczas wysiewu 2 x 10⁵/ml, tabela 5).
3. Usuń roztwór środka powierzchniowo czynnego ze studzienek przed wysiewem komórek, aby uniknąć przerwania błony komórkowej przez lizę (Rysunek 5D).
4. Dodać roztwór komórkowy do płytki i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, aby osiągnąć agregaty komórkowe (Rysunek 5E). Po około 1-3 dniach zostaną uformowane kule (Rysunek 5F) i będą gotowe do użycia w dalszych eksperymentach.

figure-protocol-2
Rysunek 4: Metoda wiszącej kropli. (A) zawiesina komory pipetującej na pokrywce i przykrycie pokrywki dolną częścią naczynia; (B) obracanie naczynia w celu wytworzenia wiszących kropli; C) dodanie wody/PBS do dolnej części naczynia (ograniczenie parowania cieczy); (D) inkubacja szalek z wiszącymi kroplami w celu utworzenia kul komórkowych; (E) zbieranie kropel z uformowanymi kulami i stabilizacja przenoszonych kulek w płytkach wielodołkowych. Figura została stworzona przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 5: Przygotowanie kul krok po kroku metodą ograniczającą adhezję komórek. (A) Studzienka w kształcie litery U; (B,C) ograniczanie przyłączania komórek przez roztwór środka powierzchniowo czynnego; D) usuwanie roztworu ze studni; E) komórki wysiewające; (F) agregacja komórek i formowanie kuli. Figura została stworzona przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie pełnogrubych odpowiedników skóry

UWAGA: Rozwój pełnogrubych (naskórek i skóra właściwa) odpowiedników skóry można podzielić na trzy etapy (Rysunek 6): przygotowanie sztucznej warstwy skóry właściwej z udziałem typowych komórek skóry właściwej (takich jak fibroblasty i komórki tuczne, Rysunek 6A), wysiewanie komórek wchodzących w skład sztucznego naskórka (głównie keratynocytów i melanocytów, Rysunek 6B) i pionowy wzrost keratynocytów z możliwym procesem keratynizacji (tworzenie warstwy rogowej naskórka, Ryc. 6C). Przygotowanie pełnogrubych odpowiedników skóry opisano w kroku 3.1 (3.1.1-3.1.10). Jeśli potrzebny jest mniej zaawansowany odpowiednik skóry (np. tylko typ naskórka), wybrany typ komórek (np. keratynocyty) można wysiewać bezpośrednio na dostępne na rynku błony kolagenowe lub poliwęglanowe, a także hodować z możliwością wywołania procesu keratynizacji (przejdź bezpośrednio do kroków 3.1.9-3.1.10).

figure-protocol-4
Rysunek 6: Krok po kroku przygotowanie pełnogrubych odpowiedników skóry we wkładkach. (A) przygotowanie warstwy pseudo-skóry właściwej z komórkami skóry właściwej, (B) wysiewanie komórek naskórka, (C) dalsza hodowla równoważnika w pożywce, (D) hodowla na granicy faz powietrze-ciecz sprzyja tworzeniu się warstwowego nabłonka. Figura została stworzona przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przygotowanie pełnogrubych odpowiedników skóry w płytce 24-dołkowej
1. Umieść probówki z wodą, PBS (10x), 1 M NaOH i roztworem kolagenu typu I na lodzie.
2. Określ odpowiednią liczbę komórek skóry właściwej (np. fibroblastów i komórek tucznych; w stosunku 10:1), które mają zostać wysiane w hydrożelu. Przenieść odpowiednią liczbę komórek skóry właściwej do probówki o pojemności 1,5 ml (500 μl fibroblastów i 500 μl komórek tucznych, zgodnie z gęstością komórek w tabeli 5) i odwirować komórki (300 x g, 3 min, RT).
3. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w mieszaninie 695 μl wody/100 μl PBS (10x)/ 5 μl NaOH.
  UWAGA: Jeśli 1 ml całkowitego roztworu nie wystarczy, należy skorzystać z Tabeli 6, aby ponownie obliczyć objętości każdego odczynnika.
4. Dodać 200 μl roztworu kolagenu do mieszaniny i delikatnie wymieszać pipetując.
  UWAGA: Bądź ostrożny, ponieważ konsystencja mieszanki będzie gęsta.
5. Dodać 200 μl przygotowanej mieszaniny do wkładu w płytce 24-dołkowej. W przypadku modelu bez warstwy rogowej naskórka dodaj 500 μl do każdego dołka płytki 24-dołkowej.
6. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść ją do inkubatora na 30 min.
  UWAGA: Sprawdź, czy hydrożel spolimeryzował przed jakimkolwiek innym działaniem.
7. Przed wysiewem komórek na powierzchnię hydrożelu należy go przepłukać buforem PBS (500 μl/studzienkę).
8. Określ odpowiednią liczbę komórek naskórka (np. keratynocytów i melanocytów; w stosunku 15:1), które należy wysiać na wierzchu hydrożelu. Przygotować mieszaninę komórek w 500 μl pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS (dodać 250 μL keratynocytów i 250 μL melanocytów, gęstości komórek podano w tabeli 4) i delikatnie dodać do studzienek.
  UWAGA: W niektórych przypadkach lepiej jest najpierw wysiać melanocyty i pozwolić im dobrze rozprowadzić się na hydrożelu, a po dodatkowych 24 godzinach usunąć pożywkę i keratynocyty nasienne. W takim przypadku dodać 250 μl zawiesiny komórek i 250 μl pożywki.
9. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2-5 dni, w zależności od szybkości wzrostu komórek, z wymianą pożywki (o malejącym stężeniu FBS od 10% do 1%) co 48 godzin i monitorowaniem komórek przeprowadzanym pod mikroskopem optymicznym.
10. Jeśli proces keratynizacji ma być wywołany po uzyskaniu monowarstwy keratynocytów na wierzchu hydrożelu, należy użyć pożywki wolnej od FBS dodatkowo uzupełnionej jonami wapnia i kwasem L-askorbinowym przez dodatkowe 2-7 tygodni (w stężeniu 1,5 μM CaCl₂ i 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego).
  UWAGA: Czas inkubacji zależy od użytych keratynocytów i szybkości ich różnicowania.

Odczynnik	Równanie do obliczania objętości odczynnika	Przykładowe obliczenia
		(dla końcowej objętości =_{V łącznie} 1 ml)
roztwór kolagenu typu I		(C_kolagen = 10 mg/ml)
		0,2 ml = 200 μl
PBS (10x)		0,1 ml = 100 μl
1 M NaOH		0,005 ml = 5 μl
sterylne_H2O		0,695 ml = 695 μl

Tabela 6: Obliczanie objętości odczynnika wymaganych dla preparatu hydrożelowego kolagenu typu I 2 mg/mL.

4. Identyfikacja typów komórek w modelu skóry 3D za pomocą metod barwienia komórek

UWAGA: Aby potwierdzić, że opracowany model skóry składa się z oczekiwanych komórek, dobrze jest przeprowadzić barwienie komórek. Jest to kluczowy krok, zanim będzie można przeprowadzić jakiekolwiek eksperymenty docelowe na danym modelu²². W przypadku modeli 3D skóry konieczne jest zatopienie danego modelu w parafinie i przygotowanie preparatów mikroskopowych ze sztuczną tkanką wyciętą na mikrotomie (krok 4.1) przed barwieniem komórek (Rysunek 7).

figure-protocol-9
Rysunek 7: Podstawowe kroki osadzania modelu skóry 3D, barwienia komórek i obserwacji mikroskopowych. Figura została stworzona przy użyciu Biorender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Osadzanie modeli 3D powłok
1. Umyj skórę odpowiednikiem PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej dwa razy i utrwal ją za pomocą 3,7% roztworu paraformaldehydu w PBS (30 minut, RT). Powtórz etap prania z PBS.
2. Przed zatopieniem należy odwodnić skórę poprzez inkubację w rosnących stężeniach roztworów etanolu: 50% (15 min), 70% (15 min), 96% (2x, 30 min) i 99,8% (2x, 30 min).
3. Utrwalony i odwodniony odpowiednik skóry umieść w formie wypełnionej parafiną.
  UWAGA: Umieść odpowiednik w odpowiedniej orientacji.
4. Przykryj formę kasetą i dodaj więcej parafiny na wierzch. Pozwól mu zastygnąć do 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zamrażać ekwiwalent skóry zatopiony w parafinie przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C.
6. Włącz mikrotom, włóż odpowiednik skóry zatopiony w parafinie i pokrój plastry o grubości 5 μm. Umieścić pokrojone plastry sztucznej tkanki na szkiełkach mikroskopowych i suszyć je przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 37 °C.
7. Zanurz szkiełka w ksylenie (2x, 10 min), a następnie ponownie nawodnij szkiełka o spadających stężeniach etanolu 99,8% (5 min), 96% (5 min), 70% (5 min) i 50% (5 min).
8. Wyjąć szkiełka z roztworu etanolu i spłukać je dwukrotnie wodą (5 min).
  UWAGA: Tradycyjne barwienie komórek odbywa się albo poprzez zastosowanie określonych barwników (Hematoxylin, Eosin²³) lub poprzez użycie przeciwciał selektywnie ukierunkowanych na biomarkery (w tym kolagen 1A2 dla fibroblastów, cytokeratyna 14 dla keratynocytów, melan-A lub tyrozynaza dla melanocytów²⁴). Rutynowe barwienie hematoksyliną i eozyną można wykonać, postępując zgodnie z protokołami przygotowanymi przez różne firmy (krok 4.2). Z drugiej strony, jeśli wymagane jest barwienie immunofluorescencyjne lub immunohistochemiczne, procedura jest inna i znacznie dłuższa (kroki 4.3 i 4.4). Aby uniknąć niespecyficznych reakcji, należy użyć przeciwciał pierwszorzędowych wytwarzanych u różnych gatunków, a następnie dedykowanych przeciwciał drugorzędowych.
Barwienie hematoksyliną i eozyną modeli 3D skóry
1. Wybarwić szkiełko mikroskopowe w roztworze hematoksyliny przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
2. Myć szkiełka w zakwaszonym roztworze alkoholu przez 1 min.
  UWAGA: Przygotuj zakwaszony roztwór alkoholu, mieszając 2 ml 35%-38% kwasu solnego z 98 ml 99,8% alkoholu etylowego.
3. Następnie umyj szkiełko w 0,1% roztworze wodorowęglanu sodu, aby uzyskać widoczny, delikatny niebiesko-fioletowy kolor.
  UWAGA: Aby otrzymać 0,1% roztwór wodorowęglanu sodu, rozpuść 100 mg wodorowęglanu sodu w 100 ml ultraczystej wody.
4. Myj szkiełka 95% etanolem przez 1 minutę.
5. Wybarwić szkiełko mikroskopijne w roztworze eozyny przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
6. Myć szkiełka 95% etanolem przez 1 minutę i 99,8% etanolem przez 2 minuty.
7. Umyj szkiełka ksylenem przez 2 minuty dwa razy.
8. Zamontuj w balsamie i umieść szkiełko nakrywkowe na górze szkiełka. Próbki są gotowe do obserwacji mikroskopowych.
Barwienie immunofluorescencyjne modeli 3D skóry
1. Przepłukać szkiełko PBS (5 min).
2. Przygotować roztwór blokujący (3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] lub mleko odtłuszczone w buforze PBS z dodatkiem 0,1% Triton X-100 i 0,1% Tween 20) i inkubować w nim szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Umyć szkiełka dwukrotnie buforem PBS (5 min).
4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze PBS (zgodnie z zaleceniami producenta, tabela 7) i inkubować szkiełka przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Umyć szkiełka dwukrotnie buforem PBS (5 min).
6. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze PBS (zgodnie z zaleceniami producenta, tabela 7) i inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Umyj szkiełka dwukrotnie PBS (5 min).
8. Przygotować roztwór barwnika do barwienia jąder (np. Hoechst 33342 lub DAPI, tabela 7) i inkubować szkiełka przez maksymalnie 15 minut w temperaturze pokojowej.
9. Umyj szkiełka PBS (5 min).
10. Zamontuj w balsamie, przykryj wycinek szkiełkiem nakrywkowym i zwizualizuj efekty barwienia komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Barwienie immunohistochemiczne modeli 3D skóry
1. Wykonaj kroki 4.3.1-4.3.5.
2. Dodatkowo wykonać etap przemywania buforem odpowiednim dla enzymu, z którym sprzężone jest przeciwciało drugorzędowe.
3. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze odpowiednim dla sprzężonego enzymu (zgodnie z zaleceniami producenta) i inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Umyj szkiełka dwukrotnie PBS (5 min).
5. Przygotować roztwór odpowiedniego podłoża dla użytego enzymu i inkubować szkiełka zgodnie z zaleceniami producenta.
6. Umyj szkiełka buforem (5 min) i zamontuj je w balsamie.
7. Wizualizacja efektów barwienia komórek za pomocą mikroskopii w jasnym polu.

jedn. jedn. jedn.

Wykryto typ komórki/organoid komórkowy	Środek barwiący	Rozcieńczenie / Stężenie
Tuczne	Avidin−Sulforodamina 101	1 μg/ml
Fibroblasty	Przeciwciało Col1A2 wytwarzane u królika	1:50
	Drugorzędowe przeciwciało przeciw królikowi Kozie sprzężone z FITC	1:250
Keratynocyty	Przeciwciało cytokeratyny 14 wytwarzane u myszy	1:50
	Drugorzędowe przeciwciało przeciw mysi skoniugowane z FITC	1:250
melanocyty	Przeciwciało Melan-A wytworzone u myszy	1:50
	Drugorzędowe przeciwciało przeciw mysi skoniugowane z FITC	1:250
Jądra	Hoechst 33342	1 μg/ml
	DAPI	1 μg/ml

Tabela 7: Stężenia i rozcieńczenia odczynników używanych do barwienia komórek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed rozpoczęciem tworzenia modeli skóry w laboratorium należy podjąć decyzję o rodzaju komórek, które mają być użyte (pierwotna/linia komórkowa) oraz wybór odpowiedniego podłoża dla tych komórek. Większość banków komórek zaleca i może dostarczyć pożywkę dla wszystkich rodzajów hodowli komórkowych. W przypadku modelu wielokulturowego konieczne jest wybranie jednej pożywki, która odpowiada wszystkim typom komórek obecnych w hodowli. Niektóre typowe podłoża komórkowe używane zarówno do hodowli pierwotnych komórek skóry, jak i najpowszechniejszych linii komórek skóry zebrano w Tabeli 8¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²⁵^,²⁶^,²⁷. Typowe podłoża stosowane do pierwotnych hodowli komórkowych są dość drogie, a ich skład jest złożony. Z drugiej strony linie komórkowe zwykle zadowalają się pożywkami o prostym składzie. Niektóre typy komórek (głównie fibroblasty i komórki tuczne) mogą wytwarzać i wydzielać czynniki stymulujące wzrost innych komórek (takich jak keratynocyty i melanocyty)²⁸^,²⁹. Jeśli planowana jest ich obecność w modelu, dodatkowa suplementacja podłoża nie jest konieczna.

Typ komórki	Nazwa komórki	Średni	odniesienie
Keratynocyty	linia celu HaCaT	DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny	Według sprzedawcy
	pierwotne normalne ludzkie keratynocyty naskórkowe (NHEK)	Pożywka dla keratynocytów 2 (podłoże podstawowe + mieszanka suplementów)	Według sprzedawcy
	pierwotne ludzkie keratynocyty naskórkowe; Normalny, Dorosły (HEKa)	Podłoże bazowe dla komórek skóry, 0,4% ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,5 ng/ml alfa-transformującego czynnika wzrostu rh, 6 mM L-glutaminy, 100 ng/ml hemibursztynian hydrokortyzonu, 5 mg/ml insuliny rh, 1 mM epinefryny, 5 mg/ml apo-transferyny, 100 U/ml penicyliny (w razie potrzeby), 100 μg/ml streptomycyny (w razie potrzeby)	Według sprzedawcy
	pierwotne keratynocyty	DMEM/F-12 (3:1), 1% Ultroser G, 1 μM hydrokortyzon, 1 μM izoproterenol, 0,1 μM insuliny, 1 ng/ml czynnik wzrostu keratynocytów, 1% penicylina-streptomycyna	Rozdział 18
melanocyty	pierwotne melanocyty	Medium 254, Suplement na wzrost ludzkich melanocytów bez PMA-2, 1% roztwór antybiotyku	Rozdział 19
	pierwotne melanocyty	RPMI-1640, 10% FBS, 14,7 μg/ml roztwór czerwieni fenolowej, 1% L-glutamina, 1% penicylina/streptomycyna	27 Rozdział 27
	linia komórkowa HEMa-LP	Medium 254, 5 μg/ml rh-insuliny, 50 μg/ml kwas askorbinowy, 6 mM L-glutamina, 1 μM epinefryna, 1,5 mM chlorek wapnia, 100 U/ml penicylina (w razie potrzeby), 100 μg/ml streptomycyna (w razie potrzeby)	Według sprzedawcy
	podstawowe normalne ludzkie melanocyty naskórkowe (NHEM)	Pożywka dla melanocytów (podłoże podstawowe + mieszanka suplementów)	Według sprzedawcy
Fibroblasty	główne ludzkie fibroblasty czopa (HTF)	EMEM, 5% FBS, 5 ng/ml rh-zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, 5 μg/ml rh-insuliny, 50 μg/ml kwas askorbinowy, 7 mM L-glutamina, 100 U/ml penicylina, 100 μg/ml streptomycyna, 0,25 μg/ml amfoterycyna B	28
	podstawowe HTF-y, oraz	DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B	20.28
	pierwotne ludzkie fibroblasty skórne
	Linia komórkowa HFF-1	DMEM, 15% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny	Według sprzedawcy
	Linia komórkowa BJ	EMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny	Według sprzedawcy
Komórki tuczne	podstawowe komórki tuczne ludzkiej skóry (hsMCs)	IMDM, 10% FBS, 1% aminokwasów endogennych, 226 μM α-monotioglicerol, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny	20
	Linia komórkowa LAD2	StemPro-34, 2,5% suplement diety StemPro-34, 2 mM L-glutamina, 100 ng/ml czynnik komórek macierzystych rh, 100 U/ml penicylina, 100 μg/ml streptomycyna	29
	Linie komórkowe HMC-1.1 i 1.2	IMDM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 25 mM HEPES, 100 U/ml penicylina, 100 μg/ml streptomycyna	29

Tabela 8: Przegląd najczęściej używanych pożywek do hodowli pierwotnych komórek skóry i linii komórkowych.
Legenda: Minimalna pożywka niezbędna (DMEM) firmy Dulbecco, minimalna pożywka niezbędna Eagle (EMEM), płodowa surowica bydlęca (FBS), mieszanka składników odżywczych F-12 szynki (F12), zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM), rekombinowany człowiek (rh), Roswell Park Memorial Institute (RPMI).

W tym artykule stworzono modele skóry z pierwotnymi komórkami keratynocytów, melanocytów, fibroblastów i komórek tucznych. Są one nieco bardziej wymagające niż linie komórkowe, a zalecanymi pożywkami do ich hodowli, które zastosowano do hodowli jednokomórkowych, są: uzupełniona pożywka Keratinocyte Growth Medium 2 (dla keratynocytów), uzupełniona pożywka 254 (dla melanocytów), uzupełniona pożywka DMEM (dla fibroblastów) oraz uzupełniona pożywka IMDM (dla komórek tucznych). Na tych pożywkach komórki prezentują swoją typową morfologię przypisaną do ich typu (reprezentatywne obrazy są pokazane w Rysunek 8). W przypadku wielokultur składających się z dwóch lub więcej typów komórek ważne było wybranie podłoża, w którym mogą rosnąć wszystkie hodowane typy komórek. Po kilku testach wybrano pożywkę DMEM z 10% FBS i 1% mieszaniną antybiotyków do przygotowania bardziej zaawansowanych modeli 3D kul i ich odpowiedników.

figure-results-1
Rysunek 8: Komórki skóry prezentują odmienną morfologię obserwowaną podczas monokultury 2D. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sfery (powszechnie nazywane sferoidami) są jednymi z najprostszych modeli 3D opracowanych przez badaczy inżynierii komórkowej i tkankowej, chociaż kule stworzone z komórek skóry nie są tak popularne. W ramach tego modelu możliwe jest tworzenie zarówno mono-, jak i wielokulturowości sfer. Wiele metod przygotowania kul (np. z wiszącym spadkiem, ograniczanie adhezji komórek, lewitacja magnetyczna, rotacja, mikrofluidyka, itp.) zostało opisanych w literaturze³⁰. Ze względu na łatwość przygotowania, niski koszt, łatwo dostępne materiały, a także sprzęt, dwie pierwsze metody są zalecane dla początkujących użytkowników trójwymiarowych (3D) modeli komórek, a protokoły ich wykonania można znaleźć powyżej (kroki 2.1 i 2.2). Według literatury³¹^,³², najważniejszymi parametrami w tych metodach są liczba komórek, objętość zawiesiny komórkowej i czas inkubacji.

Sfery mogą być tworzone z różną liczbą komórek, ale gęstość komórek do siewu powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórek osobno, jak również dla kokultur komórkowych. Prowadzony proces optymalizacji monokultur keratynocytów i fibroblastów wykazał, że wysiew 1 x 10⁴ komórek na studzienkę przyniósł najlepsze wyniki dla obu typów komórek. Kule przedstawione w Rysunek 9 zostały przygotowane przy użyciu metody ograniczania adhezji komórek w płytkach U-bottom (krok 2.2). Zaleca się przygotowanie co najmniej 4 dołków z powtórzeniami technicznymi (optymalne to 6 dołków). Kule składające się z 1 x 10⁴ komórek były łatwiejsze do manipulowania, ponieważ były widoczne w studniach. W związku z tym możliwe było nawet usunięcie starego podłoża ze studni podczas prób bez opróżniania kulek. Po opisanych operacjach kształty kul pozostały w większości niezmienione i powtarzalne. Stabilność większych kul była niska podczas tego procesu. Warto również wspomnieć, że różne typy komórek mogą tworzyć kule o różnych kolorach (np. keratynocyty tworzą ciemniejsze kule, podczas gdy kule fibroblastów są znacznie jaśniejsze).

figure-results-2
Rysunek 9: Tworzenie sfer. Kule utworzone przez różne typy i liczbę komórek skóry za pomocą metody ograniczającej adhezję komórek. Podziałka skali (górny panel): 200 μm. Podziałka skali (dolny panel): 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jak wspomniano w metodzie wiszącego kropli (krok 2.1), w pewnym momencie kule wymagają przeniesienia z pokrywy do studni. Proces ten może być potencjalnie szkodliwy dla sfer. Dlatego na tym etapie niezbędna jest wysoka dokładność pracy. Utworzone kule są podatne na utratę odpowiedniego kształtu, jeśli nie są starannie obchodzone (Rysunek 10). Pierwszy obrazek (Rysunek 10A) przedstawia dobrą kulę jednakowo zaokrągloną ze wszystkich stron. Na drugim i trzecim obrazie (Rysunek 10B,C) zaobserwowano delikatną utratę kształtu przez kulę, ale agregacja komórek pozostaje zaokrąglona. Ostatnie trzy obrazy (Rysunek 10D-F) pokazują różne fazy uszkodzenia kuli. Zdobywanie doświadczenia jest niezbędne do uzyskania powtarzalności tworzonych kształtów i struktur sferycznych. Przy pierwszych próbach opracowania kulek zaleca się stosowanie metody ograniczania adhezji komórek u niedoświadczonych badaczy (krok 2.2), ponieważ zapewnia ona bardziej porównywalne wyniki przy ograniczonym wpływie aktywności badacza.

figure-results-3
Rysunek 10: Możliwe trudności w przenoszeniu kuli z pokrywy do studni - metoda wiszącej kropli. (A) dobra kula, (B,C) lekko uszkodzone kule, (D-F) wysoce uszkodzone kule. Zdjęcia zostały wykonane 24 godziny po transferze. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odpowiedniki to znacznie bardziej zaawansowane modele 3D sztucznej skóry niż sfery. Podczas procesu budowy modelu skóry należy wziąć pod uwagę różne aspekty, w tym liczbę warstw w modelu (tylko naskórek, tylko skóra właściwa, skóra właściwa z naskórkiem i warstwą rogową naskórka), użyte typy komórek, użyte materiały, preferowany rozmiar odpowiednika, rodzaj badań, w których będzie on dalej wykorzystywany, itp.¹⁴. Odpowiedniki skóry mogą być umieszczone w specjalnych wkładkach umieszczonych w standardowych płytkach wielodołkowych o pożądanej wielkości (96-, 48-, 24-dołkowe itp.). Mimo że wkładki są łatwiejsze do przenoszenia z jednego dołka do drugiego i podczas wymiany medium, ich odpowiednik nie może zostać uszkodzony; Są dość drogie. Jeśli model nie wymaga obecności warstwy rogowej naskórka, tańszym rozwiązaniem jest przygotowanie odpowiednika w studzience płytki wielodołkowej.

Sztuczna warstwa skóry właściwej jest zazwyczaj konstruowana jako model oparty na rusztowaniu przy użyciu naturalnych (żelatyna, kolagen, fibryna, kwas hialuronowy, alginian chitozanu, itp.) lub syntetycznych (diakrylan glikolu polietylenowego i kwas polimlekowy) hydrożeli33. Aby być podobnym do prawdziwej skóry właściwej, warstwa ta musi zawierać głównie wodę z niektórymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (w tym kolagenem lub fibronektyną), które pośredniczą w wiązaniu komórek, interakcjach komórka-komórka i innych działaniach komórkowych³⁴. W niniejszej pracy wybrano kolagen typu I, ponieważ jest łatwy do przygotowania w postaci hydrożelu, a jego elastyczna struktura zapewnia łatwość dalszych potencjalnych działań badawczych (np. przeniesienia ekwiwalentu z jednej potrawy do drugiej). Roztwór kolagenu typu I uzyskany z ogona szczura jest zwykle przygotowywany przez rozpuszczenie proszku w 20 mM kwasie octowym. Aby osiągnąć etap polimeryzacji kolagenu, konieczne jest zapewnienie odpowiednich warunków pH w zakresie 6,5-7,5. Można to zapewnić poprzez dodanie ścisłej ilości wodorotlenku sodu. Dla ułatwienia niektóre firmy wprowadziły specjalne obliczenia, które mogą pomóc w określeniu dokładnych objętości potrzebnych do przygotowania takich hydrożeli (tabela 6). Chociaż w literaturze można spotkać się z różnymi stężeniami kolagenu w hydrożelach (na przykład 0,5-2 mg/ml³⁵; 5-30 mg/mL³⁶; niska i wysoka zawartość kolagenu³⁷), w opisanym modelu zastosowano roztwór 2 mg/ml, ponieważ hydrożel miał nadal elastyczną strukturę, ale był na tyle zwarty, że w razie potrzeby można go było wynieść ze studni.

Aby przygotować całkiem realistyczną skórę o pełnej grubości, należy zasiać równoważne komórki w proporcji możliwie jak najbardziej zbliżonej do tej, która występuje w naszym ciele. W przypadku naskórka, w zależności od miejsca ciała, związek między melanocytem a pulą powiązanych keratynocytów wynosi około 1:36, który definiuje się jako naskórkową jednostkę melaniny (EMU)³⁸. Zatem zastosowana proporcja w sztucznym naskórku wynosiła 1 melanocyt na 15 keratynocytów (tab. 5). Aby stworzyć sztuczną warstwę skóry właściwej, użyto hydrożelu kolagenu typu 1, w którym fibroblasty i komórki tuczne zostały włączone w proporcji 1 komórka tuczna na 10 fibroblastów. Każda warstwa skonstruowanego odpowiednika może być monitorowana w czasie rzeczywistym na odwróconym mikroskopie optycznym poprzez zmianę głębokości obserwowanej próbki (przykładowe obrazy pokazano w Rysunek 11).

figure-results-4
Rysunek 11: Obserwacja w czasie rzeczywistym różnych komórek w poszczególnych warstwach utworzonego pełnogrubego odpowiednika skóry. (A) pseudo-skóra właściwa i (B) pseudo-naskórek) uwidocznione przez mikroskopię jasnego pola. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dokładniejsze obserwacje z potwierdzeniem uzyskania zamierzonej struktury modelu można przeprowadzić, wykonując barwienie odpowiednika. Utrwalony ekwiwalent należy najpierw zatopić w parafinie, a następnie przeciąć na mikrotomie. Preparaty z cienką sztuczną tkanką mogą być później barwione różnymi barwnikami, w tym hematoksyliną i eozyną (podstawowe barwienie wykonywane w laboratoriach medycznych). Dzięki takiemu działaniu możliwe jest rozróżnienie sztucznej skóry właściwej i naskórka w ich odpowiednikach, a także identyfikacja poszczególnych komórek skóry (Ryc. 12). Na Rysunek 12 pokazane są nie tylko konkretne typy komórek, ale także możliwe jest zobaczenie keratynocytów w różnych fazach procesu podziału komórki (telofaza i metafaza). W przypadku komórek tucznych określone granulki są dobrze rozpoznawalne wewnątrz komórki. Obrazy te wstępnie potwierdzają, że stworzony odpowiednik skóry jest żywy (komórki w nim rosną) i są w stanie normalnie funkcjonować w opracowanym modelu. Jednak w przypadku naskórka 3D i pełnogrubych modeli skóry szczególnie ważne jest sprawdzenie jakości i funkcjonalności uzyskanego konstruktu. Aby sprawdzić przepuszczalność warstwy rogowej naskórka, należy zastosować pomiary transepithelial Electrical Resistance (TEER) lub barwienie Lucifer-Yellow³⁹^,⁴⁰. Ponadto w prawidłowo skomponowanej sztucznej skórze powinny być obecne specyficzne markery, w tym markery różnicowania (np. Filaggrin, Involucrin, Loricrin, Keratin 10, Keratin 5, klasy lipidów obejmujące ceramidy), markery połączeń skórno-naskórkowych (np. kolagen typu IV, Laminin V, Alpha6Beta4-integryna, antygen BP)⁴¹, markery ścisłego połączenia w warstwach naskórka (np. klaudyna-1, okludyna, białko zonula occludens (ZO)-1)⁴²a także markery proliferacji warstwy podstawowej (Ki67)⁴¹.

figure-results-5
Rysunek 12: Morfologia i funkcjonowanie komórek skóry. Przegląd morfologii i funkcjonowania komórek skóry (obserwacja podziałów komórkowych) w ekwiwalencie skóry o pełnej grubości barwionym hematoksyliną i eozyną. Podziałka: 100 μm (panel górny), 50 μm (panel środkowy, po lewej), 100 μm (panel środkowy, po prawej), 50 μm (panel dolny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Najczęściej używanym sposobem potwierdzenia obecności biomarkera jest przeprowadzenie specyficznego barwienia, takiego jak immunohistochemiczne lub immunofluorescencyjne. Do mikroskopowej wizualizacji poszczególnych komórek w modelach można zastosować różne przeciwciała i barwniki fluorescencyjne. Wynik przykładowego barwienia komórek w hodowli można zobaczyć na Rysunek 13. Do obserwacji keratynocytów użyto przeciwciała przeciwko cytokeratynie 14. W przypadku melanocytów było to przeciwciało specyficzne dla melanii A. Przeciwciało kolagenowe 1A2 zastosowano do barwienia fibroblastów, a fluorescencyjna sulforodamina 101 sprzężona z awidyną wykryła heparynę obecną w komórkach tucznych.

figure-results-6
Rysunek 13: Wyniki barwienia komórek fluorescencyjnych. (A) Cytokeratyna 14 w keratynocytach. Pasek skali: 50 μm. (B) Melan-A w melanocytach. Pasek skali: 50 μm. (C) Kolagen 1A2 w fibroblastach. Podziałka: 100 μm. (D) Heparyna w komórkach tucznych. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodykę, którą można zastosować do przygotowania własnych, zaawansowanych modeli sztucznej skóry. Jest to dobre rozwiązanie wszędzie tam, gdzie planowane badania wymagają ściśle określonych modeli badawczych, które mogą okazać się niedostępne na rynku lub bardzo drogie. Jak wspomniano wcześniej, na rynku dostępnych jest kilka komercyjnych odpowiedników skóry (np. EpiSkin, EpiDerm FT). Jednak ich koszt (100-400 euro za sztukę) oraz czas realizacji (kilka dni-tygodni) mogą skłonić badacza do podjęcia próby przygotowania takiego modelu we własnym zakresie. Proponowane zabiegi są łatwe do wykonania nawet dla niedoświadczonych naukowców, a jednocześnie pozwalają na uzyskanie bardzo zaawansowanych modeli skóry. Warto podkreślić, że decyzja o składzie komórkowym danego modelu jest w pełni zależna od badacza. Oprócz stworzonego modelu może on być dalej rozwijany i udoskonalany, co otwiera zupełnie nowe perspektywy badawcze. W przypadku modeli komercyjnych konieczne jest dokupienie innego odpowiednika.

Chociaż hodowle komórkowe 3D mogą być zaawansowane z wieloma typami komórek, łatwe w obsłudze i dostępne, nadal są to tylko sztuczne modele, które nie są w stanie w pełni odtworzyć złożoności i funkcjonalności tkanki (np. funkcji immunologicznych, unaczynienia). Dlatego w większości badań wymaganych jest kilka modeli, aby potwierdzić uzyskane wyniki. W tabeli 9 zebrano niektóre zalety i wady tych modeli, a także ich ograniczenia. Z drugiej strony, modele komercyjne gwarantują wysokie standardy jakościowe przy odtwarzalności eksperymentów i porównywalności danych między laboratoriami. Aby wdrożyć zastosowanie nowego związku do badań, z pewnością konieczny będzie zakup odpowiedniego komercyjnego odpowiednika. Ale na etapie przygotowawczym taki samodzielnie wykonany model 3D skóry (sfera wielokomórkowa lub odpowiednik) może pomóc w zmniejszeniu liczby eksperymentów, które trzeba przeprowadzić na komercyjnym odpowiedniku. Celem tworzenia i wykorzystywania opisywanych modeli nie jest ominięcie konieczności stosowania certyfikowanych modeli badawczych, ale ułatwienie prowadzenia badań i ograniczenie wydatków z tym związanych.

Porównana para modeli	Zalety	Wady
Hodowla komórkowa a zwierzęta	Zminimalizowane cierpienie zwierząt	Ograniczone informacje na temat wpływu badanego czynnika na cały organizm
	Wysoka standaryzacja eksperymentu - lepsza powtarzalność wyników	Pojedynczy model nie wystarczy, aby odzwierciedlić procesy zachodzące w organizmie
	Brak skutków ubocznych dla całego organizmu	-
	Lepsza kontrola nad warunkami eksperymentu	-
	Możliwość automatyzacji (np. bioprinting)	-
	Niższe koszty	-
	Mały rozmiar potrzebnej próbki	-
	Ograniczona ilość wytwarzanych odpadów	-
Kultury 3D i 2D	Lepiej odzwierciedlają cały organizm	Kultura czasochłonna
	Możliwość stworzenia funkcjonalnej tkanki	Wyższe koszty
	Możliwość stworzenia modelu dopasowanego do potrzeb prowadzonych badań	Spontaniczne tworzenie struktury 3D jest prawie niemożliwe
	-	Brak standaryzowanych testów do ilościowego określania wpływu różnych związków
	-	Ograniczony dostęp do różnych kultur 3D dostępnych na rynku
Linia komórkowa a komórki pierwotne	Certyfikowane i zatwierdzone modele	Dostępna jest tylko ograniczona liczba linii komórkowych
	Wysoka standaryzacja eksperymentu - lepsza powtarzalność wyników	Ograniczona możliwość pozyskania kilku typów komórek od tego samego dawcy
	Dłuższa żywotność	Może mieć zmienione właściwości w stosunku do komórek natywnych
	Dość szybkie tempo rozprzestrzeniania się	Często zaburzona funkcjonalność komórek
	Mniej wrażliwy na kilka czynności (np. zamrażanie, wirowanie)	-

Tabela 9: Porównanie wykorzystania różnych modeli w badaniach – zalety i wady

W kilku artykułach opisano, jak przygotować modele 3D skóry (poza artykułami przeglądowymi podsumowującymi dostępne na rynku modele 14,43,44, zwykle koncentrują się one na jednej metodologii uzyskiwania sfer ⁴⁵ lub odpowiedników⁴⁶).

W artykule opisano dwie metodologie tworzenia kuli z komórkami skóry. Metoda wiszącego kropli jest szeroko stosowana, ale jej powtarzalność i stabilność może być w niektórych przypadkach niewystarczająca. Większość kroków wymaga określonych działań, takich jak praca z dużą prędkością ze względu na parowanie wody z kropelek podczas przenoszenia. Zalecane są również delikatne ruchy, ponieważ brak takiej umiejętności może skutkować uszkodzeniem agregatu komórkowego^31,32. Tak więc łatwiejsza metoda przygotowania kuli koncentruje się na ograniczeniu adhezji komórek. Brak dobrej powierzchni do przyczepiania komórek sprzyja wyższym interakcjom między komórkami. W konsekwencji generowane są agregaty komórek. Jego powtarzalność jest znacznie większa, ponieważ nie ma konieczności przenoszenia sfery. Dzięki tym metodom ustalono optymalną liczbę komórek skóry do stworzenia kuli na poziomie 1 x 10⁴ komórki/kulę.

Następnie przedstawiono procedury opisujące przygotowanie odpowiedników skórnych. Ich wygląd i funkcjonalność w badaniach może być silnie uzależniona od elementów, z których są zbudowane, w tym komórek (tab. 2), rusztowań i pożywek. Rusztowania 3D wykorzystywane do przygotowania sztucznej skóry można podzielić na hydrożele syntetyczne oraz te powstałe ze źródeł naturalnych. W zależności od użytego materiału i jego właściwości do skomponowania hydrożelu może wystąpić konieczność dodatkowego uzupełnienia podłoża. Syntetyczne hydrożele wymagają włączenia bioaktywnych cząsteczek (białek, enzymów i czynników wzrostu) do sieci syntetycznego hydrożelu w celu pośredniczenia w określonych funkcjach komórek⁴⁷. Główne podejścia prezentowane w literaturze w celu osiągnięcia kontrolowanego dostarczania czynników wzrostu do hydrożeli obejmują bezpośrednie obciążenie, oddziaływanie elektrostatyczne, wiązanie kowalencyjne i stosowanie nośników⁴⁸. Hydrożele utworzone ze źródeł naturalnych, takich jak białka ECM i polimery, mogą generować płynne ścieżki w całym rusztowaniu 3D, przyspieszając dystrybucję składników odżywczych; Dzięki temu nie ma potrzeby dodatkowej suplementacji pożywki. Badania wykazały, że małe cząsteczki (takie jak cytokiny i czynniki wzrostu) i makrocząsteczki (w tym glikozaminoglikany i proteoglikany) mogą być transportowane przez ECM przez dyfuzję⁴⁷. Jednak dyfuzja molekularna tlenu, składników odżywczych i innych bioaktywnych cząsteczek może być utrudniona przez właściwości samego hydrożelu ECM. Mniejsza dyfuzja była skorelowana z większą gęstością hydrożelu, ale także z bardzo wysokim stężeniem kolagenu³⁷. W tym badaniu, aby stworzyć odpowiednik skóry, zastosowano niskie stężenie kolagenu równe 2 mg / ml, co sugeruje, że dyfuzja molekularna przez hydrożel powinna być dobra i szybka. W związku z tym nie zapewniono dodatkowej suplementacji do pożywki na tym etapie ani do samego hydrożelu. Aby naśladować skórę właściwą, komórki tuczne i fibroblasty (1:10) zostały osadzone w hydrożelu kolagenowym. Następnie melanocyty i keratynocyty (1:15) wysiano na hydrożel, a cały odpowiednik wyhodowano w pożywce. Warto wspomnieć, że podstawowa pożywka składa się z kilku aminokwasów, kwasów nieorganicznych i witamin, a dodatkowo jest uzupełniana surowicą (składającą się z wielu: czynników wzrostu i przyłączenia komórek, lipidów, hormonów, składników odżywczych i źródeł energii, nośników, białek wiążących i przenoszących itp.). Aby osiągnąć prawidłową strukturę naskórka, należy w określonym czasie dodawać do podłoża różne suplementy. Najważniejszym stymulatorem inicjującym różnicowanie naskórka jest wapń, który aktywuje sygnalizację wewnątrzkomórkową. Kwas askorbinowy stymuluje podobny szlak sygnałowy jak ten, w którym pośredniczy wapń, ale jego działaniu towarzyszy również zwiększony transport askorbinianu i zapobieganie wyczerpaniu hydrofilowych przeciwutleniaczy⁴¹. Co więcej, różnicowanie komórek uległo poprawie, gdy do pożywki dodano inne składniki (takie jak kofeina, hydrokortyzon, trójjodotyronina, adenina i toksyna)^41,44. Ważne jest, aby przygotowane modele zawsze były sprawdzane pod kątem obecności danego typu komórek w odpowiedniej warstwie. Obecność wszystkich czterech typów komórek skóry została potwierdzona w strukturze stworzonego odpowiednika przez barwienie H&E.

Najczęstszym spotykanym problemem jest delikatność i intuicja w obchodzeniu się z uzyskanymi modelami. Pewne trudności mogą być związane z tworzeniem kuli komórkowej, a także z preparatem hydrożelowym. Podczas hodowli komórkowej może również wystąpić kilka innych problemów; Należą do nich infekcje mikrobiologiczne, niski współczynnik proliferacji komórek, starzenie się komórek pierwotnych wykorzystywanych w modelach, maksymalny czas hodowli modeli 2D i 3D zrekonstruowanych z komórek pierwotnych w porównaniu z liniami komórkowymi itp. W tabeli 10 zebrano kilka praktycznych porad dotyczących postępowania w przypadku wystąpienia jednego z poniższych problemów.

Najczęstsze problemy w hodowli komórkowej	Sugestie
Zakażenie bakteryjne	Jeśli do zakażenia bakteryjnego dojdzie w jednej z kolb/szalek z komórkami, lepiej jest usunąć zakażoną kulturę tak szybko, jak to możliwe (aby nie zanieczyszczać pozostałych kolb/szalek komórkami). Ponownie zamrozić nową fiolkę z komórkami. Jeśli infekcja powróci, dobrze jest spróbować poszerzyć spektrum stosowanych antybiotyków i zwiększyć ich stężenie.
Niski współczynnik proliferacji komórek	Niektóre ogniwa mają długi czas podwajania. Aby stymulować ich proliferację, do podłoża podstawowego można dodać kilka specyficznych dla komórek czynników wzrostu. Również zwiększenie stężenia FBS lub L-glutaminy w pożywce podstawowej może pomóc w stymulowaniu wzrostu komórek.
Starzenie się komórek pierwotnych wykorzystywanych w modelach	Po kilku przejściach komórki pierwotne wchodzą w proces starzenia się i przestają się dzielić. Aby przezwyciężyć ten problem w modelach, zaleca się użycie komórek z jak najwcześniejszego przejścia do budowy modelu.
Maksymalny czas hodowli modeli 2D i 3D zrekonstruowanych z komórek pierwotnych w porównaniu z liniami komórkowymi	Czas hodowli modelu zależy w dużym stopniu od rodzaju użytych komórek. W przypadku komórek pierwotnych czas hodowli będzie krótszy ze względu na ich krótką żywotność.
Trudności w tworzeniu sfery komórkowej	Niektóre komórki mogą wymagać dłuższego czasu na uformowanie się kuli. Jeśli po kilku kolejnych dniach kulki nie zostaną uformowane, należy pobrać komórki z próbki i sprawdzić ich żywotność, na przykład za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
Problemy ze stabilnością sfery	Jeśli kule nie są stabilne i ulegną zniszczeniu podczas przenoszenia, spróbuj utworzyć kule z mniejszej liczby komórek. Upewnij się, że zawsze delikatnie przenosisz naczynia, w których rosną kule.
Trudności z przygotowaniem hydrożelu	Sprawdź, czy proporcje składników (woda, PBS [10x], NaOH, kolagen typu 1) były prawidłowe. Podstawowy roztwór kolagenu jest zwykle bardzo gęsty, dlatego należy go powoli pipetować. Pęcherzyki powietrza zaburzają morfologię hydrożelu, dlatego odwrotne pipetowanie żelu może pomóc w rozwiązaniu tego problemu.

Tabela 10: Rozwiązywanie problemów z hodowlami komórkowymi

Ustalone modele po wytworzeniu mogą być wykorzystywane w wielu dziedzinach, począwszy od (1) eksperymentów cytotoksyczności i genotoksyczności nowych związków o aktywności biologicznej do stosowania w lekach i kosmetykach⁴⁹, (2) eksperymentów z różnymi czynnikami stymulacji⁵⁰, (3) badań podstawowych zwiększających naszą wiedzę o komórkach skóry, ich funkcjach biologicznych, interakcjach z innymi komórkami i środowiskiem⁵¹^,⁵², (4) badania nad wybranymi jednostkami chorobowymi, w których do stworzonego modelu można wprowadzić określony typ komórki (komórki nowotworowe, komórki z mutacją w danym genie ^itp.14,53) i wiele innych. Nie trzeba dodawać, że stosowanie tych modeli pozostaje w zgodzie z zasadą 3R na rzecz bardziej etycznego wykorzystywania zwierząt w testowaniu produktów i badaniach naukowych oraz nie narusza prawa zakazu testowania produktów kosmetycznych na zwierzętach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe udzielone przez Politechnikę Warszawską z programu 'Inicjatywa Doskonałości - Uczelnia Badawcza' w postaci dwóch grantów: POB BIB BIOTECHMED-2 start (nr 1820/2/ZO1/POB4/2021) oraz grantu Rektora dla Studenckich Kół Naukowych (SKIN-ART, nr 1820/116/Z16/2021). Ponadto Autorzy dziękują za wsparcie, jakie otrzymali prof. Joanna Cieśla oraz Katedra Biotechnologii Leków i Kosmetyków oraz Koła Naukowego Biotechnologii "Herbion" na Wydziale Chemicznym Politechniki Warszawskiej. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Michała Stepulaka za udostępnienie związku Pluronic F-127.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowa płytka do adherentnej hodowli komórkowej	Biologix Europe GmbH	07-6024-35
%– 38% HCL	Chempur		115752837-60
mm kultura komórkowa szalka Petriego	Gniazdo		705001-Awidin
− Sulforodamina 101	Sigma Aldrich	A2348-5MG-Mikroskop
odwrócony jasnego pola	Olympus	CKX41-Chlorek
wapnia	Avantor		874870116-Kolba
do hodowli komórkowych T75 do komórek przylegających			Genoplast
15 ml		G66010522-CO2	GoogLab Scientific
	Przeciwciało Heal Force	Galaxy 170R-Col1A2
wytwarzane w króliku	Novus	NBP2-92790-Corning
(R) Transwell(R) Poliwęglan	Corning	CLS3422-48EA-Przeciwciało
cytokeratyny 14 wytwarzane u myszy	Novus	NBP1-79069-DPX
Mountant do histologii	Sigma Aldrich	06522-100ML	-
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy DulbeccoVWR	Chemicals	L0102-500-Eozyna
Y	Kolchem-0,5		% roztwór wodny
Probówka Eppendorfa 1,5 ml	Sarstedt	72.690.001-Probówka
Eppendorfa 2 ml	Sarstedt	72.691-Alkohol
etylowy absolut 99,8%	Avantor	396480111	rozcieńczony w ultraczystej wodzie do potrzebnej ilości stężenia
Surowica bydlęca	płodu Gibco		10270106-fluorescencyjny
mikroskop odwrócony	Olympus	IX71-Goat
drugorzędowe przeciwciało przeciw myszom sprzężone z FITC	Sigma Aldrich	F0257-1mL
Kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi sprzężone z FITC	Novus	NB7159-Harris
Hematoksylina	Kolchem-1		mg/ml w 95% etanolu
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570-Laminar
komora	Heal Force	HFSafe-1200-Melan-A
przeciwciało wytwarzane u myszy	Santa Cruz Biotechnology	sc-20032-Microtome
	Microm	HM355S-NaOH
	Avantor		810981997-Pastylki
parafinowe	Sigma Aldrich	1.07164-Paraformaldehyd
	Sigma Aldrich		1581227-roztwór
penicyliny/streptomycyny	Sigma Aldrich	P4333-Końcówka
do pipet, 1000 &mikro; L	Sarstedt	70.305-Końcówka
do pipet, 20 &mikro; L	Sarstedt	70.3021-Końcówka
do pipety, 200 &mikro; L	Sarstedt	70.303-Pluronic
F-127	BASF
50401036-Pipeta serologiczna 10 ml	GoogLab Scientific	Pipeta
G33270011-serologiczna 25 ml	GoogLab Scientific	Pipeta	G33280011-serologiczna
5 ml	GoogLab Scientific
G33260011-Sodu Wodorowęglan	Sigma Aldrich	S5761-Wodorowęglan
sodu	Chempur	118105307
0,25% roztwór trypsyny-EDTA, czerwień fenolowa	Kolagen Sigma Aldrich		25200072-Type
1	IBIDI	50201-U-bottom
96-dołkowa płytka	Sarstedt	83.3925500-Xylene
	Sigma Aldrich	534056	-

Probówka wirówkowa G77080033 Inkubator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farage, M. A., Miller, K. W., Elsner, P., Maibach, H. I. Characteristics of the aging skin. Advances in Wound Care. 2 (1), 5-10 (2013).
Zhu, H., Alikhan, A., Maibach, H. I. Biology of Stratum Corneum: Tape Stripping and Protein Quantification. Textbook of Aging Skin. Farage, M. A., Miller, K. W., Maibach, H. I. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2015).
Boer, M., Duchnik, E., Maleszka, R., Marchlewicz, M. Structural and biophysical characteristics of human skin in maintaining proper epidermal barrier function. Postepy Dermatogogii I Alergologii. 33 (1), 1-5 (2016).
De Falco, M., Pisano, M. M., De Luca, A. Embryology and Anatomy of the Skin. In Skin Cancer: A Practical Approach. Current Clinical Pathology. Baldi, A., Pasquali, P., Spugnini, E. P. , Springer. New York. (2014).
Dehdashtian, A., Stringer, T. P., Warren, A. J., Mu, E. W., Amirlak, B., Shahabi, L. Anatomy and Physiology of the Skin. Melanoma: A Modern Multidisciplinary Approach. Riker, A. I. , Springer International Publishing: Cham. 15-26 (2018).
Graham, H. K., Eckersley, A., Ozols, M., Mellody, K. T., Sherratt, M. J. Human Skin: Composition, Structure and Visualisation Methods. Skin Biophysics; Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering, and Biomaterials. Limbert, G. 22, Springer International Publishing: Cham. 1-18 (2019).
Piasek, A. M., Musolf, P., Sobiepanek, A. Aptamer-based advances in skin cancer research. Current Medicinal Chemistry. 30 (8), 953-973 (2023).
Bergfeld, W. F., Belsito, D. V., Marks, J. G., Andersen, F. A. Safety of ingredients used in cosmetics. Journal of the American Academy of Dermatology. 52 (1), 125-132 (2005).
Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
Sreedhar, D., Manjula, N., Ajay, P., Shilpa, P., Ligade, V. Ban of cosmetic testing on animals: A brief overview. International Journal of Current Research and Review. 12 (14), 113-116 (2020).
Silva, R. J., Tamburic, S. A state-of-the-art review on the alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics. Cosmetics. 9 (5), 90(2022).
Xu, Y., Shrestha, N., Préat, V., Beloqui, A. An overview of in vitro, ex vivo and in vivo models for studying the transport of drugs across intestinal barriers. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113795(2021).
Boelsma, E., Ponec, M. Basics (Guidelines) on Cell Culture Testing for Topical/Dermatological Drugs/Products and Cosmetics With Regard to Efficacy and Safety of the Preparations. In Dermatopharmacology of Topical Preparations. Gabard, B., Surber, C., Elsner, P., Treffel, P. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 37-57 (2000).
Suhail, S., Sardashti, N., Jaiswal, D., Rudraiah, S., Misra, M., Kumbar, S. G. Engineered skin tissue equivalents for product evaluation and therapeutic applications. Biotechnology Journal. 14 (7), 1900022(2019).
Sobiepanek, A., et al. Novel diagnostic and prognostic factors for the advanced melanoma based on the glycosylation-related changes studied by biophysical profiling methods. Biosensors and Bioelectronics. 203, 114046(2022).
Yang, H., Sun, L., Liu, M., Mao, Y. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
Baran, J., et al. Mast cells as a target-A comprehensive review of recent therapeutic approaches. Cells. 12 (8), 1187(2023).
Kosten, I. J., Buskermolen, J. K., Spiekstra, S. W., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Gingiva equivalents secrete negligible amounts of key chemokines involved in langerhans cell migration compared to skin equivalents. Journal of Immunology Research. 2015, 627125(2015).
cieżyńska, A., et al. A novel and effective method for human primary skin melanocytes and metastatic melanoma cell isolation. Cancers. 13 (24), 6244(2021).
Kröger, M., et al. In vivo non-invasive staining-free visualization of dermal mast cells in healthy, allergy and mastocytosis humans using two-photon fluorescence lifetime imaging. Scientific Reports. 10 (1), 14930(2020).
Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnology and Bioengineering. 118 (2), 542-554 (2021).
Rossi, A., Appelt-Menzel, A., Kurdyn, S., Walles, H., Groeber, F. Generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent and automated wounding. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52576(2015).
Kim, K., Kim, J., Kim, H., Sung, G. Y. Effect of α-lipoic acid on the development of human skin equivalents using a pumpless skin-on-a-chip model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2160(2021).
Curto, E. V., Lambert, G. W., Davis, R. L., Wilborn, T. W., Dooley, T. P. Biomarkers of human skin cells identified using DermArray DNA arrays and new bioinformatics methods. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 1052-1064 (2002).
Godwin, L. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Current Protocols in Cell Biology. 63, 1-20 (2014).
Przekora, A., Zarnowski, T., Ginalska, G. A simple and effective protocol for fast isolation of human tenon's fibroblasts from a single trabeculectomy biopsy - a comparison of cell behaviour in different culture media. Cellular & Molecular Biology Letters. 22, 5(2017).
Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, Isolation, and Maintenance of Human Mast Cells and Mast Cell Lines Derived from Peripheral Blood or Cord Blood. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., Bierer, B. E., Margulies, D. H., Shevach, E. M., Strober, W. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
Artuc, M., Muscha Steckelings, U., Henz, B. M. Mast cell-fibroblast interactions: Human mast cells as source and inducers of fibroblast and epithelial growth factors. Journal of Investigative Dermatology. 118 (3), 391-395 (2002).
Panos, R. J., Rubin, J. S., Csaky, K. G., Aaronson, S. A., Mason, R. J. Keratinocyte growth factor and hepatocyte growth factor/scatter factor are heparin-binding growth factors for alveolar type ii cells in fibroblast-conditioned medium. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 969-977 (1993).
Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Threedimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery (Review). Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
Amaral, R. L. F., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).
Gao, B., Jing, C., Ng, K., Pingguan-Murphy, B., Yang, Q. Fabrication of three-dimensional islet models by the geometry-controlled hanging-drop method. Acta Mechanica Sinica. 35 (2), 329-337 (2019).
Zhang, C., et al. 3D culture technologies of cancer stem cells: Promising ex vivo tumor models. Journal of Tissue Engineering. 11, (2020).
Sobiepanek, A., Paone, A., Cutruzzolà, F., Kobiela, T. Biophysical characterization of melanoma cell phenotype markers during metastatic progression. European Biophysics Journal: EBJ. 50 (3-4), 523-542 (2021).
Jin, G. -Z., Kim, H. -W. Effects of Type I collagen concentration in hydrogel on the growth and phenotypic expression of rat chondrocytes. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 383-391 (2017).
Osidak, E. O., et al. Concentrated collagen hydrogels: A new approach for developing artificial tissues. Materialia. 20, 101217(2021).
Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: Characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
Jimbow, K., Salopek, T. G., Dixon, W. T., Searles, G. E., Yamada, K. The epidermal melanin unit in the pathophysiology of malignant melanoma. The American Journal of Dermatopathology. 13 (2), 179-188 (1991).
Van Den Bogaard, E., et al. Perspective and consensus opinion: Good practices for using organotypic skin and epidermal equivalents in experimental dermatology research. Journal of Investigative Dermatology. 141 (1), 203-205 (2021).
Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17(2022).
Idrees, A., et al. Fundamental in vitro 3D human skin equivalent tool development for assessing biological safety and biocompatibility - towards alternative for animal experiments. 4 Open. 4, (2021).
Park, H. -Y., Kweon, D. -K., Kim, J. -K. Upregulation of tight junction-related proteins by hyaluronic acid in human HaCaT keratinocytes. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre. 30, 100374(2023).
Choudhury, S., Das, A. Advances in generation of three-dimensional skin equivalents: Pre-clinical studies to clinical therapies. Cytotherapy. 23 (1), 1-9 (2021).
Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue engineered human skin equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).
Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K. E., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. 49, 102048(2020).
Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
Akther, F., Little, P., Li, Z., Nguyen, N. -T., Ta, H. T. Hydrogels as artificial matrices for cell seeding in microfluidic devices. RSC Advances. 10 (71), 43682-43703 (2020).
Silva, A. K. A., Richard, C., Bessodes, M., Scherman, D., Merten, O. -W. Growth factor delivery approaches in hydrogels. Biomacromolecules. 10 (1), 9-18 (2009).
Lee, H. -R., et al. Effect of Aronia extract on collagen synthesis in human skin cell and dermal equivalent. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 4392256(2022).
Mulder, P. P. G., Raktoe, R. S., Vlig, M., Elgersma, A., Middelkoop, E., Boekema, B. K. H. L. Full skin equivalent models for simulation of burn wound healing, exploring skin regeneration and cytokine response. Journal of Functional Biomaterials. 14 (1), 29(2023).
Goncalves, K., et al. Investigation into the effect of skin tone modulators and exogenous stress on skin pigmentation utilizing a novel bioengineered skin equivalent. Bioengineering & Translational Medicine. 8 (2), 10415(2023).
Michel, M., L'Heureux, N., Pouliot, R., Xu, W., Auger, F. A., Germain, L. Characterization of a New Tissue-Engineered Human Skin Equivalent with Hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
Müller, I., Kulms, D. A 3D organotypic melanoma spheroid skin model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57500(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe modele sk ry monokultury 2D modele wielokulturowe metoda wisz cej kropli ograniczanie adhezji kom rek sferoidy kom rkowe hodowla keratynocyt w hodowla fibroblast w testy kosmetyczne

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły