Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65774

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Streszczenie

Sieć mikrotubul jest niezbędnym elementem układu nerwowego. Mutacje w wielu białkach regulatorowych mikrotubul są związane z zaburzeniami neurorozwojowymi i chorobami neurologicznymi, takimi jak białko Tau związane z mikrotubulami do chorób neurodegeneracyjnych, białko zrywające mikrotubule Spastin i Katanin 60 powodują odpowiednio dziedziczną paraplegię spastyczną i nieprawidłowości neurorozwojowe. Wykrywanie sieci mikrotubul w neuronach jest korzystne dla wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neurologicznych. Jednak mały rozmiar neuronów i gęste ułożenie aksonalnych wiązek mikrotubul sprawiają, że wizualizacja sieci mikrotubul jest trudna. W tym badaniu opisano metodę preparacji połączenia nerwowo-mięśniowego larw i komórek mięśniowych, a także barwienia immunologicznego α-tubuliny i białka związanego z mikrotubulami Futscha w celu wizualizacji sieci mikrotubul u Drosophila melanogaster. Połączenie nerwowo-mięśniowe pozwala na obserwację zarówno mikrotubul przed-, jak i postsynaptycznych, a duży rozmiar komórek mięśniowych u larw Drosophila pozwala na wyraźną wizualizację sieci mikrotubul. Tutaj, poprzez mutację i nadekspresję Kataniny 60 w Drosophila melanogaster, a następnie badanie sieci mikrotubul w złączu nerwowo-mięśniowym i komórkach mięśniowych, dokładnie ujawniamy regulacyjną rolę Kataniny 60 w rozwoju neurologicznym. Dlatego też, w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wprowadzenie

Mikrotubule (MT), jako jeden ze składników strukturalnych cytoszkieletu, odgrywają ważną rolę w różnych procesach biologicznych, w tym w podziale komórek, wzroście i ruchliwości komórek, transporcie wewnątrzkomórkowym i utrzymaniu kształtu komórki. Dynamika i funkcja mikrotubul są modulowane przez interakcje z innymi białkami, takimi jak MAP1, MAP2, Tau, Katanina i Kinezyna1,2,3,4,5.

W neuronach mikrotubule są niezbędne do rozwoju i utrzymania aksonów i dendrytów. Nieprawidłowości w mikrotubulach prowadzą do dysfunkcji, a nawet śmierci neuronów. Na przykład w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera hiperfosforylacja białka Tau zmniejsza stabilność sieci mikrotubul, powodując nieprawidłowości neurologiczne6. W ten sposób badanie sieci mikrotubul przyczyni się do zrozumienia rozwoju neurologicznego i patogenezy chorób neurologicznych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa obwodowa utworzona pomiędzy końcem aksonu neuronu ruchowego a włóknem mięśniowym, która jest doskonałym i potężnym systemem modelowym do badania struktury i funkcji synaptycznych7. Futsch to białko z rodziny Drosophila, które jest homologiczne do białka wiążącego mikrotubule MAP1B występującego u ssaków8. Jest wyrażany tylko w neuronach i odgrywa rolę w rozwoju przycisków synaptycznych NMJ8,9. W typie dzikim nitkowate wiązki, które biegną wzdłuż środka procesów NMJ, są wizualizowane przez barwienie immunologiczne za pomocą anty-Futscha. Po dotarciu do końca NMJ, wiązka ta ma zdolność do tworzenia pętli składającej się z mikrotubul lub do utraty swojej nitkowatej struktury, co skutkuje dyfuzyjnym i punktowym wyglądem10. Pętle mikrotubul są powiązane z wstrzymanymi stożkami wzrostu, co sugeruje, że tablica mikrotubul jest stabilna11. W związku z tym możemy pośrednio określić stabilny rozwój mikrotubul w NMJ za pomocą barwienia Futscha. Duży rozmiar komórek mięśniowych u larw Drosophila pozwala na wyraźną wizualizację sieci mikrotubul. Czynniki wpływające na stabilność sieci mikrotubul można znaleźć, analizując gęstość i kształt mikrotubul. Jednocześnie stan sieci mikrotubul komórek mięśniowych może być weryfikowany krzyżowo z wynikiem NMJ w celu uzyskania bardziej kompleksowych wniosków.

Wiele protokołów zostało wykorzystanych do badania sieci i dynamiki mikrotubul. Jednak badania te często koncentrowały się na badaniach in vitro12,13,14,15,16. Alternatywnie, w niektórych eksperymentach in vivo zastosowano mikroskopię elektronową do wykrycia cytoszkieletu17. Ze względu na specyficzne wiązanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał lub barwników chemicznych z białkami lub DNA, przedstawione tutaj metody pozwalają na wykrycie sieci mikrotubul w NMJ na poziomie pojedynczych neuronów in vivo, przy czym wyniki potwierdzają obserwacje w komórkach mięśniowych. Protokół ten jest prosty, stabilny i powtarzalny w połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi w Drosophila melanogaster, umożliwiając różnorodny zakres badań fenotypowych i genetycznych badań przesiewowych pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sekcja larw

UWAGA: Roztwór do preparowania soli fizjologicznej podobnej do hemolimfy (HL3.1)18 i roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu (PFA)19,20są używane w temperaturze pokojowej, ponieważ mikrotubule depolimeryzują, gdy temperatura jest zbyt niska.

  1. Wybierz wędrującą larwę w 3.stadium za pomocą długich, kleszczy. Umyj go HL3.1 i umieść na naczyniu preparacyjnym pod mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Wędrująca larwa 3 stopnia jest identyfikowana przez rozgałęzioną przetchlinkę przednią i pełza wokół rurki po około 96 godzinach (25 °C)21.
  2. Ustaw larwę grzbietową lub brzuszną stroną do góry. Zidentyfikuj stronę grzbietową za pomocą dwóch długich tchawic, a brzuszną za pomocą brzusznych pasów zębatych.
    1. W zależności od tkanki, którą chcesz obserwować, zdecyduj się na rozwarstwienie grzbietowe lub brzuszne. Pozwoli to na bardziej precyzyjny i szczegółowy wgląd w konkretny obszar zainteresowania. W celu obserwacji NMJ i komórek mięśniowych należy rozciąć odpowiednio obszar grzbietowy i brzuszny larwy.
  3. Przypnij haczyki do ust i ogon. Wyreguluj szpilki, aby utrzymać larwę w stanie rozszerzonym. Dodaj kroplę HL3.1 do larwy, aby zapobiec jej wysuszeniu.
    UWAGA: HL 3.1 wolny od Ca2+ może być stosowany w celu zminimalizowania skurczu mięśni podczas rozwarstwienia.
  4. Użyj nożyczek do preparowania, aby wykonać małe poprzeczne cięcie blisko tylnego końca, ale nie odcinaj tylnego końca. Następnie przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej w kierunku przedniego końca.
  5. Włóż cztery szpilki do owadów w czterech rogach larwy. Wyreguluj szpilki owadów tak, aby larwa była maksymalnie rozciągnięta we wszystkich kierunkach.
  6. Użyj kleszczy, aby usunąć narządy wewnętrzne, nie uszkadzając mięśni.

2. Fiksacja

  1. Dodaj 100 μl PFA (4%), aby zanurzyć tusze na 40 minut, podczas gdy tusze są jeszcze przypięte do naczynia sekcyjnego.
    UWAGA: Stosuje się skuteczne środki ochronne, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą lub wdychania, ponieważ PFA stanowi zagrożenie.
  2. Zdemontuj kołki i przenieś próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Spłucz PFA 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST), aby napełnić probówkę mikrowirówki o pojemności 2 ml na 10 minut na wytrząsarce odbarwiającej z prędkością 15 obr./min. Powtórz proces prania 5x.

3. Immunocytochemia

  1. Zanurzyć tusze w środku blokującym (5% surowicy koziej w 0,2% PBST) i blokować przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć czynnik blokujący i zastąpić go 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego (np. anty-α-tubuliny w stosunku 1:1000; anty-Futsch w stosunku 1:50) rozcieńczonego 0,2% PBST w temperaturze 4 °C przez noc. Wizualizacja mikrotubul mięśniowych poprzez barwienie immunologiczne monoklonalną anty-α-tubuliną. Anty-Futsch może pośrednio odzwierciedlać morfologię mikrotubul w NMJ.
  3. Po inkubacji przeciwciała pierwszorzędowego przemywać larwy 0,2% PBST przez 10 min. Powtórzyć 5x.
  4. Inkubować larwy z 200 μl przeciwciała drugorzędowego (np. koziego przeciwciała anty-Mouse-488, 1:1000) rozcieńczonego 0,2% PBST w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny w ciemności.
  5. Następnie dodaj barwnik jądrowy, taki jak jodek TO-PRO(R) 3 (T3605) o stężeniu 1:1000 do probówki inkubacyjnej na 30 minut podczas barwienia mikrotubul w ciemności20,22.
  6. Spłucz przeciwciało drugorzędowe i barwnik jądrowy 0,2% PBST przez 10 minut. Powtórz 5x w ciemności.

4. Montaż

  1. Umieścić tuszę larwalną w 0,2% PBST na szkiełku podstawowym i wyregulować pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że wewnętrzna powierzchnia tuszy larwalnej jest skierowana do góry, a wszystkie tusze larwalne są ułożone zgodnie z życzeniem.
  2. Nadmiar roztworu PBST wchłonąć chusteczką i delikatnie dodać kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, aby powoli i delikatnie przykryć wypreparowane larwy, aby uniknąć pęcherzyków.
  4. Nałóż lakier do paznokci wokół szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko w ciemnym miejscu, aby zmniejszyć tłumienie fluorescencji.

5. Akwizycja obrazu

  1. Aby uzyskać obrazy, użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, wybierz obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w oleju (apertura numeryczna 1,42) lub podobny i dostosuj moc lasera i długość fali w oparciu o eksperyment.
  2. Aby zidentyfikować NMJ, uchwyć obrazy w mięśniu 4 w segmencie A3 (jak pokazano w lokalizacji w Rysunek 1F). Wybierz laser o długości fali 488 nm, aby aktywować α-tubulinę lub Futscha i 543 nm, aby aktywować ścieżkę obrazowania HRP. Dostosuj parametry do rozmiaru klatki 800 x 800 pikseli, zoomu cyfrowego 2,0 i interwału obrazowania 0,8 μm w NMJ (Rysunek 2).
  3. Aby zidentyfikować mikrotubule w mięśniach, uchwyć obrazy mięśnia 2 w segmencie A3-A5 (jak pokazano w lokalizacji w Rysunek 1G), ponieważ ma on mniej gałęzi tchawicy. Wybierz laser 488 nm do aktywacji tubuliny α i laser 635 nm do aktywacji ścieżki obrazowania T3605. Dostosuj parametry do rozmiaru klatki 1024 pikseli x 1024 pikseli, zoomu cyfrowego 3,0 i interwału obrazowania 0,4 μm w komórkach mięśniowych (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiliśmy szczegółową procedurę wizualizacji sieci mikrotubul zarówno w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jak i w komórkach mięśniowych. Po przeprowadzeniu sekcji zgodnie ze schematem (Rysunek 1A-E), wykonuje się immunobarwienie, a następnie obrazy są obserwowane i gromadzone przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego lub stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 1F,G).

Zarówn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano protokół preparacji i barwienia immunologicznego połączeń nerwowo-mięśniowych larw Drosophila i komórek mięśniowych. Należy wziąć pod uwagę kilka istotnych punktów. Po pierwsze, unikanie urazów obserwowanych mięśni ma kluczowe znaczenie podczas procesu sekcji. Warto przymocować filet przed usunięciem narządów wewnętrznych, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi kleszczy z mięśniami. Aby uniknąć uszkodzenia mięśni lub oddzielenia się od naskórka larw, ważne jest, aby upewnić się, że prędkość...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Ying Xiong za dyskusje i komentarze na temat manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauki Chin (NSFC) dla C. M. (31500839).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor Plus 405 falloidynainvitrogenA30104rozcieńczony 1:200
Ulepszony środek do montażu przeciwblaknięcia ŚredniBeyotimeP0128M
FV10-ASWOlympus
Goat przeciwciało anty-mysie, Alexa Fluor 488 sprzężonyThermo FisherA-11001rozcieńczony 1:1,000
Laserowy mikroskop konfokalny LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mysie przeciwciało anty-FutschaBadania rozwojowe Hybridoma Bank   22C10rozcieńczony 1:50
Mysie przeciwciało anty-&alfa-tubulinoweSigmaT5168rozcieńczone 1:1,000
ParaformaldehydWako168-20955Stężenie końcowe: 4% w PB Bufor
Szpilki Minutien ze stali nierdzewnejEntomoraviaśrednicy 0,1 mm
SMZ161Motic
fluorescencyjny stereoskopowy mikroskop BX41Olympus
Texas Koza czerwono sprzężona anty-HRPJackson ImmunoResearchrozcieńczony 1:100
TO-PRO(R) 3 jodekInvitrogenT3605rozcieńczony 1:1,000
Wytrząsarka transferowa odbarwiająca TS-8Instrumenty laboratoryjne Kylin-BellE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Pęseta Dumont500342
mikroskop konfokalny Mikroskop stereoskopowy o

Bibliografia

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204(2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488(2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202(2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

złącze nerwowo-mięśniowe Drosophiladynamika mikrotubulkatanina 60barwienie alfa-tubulinymikroskopia konfokalnaprzesiew genetycznyprotokół immunobarwieniazaburzenia rozwoju neurologicznego
Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.