Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę biorepozytorium do standaryzowanego zbierania, opisywania i biobankowania wysokiej jakości ludzkich biopsji cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.
Artykuł metodologiczny
Biobankowanie płynnych biopsji ludzkich roztworów wodnych i ciała szklistego do analiz molekularnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kluczowym wyzwaniem w badaniach translacyjnych jest stworzenie realnego i efektywnego interfejsu między opieką nad pacjentem na sali operacyjnej (OR) a laboratorium badawczym. W tym miejscu opracowaliśmy protokół pozyskiwania wysokiej jakości płynnych biopsji do analiz molekularnych z cieczy wodnistej i ciała szklistego od pacjentów poddawanych operacji oka. W tym przepływie pracy wózek z interfejsem MORLI (Mobile Operating Room Lab Interface) wyposażony w komputer, skaner kodów kreskowych i przyrządy laboratoryjne, w tym pokładową chłodnię, jest używany do pozyskiwania i archiwizowania próbek biologicznych ludzi. Internetowa baza danych zgodna z przepisami o ochronie danych umożliwia dodawanie adnotacji do każdej próbki przez cały okres jej użytkowania, a kartezjański układ współrzędnych umożliwia śledzenie każdej próbki z kodem kreskowym w magazynie, umożliwiając szybkie i dokładne pobieranie próbek do dalszych analiz. Charakterystyka molekularna próbek tkanek ludzkich służy nie tylko jako narzędzie diagnostyczne (np. do rozróżnienia między zakaźnym zapaleniem wnętrza gałki ocznej a innym niezakaźnym zapaleniem wewnątrzgałkowym), ale stanowi również ważny element badań translacyjnych, umożliwiając identyfikację nowych celów leków, rozwój nowych narzędzi diagnostycznych i spersonalizowanych terapii.
Wprowadzenie
Profilowanie molekularne płynnych biopsji z ludzkiego oka może wychwycić lokalnie wzbogacone płyny zawierające cząsteczki takie jak DNA, RNA, białka, glikany i metabolity z wysoce wyspecjalizowanych tkanek oka. Płynne biopsje z ciała szklistego w tylnej komorze ludzkiego oka okazały się ogólnie bezpieczną procedurą1. Pozwalają one na molekularną charakterystykę chorób oczu u żyjących ludzi i oferują potencjał do identyfikacji nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych2,3,4. Ciecz wodnista w przedniej komorze oka jest jeszcze bardziej dostępna chirurgicznie i można ją uzyskać w dużych ilościach, np. podczas operacji zaćmy, która jest jedną z najczęściej wykonywanych operacji. Jednak do tej pory nie jest dostępny żaden znormalizowany protokół pobierania, opisywania i biobankowania biopsji ludzkiego cieczy wodnistej i płynu szklistego do dalszych analiz molekularnych, w tym proteomiki, metabolomiki i glikomiki.
Tutaj opracowaliśmy protokół pobierania i biobankowania wysokiej jakości płynnych biopsji do analiz molekularnych od pacjentów poddawanych operacji oka. Mobilny interfejs laboratoryjny sali operacyjnej (MORLI) umożliwia badaczowi natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie pobranych próbek w kriowiach z kodami kreskowymi na suchym lodzie w temperaturze -80 °C na sali operacyjnej (OR). Procedura ta zapewnia wysoką i stałą jakość próbki do dalszej analizy molekularnej. Oprócz doskonałej jakości próbek, kluczowe znaczenie ma dokładna adnotacja próbek w biobanku. Korzystając z internetowej bazy danych REDCap (Health Insurance Portability and Accountability Act) zgodnej z HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, nasz przepływ pracy umożliwia przechowywanie szczegółowych metadanych dla każdej próbki, w tym wieku, płci, choroby, stadium choroby, rodzaju próbki i unikalnych cech operacji. Umożliwi to w przyszłości dokładne wyszukiwanie, np. próbek z określonej choroby lub określonej grupy pacjentów. Ponadto dokładna lokalizacja każdej próbki w zamrażarce jest archiwizowana za pomocą kartezjańskiego systemu siatkowego, który umożliwia efektywne pobieranie próbek na potrzeby dalszych eksperymentów. Pokazujemy przykłady analiz DNA, białek, glikanów i metabolitów.
Nasz przepływ pracy stanowi praktyczne i skuteczne połączenie między salą operacyjną a laboratorium badawczym i stanowi cenną podstawę dla badań translacyjnych.
Protokół
Protokół jest zgodny z wytycznymi Institutional Review Board for Human Subject Research (IRB) na Uniwersytecie Stanforda, USA.
UWAGA: Ten protokół jest przewodnikiem dla wykwalifikowanych chirurgów okulistycznych. W kontekście nowotworów złośliwych wewnątrzgałkowych nie można wykluczyć wysiewu guza poza gałką oczną w przypadku biopsji cieczy wodnistej lub płynnej biopsji ciała szklistego. Jednak ryzyko rozszerzenia zewnątrzgałkowego i zajęcia oczodołu jest niezwykle niskie w biopsji przezszklistkowej guza naczyniówkowego, która jest wykonywana w sposób zwiększony pod kątem bezpieczeństwa i z dokładnym uwzględnieniem miejsca wejścia6. Protokół ten nie obejmuje i może być przeciwwskazany w przypadku siatkówczaka lub guzów o wysokim ryzyku przerzutów.
1. Przed pobraniem próbki
- Zatwierdzenie przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną
- Przed rozpoczęciem eksperymentu należy uzyskać zgody od lokalnego IRB i odpowiednio przeprowadzić pobieranie próbek.
- Badana populacja
- Kryteria włączenia: Uwzględnij wszystkich pacjentów (w wieku od 0 do 99 lat), którzy przechodzą operację wewnątrzgałkową w placówce, która zapewni odpowiednią ilość cieczy wodnistej lub płynu do ciała szklistego przekraczającą ilość wymaganą do odpowiednich badań diagnostycznych w celu oceny stanu pacjenta oraz pacjentów, którzy chcą wziąć udział w badaniu.
- Kryteria wyłączenia: Wykluczenie pacjentów, którzy odmawiają udziału w programie, oraz kobiet w ciąży.
- Świadoma zgoda
- Uzyskaj pisemną świadomą zgodę od każdego pacjenta zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB.
- Zarchiwizuj podpisaną zgodę w zabezpieczonej bazie danych.
- Szkolenie zaangażowanego personelu (chirurgów, techników laboratoryjnych, personelu sali operacyjnej, naukowców) zgodnie z opisem w niniejszym protokole.
- Skonfiguruj przykładową bazę danych do zarządzania. Użyj REDCap jako zgodnej z HIPAA przykładowej internetowej bazy danych, która została zaprojektowana do obsługi przechwytywania danych na potrzeby badań naukowych5.
UWAGA: W tym artykule opisano użycie interfejsu internetowego dostarczanego przez REDCap do projektowania formularzy, definiowania pól, konfigurowania logiki rozgałęziania i stosowania reguł sprawdzania poprawności danych bez konieczności posiadania rozległej wiedzy programistycznej. Alternatywnie odpowiednie może być również inne oprogramowanie, takie jak standardowe aplikacje do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. - Upewnij się, że dostępny jest pojemnik chłodzący, suchy lód, strzykawka do pobierania próbek i kriowiale (patrz Tabela materiałów). Używaj kriofiali z kodami kreskowymi, które są trwale wytrawione na fiolkach. Eliminuje to konieczność dodawania identyfikatorów pacjenta na fiolce i możliwość zgubienia etykiety w warunkach zamrożenia.
- Powiadom chirurga w sprawie oraz technika laboratoryjnego, który pomoże w pobraniu próbki na sali operacyjnej co najmniej 24 godziny przed planowanym zabiegiem.
2. Pobieranie próbek chirurgicznych na sali operacyjnej
- Interfejs mobilnego laboratorium sali operacyjnej (MORLI)
- Ułóż MORLI na sali operacyjnej. MORLI składa się z płaskiej powierzchni stołu laboratoryjnego, komputera/tabletu ze skanerem kodów kreskowych z dostępem do bazy danych REDCap oraz pojemnika chłodzącego z suchym lodem (patrz Tabela Materiałów).
UWAGA: Suchy lód jest bardzo zimny. Zawsze noś rękawice podczas pracy z suchym lodem i unikaj jego dotykania.
- Ułóż MORLI na sali operacyjnej. MORLI składa się z płaskiej powierzchni stołu laboratoryjnego, komputera/tabletu ze skanerem kodów kreskowych z dostępem do bazy danych REDCap oraz pojemnika chłodzącego z suchym lodem (patrz Tabela Materiałów).
- Przygotowanie pobierania próbek na sali operacyjnej
- Zaloguj się do komputera/tabletu na MORLI i otwórz bazę danych REDCap.
- Sprawdź, czy pacjent podpisał świadomą zgodę i potwierdź to z chirurgiem. Przypomnij mu, że wymagana jest nierozcieńczona próbka.
- Nosić rękawice. Uzyskać odpowiednią liczbę kriowialiów z kodami kreskowymi (0,5 ml dla cieczy wodnistej i 1,9 ml dla próbek szklistych) i umieścić je w łatwo dostępnym miejscu.
- Zbiór biopsji płynnych z cieczy wodnistej
UWAGA: Próbki tkanek ludzkich należy traktować jako materiał niebezpieczny biologicznie, który wymaga odpowiednich środków ostrożności, takich jak fartuch laboratoryjny i rękawice, aby zapewnić bezpieczeństwo zaangażowanemu personelowi.
UWAGA: Poniższe kroki powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolonego chirurga okulisty. Biopsje cieczy wodnistej w płynie można uzyskać na przykład na początku operacji zaćmy, jednej z najczęstszych operacji na świecie.
UWAGA: Na sali operacyjnej utrzymywane jest sterylne pole zgodnie ze standardowymi protokołami opieki. Procedury przedoperacyjne związane ze znieczuleniem pacjenta są zgodne ze standardowymi krokami opieki w przypadku operacji przedniej komory i witreoretinalnej.- Przygotuj i udrapuj oko do operacji i umieść sterylny wziernik pokrywy, aby uzyskać optymalną wizualizację sterylnego pola.
- Użyj mikroskopu operacyjnego, aby wykonać paracentezę przedniej komory prostopadłej do rąbka za pomocą igły 30-32 G połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml. Użyj bawełnianej końcówki lub małych kleszczyków, aby ustabilizować oko podczas tego zabiegu.
UWAGA: Upewnić się, że igła i strzykawka są zablokowane i że nie ma nacisku w strzykawce (przesuwając tłok). Upewnij się, że końcówka igły pozostaje nad obwodową tęczówką w środkowej komorze przedniej, aby uniknąć uszkodzenia struktur wewnątrzgałkowych. W przypadku operacji zaćmy igła do uzyskania płynnej biopsji może również wejść do komory przedniej przez jedną z paracentez, które są tworzone do operacji zaćmy. - Pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą mikroskopu ręcznie odessać około 100 μl nierozcieńczonej cieczy wodnistej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Przesuwać tłok strzykawki ręką niedominującą chirurga lub przez przeszkolonego asystenta bez przesuwania igły.
UWAGA: Uzyskać mniej niż 100 μl cieczy wodnistej na wypadek zapadnięcia się komory przedniej. - Ostrożnie wyjąć igłę z komory przedniej.
UWAGA: W oku fakijnym trzymaj igłę nad tęczówką, aby uniknąć dotykania soczewki. Dodatnie ciśnienie na kuli ziemskiej może zwiększyć refluks. Zwolnienie bawełnianej końcówki przed wyjęciem igły pomaga zmniejszyć refluks .
- Odciągnąć tłok i zobaczyć, jak porusza się powietrze i zebrany płyn.
- Wstrzyknąć strzykawkę do kriowialu. Dodatkowe powietrze oczyszcza martwą przestrzeń strzykawki.
- Użyj kodu kreskowego na kriowiale, aby zeskanować próbkę do formularza REDCap na komputerze na sali operacyjnej (więcej szczegółów w krokach od 3.1 do 3.9).
- Natychmiast przenieś kriowial do suchego lodu w komorze chłodzącej.
- Kontynuuj zaplanowaną dla pacjenta operację (np. operację zaćmy, jak opisano wcześniej7 ).
- Zbiór płynnych biopsji ciała szklistego
UWAGA: Poniższe kroki powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolonego chirurga witreoretinalnego. Biopsje płynu do ciała szklistego można wykonać na początku witrektomii8. Ponieważ celem jest pobranie nierozcieńczonej próbki ciała szklistego, frez do witrektomii nie zostanie zagruntowany płynem1.
UWAGA: Na sali operacyjnej utrzymywane jest sterylne pole zgodnie ze standardowymi protokołami opieki. Procedury przedoperacyjne związane ze znieczuleniem pacjenta są zgodne ze standardowymi krokami opieki w przypadku operacji przedniej komory i witreoretinalnej.- Przygotuj i udrapuj oko do operacji i umieść sterylny wziernik pokrywy, aby uzyskać optymalną wizualizację sterylnego pola.
- Wykonaj sklerotomię za pomocą kaniuli trokarowej 23, 25 lub 27 G, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami pielęgnacyjnymi. Wprowadzić kaniulę infuzyjną i wizualnie potwierdzić odpowiednie umieszczenie w jamie ciała szklistego.
- W jamie ciała szklistego aktywować nożownik do ciała szklistego bez infuzji, aby pobrać nierozcieńczoną próbkę ciała szklistego. Ręcznie odessać od 0,5 do 1,0 ml ciała szklistego za pomocą strzykawki podłączonej do kaniuli do wytłaczania ciała szklistego1.
- Wyjmij nóż do ciała szklistego z oka i włącz napar płynu.
- Odessać pozostały płyn z rurki do strzykawki.
- Odłączyć strzykawkę.
- Badać próbkę zgodnie z opisem dla próbki cieczy wodnistej w sekcji 2.3 (etapy od 2.3.5 do 2.3.9).
3. Przetwarzanie próbek na sali operacyjnej i dodawanie próbek do bazy danych
- Poproś technika laboratoryjnego, aby wziął przygotowany kriowial (0,5 ml dla cieczy wodnistej i 1,9 ml dla próbek ciała szklistego) i poszedł do chirurga, nie dotykając żadnego sterylnego sprzętu OR.
- Poproś technika laboratoryjnego o otwarcie kriowiala.
- Rozładować strzykawkę bezpośrednio do kriowialu.
- Poproś technika laboratoryjnego o natychmiastowe ponowne zamknięcie kriowialu.
- Poproś technika laboratoryjnego, aby wrócił do MORLI i natychmiast przeniósł próbkę na suchy lód w komorze chłodzącej (-80 °C). Zamknij pokrywę pudełka.
- Otwórz nowy formularz pobierania próbki. W odpowiednim polu formularza należy wprowadzić następujące informacje: chirurg przypadku, miejsce i datę pobrania, numer identyfikacyjny pacjenta oraz inne podstawowe informacje, takie jak wiek, płeć, prawe lub lewe oko, diagnoza, historia przedoperacyjna (tekst dowolny), informacje o zabiegu (np. rodzaj zabiegu), a także informacje o próbkach, takie jak liczba pobranych próbek, rodzaj próbek (ciecz ciekła, ciało szkliste) oraz inne szczegóły, takie jak objętość. Dodaj kod kreskowy probówki za pomocą skanera kodów kreskowych.
- Kliknij Prześlij/Dalej.
- Powtórzyć kroki od 3.1 do 3.7, jeśli zostaną pobrane dodatkowe próbki.
- Gdy wszystkie próbki są zabezpieczone, kliknij przycisk Zapisz i prześlij w formularzu zbierania próbki REDCap. Następnie wyloguj się z bazy danych i komputera/tabletu.
4. Przenoszenie kriowiali do magazynu
- Próbki należy przetransportować na suchym lodzie w chłodziarce z sali operacyjnej do laboratorium i umieścić je na stole laboratoryjnym obok komputera laboratoryjnego.
- Zaloguj się do REDCap na komputerze laboratoryjnym przy użyciu swojego identyfikatora logowania i hasła.
- Nosić rękawice. Pobrać jedną z pobranych próbek i zeskanować kod kreskowy kriowialu do bazy danych (więcej szczegółów w sekcji 5). Natychmiast umieścić próbkę z powrotem na suchym lodzie.
- Zaopatrz się w drugi pojemnik wypełniony suchym lodem.
- Zaopatrz się w stojak na kriowiale z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Umieść go w drugim pojemniku na suchym lodzie.
UWAGA: Stojak w formacie 96 będzie potrzebny na probówki do wody o pojemności 0,5 ml i stojak w formacie 48 na probówki do ciała szklistego o pojemności 1,9 ml. - Zeskanuj kod kreskowy regału do bazy danych (więcej szczegółów w rozdziale 5).
- Przenieść próbkę do stojaka.
- Dodać pozycję fiolek w stojaku do bazy danych (więcej szczegółów w sekcji 5).
- Kliknij Zapisz i prześlij.
- Przetransportować ruszt z fiolkami na suchym lodzie do lodówki w celu przechowywania w temperaturze -80 °C. Dodać ruszt w określone miejsce w lodówce za pomocą układu współrzędnych. Umożliwi to późniejsze łatwe pobieranie próbek do dalszej analizy.
5. Przykładowy formularz przechowywania
- Należy wypełnić formularz przechowywania dla każdej próbki pobranej na etapie formularza zgłoszeniowego. Kliknij puste kółko lub znak "+" w obszarze Przechowywanie próbek, aby utworzyć i otworzyć nowy formularz przechowywania.
- Wprowadź datę wypełnienia tego formularza w polu Data archiwizacji rekordu.
- Zeskanuj lub wpisz kod kreskowy probówki w polu Kod kreskowy probówki z próbką. Natychmiast umieścić próbkę z powrotem na suchym lodzie.
- Umożliwia wybranie, czy próbka ma zostać przeniesiona na zewnątrz, czy też próbka ma być przechowywana w wewnętrznym repozytorium biologicznym.
- Sprawdź, czy pacjent uzyskał pisemną świadomą zgodę i zaznacz pole wyboru w obszarze Sprawdź zgodność zgody, a następnie wprowadź swoje imię i nazwisko w polu Zgoda zweryfikowana przez.
- Wybierz wolne i odpowiednie miejsce dla kriowialu w stojaku. Przenieś kriowial w tej pozycji do stojaka (np. pozycja A1). Trzymaj ruszt na suchym lodzie.
- W fazie Lokalizacja wprowadź następujące informacje: lokalizację zamrażarki w obszarze Zamrażarka, numer półki, na której próbka będzie przechowywana w obszarze Półka, kod kreskowy pudełka w polu Kod kreskowy pudełka, pozycję probówki w pudełku według wierszy (Pozycja probówki (wiersz)) i kolumnę (Pozycja probówki (kolumna)).
UWAGA: Opcjonalnie w polu Etykieta pudełka można również wprowadzić etykietę pudełka, co może ułatwić odnalezienie pudełka w zamrażarce. - W sekcji Użycie wprowadź następujące informacje: nazwę projektu, w którym próbka jest używana (Nazwa projektu), objętość próbki w jednej z następujących kategorii: pełna, częściowa, prawie pusta lub pusta (Objętość próbki) oraz uwagi dotyczące przechowywania, jeśli ma to zastosowanie, w obszarze Uwagi do przechowywania.
UWAGA: Data, godzina i użytkownik, który ostatnio korzystał z formularza, są wypełniane automatycznie, aby zapewnić łańcuch dowodowy, który można przeglądać i kontrolować w razie potrzeby. - Upewnij się, że formularz został wypełniony, klikając przycisk Ukończono w obszarze Ukończono?.
- Kliknij Zapisz i wyjdź z formularza. Spowoduje to powrót do przeglądu pacjentów.
- Dla każdej pobranej probówki wygeneruj kolejny formularz pobierania próbki, klikając "+" w obszarze Przechowywanie próbek. Następnie powtórz kroki od 5.1 do 5.10.
- Kliknij Zapisz i wyjdź, aby wypełnić formularz i wylogować się z bazy danych oraz komputera/tabletu.
- Przenieść stojak na próbki (na suchym lodzie) do lodówki w określonej pozycji.
6. Pobieranie próbek chirurgicznych do dalszej analizy
UWAGA: Próbki są często archiwizowane przez kilka lat, zanim zostaną przeanalizowane. Kriowiale z kodami kreskowymi i przeszukiwalny system baz danych REDCap pozwalają łatwo znaleźć i zlokalizować każdą próbkę do dalszej analizy.
- Zidentyfikuj próbki interesujące dla eksperymentu, korzystając z funkcji wyszukiwania w bazie danych. Pozwoli to na odnalezienie m.in. wszystkich próbek cieczy wodnistej od pacjentów w wieku od 20 do 40 lat z retinopatią cukrzycową.
- Uzyskaj lokalizację interesujących nas kriowiali (zamrażarka, półka/stojak, stojak na próbki, współrzędne w stojaku). Zapisz je, wydrukuj lub miej pod ręką na komputerze przenośnym/tablecie, aby ułatwić odnalezienie próbek w zamrażarce.
- Oznacz próbki jako używane w bazie danych.
- Kliknij Zapisz i wyjdź, aby wypełnić formularz i wylogować się z REDCap oraz komputera/tabletu.
Wyniki
Zebrane próbki z płynnej biopsji mogą zostać poddane różnym analizom molekularnym, w tym analizie DNA, białek, glikanów i metabolitów. Wykazano wcześniej, że długoterminowe przechowywanie przez kilka lat w temperaturze -70 °C nie wpływa znacząco na integralność profilu proteomicznego9. Baza danych REDCap umożliwia prosty i szybki odzysk próbek. W bazie można wyszukiwać próbki z konkretnej grupy pacjentów, np. wszystkich pacjentów z retinopatią cukrzycową. Baza danych dostarcza wówczas kody kreskowe probówek oraz ich pozycje w magazynie. Do chwili obecnej zebraliśmy i zarchiwizowaliśmy ponad 1 000 próbek z płynnej biopsji. Baza danych pozwoliła nam na szybkie odnalezienie próbek do dalszych analiz3,10 i pomogła w przeprowadzeniu następujących eksperymentów.
17-letnia pacjentka zgłosiła się z zapaleniem siatkówki i nerwu wzrokowego. Pacjentka była w stanie immunosupresji, co budziło obawy o wystąpienie infekcji. Z prawego oka pobrano ciecz wodnistą i wysłano ją do analizy DNA PCR. Wyniki były dodatnie w kierunku Cytomegalovirus i ujemne w kierunku Herpes simplex virus oraz toksoplazmozy. Wyniki te pokazują, że płynna biopsja cieczy wodnistej może pomóc w odróżnieniu zakaźnych od niezakaźnych form zapalenia wewnątrzgałkowego, co jest kluczowe dla wyboru odpowiedniej terapii.
Chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas umożliwia nieobiektywną i półilościową analizę proteomu. W biopsji płynnej z ciała szklistego pacjenta poddawanego witrektomii, technika ta pozwoliła na zidentyfikowanie 484 unikalnych białek, w tym dopełniacza C3 (C3), optycyny (OPTC) oraz kolagenu typu II alfa 1 (COL2A1) (Rysunek 1A).
Przeprowadzono analizę trzech biopsji cieczy szklistej przy użyciu multipleksowego testu ELISA w glikoproteomice (patrz Tabela materiałów)11Analiza pozwoliła na wykrycie profili glikozylacji 500 białek ludzkich, obejmując szereg szlaków biologicznych, takich jak metabolizm, odpowiedź immunologiczna, adhezja komórkowa oraz organizacja aktyny (Rycina 1B).
Przesiewy metabolomiczne z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej sprzężonej z spektrometrią mas z transformacją Fouriera12 (patrz Tabela materiałów) pozwoliły zidentyfikować 292 różne metabolity w trzech próbkach płynnej biopsji ciała szklistego. Analiza szlaków (patrz Tabela materiałów)13 wykazała szereg szlaków metabolicznych, w tym metabolizm aminokwasów, cykl mocznikowy oraz syntezę karnityny (Rysunek 1C).
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki. (A) Analiza proteomiczna ludzkiego ciała szklistego z wykorzystaniem chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) zidentyfikowała 484 unikalne białka w pojedynczej płynnej biopsji. Poziomy białek są przedstawione i uszeregowane na podstawie liczby widm. Reprezentatywne białka zaznaczono na niebiesko. (B) Multiplexowy test ELISA w glikoproteomice wykrył stopnie glikozylacji 500 unikalnych białek w trzech płynnych biopsjach ciała szklistego. Analiza oddziaływań białkowych STRING zidentyfikowała klastry interakcji białkowych (pokazano klastry zawierające co najmniej 10 białek). Dla każdego klastra przedstawiono najbardziej istotnie wzbogaconą ścieżkę. (C) Analiza metabolomiczna z wykorzystaniem spektrometrii mas zidentyfikowała 292 różne metabolity w trzech płynnych biopsjach cieczy wodnistej. Każdy punkt reprezentuje jedną próbkę. Wysokość słupka odpowiada średniej liczbie metabolitów, a słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe. Prawy panel przedstawia istotnie wzbogacone ścieżki. Pokazano liczbę wykrytych metabolitów (licznik) oraz całkowitą liczbę metabolitów w każdej ścieżce (mianownik). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Dyskusja
Próbki chirurgiczne pobrane od pacjentów pozwalają na bezpośrednią molekularną charakterystykę choroby u żyjących ludzi 2,3,4,14 i mogą pomóc w przezwyciężeniu ograniczeń modeli chorób komórkowych i zwierzęcych, które nie oddają w pełni choroby człowieka15,16. Analiza molekularna tkanek ludzkich może poprawić wybór nowych celów terapeutycznych i przyczynić się do zwiększenia wskaźnika powodzenia badań klinicznych i zatwierdzenia leku17. Ponadto podejście to oferuje potencjał dla medycyny spersonalizowanej, ponieważ uzyskana tkanka zachowuje unikalny genomowy, epigenomiczny, metabolomiczny, glikomiczny i proteomiczny odcisk palca każdej osoby 2,18,19.
Wysoka i stała jakość próbki ma fundamentalne znaczenie dla wszystkich zastosowań związanych z analizą molekularną. Wcześniejsze badania wykazały, że natychmiastowe zamrażanie po pobraniu próbki i unikanie powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania ma kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości próbki 9,20. Długotrwałe przechowywanie przez kilka lat w temperaturze -70 °C nie wpłynęło znacząco na integralność profilu proteomicznego9. Ustandaryzowany protokół jest ważną podstawą do zmniejszenia stronniczości i poprawy porównywalności danych naukowych, zwłaszcza gdy w proces pobierania próbek zaangażowanych jest kilka osób (chirurgów, techników i innych) lub różne instytucje. Oprócz jakości próbki, adnotacja próbek jest kolejnym ważnym czynnikiem, który wymaga standaryzacji, aby umożliwić korelację wyników molekularnych z danymi klinicznymi. Aby to osiągnąć, nasz protokół opiera się na trzech podstawowych zasadach: 1) ustandaryzowana procedura pobierania próbek do biopsji cieczy wodnistej i płynu ciała szklistego przez chirurga okulistycznego, 2) natychmiastowe przetwarzanie i błyskawiczne zamrażanie próbek na sali operacyjnej przez personel laboratoryjny oraz 3) adnotacja metadanych każdej próbki w internetowej bazie danych, która umożliwia badaczom szybkie znalezienie próbek do późniejszych eksperymentów.
Oprócz próbek ciała szklistego20 w ramach tego procesu opracowywana jest również znormalizowana kolekcja biopsji płynnych z cieczy wodnistej do analizy molekularnej. Ciecz wodnista jest wysoce dostępnym, złożonym płynem w przedniej komorze oka, który odzwierciedla nie tylko choroby oka przedniego, ale także tylnego odcinka oka, w tym choroby siatkówki18,21. Wraz z faktem, że można pobrać dużą liczbę próbek cieczy wodnistej, np. podczas operacji zaćmy, jednej z najczęściej wykonywanych operacji na świecie, cechy te sprawiają, że jest to interesujące źródło płynnych biopsji ludzkiego oka. Ustandaryzowana adnotacja metadanych każdej próbki ustalona w tym przepływie pracy może również umożliwić korelację danych proteomu z prospektywnymi danymi z obserwacji klinicznej. Stwarza to ekscytującą okazję do zidentyfikowania nowych biomarkerów prognostycznych, które mogą pomóc w oszacowaniu rokowania dla przyszłych pacjentów.
Jednak analiza molekularna ludzkich próbek chirurgicznych ma również istotne ograniczenia. Na przykład złożone manipulacje eksperymentalne są często możliwe tylko w modelach zwierzęcych i komórkowych. Rozwiązaniem może być porównanie profilu molekularnego modeli zwierzęcych lub komórkowych z profilem choroby ludzkiej. Strategia ta może zidentyfikować nakładające się na siebie biomarkery białkowe i cele terapeutyczne, które można zwalidować na zwierzętach lub modelach komórkowych w celu zidentyfikowania najbardziej obiecujących kandydatów, którzy korelują z chorobą człowieka i mają szansę odnieść sukces w badaniach klinicznych 4,16.
Podsumowując, nasz przepływ pracy ustanawia praktyczny interfejs między salą operacyjną a laboratorium badawczym, który umożliwia ustandaryzowane i wysokowydajne gromadzenie, opisywanie i przechowywanie wysokiej jakości próbek chirurgicznych do dalszej analizy molekularnej, stanowiąc cenną podstawę dla przyszłych badań translacyjnych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
VBM jest wspierany przez granty NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 i P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen, oraz Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, USA. JW i DR są wspierani przez Fundację Chirurgii Witreosiatkówkowej, USA. DR jest wspierany przez DARE Fellowship, który jest sponsorowany przez Fundację Lundbeck.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka trójkodowa 0,5 ml, format 96, gwint zewnętrzny | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | używana do próbek cieczy wodnistej |
| 1 ml strzykawka | chirurgiczna, niezależnie od dostępności w szpitalu | - | do biopsji cieczy wodnistej |
| 1,9 ml Tri-coded, format 48, gwint zewnętrzny | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | używana do próbek ciała szklistego |
| 3 ml strzykawka | klasy chirurgicznej, niezależnie od dostępności w szpitalu | - | do biopsji ciała szklistego |
| igły 30-32 | , cokolwiek jest dostępna w szpitalu | - | do biopsji cieczy wodnistej |
| Elektroforeza kapilarna sprzężona ze spektrometrią mas z transformacją Fouriera (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japonia | - | - |
| System witrektomii konstelacji z systemem kaniuli trokarowej o rozmiarze 23, 25 lub 27 Alcon | Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | do biopsji ciała szklistego |
| Pudełko chłodzące | Standardowe pudełko styropianowe, cokolwiek jest dostępne w laboratorium | - | |
| Suchy lód | Wszystko, co jest dostępne w laboratorium | - | |
| Zestaw głośnomówiący o standardowym zasięgu z ekranowanym USB | Symbol zebra | DS9208-SR4NNU21Z | Skaner kodów kreskowych |
| Ludzka matryca przeciwciał glikozylacyjnych L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3-Mac | |
| mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA- | - | |
| Oprogramowanie MetaboAnalyst | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Stojak na probówki 0,5 ml, format 96 | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | na próbki cieczy wodnistej |
| Stojak na probówki 1,9 ml, format | 48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | dla próbek ciała szklistego |
| Baza danych próbek REDCap oparta na przeglądarce REDCap | Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
Bibliografia
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39(2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636(2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208(2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608(2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79(2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13(2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286(2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340(2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523(2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12(2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18(2021).
Przedruki i uprawnienia
