Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65811

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research, The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care, Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery, Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics, Oregon Health & Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i normalnych komórek nabłonka przewodowego trzustki na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Zapewniamy zoptymalizowaną i szczegółową procedurę krok po kroku, od przygotowania lentiwirusa do ustanowienia stabilnych linii iPSC.

Streszczenie

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą czynników transkrypcyjnych zostało osiągnięte z prawie każdego zróżnicowanego typu komórek i okazało się bardzo cenne dla badań i zastosowań klinicznych. Co ciekawe, wykazano, że przeprogramowanie iPSC komórek rakowych, takich jak gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC), odwraca inwazyjny fenotyp PDAC i zastępuje epigenom raka. Różnicowanie iPSC pochodzących z PDAC może podsumować progresję PDAC od jego wczesnego prekursora śródnabłonkowej neoplazji trzustki (PanIN), ujawniając zmiany molekularne i komórkowe, które zachodzą na wczesnym etapie progresji PDAC. W związku z tym iPSC pochodzące z PDAC mogą być wykorzystywane do modelowania najwcześniejszych etapów PDAC w celu odkrycia markerów diagnostycznych wczesnego wykrywania. Jest to szczególnie ważne dla pacjentów z PDAC, którzy są zwykle diagnozowani w późnych stadiach przerzutów z powodu braku wiarygodnych biomarkerów dla wcześniejszych stadiów PanIN. Jednak przeprogramowanie linii komórek nowotworowych, w tym PDAC, na pluripotencję pozostaje trudne, pracochłonne i bardzo zmienne między różnymi liniami. W tym miejscu opisujemy bardziej spójny protokół generowania iPSC z różnych ludzkich linii komórkowych PDAC przy użyciu dwubitycznych wektorów lentiwirusowych. Powstałe w ten sposób linie iPSC są stabilne, nie wykazują zależności od egzogennej ekspresji czynników przeprogramowujących lub leków indukowalnych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ułatwia generowanie szerokiej gamy iPSC pochodzących z PDAC, co jest niezbędne do odkrycia wczesnych biomarkerów, które są bardziej specyficzne i reprezentatywne dla przypadków PDAC.

Wprowadzenie

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów złośliwych, a wczesna diagnoza pozostaje wyzwaniem ze względu na bezobjawowy charakter choroby. Większość pacjentów z PDAC jest diagnozowana w zaawansowanym stadium przerzutowym, kiedy dostępne są bardzo ograniczone opcje leczenia1,2. Wynika to głównie z braku wiarygodnych biomarkerów dla wcześniejszych etapów, takich jak te, które można by wygodnie wykryć jako białka uwalniane do krwiobiegu.

PDAC może rozprzestrzeniać się bardzo wcześnie w trakcie swojej progresji, a lepsze rokowanie wiąże się z wczesnym wykrywaniem raka, gdy PDAC jest zlokalizowany w trzustce3. Jednak u mniej niż jednej dziesiątej pacjentów z PDAC diagnozuje się korzystne rokowanie, co pozwala na resekcję chirurgiczną. Niemniej jednak ci nieliczni z guzami resekcyjnymi są również podatni na nawroty guza w ciągu 12 miesięcy4.

W ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat dokonano znacznych postępów w technikach chirurgicznych, opiece nad pacjentem i metodach leczenia5,6. Jednak 5-letni wskaźnik przeżycia u pacjentów z PDAC po operacji ledwo wzrósł do 17%. Niemniej jednak jest to i tak lepsze wynik niż u pacjentów bez resekcji, który pozostał prawie niezmieniony (0,9%)4,7. Chemioterapia jest jedynym innym alternatywnym sposobem leczenia PDAC. Jednak ta opcja jest bardzo ograniczona, ponieważ zdecydowana większość pacjentów z PDAC wykazuje silną oporność na leki chemioterapeutyczne, takie jak Gemcitabine7,8. Inne leki, takie jak erlotynib, są dostępne tylko dla niewielkiej grupy pacjentów z PDAC ze specyficznymi mutacjami, z których większość wykazuje oporność na erlotynib9. Niepożądane skutki uboczne związane z chemioterapią u większości pacjentów z PDAC są kolejną wadą tego leczenia10. Ostatnio obiecujące strategie wykazały, że inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI) i inhibitory kinaz małocząsteczkowych (SMKI) mogą być skuteczne w leczeniu PDAC, ale trwałe odpowiedzi na te terapie celowane pozostają ograniczone do mniejszości pacjentów11,12. Ogólnie rzecz biorąc, odkrycie wczesnych biomarkerów specyficznych dla PDAC może utorować nowe możliwości wczesnej diagnozy i leczenia.

PDAC rozwija się z zmian prekursorowych śródnabłonkowych nowotworów trzustki (PanIN), które wynikają z nieinwazyjnych proliferacji nabłonka przewodu trzustkowego13,14. Podczas gdy tworzenie PanIN jest inicjowane przez mutacje onkogenowe, takie jak KRAS, do progresji do PDAC wymagane są dodatkowe zmiany genetyczne i epigenetyczne. Przewiduje się, że postęp PanIN przez różne etapy inwazyjnego PDAC trwa około 10 lat13,15,16,17. Te ramy czasowe stanowią doskonałą okazję do skorzystania z wczesnej diagnozy PDAC. W związku z tym przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu ustalenia modeli zwierzęcych ksenoprzeszczepów nowotworowych i kultur organoidów w celu zbadania progresji PDAC18,19,20,21. Modele te okazały się bardzo przydatne do badania inwazyjnych stadiów PDAC, chociaż nie przejścia z wczesnych faz PanIN. Dlatego ważne jest opracowanie modeli eksperymentalnych, które mogą podsumować wczesną progresję etapów PanIN, aby umożliwić odkrycie biomarkerów wczesnego wykrywania.

Przeprogramowanie komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu czterech czynników transkrypcyjnych OCT4, SOX2, KLF4 i c-MYC (OSKM) zilustrowało zakres plastyczności komórkowej22. Plastyczność komórek rakowych została dobrze udokumentowana, a przeprogramowanie ludzkich komórek rakowych w iPSC zostało z powodzeniem wykorzystane do zresetowania komórek do ich pierwotnego stanu komórkowego, usuwając wiele epigenetycznych zniewag, które nagromadziły się podczas progresji raka23,24,25,26,27,28,29. Możliwość wykorzystania tej strategii przeprogramowania do manipulowania tożsamością komórek nowotworowych jest zatem bardzo obiecująca w leczeniu raka30,31. Rzeczywiście, wcześniej wykazaliśmy, że różnicowanie iPSC pochodzących z PDAC może podsumować progresję PDAC przez wczesne etapy PanIN32. Identyfikując geny i szlaki specyficzne dla wczesnych i pośrednich stadiów PDAC, zidentyfikowano potencjalne biomarkery, które można klinicznie wykorzystać do wczesnej diagnozy PDAC32,33. Jednak biomarkery odkryte przy użyciu pojedynczej linii iPSC wykazały ograniczony zasięg u większości pacjentów z PDAC32. Wyzwania związane z generowaniem linii iPSC od innych pacjentów z PDAC zatrzymały możliwość odkrywania bardziej wiarygodnych biomarkerów. Wynika to z wielu czynników technicznych, w tym niejednorodności dostarczania OSKM, ponieważ tylko niewielka część ludzkich pierwotnych komórek PDAC zawierała wszystkie cztery czynniki i skutecznie reagowała na przeprogramowanie. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół przeprogramowania pierwotnych komórek PDAC przy użyciu bardziej wydajnego i spójnego dostarczania podwójnego lentiwirusa OSKM.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną OHSU. Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Wszystkie prace na zwierzętach w kierunku guzów PDX zostały wykonane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami OHSU (IACUC). Protokół ten został przetestowany na pierwotnych komórkach PDAC z ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX), linii komórkowej BxPc3 wykazującej morfologię nabłonka, która została wyizolowana z tkanki trzustki 61-letniej pacjentki z gruczolakorakiem, unieśmiertelnionej linii komórek nabłonkowych H6C7 pochodzącej z normalnego ludzkiego nabłonka przewodu trzustkowego oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów pochodzących z biopsji skóry zdrowych osób. Próbki ludzkiego PDAC uzyskano w ramach badania Oregon Pancreas Tissue Registry (IRB00003609). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników. Ludzkie pierwotne fibroblasty uzyskano w RBiomedical, Edynburg, Wielka Brytania, z próbek skóry od anonimowych dawców poddawanych rutynowym zabiegom chirurgicznym w Królewskim Szpitalu w Edynburgu, Little France, Wielka Brytania, za ich zgodą i aprobatą etyczną (09/MRE00/91). Wszystkie prace związane z lentiwirusem zostały przeprowadzone w ramach działalności badawczej klasy 2 (GM207/16.6) i zatwierdzone przez Departament Bezpieczeństwa i Zdrowia Uniwersytetu w Edynburgu oraz zgłoszone właściwemu organowi HSE rządu szkockiego. Wszystkie eksperymenty z przeprogramowaniem z wykorzystaniem ludzkich komórek trzustki zostały przeprowadzone za etyczną aprobatą komisji etycznej Szkoły Nauk Biologicznych na Uniwersytecie w Edynburgu (numer referencyjny # asoufi-0002).

1. Przygotowanie lentiwirusów

  1. Do przygotowania lentiwirusa należy przygotować wysokiej jakości plazmidy opakowaniowe i ekspresyjne (wolne od endotoksyn) o stężeniach między 1-2 μg/μL, w tym psPAX2, pMDG34 i dwa wektory bicystroniczne zawierające RES; kodowanie pSIN4-EF1a-O2S dla ekspresji OCT4 i SOX2 sterowanej przez promotor EF-1α oraz pSIN4-CMV-K2M dla ekspresji KLF4 i c-MYC pod wzmacniaczem/promotorem CMV 35 (patrz Tabela materiałów). Przygotuj również plazmid pWPT-GFP do użycia jako kontrola transfekcji.
  2. Rozmrozić ludzką embrionalną linię komórkową nerki (293T) i kulturę w Glasgow's Minimum Essential Medium (GMEM), uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 1x aminokwasami endogennymi, 1 mM pirogronianu sodu i 1 mM glutaminy w temperaturze (patrz tabela materiałów) 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Zaleca się stosowanie komórek 293T w ciągu czterech pasaży po rozmrożeniu.
  3. Wysiew 293T o gęstości 3 milionów komórek na 15 cm szalce, 24 godziny przed transfekcją. W sumie wymagane są trzy dania. Lepiej jest wysiewać komórki późnym popołudniem ~ 16:00.
  4. Następnego dnia (~16:00), gdy komórki osiągną konfluencję ~40%-50%, przygotuj następujące elementy do trzech reakcji transfekcji:
    UWAGA: Zawsze należy uwzględniać błąd pipetowania, dodając 10% więcej objętości.
    1. Oznacz trzy plastikowe probówki o pojemności 15 ml odpowiednią nazwą lentiwirusa (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M i kontrola pwPT-GFP). Do każdej probówki dodać 1,710 ml zredukowanej pożywki surowicy (patrz Tabela Materiałów).
    2. Rozcieńczyć 90 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) w 1,710 ml zredukowanej pożywki surowicy, mieszać przez wierzchołkowanie przez 2 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Wymieszaj wektory opakowania; 5,1 μg psPAX2 i 2,4 μg pMDG (łącznie 7,5 μg).
    4. Dodać mieszaninę wektorów opakowaniowych do pożywki transfekcyjnej (od kroku 1.4.2) i wirować przez 2 s.
    5. Dodać 7,5 μg każdego wektora przeprogramowania: pSIN4-EF1a-O2S i pSIN4-CMV-K2M oraz regulatora pwPT-GFP do mieszaniny transfekcyjnej z kroku (1.4.4) i wirować dla 2 s.
      UWAGA: Użyj wektora wyrażenia: wektor wirusowy w stosunku 1:1.
  5. Inkubować probówki do transfekcji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Transfekcję komórek 293T za pomocą każdego lentiwirusa polega na bezpośrednim dodawaniu mieszaniny transfekcji DNA z etapu (1.4.5) do pożywki w sposób kroplowy. Zakręć naczyniem, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na całej powierzchni.
  7. Inkubować transfekowane komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
    UWAGA: Użyj odpadów specyficznych dla wirusów, metalowego wiadra do utylizacji, podwójnego worka z workami autoklawowymi oraz weź pojemnik na odpady płynne na wirusa i dodaj tabletkę dezynfekującą. Wyrzuć wszystkie pipety, końcówki i probówki do metalowego wiadra. Wyrzuć stare media do pojemnika na odpady z płynnymi wirusami. Unikaj używania szklanych pipet i szklanych naczyń, aby wyeliminować przypadkowe zanieczyszczenie wirusem.
  8. Po 14-16 godzinach od transfekcji zastąp pożywkę 30 ml świeżej pożywki 293T.
  9. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 60-72 godziny po zmianie pożywki. Codziennie obserwuj komórki i sprawdzaj skuteczność transfekcji za pomocą fluorescencji GFP.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby skuteczność transfekcji wynosiła >90% według GFP. W przypadku innych wirusów należy zaobserwować wyraźne zmiany morfologiczne komórek 293T, ponieważ mają one tendencję do stawania się bardziej okrągłymi podczas wytwarzania cząsteczek wirusa.
  10. Zebrać pożywkę z każdej kultury transfekcyjnej wirusa do probówek o pojemności 50 ml i wirować w celu usunięcia resztek komórek o temperaturze 1932 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Przefiltruj każdy supernatant lentiwirusa przez filtr strzykawkowy 0,45 μM, aby usunąć mniejsze zanieczyszczenia i zebrać je do nowych probówek o pojemności 50 ml.
  12. Podzielić każdy supernatant lentiwirusa na 6 ml porcji i zamrozić w ciekłym azocie.
  13. Porcje lentiwirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.

2. Przeprogramowanie transdukcji lentiwirusa

  1. Rozmrozić pierwotne komórki PDAC i hodowlę w całkowicie zdefiniowanym pożywce wolnej od keratynocytów w surowicy (KSFM), uzupełnionej ekstraktem z przysadki bydlęcej (BPE), ludzkim rekombinowanym naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) w stężeniu 5 ng/ml i toksyną w stężeniu 50 ng/ml w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 (hipoksja) (patrz tabela materiałów).
  2. Rozmrozić BxPc3, płaskonabłonkową linię komórkową gruczolakoraka przewodowego trzustki, i posiew w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Rozmrozić komórki H6C7, komórki nabłonka przewodowego trzustki i hodowlę w KSFM uzupełnionym BPE i EGF w stężeniu 5 ng / ml, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Rozmrozić ludzki fibroblasty (hFib) i kulturę w Glasgow's Minimum Essential Medium (GMEM), uzupełnionym 10% FCS, 1x aminokwasami endogennymi, 1 mM pirogronianu sodu i 1 mM glutaminy oraz 0,05 mM (końcowym) beta-merkaptoetanolem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Na dzień przed transdukcją lentiwirusa (najlepiej późnym popołudniem) przygotuj dwie studzienki z 6-dołkową płytką zawierającą 100 000 komórek na dołek każdej z komórek PDAC, BxPc3, H6C7 i hFib. Zainfekuj jedną studzienkę lentiwirusami OSKM, a drugą użyj jako niezainfekowanej kontroli.
    UWAGA: Użyj osobnej płytki dla każdego typu ogniwa.
  6. Następnego dnia, po południu (około 24 godziny później), upewnij się, że konfluencja komórek osiągnie co najmniej 70% przed przejściem do następnego etapu infekcji lentiwirusem.

3. Transdukcja lentiwirusa w PDAC

  1. Rozmrozić 5 ml każdego supernatantu lentiwirusa w inkubatorze wirusów o temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej PDAC.
  3. Do pierwszej probówki dodać 6 ml każdego przeprogramowującego lentiwirusa (pSIN4-CMV-K2M i pSIN4-EF1a-O2S) i 12 μl 4,5 mg/ml polibrenu (końcowe 4,5 μg/ml, patrz tabela materiałów) i wymieszać.
  4. Do drugiej probówki dodać 2 μl polibrenu o stężeniu 4,5 mg/ml (ostatecznie 4,5 μg/ml).
  5. Wyrzuć pożywkę z każdej studzienki i przemyj raz PBS w temperaturze pokojowej.
  6. Dodaj przeprogramowaną pożywkę infekcyjną (probówka 1) do pierwszego dołka.
  7. Dodaj mieszaninę probówki 2 do drugiego dołka. Będzie to niezainfekowana kontrola.
  8. Inkubować komórki PDAC w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 (hipoksja) przez noc.
  9. Następnego dnia, po południu, wyrzuć pożywkę z obu studzienek i zastąp ją świeżą pożywką hodowlaną PDAC.
  10. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 (hipoksja) przez 48 godzin.

4. Transdukcja lentiwirusa w komórkach BxPc3

  1. Rozmrozić 3 ml każdego supernatantu lentiwirusa w inkubatorze wirusów o temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 2 ml pożywki hodowlanej BxPc3.
  3. Do pierwszej probówki dodać 3 ml każdego przeprogramowującego lentiwirusa (pSIN4-CMV-K2M i pSIN4-EF1a-O2S) oraz 6 μl 4,5 mg/ml polibrenu (końcowe 4,5 μg/ml) i wymieszać.
  4. Do drugiej probówki dodać 2 μl polibrenu o stężeniu 4,5 mg/ml (ostatecznie 4,5 μg/ml).
  5. Wyrzuć pożywkę z każdej studzienki i przemyj raz PBS.
  6. Dodaj przeprogramowaną pożywkę infekcyjną (probówka 1) do pierwszego dołka.
  7. Dodaj mieszaninę probówki 2 do drugiego dołka. Będzie to niezainfekowana kontrola.
  8. Inkubować zakażone komórki BxPc3 w temperaturze 37 °C wirusa i 5% CO2 przez noc.
  9. Następnego dnia, po południu, wyrzuć pożywkę z obu studzienek i zastąp ją świeżą pożywką hodowlaną BxPc3.
  10. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.

5. Transdukcja lentiwirusa zakażenia komórkami H6c7

  1. Rozmrozić 4 ml każdego supernatantu lentiwirusa w inkubatorze wirusów o temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 2 ml pożywki hodowlanej H6c7.
  3. Do pierwszej probówki dodać 4 ml każdego przeprogramowującego lentiwirusa (pSIN4-CMV-K2M i pSIN4-EF1a-O2S) i 8 μl 4,5 mg/ml polibrenu (ostatecznie 4,5 μg/ml) i wymieszać.
  4. Do drugiej probówki dodać 2 μl polibrenu o stężeniu 4,5 mg/ml (ostatecznie 4,5 μg/ml).
  5. Wyrzuć pożywkę z obu studzienek i przemyj raz PBS.
  6. Dodaj przeprogramowaną pożywkę infekcyjną (probówka 1) do pierwszego dołka.
  7. Dodaj mieszaninę probówki 2 do drugiego dołka. Będzie to niezainfekowana kontrola.
  8. Inkubować zakażone komórki H6C7 w temperaturze 37 °C wirusa i 5% CO2 przez noc.
  9. Następnego dnia, po południu, wyrzuć pożywki z obu studzienek i zastąp je świeżą pożywką hodowlaną H6c7.
  10. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.

6. Transdukcja lentiwirusa w komórkach hFib

  1. Rozmrozić 2 ml każdego supernatantu lentiwirusa w inkubatorze wirusów o temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować dwie probówki o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 2 ml pożywki hodowlanej hFib.
  3. Do pierwszej probówki dodać 2 ml każdego wirusa przeprogramowującego (pSIN4-CMV-K2M i pSIN4-EF1a-O2S) i dodać 4 μl 4,5 mg/ml polibrenu (ostatecznie 4,5 μg/ml) i wymieszać.
  4. Do drugiej probówki dodać 2 μl polibrenu o stężeniu 4,5 mg/ml (końcowe 4,5 μg/ml) i wymieszać.
  5. Wyrzuć pożywkę z każdej studzienki i przemyj raz PBS.
  6. Dodaj przeprogramowaną pożywkę infekcyjną (probówka 1) do pierwszego dołka.
  7. Dodaj mieszaninę probówki 2 do drugiego dołka. Będzie to niezainfekowana kontrola.
  8. Inkubować zakażone komórki hFib w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  9. Następnego dnia, po południu, wyrzuć pożywkę z obu studzienek i zastąp ją świeżą pożywką hodowlaną hFib.
  10. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 48 godzin
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczną transdukcję lentiwirusa, należy ostrożnie określić miano lentiwirusa, ponieważ różni się ono znacznie w zależności od typu komórek. W przypadku niektórych typów komórek może być wymagana wielokrotna transdukcja lentiwirusa. Linie komórkowe PDAC wymagają do trzech dawek, podczas gdy jedna dawka wystarczyła do przeprogramowania linii BxPc3, H6C7 i hFib.

7. Przygotowanie komórek zasilających iMEF

  1. Przygotować 40 ml 0,2% roztworu żelatyny, rozcieńczając 1% roztwór podstawowy żelatyny PBS.
  2. Pokryj cztery płytki 6-dołkowe, przykrywając każdą z nich 2 ml 0,2% roztworu żelatyny.
  3. Inkubować płytki pokryte żelatyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut.
  4. Odessać nadmiar roztworu żelatyny i pozostawić płytki do wyschnięcia pod pokrywą przepływową.
  5. Rozmrozić dwie fiolki (~ 4 miliony komórek na fiolkę) napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF), obracając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia, należy uważać, aby woda nie rozpryskiwała się w pobliżu otworu nasadki. Osuszyć fiolkę ręcznikiem papierowym i spryskać ją 70% etanolem.
  6. W kapturze do hodowli tkankowych odpipetować zawartość każdej rozmrożonej fiolki iMEF do jednej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej hFib w sposób kroplowy i dobrze wymieszać, delikatnie odwracając probówkę.
  7. Odwirować zawiesinę komórek o masie 309 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant z każdej probówki. Zawiesić każdą komórkę w 12 ml pożywki hFib.
  8. Płytka: 2 ml zawiesiny komórkowej na zagłębienie 6-dołkowych płytek pokrytych żelatyną. Równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie potrząsając płytkami we wszystkich kierunkach.
  9. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
    UWAGA: Przygotuj świeże płytki iMEF na 24 godziny przed użyciem do eksperymentu z przeprogramowywaniem.

8. Przenoszenie zainfekowanych komórek do warstwy zasilającej iMEF

  1. Wyrzuć pożywkę z zainfekowanych i niezainfekowanych komórek PDAC, BxPc3, H6c7 i hFib. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS w temperaturze pokojowej.
  2. Oddziel komórki od płytki, dodając 0,5 ml trypsyny do każdej studzienki. Inkubować komórki PDAC w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 (hipoksja) przez 15 minut.
  3. Inkubować komórki BxPc3 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut.
  4. Inkubować komórki H6c7 i hFib w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 minuty.
  5. Przenieś zdysocjowaną zawiesinę komórkową z każdej studzienki do probówek o pojemności 15 ml odpowiednio oznaczonych jako zakażone lub niezakażone.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie w następujący sposób: w przypadku PDAC wirować zawiesinę komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut; w przypadku BxPc3 należy wirować zawiesinę komórek w temperaturze 120 x g przez 5 minut; w przypadku H6C7 obracać zawiesinę komórek w temperaturze 112 x g przez 4 minuty; w przypadku hFib wirować zawiesinę komórek w temperaturze 161 x g przez 3 minuty. Wszystkie wirowania należy wykonać w temperaturze pokojowej.
  7. Zawiesić każdy osad typu komórkowego w 1 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej.
  8. Umyć płytki iMEF przygotowane w kroku 7 dwukrotnie każdą pożywką do hodowli komórkowych, tj. umyć jedną płytkę pożywką PDAC, jedną pożywką BxPc3, jedną pożywką H6C7, a trzecią pożywką hFib.
  9. Płytka 50 000 zainfekowanych komórek na studzienkę w pięciu dołkach 6-dołkowej płytki iMEF. Umieść 50 000 niezainfekowanych komórek kontrolnych w pozostałym jednym dołku 6-dołkowej płytki iMEF.
    UWAGA: Zoptymalizuj liczbę zakażonych komórek do posiewu od 1 000 do 50 000 komórek na studzienkę.
  10. Inkubować komórki PDAC w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 (hipoksja) przez noc.
  11. Inkubować komórki BxPc3, H6C7 i hFib w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  12. Następnego dnia przygotuj pożywkę przeprogramowującą w następujący sposób: dodaj 100 ml zastępczej surowicy nokautującej (25% finału), 5 ml 200 ml glutaminy (1 mM finał), 5 ml 100x aminokwasów endogennych (100 μM końcowy), 1,5 ml beta-merkaptoetanolu (0,1 mM końcowy) do 400 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM).
  13. Przechowywać pożywkę przeprogramowującą w podwielokrotnościach o pojemności 100 ml w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
  14. Gdy produkt jest gotowy do użycia, dodać 100 μl zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) o stężeniu 10 mg/ml (10 ng/ml wersja ostateczna) do jednej podwielokrotności pożywki o pojemności 100 ml.
  15. Ogrzej media przeprogramowujące w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  16. Umyj komórki rosnące na podajnikach iMEF wstępnie podgrzanym medium do przeprogramowania dwukrotnie.
    Dodaj 2 ml pożywki do przeprogramowania do każdej studzienki.
  17. Przenieść płytki przeprogramowujące do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2i 3% O2 (hipoksja).
    UWAGA: Dzień, w którym dodawany jest nośnik do przeprogramowywania, jest uważany za 1 dzień przeprogramowania.
  18. Codziennie podawaj komórki świeżą pożywką do przeprogramowywania, aż zaczną pojawiać się kolonie iPSC.
    UWAGA: Zidentyfikuj kolonie iPSC na podstawie ich morfologii podobnej do ESC (zwarte kolonie z dobrze zaznaczonymi krawędziami i składające się z komórek o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy).
  19. Codziennie monitoruj kolonie iPSC, a po utworzeniu odpowiedniej liczby przechodź przez nie jako pulę.
    UWAGA: Upewnij się, że kolonie iPSC nie stykają się ze sobą, ponieważ spowodowałoby to różnicowanie i wpłynęłoby na ich długoterminową stabilność.
  20. Aby ustalić linie klonalne, przejdź przez pulę iPSC około 5 razy, a następnie wybierz silne kolonie, które zachowują morfologię podobną do ESC.
  21. Aby zidentyfikować w pełni przeprogramowane kolonie iPSC, należy przeprowadzić barwienie na żywo za pomocą TRA-160 (patrz tabela materiałów) i zebrać RNA z kolonii iPSC w celu scharakteryzowania ekspresji genów.

9. Przekazywanie kolonii iPSC

  1. Przygotuj wystarczającą ilość płytek podajnika iMEF na 24 godziny przed przekazaniem kolonii iPSC, jak opisano w kroku 7.
  2. Umyj płyty podajnika iMEF dwukrotnie wstępnie podgrzanym medium do przeprogramowywania.
  3. Dodać 2 ml pożywki do przeprogramowywania uzupełnionej inhibitorem ROCK (Y2) (10 μM) do każdej studzienki płytki iMEF.
  4. Inkubować płytki iMEF w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3% O2 do momentu, aż będą gotowe do użycia.
  5. Przygotować roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego/soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (EDTA/PBS), rozcieńczając 0,5 M EDTA w stosunku 1:1000 w PBS (0,5 mM końcowy).
  6. Zastąp przeprogramowaną pożywkę hodowlaną 0,5 ml EDTA/PBS w każdym dołku.
  7. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3%O2 lub w temperaturze pokojowej, w zależności od typu komórki. IPSC BxPc3 i PDAC wymagają 15-minutowej inkubacji w temperaturze 37 °C. IPSC H6C7 i hFib należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Sprawdź komórki iPSC pod mikroskopem, aż zaczną równomiernie oddzielać się od warstwy zasilającej w całej kolonii.
  9. Zebrać zdysocjowaną zawiesinę komórek iPSC do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do przeprogramowania uzupełnionej Y2 (10 μM).
  11. Umieść komórki na warstwie zasilającej iMEF, przenosząc każdy 1 ml zawiesiny komórek iPSC do trzech dołków płytki iMEF.
    UWAGA: Współczynnik podziału może się różnić w zależności od liczby zebranych kolonii iPSC.
  12. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3% O2 .

10. Barwienie na żywo kolonii iPSC za pomocą TRA-1-60

  1. Przygotować 0,5 ml na studzienkę 4 μg/ml przeciwciała TRA-1-60 w pożywce do przeprogramowywania.
  2. Wyrzuć pożywkę do przeprogramowywania i zastąp ją mieszaniną przeciwciał o pojemności 0,5 ml w każdym dołku. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 3% O2 przez 30 minut.
  3. Umyj ogniwa dwukrotnie za pomocą środka do przeprogramowywania.
  4. Przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych za pomocą systemu obrazowania komórek przy użyciu filtra GFP.
  5. Sprawdź jakość obrazu, biorąc pod uwagę kanał kontroli ujemnej.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy przedstawiające morfologię kolonii iPSC pochodzących z komórek PDAC, BXPc3, H6C7 i hFib pokazano na Rysunku 1. Kolonie PDAC-iPSC zaczęły tworzyć się w 25. dniu reprogramowania. Wyraźne kolonie iPSC o bardziej utrwalonej morfologii przypominającej ESC zidentyfikowano w 40. dniu reprogramowania (Rysunek 1). Podobnie formowanie BxPc3-iPSCs rozpoczęło się w 23. dniu i stało się bardziej utrwalone do 35. dnia. Tworzenie H6C7-iPSC przebiegało podobnie jak w przypadku PDAC-iPSCs i zaczęło się utrwalać w 45. dniu. Kolonie hFib-iPSC zaczęły tworzyć się w 15. dniu reprogramowania.

Reprogramowanie komórek macierzystych, obrazy mikroskopowe przedstawiające iPSC na różnych etapach, morfologia komórkowa.
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy kolonii iPSC. Obrazy przedstawiają ukształtowaną morfologię typu hESC pochodzącą z (A>) PDAC, (B>) BxPc3, (C>) H6c7 oraz (D>) hFib. Dni reprogramowania są zaznaczone nad każdym obrazem. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Klonalne linie iPSC ustanowiono z każdej reprogramacji komórek PDAC, BxPc3, H6C7 oraz hFib. Wszystkie ustanowione linie iPSC wykazały pozytywne barwienie na TRA-1-60, marker powierzchniowy niediferencjonowanych komórek hESC, co potwierdziło ich reprogramowanie do stanu pluripotencji (Rysunek 2).

Różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, marker TRA-1-60, obraz mikroskopowy, analiza komórkowa.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy klonalnych linii iPSC. Obrazy pochodzą z (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 oraz (D) hFib, wykazujące morfologię przypominającą ESC (panele górne) oraz pozytywne barwienie na TRA-1-60 (panel dolny). Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Aby ułatwić wykorzystanie przeprogramowania iPSC do badania progresji raka, opracowano solidny protokół przeprogramowania komórek raka trzustki. Przeprogramowanie komórek rakowych na pluripotencję okazało się do tej pory bardzo trudne, ponieważ tylko kilka badań z powodzeniem wygenerowało iPSC z komórek rakowych 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. W większości tych badań wykorzystano unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych do generowania linii iPSC, a nie pierwotnych komórek pochodzących od pacjenta 36,37,38,40,42,43,44,46. Na przykład próbowano przeprogramować cztery różne linie komórkowe raka wątroby przy użyciu retrowirusowego wprowadzenia czynników OSKM, ale tylko jedna linia komórkowa została pomyślnie przeprogramowana41. Jednak wygenerowana linia iPSC raka wątroby wykazała utratę łodygi po kilku przejściach, co podkreśla wysoką odporność komórek rakowych na przeprogramowanie OSKM41. Wcześniej podjęto próby przeprogramowania komórek PDAC za pomocą indywidualnego dostarczania lentiwirusa OSKM; jednak wygenerowano tylko jedną linię iPSC, zależną od egzogennej ekspresji OSKM, a zatem nie w pełni przeprogramowaną37. W innym badaniu wykorzystano wektory epizodyczne do dostarczania czynników OSKM bez integracji genomowej, ale udało się wygenerować tylko pojedynczy klon iPSC z PDAC39. Ograniczony sukces w przeprogramowywaniu komórek nowotworowych stanowi kolejny powód do wielu wyzwań utrudniających wykorzystanie technologii iPSC w badaniach nad rakiem.

W tym miejscu wyjaśniono wytwarzanie iPSC z pierwotnych próbek PDAC pochodzących od dwóch różnych pacjentów i jednej ustalonej linii komórkowej PDAC (BxPc3). Co więcej, iPSC zostały również wygenerowane z H6c7, linii komórkowej nabłonka przewodowego trzustki. Według naszej wiedzy jest to pierwszy raport o pomyślnie uzyskanych stabilnych liniach iPSC z BxPc3 i H6c7. Zgodnie z tym protokołem, iPSC zostały również z powodzeniem wygenerowane z pierwotnych ludzkich fibroblastów pochodzących od zdrowych osób, co rozszerza zastosowanie tej metody poza badania nad rakiem.

Jednym z kluczowych elementów stojących za sukcesem protokołu jest wykorzystanie dwulicytronicznych wektorów lentiwirusowych do jednoczesnej ekspresji czynników OS i KM. Wektory te zawierają wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu 2 (IRES2) do ekspresji OCT4 i SOX2 w jednym wektorze oraz KLF4 i cMYC w drugim. Liczne badania z wykorzystaniem wektorów monocistronicznych, w których każdy czynnik przeprogramowujący był dostarczany indywidualnie, wykazały, że absorpcja każdego wektora jest inna, co wpływa na stechiometrię OSKM i wydajność przeprogramowania47. Korzystanie z wektorów bicistronic może pomóc złagodzić ten problem. Co więcej, zastosowanie IRES w wektorach lentiwirusowych wykazało znaczny wzrost wydajności przeprogramowania48. W tym systemie lentiwirusowym ekspresja OS jest sterowana przez promotor EF1a, podczas gdy ekspresja KM jest pod kontrolą promotora CMV. Wiadomo, że promotor CMV może być poddany wysoce wydajnemu wyciszaniu przez metylację DNA i deacetylację histonów, w przeciwieństwie do EF1a49,50. W związku z tym wczesne wyciszenie KM przed systemem operacyjnym podczas przeprogramowania może być kluczowym czynnikiem sukcesu protokołu. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami pokazującymi znaczenie dynamiki ekspresji OSKM podczas przeprogramowania 51,52,53,54,55. Zatem wektor bicistroniczny jest również korzystniejszy niż wektor policistroniczny, w którym wszystkie czynniki OSKM są wyrażone z jednego promotora56. Inne czynniki, które przyczyniają się do sukcesu protokołu, to dawki infekcji lentiwirusem oraz liczba zakażonych komórek użytych do przeprogramowania, które zostały dostosowane do każdego typu komórki.

Podsumowując, przedstawiono zoptymalizowaną metodę przeprogramowania pierwotnych komórek PDAC wraz z innymi liniami komórkowymi i normalnymi komórkami. Metoda ta pomoże rozszerzyć zastosowanie przeprogramowania iPSC do modelowania progresji raka, a w tym przypadku do odkrycia wczesnych biomarkerów PDAC.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

A.S i J.K pragną podziękować Cancer Research UK i OHSU za finansowanie (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S jest wspierany przez nagrodę MRC za rozwój kariery (MR/N024028/1). AA jest finansowane ze stypendium doktoranckiego (stypendium nr ref. 1078107040) od Miasta Króla Abdulaziza na rzecz Nauki i Technologii. J.K jest finansowany przez MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) i grant Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Dziękujemy prof. Keisuke Kaji za uprzejme udostępnienie wektora przeprogramowania pSIN4-EF1a-O2S i pSIN4-CMV-K2M. Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (50 mM)Thermo Fisher31350010
Alexa Fluor 488 anty-ludzki TRA-1-60-RBioLegend330613
Ekstrakt z przysadki bydlęcej (BPE)Thermo Fisher13028014
BxPc3ATCCCRL-1687
Toksyna z Vibrio choleraeMerck C8052-1MG
Kolagen, roztwór typu I z ogona szczuraMerck C3867
Ukończono zdefiniowany K-SFMThermo Fisher  10744-019
Płytki wielodołkowe Corning Costar z powłoką TC Merck 
Filtry strzykawkowe CorningMerck 
Naczynia hodowlane poddane kulturze tkankowej CorningMerck 
CLS430599 Dzień Impex  Virkon Dezynfekujące tabletki wirusobójczeThermo Fisher12328667
Dulbecco′ s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Merck D8537
Surowica cielęca płodu (FCS) Thermo Fisher10270-106
Odczynnik do transfekcji Fugene HD Promega   E2312
Roztwór żelatyny typu B 2% w H2OMerck G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)Merck G5154
Ludzkie białko rekombinowane EGFThermo FisherPHG0311
Ludzkie białko rekombinowane FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa), liniaThermo Fisher100-18B
(H6c7)KerafastECA001-FP
Komórki zasilające iMEF iXcells Biotechnologies10MU-001-1V
Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy (KSFM) Thermo Fisher17005-042
KnockOut DMEM Zamiennik serum Thermo Fisher10829018
KnockOut Thermo Fisher10828028
L-Glutamina (200 mM)Thermo Fisher25030-024
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher11140050
Millex-HP 0,45 μ Jednostka filtrująca strzykawkę M (sterylna)Merck 
Opti-MEM Obniżona pożywka w surowicy Thermo Fisher31985062
pMDG AddGene187440
Polibren (bromek heksadimetryny) Firma Merck H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M AddGene21164
pSIN4-EF2-O2S AddGene21162
psPAX2AddGene12260
pWPT-GFP AddGene12255
RPMI 1640 Medium (modyfikacja ATCC)Thermo FisherA1049101
Sodym PyrgronianThermo Fisher11360-039
Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku (60 ml) Thermo Fisher15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), czerwień fenolowaThermo Fisher12605036
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Y-27632 (Dichlorowodorek)STEMCELL Technologies72304
CLS3516CLS431231 komórek nabłonka ludzkiego przewodu trzustkowego PeproTech SLHP033RS

Bibliografia

  1. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  2. Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298(2021).
  3. Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
  4. Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425(2020).
  5. He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
  6. Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
  7. Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377(2021).
  8. Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
  9. Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
  10. Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
  11. Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
  12. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
  13. Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
  14. Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
  15. Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
  16. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  17. Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
  18. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  19. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  20. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  23. Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
  24. Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  25. Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
  26. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  27. Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
  28. Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
  29. Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
  30. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  31. Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
  32. Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
  33. Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
  34. Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
  35. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  36. Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
  37. Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
  38. Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
  39. Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
  40. Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
  41. Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
  42. Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261(2017).
  43. Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
  44. Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
  45. Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
  46. Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
  47. Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
  48. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  49. Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
  50. Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
  51. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  52. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  53. Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
  54. Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
  55. Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
  56. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukowane pluripotencyjne komórki macierzysteprzeprogramowanie PDACindukcja pluripotencjitransdukcja lentiwirusowawczesne markery diagnostyczneprogresja PanINkonwersja losu komórkiplastyczność komórek nowotworowychbarwienie TRA-160
Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.