Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

DOI:

10.3791/65831

⸱

13 października 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie Multiome, które dostarcza RNA dla tej samej komórki/sparowanej pojedynczej komórki- oraz test na chromatynę dostępną dla transpozazy z danymi sekwencjonowania (sekwencjonowania ATAC), stanowi przełom w naszej zdolności do rozpoznawania heterogeniczności komórek nowotworowych - głównego celu badań translacyjnych nad rakiem w tym czasie. Jednak jakość danych sekwencjonowania uzyskanych przy użyciu tej zaawansowanej modalności w dużym stopniu zależy od jakości materiału wejściowego.

Warunki trawienia muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować wydajność komórek bez utraty jakości. Jest to szczególnie trudne w kontekście guzów litych z gęstymi matrycami desmoplastycznymi, które muszą być delikatnie rozbite w celu uwolnienia komórek. Świeżo wyizolowane komórki z litej tkanki nowotworowej są bardziej kruche niż te wyizolowane z linii komórkowych. Dodatkowo, ponieważ izolowane typy komórek są niejednorodne, należy wybrać warunki sprzyjające utrzymaniu całej populacji komórek.

Na koniec, warunki izolacji jądrowej muszą być zoptymalizowane w oparciu o te cechy pod względem czasu lizy i typów/proporcji odczynników. W tym artykule opisujemy nasze doświadczenia z izolacją jądrową dla platformy sekwencjonowania multiomu 10x Genomics z próbek guzów litych. Przedstawiamy zalecenia dotyczące trawienia tkanek, przechowywania zawiesin jednokomórkowych (w razie potrzeby) oraz izolacji i oceny jądra komórkowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat biologii nowotworów, wzrosło również znaczenie analizy heterogenicznych komórek w mikrośrodowisku guza1,2. Możliwość pozyskiwania RNA pojedynczej komórki i testu chromatyny dostępnej dla transpozazy z danymi sekwencjonowania (sekwencjonowanie ATAC) z tej samej komórki w sposób sparowany (sekwencjonowanie wieloomowe) zapewnia znaczny postęp w tym kierunku3,4. Eksperymenty te są jednak kosztowne i czasochłonne, a jakość i wpływ uzyskanych danych w dużym stopniu zależą od jakości warunków i materiałów doświadczalnych. Opublikowano ustandaryzowane protokoły izolacji jąder5,6. Świeże i niejednorodne tkanki wymagają optymalizacji protokołu, ponieważ świeżo wyizolowane komórki z próbek guzów litych są bardziej kruche niż te wyizolowane z linii komórkowych.

Inną kwestią jest to, że w przypadku guzów litych, próbki chirurgiczne często nie są dostępne na sali operacyjnej aż do późnych godzin porannych. W związku z tym na ogół nie jest możliwe bezpośrednie przejście od pobrania próbki do wychwytu jąder bez etapu kriokonserwacji. Z naszego doświadczenia wynika, że zamrożenie zawiesiny pojedynczej komórki daje jądra najwyższej jakości (a nie zamrożoną całą tkankę lub inne metody konserwacji). Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku typów tkanek enzymatycznych o wysokiej zawartości RNazy, takich jak trzustka.

Warunki trawienia tkanek również muszą być zaprojektowane tak, aby maksymalizować wydajność komórek bez poświęcania jakości7. W kontekście typów guzów litych z gęstymi matrycami desmoplastycznymi8, macierz zewnątrzkomórkowa musi zostać delikatnie rozbita w celu uwolnienia komórek. Dodatkowo, ponieważ izolowane typy komórek są niejednorodne, warunki powinny być dostosowane do obsługi całej populacji komórek. W opisanym protokole wykorzystuje się próbki ludzkiego raka trzustki (gruczolakorak przewodowy trzustki). Rak trzustki reprezentuje wysoce desmoplastyczny typ nowotworu, który zwiastuje stosunkowo lepką tkankę i komórki. Co więcej, ponieważ próbki guzów trzustki dostępne do badań są również stosunkowo małe, dokłada się starań, aby zmaksymalizować ilość wychwyconych komórek.

Izolacja jąder wymaga największej optymalizacji pod względem warunków i czasu lizy komórek, a także typów i proporcji odczynników. Obchodzenie się z jądrami w trakcie izolacji również wymaga dużej ostrożności. W tym artykule opisujemy nasze doświadczenia w optymalizacji izolacji jądrowej dla platformy sekwencjonowania multiomu 10x Genomics z tkanki guza litego (Rysunek 1). Przedstawiamy zalecenia dotyczące trawienia tkanek, kriokonserwacji zawiesin jednokomórkowych (w razie potrzeby) i izolacji jądrowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki ludzkiego raka trzustki (gruczolakorak przewodowy trzustki) zostały pobrane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB w naszym laboratorium. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na pobranie tkanek. Tkanka została przetransportowana z sali operacyjnej do laboratorium, a następnie przetworzona w następujący sposób.

1. Dysocjacja tkanek (trawienie)

  1. Przygotuj bufor trawienny (patrz tabela materiałów).
  2. Uzyskaj interesującą tkankę tak szybko, jak to możliwe po wycięciu guza i przetransportuj próbkę w buforze hartowniczym (DMEM F-12 z ~5% płodowej surowicy bydlęcej) lub 1x PBS na lodzie.
  3. Zmiel tkankę za pomocą czystych kleszczyków i nożyczek w 3-5 ml buforu do trawienia na szalce Petriego o średnicy 90 mm (Rysunek 2A).
  4. Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dysocjować w ~10 ml buforu trawiennego przez 30 minut w temperaturze 37 °C, używając łaźni wodnej z funkcją wstrząsania lub suchego mieszadła.
  5. Wyjąć z mieszadła i zalać ~20 ml pożywki hartującej. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 100 μm do czystej stożkowej probówki.
  6. Zebrać pozostałą tkankę stałą z sitka (w razie potrzeby ponownie zmielić pozostałe kawałki tkanki) i umieścić w ~10 ml świeżego buforu do trawienia na kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem. Powtarzaj, aż cała tkanka nowotworowa zostanie zdysocjowana.
  7. Zebrać podwielokrotności zawiesiny komórek i przefiltrować przez 70 μm, a następnie sitko o wielkości 40 μm do czystej stożkowej rurki na lodzie.
  8. Odwirować do osadzania komórek w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować supernatant.

2. Kriokonserwacja

  1. Przepłukać komórki, ponownie zawieszając osad w 1 ml 1x PBS.
  2. Przenieś zawiesinę komórek (~1-10 milionów komórek/probówkę dla optymalnego zamrażania) do 1,5 ml kriowialu na lodzie.
  3. Odwirować do osadzania komórek w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować supernatant.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu Bambankera, przenieść do 1,5 lub 2 ml kriowialnego (Rysunek 2B) i zamrozić za pomocą pojemnika do zamrażania o szybkości chłodzenia -1 °C/min (zawierającego 100% alkoholu izopropylowego) w temperaturze -80 °C lub przenieść do ciekłego azotu, jeśli przewiduje się dłuższe przechowywanie próbki.

3. Izolacja jąder

  1. Szybko rozmrozić kriowialną zawiesinę komórkową i umieścić ją na mokrym lodzie.
  2. Przenieść zawiesinę rozmrożonych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i uzupełnić fiolkę do roztworu o objętości 2 ml 1x PBS w celu przepłukania komórek.
  3. Uzyskaj ręczne zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, aby ocenić zarówno ilość, jak i jakość komórek (Rysunek 2C).
  4. Odwirować do granulek o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie zdekantować supernatant za pomocą coraz mniejszych końcówek pipet, aby pozostawić suchy osad i utrzymać go na lodzie.
    1. Do wszystkich etapów wirowania należy używać wirnika z odchylanym kubełkiem. Aby uzyskać maksymalną wydajność komórek, umieść probówki w wirówce z zawiasem skierowanym na zewnątrz, a następnie zdekantuj z końcówką pipety skierowaną na przeciwną stronę probówki (Rysunek 2D).
      UWAGA: Do dekantacji supernatantu należy używać stopniowo mniejszych końcówek pipet do usuwania płynu, aby ograniczyć rozerwanie osadu, jednocześnie maksymalizując objętość dekantowanego płynu. Strategia ta jest szczególnie pomocna w dalszej części protokołu po ekstrakcji jąder, ponieważ osad jądrowy na ogół nie jest widoczny.
  5. Przygotuj 1x bufor do lizy komórek, bufor do rozcieńczania lizy komórek i bufor do płukania ( rysunek 3A) zgodnie z opublikowanym protokołem z następującymi modyfikacjami (patrz Tabela 1, Tabela materiałów):
    UWAGA: Przed użyciem umieścić digitoninę na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C, aby rozpuścić osad ( Rysunek 3B). Zwykle trwa to około 10 minut.
  6. Przygotuj 0,1x bufor do lizy komórek, łącząc 100 μl 1x buforu do lizy komórek i 900 μl buforu do rozcieńczania lizy komórek, delikatnie odpipetuj do wymieszania i umieść na lodzie.
  7. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl schłodzonego 0,1x buforu do lizy komórek i delikatnie pipetować, aby wymieszać 5x.
  8. Inkubować na lodzie przez 3 minuty (Rysunek 3C).
  9. Dodaj 1 ml schłodzonego buforu do płukania i pipetuj w górę iw dół, aby delikatnie wymieszać 5x.
  10. Odwirować do granulowania jąder o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie zdekantować supernatant do postaci suchego osadu i utrzymywać na lodzie.
    UWAGA: Jeśli początkowa liczba komórek jest niska (100 000-200 000 komórek), wykonaj etapy lizy i płukania komórek w probówce PCR o pojemności 200 μl zamiast w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml, aby zmniejszyć powierzchnię probówki i zminimalizować straty. W takim przypadku zmniejsz objętość bufora myjącego, aby dostosować się do mniejszej objętości rurki.
  11. Powtórz kroki 3.9-3.10 2x, w sumie trzy prania.
  12. Ręcznie policz jądra za pomocą szkiełka hemocytometrycznego pod mikroskopem. W razie potrzeby użyj barwnika z błękitem trypanowym, aby zapewnić kontrast do oglądania jąder i pomóc w odróżnieniu jąder od niezlizowanych komórek.
  13. Przygotuj 1x Bufor Jąder zgodnie z opublikowanym protokołem: 20x Nuclei Buffer Stock, 1 mM DTT, 1 U/μL RNazy Inhibitor w wodzie wolnej od nukleaz i trzymaj na lodzie (patrz Tabela Materiałów).
  14. Ponownie zawiesić osad jądrowy w 1x buforze jąder w oparciu o celowe odzyskiwanie jąder.
    UWAGA: Jeśli stężenie jest wystarczająco wysokie, należy dążyć do docelowego odzysku 10 000 lub nieco wyższego na tym etapie (3 230-8 060 jąder/μl) podczas określania początkowej objętości refuzji, biorąc pod uwagę przewidywaną utratę objętości o 25 μl i 20% spadek stężenia przy filtrowaniu (krok 3.15).
  15. Delikatnie przepuść objętość zawieszonych jąder przez sitko do komórek z końcówką pipety o średnicy 40 μm i umieść jądra na lodzie (Rysunek 3D).
  16. Przelicz jądra (Rysunek 4A-C). W razie potrzeby rozcieńczyć końcowy roztwór buforem jądrowym.
  17. Transportuj jądra na lodzie i natychmiast przystąp do wychwytywania jąder zgodnie z opublikowanymi protokołami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyizolować wysokiej jakości jądra z próbek guzów litych pacjenta do sekwencjonowania wieloomowego (Rysunek 1), tkanka nowotworowa została zdysocjowana i zawiesina pojedynczej komórki została poddana kriokonserwacji (Rysunek 2A-D). Zawiesina komórek została następnie rozmrożona w czasie planowanego wychwytu wieloomowego. Wychwytywanie jąder przeprowadzono przy użyciu zoptymalizowanych odczynników buforowych do lizy i czasu, aby zmaksymalizować z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozplątywanie heterogenicznych populacji komórek obecnych w mikrośrodowisku guza jest aktywnym obszarem zainteresowania w biologii nowotworów. Podobnie złożone tkanki występują w łagodnych patologiach, takich jak gojenie się ran i zwłóknienie. Sekwencjonowanie wieloomowe okazało się potężnym narzędziem umożliwiającym pozyskiwanie danych sekwencyjnych scRNA i ATAC dla tych samych par komórek. Protokół ten opisuje izolację jąder, która wymaga optymalizacji w warunkach przetwarzania świeżych, delikatnych, małych próbek guza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), w szczególności Dhananjay Wagh i Johnowi Collerowi, oraz 10x Genomics za pomoc w optymalizacji naszych eksperymentów. Chcielibyśmy również podziękować doktorom George'owi Poultsidesowi, Monice Dua, Brendanowi Visserowi i Byrne'owi Lee za pomoc w pozyskiwaniu próbek od pacjentów. Chcielibyśmy podziękować Artowi i Elaine Taylor, Fundacji Rantz oraz Warrenowi i Judy Kaplanom za ich hojne wsparcie naszych wysiłków badawczych. Źródła finansowania obejmują granty NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Cancer Research Foundation (D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fund, California Institute for Regenerative Medicine, Stinehart/Reed Foundation oraz Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine. Sekwencjonowanie uzyskano przy użyciu maszyn zakupionych ze środków NIH (S10OD025212, S10OD018220 i 1S10OD01058001A1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100, 70 i 40 μ m Sitka do komórek Falcon   ThermoFisher
10x Bufor jąder Genomics (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher NaukowyNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Chlorek wapniaSigma Aldrich499609
Kolagenaza (Kolagenaza typu IV)ThermoFisher17104019
DigitoninaThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco' s Zmodyfikowana Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μ m  Sitko do końcówek pipet Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradientowy roztwór do separacji komórekSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaClSigma Aldrich59222C
Pojemnik do zamrażania Nalgene Cryo "Mr. Frosty"  ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SubstytutSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Inhibitor Rnazy Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, S., et al. Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects. J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).
  2. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  3. Foster, D. S., et al. Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin. Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).
  4. Hasan, S., Buechler, M. B. What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts. Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).
  5. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  6. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  7. Januszyk, M., et al. Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing. Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).
  8. Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).
  9. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  10. Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
  11. Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. J Vis Exp. (175), (2021).
  12. Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J Vis Exp. (162), e61542(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Cell RNAATAC SequencingTissue DigestionCell Lysis BufferHemocytometer AssessmentPancreatic TumorCryopreservation

Powiązane artykuły