Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obustronny model niedokrwienia nerek i reperfuzji w ostrym uszkodzeniu nerek u myszy

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65838

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) może być używany na różnych etapach rozwoju ostrego uszkodzenia nerek (AKI), szczególnie podczas progresji AKI do przewlekłej choroby nerek (PChN). W tym miejscu opisujemy procedurę rozwoju modelu IRI u myszy za pomocą podejścia przezbrzusznego, zaciskając szypułki nerek za pomocą klipsa naczyniowego w celu wywołania uszkodzenia niedokrwiennego.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) definiuje się jako gwałtowne pogorszenie funkcji nerek, w którym uporczywa dysfunkcja nerek stopniowo przechodzi w przewlekłą chorobę nerek (PChN) z powodu nieodwracalnej utraty nefronów i ich nieadaptacyjnej naprawy. W ostatnich latach częstość występowania AKI wzrasta w związku z różnorodną etiologią, w tym zmniejszeniem objętości, posocznicą, nefrotoksycznością, uszkodzeniem mięśni i poważnym urazem, w którym uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) odpowiada za większość epizodów. Rozwój modelu IRI u myszy jest indukowany przez chirurgiczne zaciskanie szypułek nerkowych, co zapewnia potężne i kontrolowane narzędzia dla przedklinicznych modeli AKI. Co ważne, model IRI jest wdrażany na różnych etapach rozwoju AKI, zwłaszcza w procesach od AKI do CKD. Pomimo tego, że model IRI jest szeroko praktykowany w wielu laboratoriach, szereg zmiennych nadal wpływa na wyniki tego modelu. W tym miejscu opisujemy procedurę opracowywania modelu IRI, aby zapewnić badaczom powtarzalną i wiarygodną metodę badania patogenezy leżącej u podstaw rozwoju AKI i progresji AKI do PChN.

Wprowadzenie

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) to ciężki zespół kliniczny ze znaczną zachorowalnością i śmiertelnością, zdefiniowany jako wzrost stężenia kreatyniny w surowicy o ≥ 0,3 mg/dl (26,5 μM/L) w ciągu 48 godzin lub wzrost stężenia kreatyniny w surowicy do ≥ 1,5-krotności wartości wyjściowej w ciągu 7 dni, lub objętość moczu < 0,5 ml/kg/h przez 6 godzin1, 2,3. Pomimo dziesięcioleci badań, brakuje skutecznej terapii AKI, która złagodziłaby uszkodzenie nerek lub przyspieszyła regenerację nerek, a znaczna część pacjentów z AKI przechodzi w przewlekłą chorobę nerek (PChN)4,5,6. Złożone cząsteczki i szlaki są zaangażowane w AKI i jego progresję po części, więc modele przedkliniczne dostarczają potężnych narzędzi do rozwikłania tych zawiłości w celu opracowania skutecznych metod terapeutycznych.

Klinicznie, uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IRI) jest główną przyczyną AKI w różnych stanach, w tym operacjach serca i wątroby, wstrząsie krążeniowym, zmniejszeniu objętości, sepsie, niedrożności lub niedrożności naczyń nerkowych, przeszczepie nerki i tak dalej7. Model myszy IRI-AKI jest używany od 1960 roku; Model ten został opracowany przez chirurgiczne zaciśnięcie szypułek nerek za pomocą nieurazowych klamer u myszy prowadzących do niedokrwienia, a następnie reperfuzji przepływu krwi przez nerki poprzez usunięcie zacisków. Model IRI-AKI zwykle charakteryzuje się śmiercią komórek kanalików nerkowych i postępującym uszkodzeniem tkanki nerkowej. IRI jest jednym z najczęstszych modeli stosowanych w patogenezie i interwencji terapeutycznej w AKI z kilku powodów: (1) Prostota i bezpieczeństwo zabiegu chirurgicznego poprawiają wskaźnik przeżycia i wskaźnik sukcesu modelu IRI-AKI8; (2) Ponieważ niedokrwienie jest główną etiologią u ludzi, model IRI-AKI jest lepiej stosowany do oceny klinicznego zdarzenia AKI 9; (3) Model IRI może przedstawiać uszkodzenie nerek i zmiany histopatologiczne w różnych stadiach AKI, co ma również zastosowanie do badania progresji od AKI do CKD10. W zależności od projektu eksperymentalnego, modele AKI indukowane przez IRI obejmują obustronne IRI, jednostronne IRI z nienaruszoną przeciwległą nerką i jednostronne IRI z jednoczesną kontralateralną nefrektomią. Warto zauważyć, że obustronny model IRI jest uważany za bardziej odpowiedni dla ludzkich stanów patologicznych AKI, ponieważ obie nerki zostały dotknięte przez dopływ krwi11. Model IRI ma zastosowanie do symulacji skutków zmniejszonego przepływu krwi w nerkach po przeszczepieniu nerki, pomostowaniu krążenia, operacji nerkowej lub oszczędzającej nefron, a także w warunkach niedociśnienia9. W tym miejscu opisujemy procedurę obustronnego modelu IRI, aby zapewnić badaczom spójną i wiarygodną metodę badania leżącej u podstaw patogenezy AKI wywołanej niedokrwieniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Męskie myszy C57BL/6J w wieku 8 tygodni i ważące 25 g zostały użyte do stworzenia modelu AKI poprzez obustronną reperfuzję niedokrwienną. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, utrzymujemy temperaturę ciała na poziomie około 36,5 °C-37 °C, a czas trwania niedokrwienia nerek wynosi 30 minut w chirurgii IRI12,13. W sumie potrzeba było 6 myszy dla każdej grupy, a myszy operowane pozorami służyły jako kontrole. Eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zhejiang w celu ochrony dobrostanu zwierząt. Wszystkie procedury badawcze na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zasadami etycznymi Uniwersytetu Zhejiang.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Sterylizuj pod wysokim ciśnieniem wszystkie narzędzia chirurgiczne.
  2. Przygotuj roztwór znieczulający, dodając 2 ml ketaminy i 0,4 ml ksylazyny do 7,6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp.
  3. Umieść znieczuloną mysz na kocu homeotermicznym, aby upewnić się, że jej drogi oddechowe pozostają drożne. Utrzymuj temperaturę ciała w zakresie 36,5-37 °C.
  4. Zakryj oczy myszy 1% maścią do oczu z chlorowodorkiem tetracykliny, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  5. Ogol włosy na brzuchu maszynką do strzyżenia włosów i oczyść skórę pola operacyjnego roztworem powidonu i jodu 3x.

2. Chirurgia

  1. Wykonaj środkowe nacięcie brzucha około 1-1,5 cm nożyczkami chirurgicznymi przez warstwę skóry i mięśni i otwórz jamę brzuszną za pomocą rozsiewacza.
  2. Odsłoń nerkę, przesuwając tłuszcz zaotrzewnowy i popychając jelita i inne narządy do spalonego za pomocą bawełnianego wacika. Nerka znajduje się w przestrzeni zaotrzewnowej, około 0,5 cm bocznie od kręgosłupa i poniżej 13. żebra.
  3. Wyciąć szypułkę nerki za pomocą cienkich spiczastych kleszczy, aby oddzielić i usunąć powięź i tkankę tłuszczową oraz odsłonić lewe szypułki nerek.
  4. Zacisnąć szypułki nerek za pomocą klipsa naczyniowego za pomocą kleszczy przytrzymujących i upewnić się, że uszkodzenie naczyń jest jak najmniejsze. Należy unikać zaciskania zbędnego tłuszczu w zatokach nerkowych, co może prowadzić do niepełnego niedokrwienia nerek.
  5. Ustaw czas trwania niedokrwienia nerek, zaczynając od zaciskania przez 30 minut. Cechą udanego niedokrwienia jest to, że nerka stopniowo zmienia kolor z czerwonego na ciemnofioletowy w ciągu kilku minut.
  6. Przenieś nerkę do przestrzeni zaotrzewnowej. Powtórz procedurę po stronie przeciwległej, aby odsłonić i zacisnąć prawe szypułki nerek.
  7. Zapisuj czas niedokrwienia z każdej strony osobno, aby upewnić się, że obie nerki otrzymują dokładny czas trwania niedokrwienia. Ponownie otwórz nacięcie i zwolnij klips naczyniowy pod koniec czasu trwania niedokrwienia.
  8. Wymień nerkę w przestrzeń zaotrzewnową, a następnie zszyj mięsień i skórę warstwa po warstwie za pomocą szwu Vicryl 4-0.
    UWAGA: Zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. W razie potrzeby wyczyść stół chirurgiczny i narzędzia 75% etanolem podczas operacji.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Podawać 0,5-1 ml ciepłej i sterylnej soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym, aby zrekompensować utratę płynów.
  2. Utrzymuj pozycję leżącą mostka z uwagą, dopóki mysz nie odzyska wystarczającej świadomości. Połóż mysz na kocu homeotermicznym, aż uzyska pełną świadomość, a następnie wróć do klatki. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
  3. Podawać buprenorfinę w dawce 0,05-0,10 mg/kg mc. co 12 godzin przez pierwsze 3 dni w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Monitoruj myszy chirurgiczne każdego dnia.

4. Ocena modelu

  1. Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE)
    1. Eutanazja zwierząt za pomocą pentobarbitalu sodu przez wstrzyknięcie dootrzewnowe w 1, 3, 7 lub 14 dniu po IRI.
    2. Utrwalić świeże tkanki nerkowe za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez noc i przechowywać w 75% etanolu w temperaturze 4 °C.
    3. Po odwodnieniu i zatopieniu otrzymane próbki należy pociąć na grubość 8 μm w celu barwienia.
    4. Odparafinować skrawki tkanek w ksylenie, a następnie ponownie uwodnić przy zmniejszających się stężeniach etanolu.
    5. Wybarwić skrawki tkanek hematoksyliną i eozyną.
    6. Odwodnić skrawki tkanki, zwiększając stężenie etanolu i ksylenu.
  2. Test czynności nerek
    1. Próbki krwi należy pobrać metodą pobierania krwi z gałki ocznej po znieczuleniu.
    2. Odwirować próbki krwi o masie 12000 x g przez 10 minut w celu oddzielenia surowicy.
    3. Oznaczyć stężenie kreatyniny w surowicy i azot mocznikowy (BUN) we krwi za pomocą automatycznego analizatora suchego składu chemicznego w celu monitorowania czynności nerek.
  3. PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR)
    1. Wyekstrahuj całkowite RNA z tkanek nerkowych za pomocą zestawu do szybkiej ekstrakcji RNA, a następnie zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do mieszania odwrotnej transkryptazy. Wykonaj RT-PCR za pomocą zestawu SYBR Green Premix Kit i uruchom na urządzeniu RT-PCR. Użyte tutaj sekwencje starterów zostały zgłoszone przed14: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; rewers 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL do przodu, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; rewers 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH do przodu, 5'-GGTGAAGGTCGTGTGAACG-3'; rewers 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stan nerki podczas operacji

Cechą udanego niedokrwienia jest to, że nerka stopniowo zmienia kolor z czerwonego na ciemnofioletowy w ciągu 1-2 minut, a udana reperfuzja charakteryzuje się stopniowym zmienianiem koloru nerki z ciemnofioletowego na czerwony w ciągu 1-2 minut.

Histologia nerki po operacji

HE i barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS) to bezpośrednie sposoby weryfikacji ostrego uszkodzenia ner...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiliśmy szczegółową procedurę dotyczącą nerkowego modelu IRI, podkreślając następnie, że jest to solidny model progresji AKI i AKI do PChN. Ponadto wykazujemy wpływ dwóch głównych kryteriów uszkodzenia nerek, w tym histologii i funkcji nerek.

Aby uzyskać powtarzalny i wiarygodny model, należy podkreślić kilka kluczowych punktów w procedurach chirurgicznych. W przypadku chirurgii jamy brzusznej zaleca się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia nerki, aby zminimaliz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Wyrażamy naszą wdzięczność wszystkim uczestnikom za współpracę w obecnym badaniu. Badanie to było wspierane przez fundusze z Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LZ22H050001) oraz prowincjonalnego programu Zhejiang na rzecz kultywowania talentów w zakresie innowacyjnego zdrowia na wysokim poziomie dla Weiqiang Lin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Maszynka do strzyżenia włosówFEIYUBIO19-7002
Strzykawki 1 mlLongreenSR60061
EtanolMacklinE885996
GazaFEIYUBIO19-5022
System monitorowania homeotermicznegoWarmmate40 x 50
Uchwyt na igłęDKBTCZQ-00160
RozsiewaczRWDR22029-03
Sterylny roztwór solifizjologicznej BiosharpBL158A
Nożyczki do tkanekDKBTDC-YKJ1002
Pęseta do tkanekDKBTDK079904
Klips naczyniowyFine Science Tools18055-02
SzewVicryl Shanghai Jinhuan4 -0 

Bibliografia

  1. Al-Jaghbeer, M., Dealmeida, D., Bilderback, A., Ambrosino, R., Kellum, J. A. Clinical decision support for in-hospital AKI. J Am Soc Nephrol. 29 (2), 654-660 (2018).
  2. Kellum, J. A., Lameire, N. KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1). Crit Care. 17 (1), 204(2013).
  3. Zhang, C., et al. The Hippo pathway and its correlation with acute kidney injury. Zool Res. 43 (5), 897-910 (2022).
  4. He, L., et al. AKI on CKD: heightened injury, suppressed repair, and the underlying mechanisms. Kidney Int. 92 (5), 1071-1083 (2017).
  5. Sato, Y., Takahashi, M., Yanagita, M. Pathophysiology of AKI to CKD progression. Semin Nephrol. 40 (2), 206-215 (2020).
  6. Wang, Z., Zhang, C. From AKI to CKD: Maladaptive repair and the underlying mechanisms. Int J Mol Sci. 23 (18), 10880(2022).
  7. Hoste, E. A. J., et al. Global epidemiology and outcomes of acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 14 (10), 607-625 (2018).
  8. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  9. Skrypnyk, N. I., Siskind, L. J., Faubel, S., de Caestecker, M. P. Bridging translation for acute kidney injury with better preclinical modeling of human disease. Am J Physiol Renal Physiol. 310 (10), F972-F984 (2016).
  10. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  11. Zhang, J., et al. A two-stage bilateral ischemia-reperfusion injury-induced AKI to CKD transition model in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 319 (2), F304-F311 (2020).
  12. Hukriede, N. A., et al. Experimental models of acute kidney injury for translational research. Nat Rev Nephrol. 18 (5), 277-293 (2022).
  13. Bao, Y., Yuan, Y., Chen, J., Lin, W. Kidney disease models: tools to identify mechanisms and potential therapeutic targets. Zool Res. 39 (2), 72-86 (2018).
  14. Bao, Y., et al. DNA demethylase Tet2 suppresses cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Discov. 7, 167(2021).
  15. Rossiter, A., La, A., Koyner, J. L., Forni, L. G. New biomarkers in acute kidney injury. Crit Rev Clin Lab Sci. 5, 1-22 (2023).
  16. Hesketh, E. E., et al. Renal ischemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. J Vis Exp. (88), e51816(2014).
  17. Zager, R. A., Altschuld, R. Body temperature: an important determinant of severity of ischemic renal injury. Am J Physiol. 251, F87-F93 (1986).
  18. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  19. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).
  20. Tannenbaum, C., Ellis, R. P., Eyssel, F., Zou, J., Schiebinger, L. Sex and gender analysis improves science and engineering. Nature. 575, 137-146 (2019).
  21. Lee, H. T., Ota-Setlik, A., Fu, Y., Nasr, S. H., Emala, C. W. Differential protective effects of volatile anesthetics against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. Anesthesiology. 101 (6), 1313-1324 (2004).
  22. Heyman, S. N., Rosen, S., Rosenberger, C. Animal models of renal dysfunction: acute kidney injury. Expert Opin Drug Discov. 4 (6), 629-641 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Choroby nerekmodel mysifunkcja nerekprzewlekła choroba nerekzaciskanie szypuły nerkowejutrata nefronówmodele przedkliniczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.