Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Czynnik tkankowy (TF) jest transbłonowym receptorem dla czynnika (F) VII i FVIIa. Kompleks TF/FVIIa inicjuje kaskadę krzepnięcia, aktywując zarówno FIX, jak i FX. TF jest uwalniany z komórek do krążenia w postaci pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Poziom TF-dodatnich (+) EV jest zwiększony w różnych chorobach, w tym raku, infekcjach bakteryjnych i wirusowych oraz marskości wątroby, i jest związany z zakrzepicą, rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, ciężkością choroby i śmiertelnością. Istnieją dwa sposoby pomiaru TF+ EV w osoczu: testy oparte na antygenach i aktywności. Dane wskazują, że testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach. W tym artykule opisano nasz wewnętrzny test aktywności EVTF oparty na dwuetapowym teście generacji FXa. FVIIa, FX i wapń dodaje się do próbek zawierających TF+ EV w celu wytworzenia FXa w obecności i bez przeciwciała anty-TF w celu odróżnienia zależnej od TF generacji FXa od generacji TF niezależnej od TFa. Do określenia poziomu TFa stosuje się substrat chromogenny rozszczepiony przez FXa, natomiast do oznaczenia stężenia TF stosuje się krzywą wzorcową wygenerowaną za pomocą relipidowanego rekombinowanego TF. Ten wewnętrzny test aktywności EVTF ma wyższą czułość i swoistość niż komercyjny test aktywności TF.
Wprowadzenie
Krzepnięcie krwi rozpoczyna się od powiązania czynnika (F) VII/VIIa z czynnikiem tkankowym (TF)1. Kompleks TF/FVIIa aktywuje zarówno FIX, jak i FX, aby aktywować krzepnięcie krwi1. Istnieją dwie formy TF o pełnej długości, związanej z błoną: szyfrowana i aktywna. Ponadto istnieje alternatywna forma splicingu TF (asTF). Sfingomielina i fosfatydylocholina w zewnętrznej ulotce błony komórkowej utrzymują TF w stanie zaszyfrowanym2,3,4. Gdy komórki są aktywowane lub uszkodzone, scramblaza fosfolipidowa przenosi fosfatydyloserynę i in....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill (numer protokołu: 14-2108).
1. Pobieranie krwi od dawców
- Pobrać krew pełną za pomocą czystego nakłucia dożylnego do żyły łokciowej za pomocą igły 21 G. Wyrzuć pierwsze 3 ml krwi, ponieważ ta część krwi może zawierać TF z komórek okołonaczyniowych.
- Pobrać 2,7 lub 1,8 ml (w zależności od wielkości probówek) krwi do urządzenia próżniowego zawierającego 3,2% cytrynianu sodu (0,109 mol/l). Nie przepełniaj ani nie przepełniaj rurek. Delikatnie odwróć probówki natychmiast po pobraniu krwi, aby rozproszy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślny wynik daje wartość kontroli pozytywnej ≥0.5 pg/mL oraz wartość kontroli negatywnej <0.5 pg/mL. Jako kontrolę pozytywną najlepiej wybrać osobę z wysoką odpowiedzią na LPS, wykazującą aktywność EVTF >1.0 pg/mL. Reprezentatywny wynik przedstawia aktywność EVTF w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) wyizolowanych z osocza krwi pełnej 11 zdrowych dawców, z aktywacją LPS i bez niej (Rysunek 4). Sześciu z jedenastu dawców (Dawcy 2, 4, 5, 8, 10, 11) wykazało średnią lub wysoką odpow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiono protokół naszego wewnętrznego testu aktywności EVTF. W protokole znajdują się trzy kluczowe kroki. Podczas rekonstytucji granulki EV ważne jest, aby pipetować w górę i w dół w miejscu, w którym znajduje się pelety EV, nawet jeśli nie jest ona widoczna. Niepełna rekonstytucja granulatu EV spowoduje fałszywie ujemny wynik lub niedoszacowanie wartości aktywności EVTF w próbkach. Po drugie, użycie HBSA-Ca(+) ma kluczowe znaczenie w kroku 6.5 protokołu, ponieważ nie można wygenerować generacji FXa .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych sprzecznych interesów, które można by ujawnić.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) i profesurę Johna C. Parkera (N.M.). Chcielibyśmy podziękować Pani Sierra J. Archibald za jej pomocne uwagi
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 1,5 ml do wirówki 20 000 x g | dowolnej firmy | Nie dotyczy | Używamy tej firmy Fisher Scientific (numer katalogowy: 05-408-129). |
| Probówka 1,5 ml do ultrawirówki | dowolnej firmy | Nie | Używamy tej firmy Beckman Coulter (Numer katalogowy: 357448) |
| Probówka 15 ml | dowolnej firmy | Nie | Używamy tej firmy VWR (numer katalogowy: 89039-666) |
| 21 G x .75 cala. BD Vacutainer Safety-Lok Zestaw do pobierania krwi z 12 calami. rurka i adapter luer | BD 367281 | ||
| płytka 96-dołkowa | dowolnej firmy | Nie dotyczy | Używamy tego firmy Globe Scientific (numer katalogowy: 120338). |
| BD Vacutainer Probówki z cytrynianem | BD | 363083 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Chlorek wapnia | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Wirówka do probówki 1,5 ml | dowolnej firmy | Nie dotyczy | Używamy wirówki 5417R (Eppendorf). |
| Wirówka do probówki 15 ml | dowolnej firmy | Nie | Używamy wirówki 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glukoza | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Laboratorium Badań Enzymów | Ludzkich FVIIa | HFVIIa | Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+). |
| Laboratorium Badań Enzymów | Ludzkich FX | HFX1010 | Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+). |
| Hamujący mysi czynnik anty-tkankowy IgG, klon HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolisacharyd z Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | Istnieje kilka lipopolisacharydów z różnych E. coli. Różne lipopolisacharydy mają różny potencjał do aktywacji monocytów. |
| Mysz IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Laboratorium Badań Enzymatycznych | 085-27 | |
| Czytnik płytek | dowolnej firmy | Nie dotyczy | Używamy SpectraMax i3x firmy Molecular Devices |
| Relipidowany rekombinowany czynnik tkankowy, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultrawirówka | Beckman Coredlicer | Optima TLX | |
| Ultrawirówka z wirnikiem | Beckman Coulter | TLA-55 |
Bibliografia
- Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
- Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
