Test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy wewnętrzny test aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Testy oparte na aktywności i testy oparte na antygenach zastosowano do pomiaru czynnika tkankowego w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych z próbek ludzkiego osocza. Testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach.

Streszczenie

Czynnik tkankowy (TF) jest transbłonowym receptorem dla czynnika (F) VII i FVIIa. Kompleks TF/FVIIa inicjuje kaskadę krzepnięcia, aktywując zarówno FIX, jak i FX. TF jest uwalniany z komórek do krążenia w postaci pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Poziom TF-dodatnich (⁺) EV jest zwiększony w różnych chorobach, w tym raku, infekcjach bakteryjnych i wirusowych oraz marskości wątroby, i jest związany z zakrzepicą, rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, ciężkością choroby i śmiertelnością. Istnieją dwa sposoby pomiaru TF⁺ EV w osoczu: testy oparte na antygenach i aktywności. Dane wskazują, że testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach. W tym artykule opisano nasz wewnętrzny test aktywności EVTF oparty na dwuetapowym teście generacji FXa. FVIIa, FX i wapń dodaje się do próbek zawierających TF⁺ EV w celu wytworzenia FXa w obecności i bez przeciwciała anty-TF w celu odróżnienia zależnej od TF generacji FXa od generacji TF niezależnej od TFa. Do określenia poziomu TFa stosuje się substrat chromogenny rozszczepiony przez FXa, natomiast do oznaczenia stężenia TF stosuje się krzywą wzorcową wygenerowaną za pomocą relipidowanego rekombinowanego TF. Ten wewnętrzny test aktywności EVTF ma wyższą czułość i swoistość niż komercyjny test aktywności TF.

Wprowadzenie

Krzepnięcie krwi rozpoczyna się od powiązania czynnika (F) VII/VIIa z czynnikiem tkankowym (TF)¹. Kompleks TF/FVIIa aktywuje zarówno FIX, jak i FX, aby aktywować krzepnięcie krwi¹. Istnieją dwie formy TF o pełnej długości, związanej z błoną: szyfrowana i aktywna. Ponadto istnieje alternatywna forma splicingu TF (asTF). Sfingomielina i fosfatydylocholina w zewnętrznej ulotce błony komórkowej utrzymują TF w stanie zaszyfrowanym^2,3,4. Gdy komórki są aktywowane lub uszkodzone, scramblaza fosfolipidowa przenosi fosfatydyloserynę i inne ujemnie naładowane fosfolipidy do zewnętrznej ulotki¹. Aktywacja komórek powoduje również translokację kwaśnej sfingomielinazy do zewnętrznego płatka, gdzie rozkłada sfingomielinę do ceramidu⁵. Te dwa mechanizmy konwertują zaszyfrowany TF na postać aktywną. Sugeruje się również, że izomeraza dwusiarczku białka pośredniczy w tworzeniu wiązań dwusiarczkowych między Cys186 i Cys209 w zaszyfrowanym TF, co powoduje deszyfrowanie TF^6,7,8. asTF jest również obecny w krążeniu, ale brakuje mu domeny transbłonowej i dlatego jest rozpuszczalny^9,10. Co ważne, asTF ma bardzo niski poziom aktywności prokoagulantu w porównaniu do pełnowymiarowego aktywnego TF^10,11.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są uwalniane z komórek gospodarza, które są w stanie spoczynku, aktywowane i umierają, a także z komórek rakowych¹². EV wyrażają białka ze swoich komórek macierzystych¹². Aktywne EV zawierające TF są uwalniane z aktywowanych monocytów, komórek śródbłonka i komórek nowotworowych do krążenia^13,14,15. Poziomy TF w osoczu można mierzyć za pomocą testów opartych na aktywności i antygenach. Testy oparte na antygenach obejmują test ELISA i cytometrię przepływową¹⁶. Istnieją dwa różne testy oparte na aktywności: jedno- i dwuetapowe testy aktywności TF. Jednoetapowy test opiera się na teście krzepnięcia osocza opartym na osoczu. Próbkę zawierającą TF dodaje się do osocza i mierzy się czas do wytworzenia skrzepu po ponownym zwapnieniu. Dwuetapowy test mierzy generowanie FXa próbek poprzez dodanie FVII lub FVIIa, FX i wapnia. Poziomy FXa są oznaczane przy użyciu substratu, który jest rozszczepiany przez FXa.

Zarówno w jedno-, jak i dwuetapowych testach aktywności TF, stężenie TF jest określane za pomocą standardowej krzywej wygenerowanej z rekombinowanym TF. Testy dwuetapowe mają wyższą czułość i swoistość niż testy jednoetapowe. Wiele badań potwierdziło, że testy oparte na aktywności mają wyższą czułość i swoistość niż testy oparte na antygenach^{17,18,19,20,21}. Ponadto nasz wewnętrzny test aktywności ma wyższą czułość i swoistość niż test aktywności komercyjnej²². Zdrowe osoby mają bardzo niski lub niewykrywalny poziom aktywności EVTF w osoczu. Natomiast osoby ze stanami patologicznymi, takimi jak rak, marskość wątroby, posocznica i infekcja wirusowa, mają wykrywalne poziomy aktywności EVTF, co jest związane z zakrzepicą, rozsianym wykrzepianiem wewnątrznaczyniowym, ciężkością choroby i śmiertelnością^{23,24,25,26,27,28}. Tutaj opiszemy ten wewnętrzny dwuetapowy test aktywności EVTF.

Protokół

Badania zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill (numer protokołu: 14-2108).

1. Pobieranie krwi od dawców

1. Pobrać krew pełną za pomocą czystego nakłucia dożylnego do żyły łokciowej za pomocą igły 21 G. Wyrzuć pierwsze 3 ml krwi, ponieważ ta część krwi może zawierać TF z komórek okołonaczyniowych.
2. Pobrać 2,7 lub 1,8 ml (w zależności od wielkości probówek) krwi do urządzenia próżniowego zawierającego 3,2% cytrynianu sodu (0,109 mol/l). Nie przepełniaj ani nie przepełniaj rurek. Delikatnie odwróć probówki natychmiast po pobraniu krwi, aby rozproszyć cytrynian sodu.
3. Unikaj mieszania, jeśli probówki są transportowane przed obróbką. Osocze należy przygotować w ciągu 2 godzin od pobrania krwi.

2. Przygotowanie osocza kontroli negatywnej

UWAGA: Próbki nie powinny być umieszczane na lodzie w żadnym momencie przed ostatecznym zamrożeniem.

1. Przygotuj osocze kontroli ujemnej przy użyciu pełnej krwi od zdrowych ochotników. Bezpośrednio po pobraniu krwi należy przygotować osocze bezpłytkowe w następujący sposób.
   1. Przenieść próbki krwi z probówek próżniowych do probówek o pojemności 15 ml.
   2. Odwirować próbki krwi o masie 2 500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (20-24 °C) bez hamowania.
   3. Przenieść supernatant (osocze ubogie w płytki krwi) do nowej probówki i powtórzyć wirowanie w tych samych warunkach.
   4. Przenieść supernatant (osocze zubożone w płytki krwi) do nowej probówki.
   5. Podzielić próbkę na podwielokrotności o objętości ≥100 μl. Pozostawić około 100 μl na dnie probówki.
   6. Natychmiast zamrozić osocze zubożone w płytki krwi w temperaturze -80 °C (Rysunek 1).

3. Przygotowanie osocza kontroli pozytywnej

UWAGA: Reakcja na lipopolisacharyd jest różna u poszczególnych osób.

1. Przenieś próbki krwi z urządzeń próżniowych do probówek o pojemności 15 ml.
2. Przygotować osocze kontroli dodatniej przy użyciu pełnej krwi od zdrowych ochotników stymulowanej lipopolisacharydem (LPS) z Escherichia coli O111:B4 (10 μg/ml) przez 5 godzin w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
3. Po 5 godzinach inkubacji wykonaj kroki od 2.1.2 do 2.1.6.

4. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza

UWAGA: Granulki EV mogą nie być widoczne. Czas rozmrażania zależy od objętości próbki, ale zazwyczaj rozmrażamy 100 μl osocza przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

1. Rozmrażanie próbek osocza w temperaturze 37 °C.
2. Dodać 1 ml HBSA bez buforu wapniowego [HBSA-Ca(-)] [137 mM NaCl, 5,38 mM KCl, 5,55 mM glukozy, 10 mM HEPES, 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej] do każdych 100 μl próbki osocza w probówce o pojemności 1,5 ml.
3. Odwirować próbki osocza o masie 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
4. Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.
5. Rozpuścić osad EV, dodając 1 ml buforu HBSA-Ca(-) do każdej probówki, pipetować w górę i w dół w miejscu osadu EV i wirować każdą probówkę przed odwirowaniem po raz drugi w temperaturze 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.
7. Rozpuść osad EV w 80 μl HBSA-Ca(-) i pipetuj w górę iw dół w miejscu, w którym znajduje się osad EV (Rysunek 2).

5. Opcja: Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirówki

1. Po wykonaniu czynności 4.3 zebrać supernatant i ultraodwirować w temperaturze 100 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
2. Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.
3. Rozpuścić osad EV, dodając 1 ml buforu HBSA-Ca(-) do każdej probówki i wymieszać każdą probówkę przed ponownym ultraodwirowaniem w temperaturze 100 000 × g przez 70 minut w temperaturze 4 °C.
4. Odessać supernatant do 20 μl bez naruszania osadu EV.
5. Rozpuść osad EV w 80 μl HBSA-Ca(-).

6. Pomiar aktywności czynnika tkanki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

UWAGA: Próbki EV powinny być pipetowane i dobrze zwirowane, aby wymieszać przed dodaniem do studzienek. EDTA-disód hamuje zdolność FXa do rozszczepiania substratu chromogennego. W związku z tym EDTA-disód nie może być stosowany jako zamiennik EDTA-tetrasodu w kroku 6.7.

1. Dodać 40 μl próbki EV do dwóch dołków 96-dołkowej płytki.
2. Dodaj 11 μl hamującej mysiej anty-ludzkiej TF IgG [(36,4 μg / ml, końcowe stężenie 7,8 μg / ml)] do jednego dołka próbki EV i 11 μl kontrolnej mysiej IgG [(36,4 μg / ml, końcowe stężenie 7,8 μg / ml)] do drugiego dołka.
3. Inkubować 96-dołkową płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. W czasie inkubacji należy przygotować 50 μl/basenik wzorców TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 pg/ml) w dwóch egzemplarzach, używając relipidowanego rekombinowanego TF.
5. Przygotować mieszaninę czynnikową, mieszając 4 ml HBSA z wapniem [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl₂, stężenie końcowe 10 mM], 800 μl 900 nM FX w HBSA-Ca(+) (stężenie końcowe: 146,4 nM) i 120 μL 200 nM FVIIa w HBSA-CA(+) (stężenie końcowe: 4,8 nM).
6. Dodać 50 μl roztworu mieszanki czynników do każdego dołka, przykryć płytkę folią i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
7. Po 2 godzinach zatrzymać wytwarzanie FXa przez dodanie 25 μl buforu HBSA kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasod, końcowe stężenie 5 mM] i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Rozpuść substrat chromogenny, który jest rozszczepiany przez FXa do 4 mM (dodać 8,7 ml wody destylowanej do fiolki 25 mg).
9. Dodać 25 μl roztworu substratu chromogennego do każdej studzienki, przykryć płytkę folią, a następnie folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
10. Po 15 minutach inkubacji usunąć pęcherzyki za pomocą igły lub przez odwirowanie w stężeniu 1 500 × g przez 1 minutę.
11. Przed odczytem odczytać płytkę przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika płytek z jedną mieszanką.
12. Przelicz generację FXa każdego dołka na aktywność TF, korzystając z krzywej standardowej wygenerowanej przy użyciu relipidowanego rekombinowanego TF.
13. Obliczać Generacja FXa zależna od TF (aktywność EVTF) za pomocą równania (1):
    Generacja FXa zależna od TF (aktywność EVTF [pg/ml]) = Całkowita generacja FXa (dobrze kontrolna IgG) - Generacja FXa niezależna od TF (studnia anty-TF IgG) (Rysunek 3) (1)

Wyniki

Pomyślny wynik daje dodatnią wartość kontrolną ≥0,5 pg/ml i ujemną wartość kontrolną <0,5 pg/ml. Najlepiej jest znaleźć osobę o wysokim poziomie LPS z aktywnością EVTF >1,0 pg/ml w celu uzyskania kontroli pozytywnej. Reprezentatywny wynik pokazuje aktywność EVTF EV wyizolowanych z osocza z krwi pełnej 11 zdrowych dawców, z aktywacją LPS i bez niej (Ryc. 4). Sześciu z jedenastu dawców (Dawcy 2, 4, 5, 8, 10, 11) było odpisami na LPS w średnim lub wysokim stopniu, podczas gdy pięciu z jedenastu daw...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono protokół naszego wewnętrznego testu aktywności EVTF. W protokole znajdują się trzy kluczowe kroki. Podczas rekonstytucji granulki EV ważne jest, aby pipetować w górę i w dół w miejscu, w którym znajduje się pelety EV, nawet jeśli nie jest ona widoczna. Niepełna rekonstytucja granulatu EV spowoduje fałszywie ujemny wynik lub niedoszacowanie wartości aktywności EVTF w próbkach. Po drugie, użycie HBSA-Ca(+) ma kluczowe znaczenie w kroku 6.5 protokołu, ponieważ nie można wygenerować generacji FXa ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka 1,5 ml do wirówki 20 000 x g	dowolnej firmy	Nie dotyczy	Używamy tej firmy Fisher Scientific (numer katalogowy: 05-408-129).
Probówka 1,5 ml do ultrawirówki	dowolnej firmy	Nie	Używamy tej firmy Beckman Coulter (Numer katalogowy: 357448)
Probówka 15 ml	dowolnej firmy	Nie	Używamy tej firmy VWR (numer katalogowy: 89039-666)
21 G x .75 cala. BD Vacutainer Safety-Lok Zestaw do pobierania krwi z 12 calami. rurka i adapter luer	BD 367281
płytka 96-dołkowa	dowolnej firmy	Nie dotyczy	Używamy tego firmy Globe Scientific (numer katalogowy: 120338).
BD Vacutainer Probówki z cytrynianem	BD	363083
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A9418
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	C69-500
Wirówka do probówki 1,5 ml	dowolnej firmy	Nie dotyczy	Używamy wirówki 5417R (Eppendorf).
Wirówka do probówki 15 ml	dowolnej firmy	Nie	Używamy wirówki 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glukoza	Sigma Aldrich	G7021
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Laboratorium Badań Enzymów	Ludzkich FVIIa	HFVIIa	Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+).
Laboratorium Badań Enzymów	Ludzkich FX	HFX1010	Roztwór należy rozcieńczyć HBSA-Ca(+).
Hamujący mysi czynnik anty-tkankowy IgG, klon HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolisacharyd z Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	Istnieje kilka lipopolisacharydów z różnych E. coli. Różne lipopolisacharydy mają różny potencjał do aktywacji monocytów.
Mysz IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Laboratorium Badań Enzymatycznych	085-27
Czytnik płytek	dowolnej firmy	Nie dotyczy	Używamy SpectraMax i3x firmy Molecular Devices
Relipidowany rekombinowany czynnik tkankowy, Dade Innovin	Siemens	10873566
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-500
Ultrawirówka	Beckman Coredlicer	Optima TLX
Ultrawirówka z wirnikiem	Beckman Coulter	TLA-55