Ten protokół opisuje metodę pomiaru ciśnienia i objętości lewej komory za pomocą techniki przewodności ciśnienie-objętość. Metoda ta umożliwia ciągłe monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu leków na serce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie w czasie rzeczywistym wpływu kwasu ferulowego na lewą komorę szczura za pomocą cewnika konduktometrycznego ciśnienie-objętość
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zmniejszona czynność serca może mieć negatywny wpływ na inne narządy. Zależność ciśnienia do objętości lewej komory jest uważana za prawidłową metodę oceny czynności serca. Monitorowanie czynności serca w czasie rzeczywistym jest ważne dla oceny leków. W warunkach zamkniętej klatki piersiowej miniaturowy przetwornik, który jest ważnym elementem cewnika ciśnieniowo-objętościowego, wchodzi do lewej komory szczura przez prawą tętnicę szyjną. Urządzenie wizualizuje zmiany w funkcji serca podczas eksperymentu w postaci pętli ciśnienie-objętość. Rzeczywistą objętość komory oblicza się, zmieniając przewodnictwo krwi poprzez wstrzyknięcie 50 μl 20% roztworu chlorku sodu do lewej żyły szyjnej szczura. Rzeczywistą objętość komory szczura oblicza się, mierząc przewodność krwi w znanej objętości za pomocą cewnika konduktowanego ciśnienie-objętość. Protokół ten pozwala na ciągłą obserwację wpływu leków na serce i będzie promował uzasadnienie stosowania specjalistycznych leków etnicznych w chorobach sercowo-naczyniowych.
Wprowadzenie
Choroby układu krążenia mają najwyższy wskaźnik śmiertelności na świecie1. Jego przyczyny obejmują zwężenie tętnicy wieńcowej (niedokrwienie mięśnia sercowego), zablokowanie tętnicy wieńcowej (zawał mięśnia sercowego) i uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne2. Ponieważ serce znajduje się w ciągłym cyklu skurczowym i rozkurczowym, jest to jedna z najbardziej energochłonnych części ciała. Dlatego, gdy tętnice wieńcowe mają trudności z utrzymaniem wystarczającej ilości energii i tlenu, czynność serca nieuchronnie się zmniejsza, co ma negatywny wpływ na inne narządy3,4. Serce jest siłą napędową układu krążenia, a czynność serca musi być racjonalnie oceniana.
Ocena funkcji serca na podstawie zależności ciśnienia komorowego i objętości jest uważana za kompleksową metodę5. Zmiany ciśnienia i objętości komór w czasie rzeczywistym podczas całego cyklu pracy serca tworzą pętlę ciśnienie-objętość. Pętla ciśnienie-objętość komory umożliwia ilościową analizę funkcji serca i pojemności rezerwowej w odniesieniu do różnych faz i energii komory. Normalna komora ma małą objętość końcowoskurczową z dobrą pracą rytmiczną i wydajnością5,6,7.
Technika cewnika przewodzącego ciśnienie-objętość jest inwazyjną metodą wykrywania stanu lewej komory. Można go użyć do uzyskania ciągłej pętli ciśnienie-objętość w czasie rzeczywistym8. Cewniki do pomiaru przewodności objętościowej ciśnienia są potężnymi narzędziami, a procedury obsługi dźwięku są niezbędne do uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników, w tym analiza in vivo równoległej przewodności mięśnia sercowego podczas kalibracji soli fizjologicznej oraz pomiar in vitro przewodności krwi w kalibracji kuwetowej3.
Kwas ferulowy (FA), kwas fenolowy, jest szeroko rozpowszechniony w królestwach roślin, takich jak Avena sativa i Ligusticum chuanxiong hort9,10. Kwas ferulowy ma farmakologiczne działanie obniżające ciśnienie krwi i arytmię. FA to bioaktywny produkt naturalny o wielu funkcjach. FA może być odporny na uszkodzenia oksydacyjne, zmniejszać reakcje zapalne, hamować agregację płytek krwi oraz zapobiegać chorobie niedokrwiennej serca i miażdżycy11. Jednak większość badań nad kwasem ferulowym koncentrowała się na jednym aspekcie serca i rzadko oceniano działanie kwasu ferulowego w układzie krążenia12,13,14,15. W tym miejscu opisujemy podejście do znieczulenia izofluranem z zamkniętą klatką piersiową w połączeniu z ketaminą (50 mg / kg), koncentrując się na odpowiedzi serca na roztwór kwasu ferulowego podczas iniekcji żyły szyjnej.
Opiszemy pełną procedurę korzystania z narzędzia w warunkach zamkniętej klatki piersiowej, w tym przygotowanie roztworu, przygotowanie przetwornika, przedeksperymentalne przygotowanie szczura, wprowadzenie cewnika do prawej tętnicy szyjnej i analizę danych. Czas trwania eksperymentu jest zwykle krótszy niż 4 godziny i jest określany przez różne protokoły eksperymentalne. W jednym eksperymencie możemy uzyskać szczegółowe informacje o sercu, takie jak ciśnienie w lewej komorze serca, objętość i tętno.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół dotyczący zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Eksperymentalnych Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2023-04). Do niniejszego badania wykorzystano samce szczurów rasy Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, w wieku 8-10 tygodni). Szczury były trzymane w komorze dla zwierząt i mogły swobodnie pić i jeść.
1. Przygotowanie roztworu
- Przygotuj 0,9% roztwór NaCl, który będzie używany do utrzymania odpowiedniej wilgotności miejsca pracy.
- Aby przygotować 20% hipertoniczny roztwór NaCl, rozpuść 2 g NaCl w 10 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Aby określić równoległą przewodność mięśnia sercowego, konieczna jest zmiana przewodności płynu dokomorowego.
- Przygotuj 1% aktywny enzymatycznie roztwór detergentu w proszku. Użyj tego po zakończeniu eksperymentu, aby zanurzyć cewnik elektryczny o ciśnieniu i objętości w roztworze na 1-2 godziny.
- Przygotować roztwór FA, rozpuszczając 10 mg kwasu ferulowego w 20 ml ddH2O. Przefiltrować roztwór przez membranę 0,22 μm. Wstrzyknąć szczurowi 1 ml/kg roztworu kwasu ferulowego.
2. Przygotowanie czujnika
- Zanurzyć czujnik ciśnienia i objętości w 0,9% roztworze NaCl o temperaturze 37 °C na około 30-60 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, co ułatwia stabilność danych eksperymentalnych.
- Podłączyć aparaturę doświadczalną. System do pomiaru pętli ciśnieniowo-objętościowych składa się z cewnika ciśnieniowo-objętościowego, dwóch jednostek sterujących, jednostki rejestrującej i oprogramowania komputerowego. Moduł pętli ciśnieniowo-objętościowej w oprogramowaniu zapewni referencyjną procedurę eksperymentalną.
- Naciśnij przycisk Start, a oprogramowanie automatycznie zarejestruje dane monitorowania z czujnika ciśnienia i objętości.
- Użyj oprogramowania Miro-Tip Pressure Volume (MPVS), aby skalibrować ciśnienie i przewodność.
3. Przedeksperymentalne przygotowanie szczurów
- Podawać szczurom ketaminę (50 mg/kg) i fentanyl (0,25 mg/kg) we wstrzyknięciu domięśniowym5.
- Uszczypnij palce u nóg szczurów, aby sprawdzić głębokość znieczulenia przy braku odruchów. Emocje wpływają na stan fizjologiczny szczurów, a ból powoduje zmiany w funkcjonowaniu serca16. Używaj maszynek do golenia dla małych zwierząt i kremów do depilacji, aby usunąć owłosienie z miejsc operowanych. Użyj jodoforu i 75% alkoholu do wytarcia skóry, aby zachować sterylność.
- Unieruchomić w pełni znieczulone szczury na izotermicznej płycie grzewczej tak, aby plecy stykały się z płytą grzewczą.
- Włóż sondę temperatury pokrytą wazeliną do odbytnicy szczura. Utrzymuj temperaturę ciała szczura na poziomie 37 °C ± 0.5, regulując płytę grzewczą.
UWAGA: Konieczne jest, aby drogi oddechowe były drożne podczas eksperymentu.
4. Wprowadzenie cewnika do prawej tętnicy szyjnej
- Naciąć skórę po prawej stronie środkowej linii szyi szczurów, wzdłużnie. Wykonaj 4 cm nacięcie i oddziel mięśnie i tkankę łączną za pomocą kleszczy. Widoczna jest tętnica szyjna znajdująca się po prawej stronie tchawicy. Prawa tętnica szyjna szczura jest ciemnoczerwona, silnie pulsująca i ma równoległy do niej biały nerw błędny.
- Oddziel tętnicę szyjną od innych tkanek i nerwów za pomocą kleszczy. Umieść trzy linie chirurgiczne 5-0 poniżej czystej tętnicy szyjnej. Wlej sterylny 0,9% roztwór chlorku sodu na obszar operacyjny, aby utrzymać nawilżenie tętnicy szyjnej.
- Przetnij skórę powyżej lewego obojczyka i oderwij tkankę wokół żyły szyjnej. Następnie umieść nić chirurgiczną 5-0 pod lewą żyłą szyjną.
- Użyj klipsów tętniczych, aby zawiesić przepływ krwi proksymalnie, używając mikronożyczek, aby przeciąć odcinek w naczyniu, w którym zatrzymał się przepływ krwi. To normalne, że w przekroju rany pojawia się niewielka ilość krwi. Jeśli krew wydostaje się z naczynia szybko i z przerwami, podnieś bliższą linię chirurgiczną i ponownie załóż zacisk tętniczy.
- Wprowadzić cewnik z przekroju wzdłuż tętnicy szyjnej głęboko do lewej komory. Upewnij się, że najniższa wartość ciśnienia skurczowego po wejściu do lewej komory jest bliska 0 mmHg.
- Aby uzyskać rozsądną zależność ciśnienie-objętość, należy nieznacznie wyregulować cewnik ciśnienie-objętość w komorze komorowej. Aby zapobiec masowej utracie krwi i zmianie położenia cewnika z powodu bicia serca, należy podwiązać bliższy koniec linii chirurgicznej.
UWAGA: Temperatura ciała, poziom znieczulenia, sygnał ciśnienia i sygnał przewodności szczura powinny pozostać stabilne podczas tego procesu. Drogi oddechowe szczura powinny być otwarte.
5. Wstrzykiwanie leków i kalibracja przewodności
- Utrzymuj pozycję cewnika objętości ciśnienia w komorze komorowej, po ustabilizowaniu się danych podwiąż linię chirurgiczną dystalną do podwiązanej żyły szyjnej i powoli wstrzyknij do 1 ml / kg roztworu kwasu ferulowego. Obserwuj przez 5-10 minut.
- Wstrzyknąć 50 μl 20% roztworu NaCl z lewej żyły szyjnej, aby usunąć równoległe przewodnictwo generowane przez mięsień sercowy. Zakres objętości przewodnictwa równoległego wynosił około 130-280 μL5. Powtórz to 3 razy w odstępie 2 minut.
- Po badaniu ciśnienia i objętości komór u szczurów należy pobrać krew z aorty brzusznej szczura za pomocą igły do pobierania krwi. Umieść pobraną krew w probówce do pobierania heparyny sodowej i odwróć 2x w górę iw dół, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Poddaj eutanazji eksperymentalne szczury, wstrzykując 120 mg/kg pentobarbitalu sodu przez lewą żyłę szyjną.
- Wykonaj konwersję zmierzonej przewodności na rzeczywistą objętość krwi za pomocą probówek do kalibracji objętości szczura. Umieść kolejno krew zmieszaną z heparyną sodową w otworach rurki kalibracyjnej, a cewnik wykryje wartości przewodności krwi w różnych otworach i zarejestruje je w module monitorowania ciśnienia i objętości.
6. Analiza danych
- Dodając zmierzoną wartość przewodności znanej objętości krwi do określonej lokalizacji, oprogramowanie automatycznie wykreśla krzywą i ekstrapoluje przewodność krwi. Użyj co najmniej trzech zestawów wartości przewodności krwi, aby wywnioskować przewodność krwi badanego szczura. Przewodność krwi jest zindywidualizowana. Dla każdego szczura poddanego badaniu należy wykonać tę procedurę indywidualnie.
- Kalibracja hipertoniczna: Dodając dane uzyskane z trzech wstrzyknięć hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do określonego miejsca, oprogramowanie oblicza równoległe średnie przewodności i automatycznie kalibruje dane eksperymentalne.
- Wykorzystaj regiony o stabilnych wartościach ciśnienia krwi i przewodności, aby przeanalizować funkcję lewej komory szczurów.
- Kliknij Analizuj, a oprogramowanie automatycznie obliczy różne parametry na podstawie wybranego obszaru, w tym EF (frakcje wyrzutowe lewej komory), SW (praca udarowa) i CO (rzut serca) itp.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Każdy test (n = 3) opierał się na wprowadzeniu cewnika do pomiaru przewodnictwa ciśnienie-objętość do lewej komory. W momencie wprowadzenia cewnika do lewej komory z tętnicy szyjnej występują znaczące zmiany sygnału, takie jak wyraźny wzrost zakresu ciśnienia (Rycina 1). Analiza graficzna zależności ciśnienie-objętość jest przeprowadzana poprzez wykreślenie objętości (µL) na osi Y oraz ciśnienia (mmHg) na osi X. Ciśnienie w lewej komorze szczura mieściło się w zakresie 10-105 mmHg, a wartośc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Konieczne jest przyjęcie racjonalnej strategii dawkowania dla różnych stanów czynności serca. Technika cewnika konduktowanego pod ciśnieniem i objętością jest najbardziej intuicyjnym sposobem badania funkcji lewej komory5. Metoda ta umożliwia badanie wpływu leków na czynność serca z całej perspektywy. Szczegółowo opisujemy poszczególne etapy eksperymentu. Zapewni to pewne ułatwienia do badania funkcji serca.
Technika cewnika przewodności objętościowej jest najbardziej w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Główny Projekt Badawczo-Rozwojowy Prowincji Syczuan (2022YFS043) oraz Specjalny Projekt Talentów Talentów Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (QJJJ2022029).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 1 ml | Sartorius AG, | Niemcy-Utrzymuje | |
| temperaturę zwierząt | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Dual Bio Amp | Millar, Inc., USA | DA-100 | |
| Enzymatycznie aktywny detergent w proszku | Alconox Inc., USA | 1104 | |
| Kwas ferulowy | Macklin Biochemical Co., Ltd, Szanghaj, Chiny | F900027 | |
| Przetworniki cewnika Mikro-Tip, SPR-838NR | Millar, Inc., USA | SPR-838NR | |
| Millar Miro-Tip Objętość ciśnienia (MPVS) Ultra | Millar, Inc., USA | SPR-869 | |
| Elektryczne maszynki do strzyżenia zwierząt | Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd. | - | |
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., USA | PL3508 | |
| Chlorek sodu, NaCl | Odczynnik chemiczny Kelong, Chengdu, Chiny | KX829463 | |
| Krem do depilacji Veet | Shanghai Songqi E-commerce Co., Ltd. |
Bibliografia
- Zaman, R., Epelman, S. Resident cardiac macrophages: Heterogeneity and function in health and disease. Immunity. 55 (9), 1549-1563 (2022).
- Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
- Medert, R., Bacmeister, L., Segin, S., Freichel, M., Camacho Londoño, J. E. Cardiac response to β-adrenergic stimulation determined by pressure-volume loop analysis. J Vis Exp. (171), e62057(2021).
- Hieda, M., Goto, Y. Cardiac mechanoenergetics in patients with acute myocardial infarction: From pressure-volume loop diagram related to cardiac oxygen consumption. Heart Fail Clin. 16 (3), 255-269 (2020).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Ziegler, T., Laugwitz, K. L., Kupatt, C. Left ventricular pressure volume loop measurements using conductance catheters to assess myocardial function in mice. Methods Mol Biol. 2158, 33-41 (2021).
- Rosch, S., et al. Characteristics of heart failure with preserved ejection fraction across the range of left ventricular ejection fraction. Circulation. 146 (7), 506-518 (2022).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Alaerts, G., et al. Exploratory analysis of chromatographic fingerprints to distinguish rhizoma Chuanxiong and rhizoma Ligustici. J Chromatogr A. 1217 (49), 7706-7716 (2010).
- Serreli, G., et al. Ferulic acid derivatives and Avenanthramides modulate endothelial function through maintenance of nitric oxide balance in HUVEC cells. Nutrients. 13 (6), 2026(2021).
- Li, D., et al. Ferulic acid: A review of its pharmacology, pharmacokinetics and derivatives. Life Sci. 284, 119921(2021).
- Monceaux, K., et al. Ferulic acid, Pterostilbene, and Tyrosol protect the heart from ER-stress-induced injury by activating SIRT1-dependent deacetylation of eIF2α. Int J Mol Sci. 23 (12), 6628(2022).
- Liu, Z., et al. N-terminal truncated peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α alleviates phenylephrine-induced mitochondrial dysfunction and decreases lipid droplet accumulation in neonatal rat cardiomyocytes. Mol Med Rep. 18 (2), 2142-2152 (2018).
- Sun, Y., et al. Shuangxinfang prevents S100A9-induced macrophage/microglial inflammation to improve cardiac function and depression-like behavior in rats after acute myocardial infarction. Front Pharmacol. 13, 832590(2022).
- Panneerselvam, L., et al. Ferulic acid attenuates arsenic-induced cardiotoxicity in rats. Biotechnol Appl Biochem. 67 (2), 186-195 (2020).
- Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
- Townsend, D. Measuring pressure volume loops in the mouse. J Vis Exp. (111), e53810(2016).
- Bastos, M. B., et al. Invasive left ventricle pressure-volume analysis: overview and practical clinical implications. Eur Heart J. 41 (12), 1286-1297 (2020).
- Wang, L. Y., et al. Effects of ferulic acid on antioxidant activity in Angelicae Sinensis Radix, Chuanxiong Rhizoma, and their combination. Chin J Nat Med. 13 (6), 401-408 (2015).
- Liu, Z., et al. Ferulic acid increases intestinal Lactobacillus and improves cardiac function in TAC mice. Biomed Pharmacother. 120, 109482(2019).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Dam Lyhne, M., et al. Effects of mechanical ventilation versus apnea on bi-ventricular pressure-volume loop recording. Physiol Res. 71 (1), 103-111 (2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
