Ten protokół opisuje procedurę wywoływania zapalenia trądzikowego na skórze szczura za pomocą kwasu oleinowego i Cutibacterium acnes.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szczurzy model trądziku złożonego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trądzik pospolity to powszechna przewlekła choroba skóry charakteryzująca się obecnością zaskórników, grudek i krost na twarzy, szyi i klatce piersiowej. Aby symulować zapalenie trądziku pospolitego, protokół ten szczegółowo opisuje podejście do ustanowienia złożonego modelu gryzoni trądzikowych poprzez wywołanie zapalenia trądziku w uszach szczurów za pomocą kwasu oleinowego i Cutibacterium acnes (C. acnes). Szczury zostały losowo podzielone na cztery grupy: normalna grupa kontrolna (NC), uszy leczone grupą kwasu oleinowego (OA), uszy leczone grupą C. acnes (C. acnes), uszy leczone kwasem oleinowym i C. acnes (OA + C. acnes). Aby naśladować nadmierną produkcję sebum, kwas oleinowy smarowano uszami szczurów w grupach OA i OA + C. acnes przez 25 dni.
Od 21 do 25 dnia, zawiesina C. acnes była wstrzykiwana śródskórnie do uszu szczurów w grupach C. acnes i OA + C. acnes w celu zaostrzenia stanu zapalnego trądziku. Grubość ucha mierzono co tydzień jako wskaźnik nasilenia stanu zapalnego. Przeprowadzono obserwację ogólną, barwienie hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemię (IHC), a wyniki wykazały, że uszy grupy OA i grupy OA + C. acnes były pogrubione i utwardzone, czemu towarzyszył rumień i obecność zaskórników. Dodatkowo grudki obserwowano w grupach C. acnes i OA + C. acnes. W badaniu histopatologicznym stwierdzono hiperkeratynizację i rozszerzone lejki mieszków włosowych w grupach OA i OA + C. acnes. Naciekanie komórek zapalnych i ropni stwierdzono w skórze właściwej grup C. acnes i OA + C. acnes. Wyniki IHC potwierdziły podwyższony poziom czynnika martwicy nowotworu (TNF)-α w skórze właściwej grup C. acnes i OA + C. acnes. Wszystkie powyższe wyniki łącznie wskazują na pomyślne ustanowienie złożonego modelu gryzoni z trądzikiem.
Wprowadzenie
Trądzik pospolity to powszechna przewlekła choroba skóry charakteryzująca się obecnością zaskórników, grudek i krost na twarzy, szyi i klatce piersiowej, które w ciężkich przypadkach mogą przekształcić się w guzki, torbiele i trwałe blizny1. Badania epidemiologiczne donoszą, że trądzik dotyka 9,4% światowej populacji, a wynikające z niego objawy stanowią poważne wyzwanie fizyczne i psychospołeczne2,3.
Patogeneza trądziku jest wieloczynnikowa, obejmuje cztery kluczowe procesy: nadmierną produkcję sebum, tworzenie zaskórników, kolonizację mieszków włosowych przez mikrobiotę skóry oraz uwalnianie mediatorów stanu zapalnego wokół jednostki włosowo-łojowej4,5. Zwiększone wydzielanie sebum, skutkujące gromadzeniem się nadmiaru nienasyconych wolnych kwasów tłuszczowych (UFFA), przyczynia się do nieprawidłowej reprodukcji mikrobioty skóry, z której jedną jest Cutibacterium acnes, jak wykazano w badaniach genomicznych6. Tymczasem mikrobiota skóry rozkłada sebum i zwiększa stężenie UFFA, co prowadzi do błędnego koła7. Ponadto nadmiar UFFA powoduje nadmierne rogowacenie mieszków włosowych, co z kolei wywołuje trądzik8. Mikrobiota skóry i zwiększone wydzielanie sebum aktywują receptory Toll-podobne (TLR) do produkcji wielu cytokin prozapalnych, takich jak interleukina (IL)-1 i TNF-α9,10. Ta kaskada stanów zapalnych, w połączeniu ze zwiększonym sebum i przerostem drobnoustrojów, kończy się wyraźnym nadmiernym rogowaceniem mieszka włosowego i wystąpieniem trądziku11.
Szybki rozwój w dziedzinie badań nad trądzikiem i związanymi z nim wymaganiami klinicznymi doprowadził do stworzenia serii zwierzęcych modeli zapalenia trądziku na uchu szczura, grzbietach szczurów lub myszy oraz uchu królika12,13,14,15. Metody obejmują śródskórne wstrzyknięcie C. trądzik, stosowanie olejków na skórę w celu symulacji nieprawidłowego wydzielania gruczołów łojowych i nadmiernego rogowacenia lub kombinacja obu w celu przyspieszenia stanu zapalnego skóry w celu powstania trądziku16,17,18,19. Jednak stosowanie i dawkowanie środków chemicznych i biologicznych różni się między poprzednimi badaniami, co może zmylić badaczy zamierzających ustalić odpowiedni model trądziku. Badanie to miało na celu ustanowienie łatwej w obsłudze i skutecznej metody tworzenia złożonego modelu gryzoni trądzikowych i zapewnienie wzorca dla naukowców zajmujących się trądzikiem pospolitym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół otrzymał etyczną aprobatę od Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej (No.2023033103-1183). W protokole wykorzystano dwanaście samców szczurów rasy Sprague-Dawley (waga, 208 g ± 5 g), które podzielono na cztery grupy: grupę NC (n = 3), grupę OA (n = 3), grupę C. acnes (n = 3) i grupę OA + C. acnes (n = 3).
1. Opracowanie modelu trądziku
- Zmierz i zapisz grubość uszu szczura za pomocą elektronicznej suwmiarki z noniuszem (patrz Tabela materiałów) przed modelowaniem.
- Umieść zewnętrzną szczękę suwmiarki z noniuszem elektronicznym w środku zewnętrznej krawędzi ucha i wysuń ją do kanału słuchowego. Zapisz grubość 2/3 punktów i grubość 1/2 punktów wzdłuż linii. Zmierz każdy punkt 3x i oblicz średnie wartości grubości dwóch punktów, które należy uznać za grubość ucha.
- Przechyl głowę szczura na bok, skieruj ucho do góry i równomiernie nałóż 50 μl kwasu oleinowego (patrz Tabela Materiałów) na brzuszną i grzbietową stronę ucha raz dziennie przez 25 dni.
- Od 21 do 25 dnia, codziennie przed zastosowaniem kwasu oleinowego, znieczulić szczury za pomocą 4% izofluranu, a następnie wstrzyknąć 50 μl zawiesiny 1 × 107 CFU C. acnes (patrz tabela materiałów) śródskórnie w brzuszną powierzchnię ucha za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 34 G lub 36 G (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Należy uważać, aby uniknąć naczyń krwionośnych w uchu podczas wstrzykiwania śródskórnego. Wymagana jest mikrostrzykawka z igłą 34 G lub 36 G (patrz tabela materiałów). Aby zapewnić prawidłowe wstrzyknięcie śródskórne, igłę należy nakłuć pod kątem od 10 do 15 stopni, na głębokość około 1 mm. - W 25 dniu zmierz i zapisz grubość uszu, jak opisano w kroku 1.1.
UWAGA: Grupa zwyrodnieniowa stawów była smarowana tylko kwasem oleinowym, jak opisano w kroku 1.2 i wstrzykiwano jej sól fizjologiczną od 21 do 25 dnia. Grupa C. acnes była wstrzykiwana tylko śródskórnie za pomocą zawiesiny C. acnes, jak opisano w kroku 1.3. Grupa OA + C. acnes była leczona kwasem oleinowym i zawiesiną C. acnes, jak opisano w krokach 1.2 i 1.3.
2. Pobieranie i analiza tkanek
- W 26 dniu, po humanitarnej eutanazji szczurów przy użyciu metody zatwierdzonej przez instytucję, należy wywiercić stały rozmiar na obustronnych uszach za pomocą wiertła pierścieniowego o średnicy 8 mm.
- Zanurz tkanki ucha w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny, a następnie zanurz parafinę i pokrój na plastry o grubości 5 μm w celu barwienia hematoksyliną i eozyną (HE)20. Obserwuj skrawki pod mikroskopem świetlnym i zapisz zmiany patologiczne do dalszej oceny przez patologa. Przypisz punkty do zmian patologicznych zgodnie z Tabelą 1 (zobacz również Rysunek 1).
- Odparafinować, ponownie nawodnić i podgrzać sekcje w celu pobrania antygenu. Dezaktywować endogenne peroksydazy przez inkubację z 0,3% H2O2 w metanolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć skrawki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie inkubować je z 3% BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki z przeciwciałem monoklonalnym TNF-α (rozcieńczenie 1:800) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc.
- Ponownie przemyć skrawki PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (patrz tabela materiałów) przez 50 minut.
- Po kolejnym płukaniu PBS nanieść mieszaninę 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) na szkiełka i monitorować proces barwienia pod mikroskopem, zatrzymując reakcję z PBS po osiągnięciu pożądanej intensywności.
- Przeciwbarwij skrawki hematoksyną Meyera przez 1 minutę, spłucz je bieżącą wodą, a następnie odwodnij i zamontuj sekcje. Obserwuj skrawki pod mikroskopem i zapisz zmiany patologiczne do dalszej oceny przez patologa.
3. Analiza statystyczna
- Przeprowadzanie analiz statystycznych.
- Przedstaw dane jako średnią ± odchylenie standardowe. Uzyskaj dostęp do normalności wszystkich danych za pomocą testu Shapro-Wilkego. Jeśli jest zgodny z rozkładem normalnym, użyj jednoczynnikowej ANOVA, aby ocenić znaczące różnice. W przypadku danych o rozkładzie innym niż normalnie należy zastosować test Kruskala-Wallisa, a następnie wielokrotne porównania Dunna. Wartość p mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Grubość i wygląd skóry
Od 7. do 21. dnia uszy w grupie OA oraz w grupie OA + C. acnes były znacznie grubsze niż w grupach NC i C. acnes. W 25. dniu uszy w grupie OA, grupie C. acnes oraz grupie OA + C. acnes były znacznie grubsze niż w grupie NC (p < 0.05). Średnią grubość uszu w trakcie eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2 oraz w Tabeli 2.
Od 7. do 25. dnia uszy w grupie OA o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ponieważ metodologia i kryteria oceny modelu trądziku nie były jasne, protokół ten miał na celu zapewnienie odniesienia dla badaczy zajmujących się trądzikiem. Ze względu na mały rozmiar ucha myszy i zakłócenia spowodowane rosnącymi włosami na plecach, stosowanie kremu do depilacji i golarki, ucho szczura może być lepszą alternatywą dla ustalenia modelu trądziku u gryzoni. Próbowaliśmy stworzyć model trądziku na skórze grzbietu szczurów, ale efekt nie był tak dobry, jak te obserwowane na uchu szczura.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie w Chinach (nr 81974572 i nr 82274523) oraz Pekiński Uniwersytet Medycyny Chińskiej (nr 202310026002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wskaźnik anaaerodynamiczny | Mitsubishi, Japonia | C-22 | |
| AnaeroPack | Mitsubishi, Japonia | C-11, C-41 | |
| Columbia Płytka z agarem do krwi | BeNa Cuture Collection, Chiny | BNCC330605 | |
| Inkubator do stałej temperatury | SHANGCHENG, Chiny | 303-0 | |
| Wacik bawełniany | HYNAUT, Chiny | _ | |
| Cutibacterium acnes | Kolekcja BeNa Cuture, Chiny | BNCC330605 | |
| System wykrywania Dako REAL EnVision, peroksydaza / DAB +, królik / mysz | DAKO, Dania | K5007 | |
| jednorazowa sterylna igła do wstrzykiwań | Aparat medyczny Zhejiang Oujian, Chiny_ | ||
| Waga elektroniczna | JINXUAN, Chiny | A017 | |
| Elektroniczna suwmiarka z noniuszem | Deli, Chiny | DL90150 | |
| Kwas oleinowy (odczynnik analityczny, AR) | Fangzheng, Chiny_ | ||
| Chlorek sodu do wstrzykiwań | CR Double CRANE, Chiny | Y2212241 | |
| SPSS Statistics | IBM, USA | 26.0 | |
| sterylne strzykawki podskórne | Polimer medyczny grupy Shandong Weigao, Chiny_ | ||
| TNF Alfa przeciwciało monoklonalne | Proteintech Group, int, Stany Zjednoczone | 60291-1-lg |
Bibliografia
- Cooper, A. J., Harris, V. R. Modern management of acne. The Medical Journal of Australia. 206 (1), 41-45 (2017).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), London, England. 2163-2196 (2012).
- Layton, A. M., Thiboutot, D., Tan, J. Reviewing the global burden of acne: how could we improve care to reduce the burden. The British Journal of Dermatology. 184 (2), 219-225 (2021).
- Hazarika, N. Acne vulgaris: new evidence in pathogenesis and future modalities of treatment. Journal of Dermatological Treatment. 32 (3), 277-285 (2021).
- Das, S., Reynolds, R. V. Recent advances in acne pathogenesis: implications for therapy. American Journal of Clinical Dermatology. 15 (6), 479-488 (2014).
- Dréno, B., et al. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) and acne vulgaris: a brief look at the latest updates. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV. 32, Suppl 2 5-14 (2018).
- Marples, R. R., Downing, D. T., Kligman, A. M. Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes. The Journal of Investigative Dermatology. 56 (2), 127-131 (1971).
- Katsuta, Y., Iida, T., Hasegawa, K., Inomata, S., Denda, M. Function of oleic acid on epidermal barrier and calcium influx into keratinocytes is associated with N-methyl D-aspartate-type glutamate receptors. The British Journal of Dermatology. 160 (1), 69-74 (2009).
- Kurokawa, I., et al. New developments in our understanding of acne pathogenesis and treatment. Experimental Dermatology. 18 (10), 821-832 (2009).
- Clayton, R. W., et al. Homeostasis of the sebaceous gland and mechanisms of acne pathogenesis. The British Journal of Dermatology. 181 (4), 677-690 (2019).
- Cong, T. X., et al. From pathogenesis of acne vulgaris to anti-acne agents. Archives of dermatological research. 311 (5), 337-349 (2019).
- Ji, J., et al. Analgesic and anti-inflammatory effects and mechanism of action of borneol on photodynamic therapy of acne. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103329(2020).
- Ou-Yang, X. L., et al. Nontargeted metabolomics to characterize the effects of isotretinoin on skin metabolism in rabbit with acne. Frontiers in Pharmacology. 13, 963472(2022).
- Zhu, Z., et al. Skin microbiome reconstruction and lipid metabolism profile alteration reveal the treatment mechanism of Cryptotanshinone in the acne rat. Phytomedicine. 101, 154101(2022).
- Jang, Y. H., et al. HR-1 mice: A new inflammatory acne mouse model. Annals of Dermatology. 27 (3), 257-264 (2015).
- De Young, L. M., Young, J. M., Ballaron, S. J., Spires, D. A., Puhvel, S. M. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. The Journal of Investigative Dermatology. 83 (5), 394-398 (1984).
- Chen, T., et al. A skin lipidomics study reveals the therapeutic effects of Tanshinones in a rat model of acne. Frontiers in Pharmacology. 12, 675659(2021).
- Cao, J., Xu, M., Zhu, L., Xiao, S. Viaminate ameliorates Propionibacterium acnes-induced acne via inhibition of the TLR2/NF-κB and MAPK pathways in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 396 (7), 1487-1500 (2023).
- Kolar, S. L., et al. Propionibacterium acnes-induced immunopathology correlates with health and disease association. JCI insight. 4 (5), e124687(2019).
- Zhong, C., et al. Inhibition of protein glycosylation is a novel pro-angiogenic strategy that acts via activation of stress pathways. Nature Communications. 11 (1), 6330(2020).
- O'Neill, A. M., Gallo, R. L. Host-microbiome interactions and recent progress into understanding the biology of acne vulgaris. Microbiome. 6 (1), 177(2018).
- Moradi Tuchayi, S., et al. Acne vulgaris. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15029(2015).
- American Academy of Dermatology. American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity. Journal of the American Academy of Dermatology. 20 (2), Pt 1 272-277 (1989).
- Katsambas, A. D., Cunliffe, W. J., Zoubolis, C. C. Clinical aspects of acne vulgaris. Pathogenesis and treatment of acne and rosacea. Zouboulis, C. C., Katsambas, A. D., Kligman, A. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 213-221 (2014).
- Williams, H. C., Dellavalle, R. P., Garner, S. Acne vulgaris. Lancet. 379 (9813), London, England. 361-372 (2012).
- Rocha, M. A., Bagatin, E. Skin barrier and microbiome in acne. Archives of Dermatological Research. 310 (3), 181-185 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
