Tutaj prezentujemy metodę badania hibernacji stonki ziemniaczanej w naturalnych warunkach strefy umiarkowanej, a także technikę zbierania chrząszczy zimą. Metoda ta pozwala na uzyskanie pożądanej liczby osobników zimujących do różnych analiz na każdym etapie hibernacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Eksperymentalne badanie stonki ziemniaczanej hibernacji w warunkach naturalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z głównych szkodników ziemniaka Solanum tuberosum L. w strefie umiarkowanej jest owad Stonka ziemniaczana (CPB). Większość badań nad odpornością i chorobami CPB przeprowadza się na aktywnych etapach karmienia. Niemniej jednak istnieje mniej badań dotyczących faz spoczynku, chociaż chrząszcze te spędzają większość swojego cyklu życiowego w stanie zimowej diapauzy (hibernacji). W niniejszej pracy opracowano i przetestowano metodę badania hibernacji CPB w warunkach naturalnych, dającą możliwość zebrania wystarczającej liczby osobników zimą. W artykule oceniono przeżywalność CPB oraz zidentyfikowano czynniki zakaźne w różnych stadiach hibernacji. Śmiertelność CPB wzrosła podczas hibernacji, osiągając maksimum w kwietniu-maju. Z martwych owadów wyizolowano grzyby entomopatogeniczne (Beauveria, Isaria i Lecanicillium) oraz bakterie Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas i Serratia. Przeżywalność chrząszczy przez cały okres hibernacji wynosiła 61%. Nie znaleziono zamrożonych ani wysuszonych chrząszczy, co wskazuje na powodzenie przedstawionej metody.
Wprowadzenie
Stonka ziemniaczana Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) jest ważnym szkodnikiem roślin Solanaceae, głównie ziemniaka Solanum tuberosum L. Zasięg geograficzny tego gatunku wynosi ponad 16 milionówkm2 i stale się powiększa1. CPB ma fakultatywną diapauzę zimową, a hibernacja jest obowiązkowa w strefie umiarkowanej. Diapauza jest wywoływana przez fotoperiod dnia krótkiego i modulowana przez temperaturę1. Chrząszcze te zimują w stadium dorosłym, zakopując się w glebie. Wraz ze wzrostem szerokości geograficznych wydłuża się czas trwania okresu hibernacji. W strefie umiarkowanej, zwłaszcza na północnych terytoriach jej zasięgu, zimowanie trwa do 9 miesięcy: od sierpnia-września do maja-czerwca (Noskov i wsp., obserwacje osobiste). W tym okresie CPB – podobnie jak każdy inny owad w strefie umiarkowanej – jest narażony na niekorzystne warunki zimowe i musi zwiększyć swoją tolerancję na zimno. Jednocześnie kontakt chrząszczy z glebą zwiększa ryzyko zakażenia różnymi mikroorganizmami oportunistycznymi i chorobotwórczymi2. Dlatego chrząszcze te muszą utrzymywać pewien poziom aktywności układu odpornościowego podczas hibernacji, co jest również kosztowne energetycznie. Niemniej jednak, nawet jeśli owad przetrwa infekcję, choroba może zmniejszyć jego mrozoodporność3. Należy zauważyć, że niska temperatura nie jest jedyną przyczyną śmiertelności zimowej CPB. Ważną rolę odgrywa również brak tlenu, a w pewnych warunkach może to być główny czynnik śmiertelności zimowej4,5.
Wiadomo, że naturalna śmiertelność zimowa CPB może być bardzo wysoka, sięgając 100% na glebach gliniastych6. Zimowanie jest więc jednym z najważniejszych okresów w cyklu życia CPB. Niemniej jednak dane dotyczące fizjologii, aktywności układu odpornościowego, przeżywalności i innych parametrów hibernacji CPB w warunkach naturalnych są nadal ograniczone. Istnieją badania nad różnicową ekspresją genów i różnymi parametrami fizjologicznymi u dorosłych CPB podczas diapauzy i w odpowiedzi na szok zimna7,8,9,10,11,12; Jednak analizy te zostały przeprowadzone głównie poprzez indukcję diapauzy lub stresu zimna w warunkach laboratoryjnych bez naturalnych wahań temperatury, wilgotności i obciążenia rodzimymi patogenami. Niemniej jednak ważne są badania nad fizjologią tych chrząszczy zbieranych przez wykopy z gleby w warunkach naturalnych. W latach 1970-1980 aktywnie badano różne aspekty zimowania CPB w warunkach naturalnych13,14,15,16,17,18. Z drugiej strony, badania te nie obejmowały wydobycia CPB z gleby zimą. Ponadto nie przedstawiono szczegółowo techniki kontrolowanej hibernacji CPB ani opisu klatek. W związku z tym konieczne jest zbadanie fizjologii CPB zimujących w warunkach naturalnych19.
Celem tego badania było opracowanie i przetestowanie metody kontrolowanej hibernacji dorosłych osób z CPB w naturalnych warunkach. Proponowana metoda pozwala na uzyskanie pożądanej liczby osobników CPB do badań mikrobiologicznych, immunologicznych i innych w czasie hibernacji w warunkach polowych klimatu kontynentalnego. Metodę tę można dostosować i zastosować do innych gatunków owadów zimujących w glebie pod śniegiem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Opis klatek do hibernacji
UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, liczba klatek jest różna. Stosować co najmniej trzy sadzki w każdym dniu pobierania próbek. Aby oszacować liczbę chrząszczy, które się pojawią, przygotuj co najmniej trzy dodatkowe klatki, które nie zostaną wyjęte z gleby do wiosny.
- Używaj klatek wykonanych ze sztywnej drewnianej ramy o wymiarach 25 × 25 × 40 cm (dł. ×. szer. ×. wys.).
- Aby zbudować ramę do klatki, użyj drewnianych listew o grubości co najmniej 2 cm i szerokości 4 cm.
- Przykryj wnętrze klatki siatką ze stali nierdzewnej o wielkości otworów nie większej niż 5 mm × 3 mm. Użyj zszywacza do drewna, aby przymocować siatkę.
- Przymocuj siatkę ze stali nierdzewnej na zewnątrz dna za pomocą zszywacza.
- Wnętrze klatki wyłożyć czarną geowłókniną syntetyczną o gramaturze 60 g/m2,
UWAGA: Geowłóknina służy jako dodatkowa bariera zapobiegająca ucieczce chrząszczy. Nie używaj go w eksperymentach związanych z aktywnie poruszającymi się entomopatogenami i parazytoidami. - Mocno przymocuj rurkę z syntetycznej, półprzezroczystej, oddychającej tkaniny o wysokości około 60 cm do górnej części klatki.
- Skrzyżuj i przymocuj dwie mocne liny do dna klatki, aby w razie potrzeby wyciągnąć ją z ziemi.
2. Instalacja klatek
- Wykop dziurę o głębokości 40 cm w ziemi i umieść w niej klatkę.
- Połóż suchą trawę lub siano na dołku.
- Umieść klatkę w środku tak, aby siano lub sucha trawa znajdowały się między ścianami klatki a glebą.
- Wypełnij klatki ziemią z tego samego pola ziemniaków, na którym zbierane są owady.
- Zainstaluj wodoodporne rejestratory temperatury i wilgotności w klatkach na wymaganych głębokościach.
UWAGA: Rejestratory danych dowolnego producenta mogą być używane i muszą być zdolne do pracy w niskich temperaturach. - Posadź sadzonki ziemniaków w każdej klatce na 3-4 tygodnie przed introdukcją chrząszczy i podlewaj je umiarkowanie.
- Przymocuj rurkę z tkaniny syntetycznej pionowo do kija z dowolnego materiału zainstalowanego na zewnątrz klatki.
3. Hodowla owadów przed zimowaniem
- Ręcznie zbieraj dorosłe chrząszcze na polach ziemniaków wolnych od pestycydów pod koniec wegetacji ziemniaków.
UWAGA: Dorosłe chrząszcze różnią się znacznie od larw i charakteryzują się pasiastą elytrą, podczas gdy larwy są czerwone. - Zebrane chrząszcze należy przechowywać w plastikowych wiaderkach o pojemności 15-20 litrów (maksymalnie 200 osobników na wiadro) zawierających blaty ziemniaczane do karmienia owadów przed umieszczeniem ich w klatkach.
- Przykryj wiadra oddychającą tkaniną.
UWAGA: Nie trzymaj owadów w wiadrach dłużej niż 12 godzin. Użyj wystarczająco dużych blatów ziemniaczanych, aby zapobiec gromadzeniu się chrząszczy na dnie wiader. - Umieścić nie więcej niż 200 osobników CPB na roślinach ziemniaka pokrytych siatką z tkaniny syntetycznej.
- Po spożyciu blatów ziemniaczanych dodaj świeże osadzone w plastikowym słoiku z wodą, a następnie codziennie zmieniaj blaty ziemniaczane.
UWAGA: Aby przymocować łodygi w słoiku, użyj waty i parafilmu. Dokładnie sprawdź stare łodygi pod kątem chrząszczy podczas ich usuwania. - Gdy wszystkie chrząszcze zostaną zakopane w glebie na zimę, odwiąż rurkę z syntetycznej tkaniny od kija i połóż tkaninę.
4. Zbieranie owadów w sezonie zimowym
- Usuń śnieg z powierzchni klatki.
- Poluzuj klatkę z każdej strony mocną łopatą.
- Wyciągnij klatkę z gleby za pomocą lin.
- Przynieś klatkę do laboratorium.
UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, hibernujące chrząszcze mogą być nieaktywne przed analizą. W takim przypadku temperatura w laboratorium podczas izolacji chrząszczy od gleby powinna wynosić ~2-5 °C. - Usuń ziemię z pudełka małymi porcjami, ostrożnie rozbij duże kawałki ziemi i odizoluj chrząszcze za pomocą pęsety.
- Oddziel żywe chrząszcze od zwłok. Żywe, zdrowe chrząszcze tworzą wokół siebie zwartą glebę, tworząc jamę powietrzną (tzw. kołyskę), dzięki czemu łatwo oddzielają się od gleby. Chrząszcze zabijane przez grzyby są mumifikowane lub mają widoczną grzybnię na powierzchni. Owady rozkładające się bakteryjnie są ciemne.
- Przesiej glebę przez sito, aby upewnić się, że wszystkie chrząszcze są odizolowane i nie są uszkodzone.
- Zwłoki z objawami infekcji grzybiczej lub rozkładu bakteryjnego należy umieścić w pojedynczej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w celu przyszłej identyfikacji.
- Żywe chrząszcze przechowywać w lodówce w temperaturze 0-2 °C do czasu analizy w zamkniętym, wentylowanym pojemniku zawierającym wilgotny wacik.
5. Przygotowanie próbek narządów i tkanek
- Aby pobrać hemolimfę, wykonaj nakłucie w bocznej części brzucha pod elytrą za pomocą igły insulinowej.
UWAGA: Podczas zimowania ilość hemolimfy jest znacznie zmniejszona, co utrudnia zebranie tego płynu. - Aby wyizolować jelito, odetnij kapsułkę głowy, wyciśnij całą zawartość na szalkę Petriego z buforem fosforanowym, oddziel jelito i oczyść je z tłuszczu i naczyń Malpighiana.
- Oddziel żądaną część jelita, taką jak jelito przednie, jelito środkowe lub jelito tylne.
- Aby wyizolować ciało tłuszczowe, oddziel je od innych tkanek po wyizolowaniu jelita.
UWAGA: Wyizolowane tkanki można wykorzystać do pomiaru aktywności enzymów przeciwutleniających i detoksykujących (przykład: rysunek uzupełniający 1), analizy regulacji genów szlaku sygnalizacji immunologicznej (przykład: rysunek uzupełniający 2) lub metabarkodowania zawartości jelit owadów itp.
6. Izolacja mikroorganizmów ze zwłok
- Aby wyizolować grzyby entomopatogeniczne ze zwłok, umieść zmumifikowane owady w sterylnej komorze wilgotnościowej.
- Użyj konidiów powietrznych (jeśli są dostępne) lub sklerocji z wewnętrznej zawartości chrząszczy do posiewu na agarze dekstrozowym Sabouraud z 0,4% kwasem mlekowym.
UWAGA: Chrząszczy z grzybnią i konidiami należy natychmiast poszyć (bez umieszczania ich w komorach wilgotnościowych). - Wyizoluj bakterie ze zwłok z objawami rozkładu bakteryjnego.
- Odetnij głowę chrząszcza, wyciśnij zawartość wewnętrzną i zbierz ją do probówek w celu późniejszego posiewu na podłożu dla bakterii (agar Luria-Bertani, agar endo i agar z eskuliną żółciową).
UWAGA: Użyj mikroskopii i metod molekularnych, aby zidentyfikować rodzaje i gatunki patogenów. W razie potrzeby można przeprowadzić analizę na obecność innych pasożytów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniższe wyniki dotyczące zimowania CPB przedstawiają temperaturę gleby, przeżywalność oraz stopień infekcji.
Dynamika temperatury gleby.
Temperatury poniżej zera w klatkach na głębokości 30 cm odnotowano od końca listopada do początku kwietnia (Rysunek 1). Średnia temperatura w tym okresie wynosiła minus 3,3 ± 0,1 °C (średnia ± błąd standardowy). Najniższa odnotowana temperatura wyniosła minus 7,9 °C w połowie lutego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Z badań tych wynika, że proponowana metoda badania zimowania CPB pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby owadów w różnych okresach hibernacji. Powodzenie prezentowanej techniki zależy od kilku niezależnych czynników, z których najważniejszym są warunki atmosferyczne. W mroźną, bezśnieżną zimę gleba może zamarznąć na całej głębokości klatki. W takim przypadku ryzyko śmierci wszystkich chrząszczy znacznie wzrasta18. Przetrwanie chrząszcza zależy od kombinacji wielu czynników, które mogą się znacz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy naszym kolegom Władimirowi Shilo, Wierze Morozovej, Uljanie Rotskaya, Oldze Polenogovej i Oksanie Tomilovej za pomoc w organizacji i realizacji procedur terenowych i laboratoryjnych.
Badania były wspierane przez Rosyjską Fundację Naukową, projekt nr 22-14-00309.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar-agar oczyszczony bakteriologicznie | diaGene | 1806.5000 | |
| Agar Esculin Żółciowy | HiMedia | M972 | |
| Endo Agar | HiMedia | M029 | |
| Glukoza monohydrat-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| Kwas mlekowy | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| Luria-Bertani płynne medium | HiMedia | G009 | |
| 15 ml stożkowe probówki wirówkowe | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| Peptone | FBIS SRCAMB | M 030/O61 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Medigen | PBS500 | |
| Rejestrator temperatury i wilgotności Ecklerk-M-11 | Relsib | Wodoodporny rejestrator danych |
Bibliografia
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).
- Ushatinskaja, R. S. Diapause of insects and its modifications. Journal of General Biology. 34, In Russian 194-215 (1973).
- Zheng, X. L., et al. Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae). Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).
- Hiiesaar, K., Metspalu, L., Jõudu, J., Jõgar, K. Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia. Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).
- Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).
- Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).
- Govaere, L., et al. Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata. Cryobiology. 88, 54-63 (2019).
- Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindström, L., Käkelä, R. The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments. Frontiers in Physiology. 11, 576617(2020).
- Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906(2021).
- Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey. Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).
- Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6(1986).
- Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation. Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).
- Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations. Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).
- Bajan, C., Kmitowa, K. Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults. Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).
- Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat. Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).
- Doğan, C., et al. Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549(2021).
- Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. Colorado potato beetle investigations in the south Urals. Nova Science Publishers. , (2011).
- Short, C. A., Hahn, D. A. Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause. Journal of Insect Physiology. , 104488(2023).
- McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae). Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
