Eksperymentalne badanie stonki ziemniaczanej hibernacji w warunkach naturalnych

Stonka ziemniaczana Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) jest ważnym szkodnikiem roślin Solanaceae, głównie ziemniaka Solanum tuberosum L. Zasięg geograficzny tego gatunku wynosi ponad 16 milionów^km2 i stale się powiększa¹. CPB ma fakultatywną diapauzę zimową, a hibernacja jest obowiązkowa w strefie umiarkowanej. Diapauza jest wywoływana przez fotoperiod dnia krótkiego i modulowana przez temperaturę¹. Chrząszcze te zimują w stadium dorosłym, zakopując się w glebie. Wraz ze wzrostem szerokości geograficznych wydłuża się czas trwania okresu hibernacji. W strefie umiarkowanej, zwłaszcza na północnych terytoriach jej zasięgu, zimowanie trwa do 9 miesięcy: od sierpnia-września do maja-czerwca (Noskov i wsp., obserwacje osobiste). W tym okresie CPB – podobnie jak każdy inny owad w strefie umiarkowanej – jest narażony na niekorzystne warunki zimowe i musi zwiększyć swoją tolerancję na zimno. Jednocześnie kontakt chrząszczy z glebą zwiększa ryzyko zakażenia różnymi mikroorganizmami oportunistycznymi i chorobotwórczymi². Dlatego chrząszcze te muszą utrzymywać pewien poziom aktywności układu odpornościowego podczas hibernacji, co jest również kosztowne energetycznie. Niemniej jednak, nawet jeśli owad przetrwa infekcję, choroba może zmniejszyć jego mrozoodporność³. Należy zauważyć, że niska temperatura nie jest jedyną przyczyną śmiertelności zimowej CPB. Ważną rolę odgrywa również brak tlenu, a w pewnych warunkach może to być główny czynnik śmiertelności zimowej^4,5.

Wiadomo, że naturalna śmiertelność zimowa CPB może być bardzo wysoka, sięgając 100% na glebach gliniastych⁶. Zimowanie jest więc jednym z najważniejszych okresów w cyklu życia CPB. Niemniej jednak dane dotyczące fizjologii, aktywności układu odpornościowego, przeżywalności i innych parametrów hibernacji CPB w warunkach naturalnych są nadal ograniczone. Istnieją badania nad różnicową ekspresją genów i różnymi parametrami fizjologicznymi u dorosłych CPB podczas diapauzy i w odpowiedzi na szok zimna^{7,8,9,10,11,12}; Jednak analizy te zostały przeprowadzone głównie poprzez indukcję diapauzy lub stresu zimna w warunkach laboratoryjnych bez naturalnych wahań temperatury, wilgotności i obciążenia rodzimymi patogenami. Niemniej jednak ważne są badania nad fizjologią tych chrząszczy zbieranych przez wykopy z gleby w warunkach naturalnych. W latach 1970-1980 aktywnie badano różne aspekty zimowania CPB w warunkach naturalnych^{13,14,15,16,17,18}. Z drugiej strony, badania te nie obejmowały wydobycia CPB z gleby zimą. Ponadto nie przedstawiono szczegółowo techniki kontrolowanej hibernacji CPB ani opisu klatek. W związku z tym konieczne jest zbadanie fizjologii CPB zimujących w warunkach naturalnych¹⁹.

Celem tego badania było opracowanie i przetestowanie metody kontrolowanej hibernacji dorosłych osób z CPB w naturalnych warunkach. Proponowana metoda pozwala na uzyskanie pożądanej liczby osobników CPB do badań mikrobiologicznych, immunologicznych i innych w czasie hibernacji w warunkach polowych klimatu kontynentalnego. Metodę tę można dostosować i zastosować do innych gatunków owadów zimujących w glebie pod śniegiem.

1. Opis klatek do hibernacji

UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, liczba klatek jest różna. Stosować co najmniej trzy sadzki w każdym dniu pobierania próbek. Aby oszacować liczbę chrząszczy, które się pojawią, przygotuj co najmniej trzy dodatkowe klatki, które nie zostaną wyjęte z gleby do wiosny.

1. Używaj klatek wykonanych ze sztywnej drewnianej ramy o wymiarach 25 × 25 × 40 cm (dł. ×. szer. ×. wys.).
2. Aby zbudować ramę do klatki, użyj drewnianych listew o grubości co najmniej 2 cm i szerokości 4 cm.
3. Przykryj wnętrze klatki siatką ze stali nierdzewnej o wielkości otworów nie większej niż 5 mm × 3 mm. Użyj zszywacza do drewna, aby przymocować siatkę.
4. Przymocuj siatkę ze stali nierdzewnej na zewnątrz dna za pomocą zszywacza.
5. Wnętrze klatki wyłożyć czarną geowłókniną syntetyczną o gramaturze 60 g/m²,
   UWAGA: Geowłóknina służy jako dodatkowa bariera zapobiegająca ucieczce chrząszczy. Nie używaj go w eksperymentach związanych z aktywnie poruszającymi się entomopatogenami i parazytoidami.
6. Mocno przymocuj rurkę z syntetycznej, półprzezroczystej, oddychającej tkaniny o wysokości około 60 cm do górnej części klatki.
7. Skrzyżuj i przymocuj dwie mocne liny do dna klatki, aby w razie potrzeby wyciągnąć ją z ziemi.

2. Instalacja klatek

1. Wykop dziurę o głębokości 40 cm w ziemi i umieść w niej klatkę.
2. Połóż suchą trawę lub siano na dołku.
3. Umieść klatkę w środku tak, aby siano lub sucha trawa znajdowały się między ścianami klatki a glebą.
4. Wypełnij klatki ziemią z tego samego pola ziemniaków, na którym zbierane są owady.
5. Zainstaluj wodoodporne rejestratory temperatury i wilgotności w klatkach na wymaganych głębokościach.
   UWAGA: Rejestratory danych dowolnego producenta mogą być używane i muszą być zdolne do pracy w niskich temperaturach.
6. Posadź sadzonki ziemniaków w każdej klatce na 3-4 tygodnie przed introdukcją chrząszczy i podlewaj je umiarkowanie.
7. Przymocuj rurkę z tkaniny syntetycznej pionowo do kija z dowolnego materiału zainstalowanego na zewnątrz klatki.

3. Hodowla owadów przed zimowaniem

1. Ręcznie zbieraj dorosłe chrząszcze na polach ziemniaków wolnych od pestycydów pod koniec wegetacji ziemniaków.
   UWAGA: Dorosłe chrząszcze różnią się znacznie od larw i charakteryzują się pasiastą elytrą, podczas gdy larwy są czerwone.
2. Zebrane chrząszcze należy przechowywać w plastikowych wiaderkach o pojemności 15-20 litrów (maksymalnie 200 osobników na wiadro) zawierających blaty ziemniaczane do karmienia owadów przed umieszczeniem ich w klatkach.
3. Przykryj wiadra oddychającą tkaniną.
   UWAGA: Nie trzymaj owadów w wiadrach dłużej niż 12 godzin. Użyj wystarczająco dużych blatów ziemniaczanych, aby zapobiec gromadzeniu się chrząszczy na dnie wiader.
4. Umieścić nie więcej niż 200 osobników CPB na roślinach ziemniaka pokrytych siatką z tkaniny syntetycznej.
5. Po spożyciu blatów ziemniaczanych dodaj świeże osadzone w plastikowym słoiku z wodą, a następnie codziennie zmieniaj blaty ziemniaczane.
   UWAGA: Aby przymocować łodygi w słoiku, użyj waty i parafilmu. Dokładnie sprawdź stare łodygi pod kątem chrząszczy podczas ich usuwania.
6. Gdy wszystkie chrząszcze zostaną zakopane w glebie na zimę, odwiąż rurkę z syntetycznej tkaniny od kija i połóż tkaninę.

4. Zbieranie owadów w sezonie zimowym

1. Usuń śnieg z powierzchni klatki.
2. Poluzuj klatkę z każdej strony mocną łopatą.
3. Wyciągnij klatkę z gleby za pomocą lin.
4. Przynieś klatkę do laboratorium.
   UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, hibernujące chrząszcze mogą być nieaktywne przed analizą. W takim przypadku temperatura w laboratorium podczas izolacji chrząszczy od gleby powinna wynosić ~2-5 °C.
5. Usuń ziemię z pudełka małymi porcjami, ostrożnie rozbij duże kawałki ziemi i odizoluj chrząszcze za pomocą pęsety.
6. Oddziel żywe chrząszcze od zwłok. Żywe, zdrowe chrząszcze tworzą wokół siebie zwartą glebę, tworząc jamę powietrzną (tzw. kołyskę), dzięki czemu łatwo oddzielają się od gleby. Chrząszcze zabijane przez grzyby są mumifikowane lub mają widoczną grzybnię na powierzchni. Owady rozkładające się bakteryjnie są ciemne.
7. Przesiej glebę przez sito, aby upewnić się, że wszystkie chrząszcze są odizolowane i nie są uszkodzone.
8. Zwłoki z objawami infekcji grzybiczej lub rozkładu bakteryjnego należy umieścić w pojedynczej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w celu przyszłej identyfikacji.
9. Żywe chrząszcze przechowywać w lodówce w temperaturze 0-2 °C do czasu analizy w zamkniętym, wentylowanym pojemniku zawierającym wilgotny wacik.

5. Przygotowanie próbek narządów i tkanek

1. Aby pobrać hemolimfę, wykonaj nakłucie w bocznej części brzucha pod elytrą za pomocą igły insulinowej.
   UWAGA: Podczas zimowania ilość hemolimfy jest znacznie zmniejszona, co utrudnia zebranie tego płynu.
2. Aby wyizolować jelito, odetnij kapsułkę głowy, wyciśnij całą zawartość na szalkę Petriego z buforem fosforanowym, oddziel jelito i oczyść je z tłuszczu i naczyń Malpighiana.
3. Oddziel żądaną część jelita, taką jak jelito przednie, jelito środkowe lub jelito tylne.
4. Aby wyizolować ciało tłuszczowe, oddziel je od innych tkanek po wyizolowaniu jelita.
   UWAGA: Wyizolowane tkanki można wykorzystać do pomiaru aktywności enzymów przeciwutleniających i detoksykujących (przykład: rysunek uzupełniający 1), analizy regulacji genów szlaku sygnalizacji immunologicznej (przykład: rysunek uzupełniający 2) lub metabarkodowania zawartości jelit owadów itp.

6. Izolacja mikroorganizmów ze zwłok

1. Aby wyizolować grzyby entomopatogeniczne ze zwłok, umieść zmumifikowane owady w sterylnej komorze wilgotnościowej.
2. Użyj konidiów powietrznych (jeśli są dostępne) lub sklerocji z wewnętrznej zawartości chrząszczy do posiewu na agarze dekstrozowym Sabouraud z 0,4% kwasem mlekowym.
   UWAGA: Chrząszczy z grzybnią i konidiami należy natychmiast poszyć (bez umieszczania ich w komorach wilgotnościowych).
3. Wyizoluj bakterie ze zwłok z objawami rozkładu bakteryjnego.
4. Odetnij głowę chrząszcza, wyciśnij zawartość wewnętrzną i zbierz ją do probówek w celu późniejszego posiewu na podłożu dla bakterii (agar Luria-Bertani, agar endo i agar z eskuliną żółciową).
   UWAGA: Użyj mikroskopii i metod molekularnych, aby zidentyfikować rodzaje i gatunki patogenów. W razie potrzeby można przeprowadzić analizę na obecność innych pasożytów.

Poniższe wyniki dotyczące zimujących CPB pokazują temperaturę gleby, przetrwanie i infekcje.

Dynamika temperatury gleby.
Temperatury poniżej zera w klatkach na głębokości 30 cm rejestrowano od końca listopada do początku kwietnia (Rysunek 1). Średnia temperatura w tym okresie wynosiła minus 3,3 ± 0,1 °C (średnia ± błąd standardowy). Najniższa odnotowana temperatura wyniosła minus 7,9 °C w połowie lutego.

Przeżywalność zimujących CPB.
Śmiertelność owadów obserwowano podczas hibernacji i osiągała maksimum wiosną przed wschodami. Początkowa liczba chrząszczy wynosiła 2000, z czego do końca maja przeżyło 1470 osobników. Przeżywalność chrząszczy podczas hibernacji wynosiła 61% (Ryc. 2).

Infekcje w zimujących CPB.
Analiza 530 martwych chrząszczy wykazała, że w okresie hibernacji 53% z nich miało objawy rozkładu bakteryjnego, a 25% miało objawy infekcji grzybiczych (Ryc. 3). Beauveria dominowała (45 izolatów) wśród izolowanych kultur grzybów entomopatogenicznych. Metarhizium, Cordyceps (=Isaria) i Lecanicillium były znacznie rzadziej spotykane (po dwa izolaty). Wśród bakterii wyizolowanych ze zwłok z objawami rozkładu bakteryjnego (n = 30) zidentyfikowano gatunki należące do rodzajów Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella i Glutamicibacter (tab. 1).

Rysunek 1: Dynamika temperatury gleby. Dynamika temperatury gleby mierzona przez wodoodporny rejestrator temperatury zainstalowany na głębokości 30 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przetrwanie zimujących stonek ziemniaczanych w różnych okresach hibernacji. Klatki zostały wykopane, a ocalałe i martwe chrząszcze policzono w listopadzie, styczniu, kwietniu i maju. Słupki reprezentują liczbę ocalałych chrząszczy. Wąsy wskazują błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Infekcje u zimujących stonki ziemniaczanej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Materiały dodatkowe: Kliknij tutaj, aby pobrać poniższe pliki uzupełniające.

Rysunek uzupełniający 1. Aktywność niespecyficznych esterazy w jelicie środkowym CPB podczas hibernacji. Wąsy oznaczają błąd standardowy. Różne litery wskazują na znaczące różnice między punktami czasowymi (test Dunna, P < 0,05).

Rysunek uzupełniający 2: Zmiany w ekspresji czynnika transkrypcyjnego NFkB (szlak IMD) w jelitach i ciele tłuszczowym CPB podczas hibernacji. Dane są prezentowane jako zmiany krotności względem punktu czasowego w sierpniu. Rp4, Rp18 i Arf19 zostały użyte jako geny referencyjne. Wąsy pokazują błąd standardowy.

Tabela uzupełniająca 1: Przypuszczalna identyfikacja sekwencji genów 16S rRNA (~800 bp) bakterii wyizolowanych z martwego CPB podczas hibernacji.

Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów.