Artykuł metodologiczny

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65863

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Cyrus Tang Hematology Center, Cyrus Tang Medical Institute, Soochow University, 2Collaborative Innovation Center of Hematology of Jiangsu Province, Soochow University, 3Suzhou Key Laboratory of Thrombosis and Vascular Biology, Soochow University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.

Streszczenie

Tętnice szyjne są głównymi naczyniami krwionośnymi w szyi, które dostarczają krew i tlen do mózgu, ale zwężenie tętnicy szyjnej występuje, gdy tętnice szyjne są zatkane przez płytkę miażdżycową. Ujawnienie składu komórkowego tętnicy szyjnej na poziomie pojedynczej komórki jest niezbędne w leczeniu miażdżycy tętnic szyjnych. Nie ma jednak gotowego do użycia protokołu przygotowania zawiesin jednokomórkowych z tętnic szyjnych. Aby uzyskać odpowiedni protokół dysocjacji normalnych tętnic szyjnych na poziomie pojedynczej komórki przy mniejszym uszkodzeniu komórek, zaprojektowaliśmy dwuetapową metodę trawienia poprzez integrację procesu trawienia kolagenazy / DNazy i trypsyny. Podwójne zliczanie fluorescencji pomarańczy akrydynowej / jodku propydyny (AO / PI) zastosowano do wykrywania żywotności i stężenia komórek i stwierdzono, że zawiesina jednokomórkowa spełniała wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek, przy żywotności komórek powyżej 85% i wysokim stężeniu komórek. Po przetworzeniu danych jednokomórkowych w każdej komórce tętnicy szyjnej wykryto medianę ~ 2500 transkryptów na komórkę. Warto zauważyć, że jednocześnie wykrywano różne typy komórek normalnej tętnicy szyjnej, w tym komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), fibroblasty, komórki śródbłonka (EC) oraz makrofagi i komórki dendrytyczne (Mφ / DC). Protokół ten może być stosowany do przygotowania jednokomórkowej zawiesiny naczyń krwionośnych z innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami.

Wprowadzenie

Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalną związaną z czynnikami ryzyka, takimi jak wysokie ciśnienie krwi, hiperlipidemia i hemodynamika1. Rozwidlenia tętnic szyjnych są podatne na zmiany hemodynamiczne i prowadzą do tworzenia się blaszki miażdżycowej w tętnicy szyjnej. Obraz kliniczny miażdżycy tętnic szyjnych może być ostry, taki jak udar mózgu i przemijające niedokrwienie mózgu, lub przewlekły, taki jak nawracające przemijające niedokrwienie mózgu i otępienie naczyniowe2. Mechanicznie blaszka miażdżycowa tętnicy szyjnej jest wynikiem interakcji między różnymi komórkami ściany naczynia i różnymi komórkami krwi w warunkach patologicznych. Dlatego ujawnienie atlasu jednokomórkowego naczyń szyjnych w warunkach fizjologicznych i patologicznych jest szczególnie ważne w zapobieganiu i leczeniu rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicy szyjnej.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest jedną z najpotężniejszych technologii badań biologicznych ze względu na ultrawysoką rozdzielczość i wykrywanie heterogeniczności komórek z tego samego typu organizmów komórkowych3,4. Naukowcy wykorzystali sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki do prowadzenia badań w wielu dziedzinach, takich jak choroby układu krążenia5 i cancer6. Jednak szybkie i dokładne rozdzielenie tkanek na pojedyncze komórki jest nadal jednym z głównych wyzwań. Dysocjacja enzymatyczna jest powszechnie stosowaną metodą, która obejmuje głównie kolagenazę, papainę, trypsynę, DNazę i hialuronidazę. W szczególności kolagenazy są głównymi gatunkami enzymów do trawienia pojedynczych komórek, głównie hydrolizy składników kolagenu w tkankach łącznych. Różne typy kolagenazy mają zastosowanie do dysocjacji różnych tkanek, takich jak gruczoł sutkowy7, kłębuszek nerkowy 8, kąt tęczówkowo-rogówkowy 9, staw kolanowy10, aorta11 i lung12. Ze względu na unikalne właściwości fizjologiczne różnych tkanek, dysocjacja przy użyciu tej samej metody może powodować wiele problemów w pozyskiwaniu pojedynczych komórek, takich jak niska żywotność komórek, niska liczba komórek i duże szczątki komórkowe. Dlatego wynalezienie metod trawienia dla różnych tkanek jest niezbędne do przygotowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych.

Ten protokół ma na celu opracowanie dwuetapowej metody trawienia komórkowego w celu przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnicy szyjnej u myszy dzikich typów. Zgodnie z charakterystyką tętnicy szyjnej, połączyliśmy kolagenazę / DNazę z trypsyną, aby uzyskać wysokiej jakości jednokomórkową zawiesinę tętnicy szyjnej myszy, ponieważ kolagenaza może hydrolizować kolagen tkanek szyjnych, który był dalej trawiony przez trypinę do zawiesiny jednokomórkowej. Podwójne zliczanie fluorescencji pomarańczy akrydynowej / jodku propydyny (AO / PI) zastosowano do wykrywania żywotności i stężenia komórek i stwierdzono, że zawiesina jednokomórkowa spełniała wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek, przy żywotności komórek powyżej 85% i wysokim stężeniu komórek. Po przetworzeniu danych jednokomórkowych zidentyfikowano cztery typy komórek, w tym komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), fibroblasty, komórki śródbłonka (EC) oraz makrofagi i komórki dendrytyczne (Mφ / DC), w normalnych tętnicach szyjnych myszy po trawieniu. Zaletą tego protokołu jest, że: 1) można zidentyfikować wiele typów komórek w tętnicy szyjnej, 2) żywotność komórek jest dobrze zachowana i 3) można ją łatwo powtórzyć bez specjalnego sprzętu. Protokół ten jest odpowiedni dla badaczy, którzy są zainteresowani badaniem monokomórkowej multiomiki tętnic szyjnych myszy. Protokół ten może być również pomocny w dysocjacji innych naczyń krwionośnych przy odpowiednich modyfikacjach.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Soochow.

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

  1. Użyj 1x PBS bez wapnia i magnezu oraz 2,5 U/ml soli sodowej heparyny do przygotowania roztworu perfuzyjnego. Przechowywać w temperaturze 4 °C, a po użyciu schłodzić na lodzie.
  2. Przygotować odczynnik dysocjacyjny A, który zawiera 125 CDU/ml kolagenazy II i 60 U/ml DNazy I, rozcieńczając 1250 CDU/ml kolagenazy II i 3000 U/ml DNazy I za pomocą HBSS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Przygotować odczynnik dysocjacyjny B, który zawiera końcowe stężenie 0,12% trypsyny, rozcieńczając 1 ml 0,25% trypsyny wolnej od EDTA (bez czerwieni fenolowej) w 1 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  4. Przygotuj 10 ml 1,5% FBS i 10 ml 5% FBS w 1x PBS. Użyj 1,5% FBS do puli tętnic szyjnych i trzymaj na lodzie przed użyciem. Użyj 5% FBS, aby zneutralizować trawienie i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Zdobądź materiały eksperymentalne, w tym strzykawki o pojemności 1 ml, strzykawki o pojemności 20 ml z igłami 26 G, sześciodołkowe płytki do hodowli komórek, probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml, sterylne sitka do komórek 40 μm i pojemniki na lód.

2. Przygotowanie sprzętu

  1. Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny, w tym mikroskop stereoskopowy, nożyczki preparacyjne, nożyczki do mikropreparacji i kleszczyki z cienką końcówką.
  2. Włącz automatyczny licznik komórek i utrzymuj go w stanie RT.
  3. Wcześniej włączyć łaźnię wodną do 37 °C.
  4. Przed użyciem schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.

3. Izolacja tętnicy szyjnej myszy

  1. Znieczulij mysz za pomocą 1,25% tribromoetanolu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (0,24 ml na każde 10 g masy ciała) i odwróć mysz, aby sprawdzić, czy po 3 minutach występuje odruch prostowania. Następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i połóż ją na plecach. Spryskaj skórę myszy 75% alkoholem.
  2. Użyj wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć skórę i odsłonić klatkę piersiową. Rozetnij membranę.
  3. Kontynuuj cięcie w górę do dolnej szczęki i ostrożnie usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu, odsłaniając tętnicę szyjną.
  4. Przetnij żyłę główną dolną myszy, aby krew wypłynęła z zamkniętego krążenia.
  5. Wstrzyknąć 20 ml wstępnie schłodzonego roztworu perfuzyjnego do lewej komory za pomocą strzykawki powoli i w sposób ciągły.
    UWAGA: Jeśli perfuzja się powiedzie, narządy bogate w krew, takie jak wątroba, śledziona i nerki, zmienią kolor na szaro-biały.
  6. Oderwij cały tłuszcz i tkankę łączną wokół tętnicy szyjnej za pomocą nożyczek do mikropreparowania pod mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Ten krok należy wykonywać powoli i ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu tętnicy szyjnej.
  7. Odizoluj tętnicę szyjną od myszy, przemyj 1x PBS, aby ponownie przepłukać krew, i przenieś na sześciodołkowe płytki zawierające 1,5% FBS na lodzie.

4. Trawienie tętnicy szyjnej do zawiesiny jednokomórkowej

  1. Użyj nożyczek do mikropreparowania, aby wyciąć tętnicę szyjną wzdłużnie i połóż płasko na innej 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej 1 ml 1,5% FBS na lodzie.
  2. Ostrożnie przepłukać błonę wewnętrzną 1,5% FBS, aby usunąć resztki krwi.
    UWAGA: Płukanie powinno być delikatne i powolne, aby uniknąć uszkodzenia komórek śródbłonka.
  3. Przetnij każdą tętnicę szyjną na około 2 mm2 kawałki tkanki za pomocą nożyczek do mikropreparowania w 1,5% FBS.
  4. Przenieść te kawałki tkanek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml z końcówkami o szerokim otworze 1 ml, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby zanurzyć tkanki na dnie.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić tkanki w 500 μl odczynnika dysocjacyjnego A.
  6. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Delikatnie pipetować pipetą o pojemności 1 ml co 10 minut.
  7. Dodaj 500 μl 5% FBS do probówki i dobrze wymieszaj z pipetą o pojemności 1 ml.
  8. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sterylne sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl odczynnika dysocjacyjnego B.
  10. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i trawić przez kolejne 5 minut. Podczas trawienia delikatnie pipetować pipetą co 2 minuty, aby całkowicie zdysocjować do zawiesiny jednokomórkowej.
  11. Użyć 200 μl 5% FBS, aby zakończyć reakcję trawienia i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x PBS na lodzie.

5. Badanie zawiesiny komórkowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki

  1. Dodać 10 μl roztworu AO/PI do 10 μl zawiesiny jednokomórkowej i delikatnie wymieszać pipetą o pojemności 20 μl.
  2. Odpipetować 20 μl mieszaniny do szkiełka komorowego i odczekać 1 min.
  3. Załaduj szkiełko do automatycznego przyrządu do liczenia komórek.
  4. Wybierz test żywotności AO/PI, a następnie poczekaj na raport jakości.
  5. Użyj zestawu odczynników do 3ʹ dla jednej komórki, aby wygenerować jednokomórkowe kulki żelowe w emulsji na jednokomórkowym kontrolerze i amplifikować cDNA z kodem kreskowym w termocyklerze zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: W tym przypadku użyto zestawów odczynników Chromium Single Cell 3ʹReagent Kit v3.
  6. Wykonaj sekwencjonowanie na sekwencerze ze strategią odczytu 150 pz (PE150) na sparowanym końcu. Użyj aplikacji (Cell Ranger), aby przekonwertować surowe pliki wywołań podstawowych na pliki fastq za pomocą potoku mkfastq. Następnie użyj potoku zliczania Cell Ranger do wykonywania wyrównywania, filtrowania, zliczania kodów kreskowych i zliczania unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) w celu wygenerowania macierzy kodów kreskowych cech13.
  7. Wykonaj redukcję wymiarowości i wizualizację danych za pomocą pakietu języka R Seurat14.
    1. Najpierw funkcja Read10X() Seurat odczytuje dane wyjściowe potoku Cell Ranger, a następnie używa macierzy count do utworzenia obiektu Seurat. Następnie odfiltruj komórki z ekspresją genów <200 lub >4000 lub stosunkiem genów mitochondrialnych, który wynosił więcej niż 10% przez funkcję podzbioru () Seurata.
    2. Użyj funkcji NormalizeData() i FindVariableFeatures(), aby znormalizować dane i zidentyfikować odpowiednio 2000 wysoce zmiennych funkcji.
    3. Wykonaj analizę głównych składowych (PCA) na skalowanych danych i zgrupuj komórki z przyciemnieniami = 30 i rozdzielczością = 0,5. Na koniec użyj funkcji RunUMAP() do wizualizacji zestawów danych z jednej komórki i FindAllMarkers(), aby znaleźć każdy biomarker klastra.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje dwuetapową metodę trawienia komórek w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tętnic szyjnych myszy (Rysunek 1). Ta dwuetapowa metoda trawienia łączy kolagenazę/DNazę z trypsyną, aby skutecznie rozdzielić ścianę naczyniową tętnicy szyjnej myszy i uzyskać wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Po dysocjacji stężenie i żywotność komórek obliczono za pomocą automatycznego licznika komórek. Obraz w polu jasnym ukazał morfologię komórek naczyniowych tętnicy szyjnej po trawieniu, a podwójne barwienie fluorescencyjne AOPI pozwoliło jednocześnie ocenić żywotność komórek (Rysunek 2A,B). Co istotne, w porównaniu z zastosowaniem samego odczynnika dysocjującego A, tkanka tętnicy szyjnej może zostać bardziej gruntownie rozdzielona w połączeniu z odczynnikiem dysocjującym B. Stwierdzono ponadto, że po dwuetapowym trawieniu liczba żywych komórek z dziewięciu tętnic oraz średnica komórek spełniały wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek (Rysunek 2C). Jednocześnie z dziewięciu lewych tętnic szyjnych zebrano łącznie 176 000 pojedynczych komórek, a większość naczyń naczyniowych została rozdzielona na pojedyncze komórki o wysokiej żywotności (Rysunek 2C).

Po dopasowaniu, filtrowaniu, zliczaniu kodów kreskowych oraz zliczaniu UMI, surowe dane z sekwencjonowania pojedynczych komórek przeanalizowano za pomocą pakietu R Seurat. Rozkład genów na komórkę, UMI na komórkę oraz odczytów mitochondrialnych na komórkę przedstawiono na wykresach skrzypcowych (Rysunek 3A-C). Co istotne, w każdej komórce tętnicy szyjnej wykryto medianę wynoszącą ~2500 transkryptów. Po usunięciu komórek niskiej jakości wykryto 14 580 komórek, które wykorzystano w dalszej analizie single-cell RNA-seq. Przy użyciu 2000 genów zmiennych o podobnych profilach, nienadzorowane klastrowanie oparte na Seurat wykazało cztery główne typy komórek w normalnych tętnicach szyjnych myszy po trawieniu: VSMCs (74,0%), fibroblasty (16,5%), ECs (6,5%) oraz Mφ/DCs (3,0%) (Rysunek 3D-F).

Schemat procesu izolacji i dysocjacji tkanki tętnicy szyjnej myszy z użyciem wirówki i pipety.
Rycina 1: Schemat trawienia tętnicy szyjnej myszy. Po wyizolowaniu i przecięciu tętnicy szyjnej myszy dodano 500 µL odczynnika dysocjującego A w celu dysocjacji tętnicy szyjnej myszy. Po przefiltrowaniu i odwirowaniu zawiesiny komórkowej dodano 200 µL odczynnika dysocjującego B w celu dalszej dysocjacji, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia w świetle przechodzącym i fluorescencyjna mikroskopia AOPI w celu oceny żywotności komórek; żywe komórki na zielono, martwe na czerwono.
Rycina 2: Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tętnicy szyjnej myszy. (A) Morfologia i żywotność komórek tętnicy szyjnej po 1 h trawienia odczynnikiem dysocjującym A przedstawione w świetle przechodzącym oraz po barwieniu AOPI. Komórki z jądrami wybarwione na zielono to komórki żywe, natomiast wybarwione na czerwono to komórki martwe. Pasek skali = 100 µm. (B) Morfologia i żywotność komórek tętnicy szyjnej po dwuetapowym trawieniu przedstawione w świetle przechodzącym oraz po barwieniu AOPI. Komórki z jądrami wybarwione na zielono to komórki żywe, natomiast wybarwione na czerwono to komórki martwe. Pasek skali = 100 µm. (C) Po dwuetapowym trawieniu zmierzono żywotność komórek, całkowitą liczbę komórek, liczbę żywych komórek oraz średnią średnicę komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cech RNA; wykresy skrzypcowe, UMAP, wykres kropkowy i wykres słupkowy; ekspresja genów w typach komórek.
Rysunek 3: Standardowe wskaźniki kontroli jakości (QC) dla scRNA-seq oraz krajobraz komórkowy tętnicy szyjnej. (A) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozkład liczby genów na komórkę (nFeature RNA), (B) liczbę UMI na komórkę (nCount_RNA) oraz (C) odczyty mitochondrialne na komórkę (percent mt) dla danych scRNA-seq. (D) Wykres UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) przedstawiający cztery zidentyfikowane typy komórek tętnicy szyjnej. (E) Wykres kropkowy przedstawiający markery definiujące każdy typ klastra komórkowego z panelu D. Wielkość każdego koła oznacza proporcję komórek w grupie wykazujących ekspresję danego transkryptu. Niebieskie kropki oznaczają geny o wysokiej ekspresji, a szare kropki geny o niskiej ekspresji. (F) Skumulowany wykres słupkowy przedstawiający względną obfitość czterech typów komórek wykrytych w scRNA-seq myszy typu dzikiego (WT). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej z tętnicy szyjnej myszy typu dzikiego, w którym skonstruowano dwuetapową metodę trawienia integrującą proces trawienia kolagenazy/DNazy i trypsyny. Po kontroli jakości zawiesiny jednokomórkowej stwierdziliśmy, że spełnia ona wymagania dotyczące sekwencjonowania pojedynczych komórek, z żywotnością komórek powyżej 85% i wysokim stężeniem komórek. Co więcej, po przetworzeniu danych jednokomórkowych z powodzeniem wykryto różne typy komórek w tętnicy szyjnej, w tym VSMC, fibroblasty, EC i Mφ/DC.

Obecne metody przygotowania zawiesin jednokomórkowych tętnic szyjnych są nadal nieliczne. Depuydt i wsp. uzyskali jednokomórkową zawiesinę z ludzkich blaszek szyjnych, łącząc kolagenazę, DNazę, ludzką frakcję albuminy V i flawopirydol w temperaturze 37 °C przez 30 min15. Po sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją zidentyfikowali 14 odrębnych populacji komórek, w tym komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, komórki tuczne, limfocyty B, komórki mieloidalne i limfocyty T15. Ponadto naukowcy trawili wspólne tętnice szyjne szczurów przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA i 0,1% kolagenazy w temperaturze 37 °C i z powodzeniem przeprowadzili sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA16. Pięć typów komórek, w tym VSMC, fibroblasty, EC, komórki przejściowe i makrofagi, zidentyfikowano zarówno w normalnych, jak i eksperymentalnych tętnicach szyjnych16. Ponadto ustalono również protokół otrzymywania preparatów jednokomórkowych tętnicy szyjnej wzbogaconych w EC17. Po zakończeniu trawienia enzymatycznego luminalnego, płukanie tętnicy szyjnej pozwoli uzyskać wystarczającą ilość jednokomórkowych granulek dla scRNAseq i scATACseq17. Aby elastycznie kontrolować czas trawienia, opracowaliśmy dwuetapową metodę trawienia dla tętnic szyjnych myszy, oddzielając etapy dysocjacji tkanek i przygotowania zawiesiny jednokomórkowej. Proces rozpoczyna się od 125 CDU/ml kolagenazy II i 60 U/ml DNazy I przez 1 godzinę, a następnie trypsyny wolnej od EDTA przez 5 minut. Co istotne, możemy odpowiednio zmodyfikować dowolny etap metody trawienia innych tkanek naczyń krwionośnych w oparciu o charakterystykę naczyń krwionośnych.

Istnieją pewne ograniczenia opisanej metody. Po pierwsze, nie wiemy, czy metoda ta może być stosowana do pierwotnej hodowli komórkowej in vitro. Ponieważ ściana tętnicy szyjnej jest cieńsza i ma mniej komórek, hodowla i ekspansja in vitro jest wyzwaniem. Po drugie, w przeciwieństwie do innych metod trawienia, protokół ten wymaga delikatnego pipetowania w celu dysocjacji komórek podczas trawienia. Wstrząsająca kąpiel wodna może również skutkować dobrej jakości zawiesiną jednokomórkową. Po trzecie, ponieważ nasza metoda ma zastosowanie do normalnych tętnic szyjnych, to, czy jest ona odpowiednia do trawienia blaszki miażdżycowej tętnicy szyjnej, pozostaje do zbadania.

Podsumowując, zaprojektowaliśmy dwuetapową metodę trawienia, aby uzyskać wysokiej jakości zawiesinę jednokomórkową z tętnicy szyjnej myszy typu dzikiego. Protokół ten może być stosowany do przygotowywania zawiesin jednokomórkowych dla innych naczyń z niewielkimi modyfikacjami, co czyni go bardzo pomocnym w badaniach sercowo-naczyniowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Natural Science Foundation of China (82070450 dla C.T. i 82170466 dla L.Z.) oraz fellowship od China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 dla F.L.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna wolna od EDTABeyotimeC0205Rozcieńczyć 1 ml 0,25% trypsyny wolnej od EDTA w 1 ml 1x PBS.
0,9% roztwór soli NaClBeyotimeST341Rozcieńczyć roztwór sodu heparyny do końcowego stężenia 10 mg/ml
1 ml strzykawki  SKJYLEANsk-r009Do wykonywania perfuzji serca
1,5 ml probówki wirówkoweKIRGENKG2211WDo odwirowania fragmentu tkanki i zawiesiny komórek
Strzykawki 20 mlSKJYLEANsk-r013Do wykonania perfuzji serca
40 &mikro; m sitko komórkoweJETBIOFILcss010040Do filtrowania niestrawionych fragmentów tkanek
Zestaw AO/PIHengrui BiologicalRE010212Aby określić, czy komórka jest żywa, czy martwa
Automatyczny licznik komórekCountstarMira FLDo analizy morfologii komórek i żywotności komórek strawionych komórek naczyniowych tętnicy szyjnej
Oprogramowanie Cell Ranger10 i razy; Genomika3.0.2Do przetwarzania danych wyjściowych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki chromu oraz wykonywania klastrowania i analizy ekspresji genów
Zestawy odczynników chromu z pojedynczą komórką 3 v310 razy; Genomika1000075Przygotowanie jednokomórkowych bibliotek sekwencyjnych RNA zawiesiny jednokomórkowej
Kolagenaza IISigma-AldrichC6885Rozcieńczyć HBSS do końcowego stężenia 125 CDU/ml
Deoksyrybonukleaza IWorthingtonLS002140Rozcieńczyć HBSS do końcowego stężenia 60 U/ml
Płodowa surowica bydlęca HyCloneSH30088.03Zakończenie reakcji trawienia
Zrównoważony roztwór soli Hanka Gibco14175095Przechowywać w temperaturze pokojowej
Sól sodowa heparynySolarbio Life ScienceH8060Rozcieńczyć 0,9% NaCl do końcowego stężenia 10 mg/ml
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75002560Stosowany do rozdrabniania tkanek i granulek komórkowych
NovaSeq 6000 IlluminaN/ASequencer
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSolarbio Life ScienceP1000Służy do perfuzji serca i ponownego zawieszania komórek
Pakiet Seurat - RSatija Lab3.1.2Do wykonania redukcji wymiarowości, wizualizacji i analizy danych sekwencjonowania scRNA
Sześciodołkowe płytki do hodowli komórkowychNEST703002Umieść tkankę naczyniową
Łaźnia wodnaJinghongDK-S22Utrzymuj temperaturę trawienia na poziomie 37 & stopni; Z

Bibliografia

  1. Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
  2. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
  3. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
  4. Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
  5. Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
  6. Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
  7. Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
  8. Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
  9. Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
  10. Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
  11. Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
  12. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
  13. You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
  14. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  15. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  16. Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
  17. Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

T tnica szyjnadysocjacja tkankitrawienie dwuetapowetrawienie kolagenaztrawienie trypsynywotno kom rekkom rki mi ni g adkich naczykom rki r db onka
Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.