Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tętnice szyjne są głównymi naczyniami krwionośnymi w szyi, które dostarczają krew i tlen do mózgu, ale zwężenie tętnicy szyjnej występuje, gdy tętnice szyjne są zatkane przez płytkę miażdżycową. Ujawnienie składu komórkowego tętnicy szyjnej na poziomie pojedynczej komórki jest niezbędne w leczeniu miażdżycy tętnic szyjnych. Nie ma jednak gotowego do użycia protokołu przygotowania zawiesin jednokomórkowych z tętnic szyjnych. Aby uzyskać odpowiedni protokół dysocjacji normalnych tętnic szyjnych na poziomie pojedynczej komórki przy mniejszym uszkodzeniu komórek, zaprojektowaliśmy dwuetapową metodę trawienia poprzez integrację procesu trawienia kolagenazy / DNazy i trypsyny. Podwójne zliczanie fluorescencji pomarańczy akrydynowej / jodku propydyny (AO / PI) zastosowano do wykrywania żywotności i stężenia komórek i stwierdzono, że zawiesina jednokomórkowa spełniała wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek, przy żywotności komórek powyżej 85% i wysokim stężeniu komórek. Po przetworzeniu danych jednokomórkowych w każdej komórce tętnicy szyjnej wykryto medianę ~ 2500 transkryptów na komórkę. Warto zauważyć, że jednocześnie wykrywano różne typy komórek normalnej tętnicy szyjnej, w tym komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), fibroblasty, komórki śródbłonka (EC) oraz makrofagi i komórki dendrytyczne (Mφ / DC). Protokół ten może być stosowany do przygotowania jednokomórkowej zawiesiny naczyń krwionośnych z innych tkanek z odpowiednimi modyfikacjami.
Wprowadzenie
Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalną związaną z czynnikami ryzyka, takimi jak wysokie ciśnienie krwi, hiperlipidemia i hemodynamika1. Rozwidlenia tętnic szyjnych są podatne na zmiany hemodynamiczne i prowadzą do tworzenia się blaszki miażdżycowej w tętnicy szyjnej. Obraz kliniczny miażdżycy tętnic szyjnych może być ostry, taki jak udar mózgu i przemijające niedokrwienie mózgu, lub przewlekły, taki jak nawracające przemijające niedokrwienie mózgu i otępienie naczyniowe2. Mechanicznie blaszka miażdżycowa tętnicy szyjnej jest wynikiem interakcji między różnymi komórkami ściany naczynia i różnymi komórkami krwi w warunkach patologicznych. Dlatego ujawnienie atlasu jednokomórkowego naczyń szyjnych w warunkach fizjologicznych i patologicznych jest szczególnie ważne w zapobieganiu i leczeniu rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicy szyjnej.
Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest jedną z najpotężniejszych technologii badań biologicznych ze względu na ultrawysoką rozdzielczość i wykrywanie heterogeniczności komórek z tego samego typu organizmów komórkowych3,4. Naukowcy wykorzystali sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki do prowadzenia badań w wielu dziedzinach, takich jak choroby układu krążenia5 i cancer6. Jednak szybkie i dokładne rozdzielenie tkanek na pojedyncze komórki jest nadal jednym z głównych wyzwań. Dysocjacja enzymatyczna jest powszechnie stosowaną metodą, która obejmuje głównie kolagenazę, papainę, trypsynę, DNazę i hialuronidazę. W szczególności kolagenazy są głównymi gatunkami enzymów do trawienia pojedynczych komórek, głównie hydrolizy składników kolagenu w tkankach łącznych. Różne typy kolagenazy mają zastosowanie do dysocjacji różnych tkanek, takich jak gruczoł sutkowy7, kłębuszek nerkowy 8, kąt tęczówkowo-rogówkowy 9, staw kolanowy10, aorta11 i lung12. Ze względu na unikalne właściwości fizjologiczne różnych tkanek, dysocjacja przy użyciu tej samej metody może powodować wiele problemów w pozyskiwaniu pojedynczych komórek, takich jak niska żywotność komórek, niska liczba komórek i duże szczątki komórkowe. Dlatego wynalezienie metod trawienia dla różnych tkanek jest niezbędne do przygotowania wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych.
Ten protokół ma na celu opracowanie dwuetapowej metody trawienia komórkowego w celu przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnicy szyjnej u myszy dzikich typów. Zgodnie z charakterystyką tętnicy szyjnej, połączyliśmy kolagenazę / DNazę z trypsyną, aby uzyskać wysokiej jakości jednokomórkową zawiesinę tętnicy szyjnej myszy, ponieważ kolagenaza może hydrolizować kolagen tkanek szyjnych, który był dalej trawiony przez trypinę do zawiesiny jednokomórkowej. Podwójne zliczanie fluorescencji pomarańczy akrydynowej / jodku propydyny (AO / PI) zastosowano do wykrywania żywotności i stężenia komórek i stwierdzono, że zawiesina jednokomórkowa spełniała wymagania sekwencjonowania pojedynczych komórek, przy żywotności komórek powyżej 85% i wysokim stężeniu komórek. Po przetworzeniu danych jednokomórkowych zidentyfikowano cztery typy komórek, w tym komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC), fibroblasty, komórki śródbłonka (EC) oraz makrofagi i komórki dendrytyczne (Mφ / DC), w normalnych tętnicach szyjnych myszy po trawieniu. Zaletą tego protokołu jest, że: 1) można zidentyfikować wiele typów komórek w tętnicy szyjnej, 2) żywotność komórek jest dobrze zachowana i 3) można ją łatwo powtórzyć bez specjalnego sprzętu. Protokół ten jest odpowiedni dla badaczy, którzy są zainteresowani badaniem monokomórkowej multiomiki tętnic szyjnych myszy. Protokół ten może być również pomocny w dysocjacji innych naczyń krwionośnych przy odpowiednich modyfikacjach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Soochow.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów
- Użyj 1x PBS bez wapnia i magnezu oraz 2,5 U/ml soli sodowej heparyny do przygotowania roztworu perfuzyjnego. Przechowywać w temperaturze 4 °C, a po użyciu schłodzić na lodzie.
- Przygotować odczynnik dysocjacyjny A, który zawiera 125 CDU/ml kolagenazy II i 60 U/ml DNazy I, rozcieńczając 1250 CDU/ml kolagenazy II i 3000 U/ml DNazy I za pomocą HBSS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotować odczynnik dysocjacyjny B, który zawiera końcowe stężenie 0,12% trypsyny, rozcieńczając 1 ml 0,25% trypsyny wolnej od EDTA (bez czerwieni fenolowej) w 1 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotuj 10 ml 1,5% FBS i 10 ml 5% FBS w 1x PBS. Użyj 1,5% FBS do puli tętnic szyjnych i trzymaj na lodzie przed użyciem. Użyj 5% FBS, aby zneutralizować trawienie i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
- Zdobądź materiały eksperymentalne, w tym strzykawki o pojemności 1 ml, strzykawki o pojemności 20 ml z igłami 26 G, sześciodołkowe płytki do hodowli komórek, probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml, sterylne sitka do komórek 40 μm i pojemniki na lód.
2. Przygotowanie sprzętu
- Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny, w tym mikroskop stereoskopowy, nożyczki preparacyjne, nożyczki do mikropreparacji i kleszczyki z cienką końcówką.
- Włącz automatyczny licznik komórek i utrzymuj go w stanie RT.
- Wcześniej włączyć łaźnię wodną do 37 °C.
- Przed użyciem schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.
3. Izolacja tętnicy szyjnej myszy
- Znieczulij mysz za pomocą 1,25% tribromoetanolu we wstrzyknięciu dootrzewnowym (0,24 ml na każde 10 g masy ciała) i odwróć mysz, aby sprawdzić, czy po 3 minutach występuje odruch prostowania. Następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i połóż ją na plecach. Spryskaj skórę myszy 75% alkoholem.
- Użyj wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć skórę i odsłonić klatkę piersiową. Rozetnij membranę.
- Kontynuuj cięcie w górę do dolnej szczęki i ostrożnie usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu, odsłaniając tętnicę szyjną.
- Przetnij żyłę główną dolną myszy, aby krew wypłynęła z zamkniętego krążenia.
- Wstrzyknąć 20 ml wstępnie schłodzonego roztworu perfuzyjnego do lewej komory za pomocą strzykawki powoli i w sposób ciągły.
UWAGA: Jeśli perfuzja się powiedzie, narządy bogate w krew, takie jak wątroba, śledziona i nerki, zmienią kolor na szaro-biały. - Oderwij cały tłuszcz i tkankę łączną wokół tętnicy szyjnej za pomocą nożyczek do mikropreparowania pod mikroskopem stereoskopowym.
UWAGA: Ten krok należy wykonywać powoli i ostrożnie, aby zapobiec uszkodzeniu tętnicy szyjnej. - Odizoluj tętnicę szyjną od myszy, przemyj 1x PBS, aby ponownie przepłukać krew, i przenieś na sześciodołkowe płytki zawierające 1,5% FBS na lodzie.
4. Trawienie tętnicy szyjnej do zawiesiny jednokomórkowej
- Użyj nożyczek do mikropreparowania, aby wyciąć tętnicę szyjną wzdłużnie i połóż płasko na innej 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej 1 ml 1,5% FBS na lodzie.
- Ostrożnie przepłukać błonę wewnętrzną 1,5% FBS, aby usunąć resztki krwi.
UWAGA: Płukanie powinno być delikatne i powolne, aby uniknąć uszkodzenia komórek śródbłonka. - Przetnij każdą tętnicę szyjną na około 2 mm2 kawałki tkanki za pomocą nożyczek do mikropreparowania w 1,5% FBS.
- Przenieść te kawałki tkanek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml z końcówkami o szerokim otworze 1 ml, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby zanurzyć tkanki na dnie.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić tkanki w 500 μl odczynnika dysocjacyjnego A.
- Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Delikatnie pipetować pipetą o pojemności 1 ml co 10 minut.
- Dodaj 500 μl 5% FBS do probówki i dobrze wymieszaj z pipetą o pojemności 1 ml.
- Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sterylne sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl odczynnika dysocjacyjnego B.
- Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i trawić przez kolejne 5 minut. Podczas trawienia delikatnie pipetować pipetą co 2 minuty, aby całkowicie zdysocjować do zawiesiny jednokomórkowej.
- Użyć 200 μl 5% FBS, aby zakończyć reakcję trawienia i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl 1x PBS na lodzie.
5. Badanie zawiesiny komórkowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki
- Dodać 10 μl roztworu AO/PI do 10 μl zawiesiny jednokomórkowej i delikatnie wymieszać pipetą o pojemności 20 μl.
- Odpipetować 20 μl mieszaniny do szkiełka komorowego i odczekać 1 min.
- Załaduj szkiełko do automatycznego przyrządu do liczenia komórek.
- Wybierz test żywotności AO/PI, a następnie poczekaj na raport jakości.
- Użyj zestawu odczynników do 3ʹ dla jednej komórki, aby wygenerować jednokomórkowe kulki żelowe w emulsji na jednokomórkowym kontrolerze i amplifikować cDNA z kodem kreskowym w termocyklerze zgodnie z protokołem producenta.
UWAGA: W tym przypadku użyto zestawów odczynników Chromium Single Cell 3ʹReagent Kit v3. - Wykonaj sekwencjonowanie na sekwencerze ze strategią odczytu 150 pz (PE150) na sparowanym końcu. Użyj aplikacji (Cell Ranger), aby przekonwertować surowe pliki wywołań podstawowych na pliki fastq za pomocą potoku mkfastq. Następnie użyj potoku zliczania Cell Ranger do wykonywania wyrównywania, filtrowania, zliczania kodów kreskowych i zliczania unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) w celu wygenerowania macierzy kodów kreskowych cech13.
- Wykonaj redukcję wymiarowości i wizualizację danych za pomocą pakietu języka R Seurat14.
- Najpierw funkcja Read10X() Seurat odczytuje dane wyjściowe potoku Cell Ranger, a następnie używa macierzy count do utworzenia obiektu Seurat. Następnie odfiltruj komórki z ekspresją genów <200 lub >4000 lub stosunkiem genów mitochondrialnych, który wynosił więcej niż 10% przez funkcję podzbioru () Seurata.
- Użyj funkcji NormalizeData() i FindVariableFeatures(), aby znormalizować dane i zidentyfikować odpowiednio 2000 wysoce zmiennych funkcji.
- Wykonaj analizę głównych składowych (PCA) na skalowanych danych i zgrupuj komórki z przyciemnieniami = 30 i rozdzielczością = 0,5. Na koniec użyj funkcji RunUMAP() do wizualizacji zestawów danych z jednej komórki i FindAllMarkers(), aby znaleźć każdy biomarker klastra.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje dwuetapową metodę trawienia komórek w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tętnic szyjnych myszy (Rysunek 1). Ta dwuetapowa metoda trawienia łączy kolagenazę/DNazę z trypsyną, aby skutecznie rozdzielić ścianę naczyniową tętnicy szyjnej myszy i uzyskać wysokiej jakości zawiesiny pojedynczych komórek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Po dysocjacji stężenie i żywotność komórek obliczono za pomocą automatycznego licznika komórek. Obraz w polu jas...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowej z tętnicy szyjnej myszy typu dzikiego, w którym skonstruowano dwuetapową metodę trawienia integrującą proces trawienia kolagenazy/DNazy i trypsyny. Po kontroli jakości zawiesiny jednokomórkowej stwierdziliśmy, że spełnia ona wymagania dotyczące sekwencjonowania pojedynczych komórek, z żywotnością komórek powyżej 85% i wysokim stężeniem komórek. Co więcej, po przetworzeniu danych jednokomórkowych z powodzeniem wykryto...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Natural Science Foundation of China (82070450 dla C.T. i 82170466 dla L.Z.) oraz fellowship od China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 dla F.L.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyna wolna od EDTA | Beyotime | C0205 | Rozcieńczyć 1 ml 0,25% trypsyny wolnej od EDTA w 1 ml 1x PBS. |
| 0,9% roztwór soli NaCl | Beyotime | ST341 | Rozcieńczyć roztwór sodu heparyny do końcowego stężenia 10 mg/ml |
| 1 ml strzykawki | SKJYLEAN | sk-r009 | Do wykonywania perfuzji serca |
| 1,5 ml probówki wirówkowe | KIRGEN | KG2211W | Do odwirowania fragmentu tkanki i zawiesiny komórek |
| Strzykawki 20 ml | SKJYLEAN | sk-r013 | Do wykonania perfuzji serca |
| 40 &mikro; m sitko komórkowe | JETBIOFIL | css010040 | Do filtrowania niestrawionych fragmentów tkanek |
| Zestaw AO/PI | Hengrui Biological | RE010212 | Aby określić, czy komórka jest żywa, czy martwa |
| Automatyczny licznik komórek | Countstar | Mira FL | Do analizy morfologii komórek i żywotności komórek strawionych komórek naczyniowych tętnicy szyjnej |
| Oprogramowanie Cell Ranger | 10 i razy; Genomika | 3.0.2 | Do przetwarzania danych wyjściowych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki chromu oraz wykonywania klastrowania i analizy ekspresji genów |
| Zestawy odczynników chromu z pojedynczą komórką 3 v3 | 10 razy; Genomika | 1000075 | Przygotowanie jednokomórkowych bibliotek sekwencyjnych RNA zawiesiny jednokomórkowej |
| Kolagenaza II | Sigma-Aldrich | C6885 | Rozcieńczyć HBSS do końcowego stężenia 125 CDU/ml |
| Deoksyrybonukleaza I | Worthington | LS002140 | Rozcieńczyć HBSS do końcowego stężenia 60 U/ml |
| Płodowa surowica bydlęca | HyClone | SH30088.03 | Zakończenie reakcji trawienia |
| Zrównoważony roztwór soli Hanka | Gibco | 14175095 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| Sól sodowa heparyny | Solarbio Life Science | H8060 | Rozcieńczyć 0,9% NaCl do końcowego stężenia 10 mg/ml |
| Mikrowirówka | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Stosowany do rozdrabniania tkanek i granulek komórkowych |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Solarbio Life Science | P1000 | Służy do perfuzji serca i ponownego zawieszania komórek |
| Pakiet Seurat - R | Satija Lab | 3.1.2 | Do wykonania redukcji wymiarowości, wizualizacji i analizy danych sekwencjonowania scRNA |
| Sześciodołkowe płytki do hodowli komórkowych | NEST | 703002 | Umieść tkankę naczyniową |
| Łaźnia wodna | Jinghong | DK-S22 | Utrzymuj temperaturę trawienia na poziomie 37 & stopni; Z |
Bibliografia
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).
- Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339(2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
