Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65865

⸱

15 września 2023

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Streszczenie

Brak potwierdzonych modeli raka, które podsumowują mikrośrodowisko nowotworów litych in vitro, pozostaje znaczącym wąskim gardłem dla przedklinicznych badań nad rakiem i rozwoju terapeutycznego. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy unaczyniony mikroguz (VMT), czyli chip nowotworowy, system mikrofizjologiczny, który realistycznie modeluje złożone mikrośrodowisko ludzkiego guza. VMT tworzy się de novo w platformie mikroprzepływowej poprzez wspólną hodowlę wielu typów komórek ludzkich w dynamicznych, fizjologicznych warunkach przepływu. Ten inżynieryjny konstrukt mikroguza zawiera żywą, perfundowaną sieć naczyniową, która podtrzymuje rosnącą masę guza, tak jak robią to nowo powstałe naczynia in vivo. Co ważne, leki i komórki odpornościowe muszą przejść przez warstwę śródbłonka, aby dotrzeć do guza, modelując in vivo fizjologiczne bariery dla dostarczania i skuteczności terapii. Ponieważ platforma VMT jest optycznie przezroczysta, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamicznych procesów, takich jak wynaczynienie komórek odpornościowych i przerzuty, można uzyskać dzięki bezpośredniej wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie komórek w tkance. Co więcej, VMT zachowuje heterogeniczność guza in vivo, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki. Praktycznie każdy typ guza może być dostosowany do platformy, a pierwotne komórki ze świeżych tkanek chirurgicznych rosną i reagują na leczenie farmakologiczne w VMT, torując drogę do prawdziwie spersonalizowanej medycyny. W tym miejscu przedstawiono metody tworzenia VMT i wykorzystywania go do badań onkologicznych. To innowacyjne podejście otwiera nowe możliwości badania nowotworów i reakcji na leki, dostarczając naukowcom potężnego narzędzia do rozwoju badań nad rakiem.

Wprowadzenie

Rak pozostaje głównym problemem zdrowotnym na całym świecie i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Tylko w 2023 roku National Center for Health Statistics przewiduje ponad 1,9 miliona nowych przypadków raka i ponad 600 000 zgonów z powodu raka w USA1, podkreślając pilną potrzebę skutecznych metod leczenia. Jednak obecnie tylko 5,1% leków przeciwnowotworowych wchodzących w badania kliniczne ostatecznie uzyskuje aprobatę FDA. Niepowodzenie obiecujących kandydatów w pomyślnym przejściu przez badania kliniczne można częściowo przypisać zastosowaniu niefizjologicznych systemów modelowych, takich jak hodowle 2D i sferoidalne, podczas przedklinicznego opracowywania leków2. W tych klasycznych modelach nowotworowych brakuje istotnych składników mikrośrodowiska guza, takich jak nisza zrębowa, związane z nią komórki odpornościowe i perfundowane naczynia krwionośne, które są kluczowymi determinantami oporności terapeutycznej i progresji choroby. W związku z tym nowy system modelowy, który lepiej naśladuje ludzkie mikrośrodowisko guza in vivo, jest niezbędny do poprawy klinicznego przełożenia wyników przedklinicznych.

Dziedzina inżynierii tkankowej szybko się rozwija, dostarczając ulepszonych metod badania chorób ludzkich w warunkach laboratoryjnych. Jednym ze znaczących osiągnięć jest pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS), znanych również jako chipy narządowe lub chipy tkankowe, które są funkcjonalnymi, zminiaturyzowanymi ludzkimi narządami zdolnymi do replikacji zdrowych lub chorych warunków3,4,5. W tym kontekście, chipy nowotworowe, które są trójwymiarowymi, opartymi na mikroprzepływach modelami ludzkich nowotworów in vitro, zostały opracowane do badań onkologicznych2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Te zaawansowane modele uwzględniają sygnały biochemiczne i biofizyczne w dynamicznym mikrośrodowisku guza, umożliwiając naukowcom badanie zachowania guza i reakcji na leczenie w bardziej fizjologicznie odpowiednim kontekście. Jednak pomimo tych postępów, niewiele grup z powodzeniem wprowadziło żywy, funkcjonalny układ naczyniowy, szczególnie taki, który sam tworzy wzorce w odpowiedzi na przepływ fizjologiczny3,4,5,6. Włączenie funkcjonalnej sieci naczyniowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala na modelowanie barier fizycznych, które wpływają na dostarczanie leków lub komórek, naprowadzanie komórek do różnych mikrośrodowisk oraz transśródbłonkową migrację komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych. Dzięki włączeniu tej funkcji, chip nowotworowy może lepiej reprezentować złożoność obserwowaną w mikrośrodowisku guza in vivo.

Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, opracowaliśmy nowatorską platformę do badań przesiewowych leków, która umożliwia tworzenie sieci mikronaczyń w urządzeniu mikroprzepływowym8,9,10,11,12,13,14,15, 16. Ta podstawowa platforma chipów narządowych, określana jako unaczyniony mikronarząd (VMO), może być dostosowana do praktycznie każdego układu narządów w celu odtworzenia oryginalnej fizjologii tkanek do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i zastosowań medycyny spersonalizowanej. VMO są ustanawiane przez wspólną hodowlę komórek śródbłonka tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z komórek (ECFC-EC), HUVEC lub iPSC-EC (zwanych dalej EC) oraz wielu komórek zrębu w komorze, w tym normalnych ludzkich fibroblastów płuc (NHLF), które przebudowują macierz, oraz perycytów, które owijają i stabilizują naczynia. VMO można również ustanowić jako system modelowy raka poprzez kokulturację komórek nowotworowych wraz z powiązanym zrębem w celu utworzenia unaczynionego mikroguza (VMT)8,9,10,11,12,13, lub model chipa nowotworowego. Poprzez kohodowlę wielu typów komórek w dynamicznym środowisku przepływu, perfundowane sieci mikronaczyniowe tworzą się de novo w komorach tkankowych urządzenia, gdzie waskulogeneza jest ściśle regulowana przez natężenia przepływu śródmiąższowego14,15. Pożywka jest napędzana przez kanały mikroprzepływowe urządzenia przez hydrostatyczną głowicę ciśnieniową, która zaopatruje otaczające komórki komory tkankowej w składniki odżywcze wyłącznie przez mikronaczynia, o współczynniku przepuszczalności 1,2 x 10-7 cm/s, podobnym do tego, jaki obserwuje się dla naczyń włosowatych in vivo8.

Włączenie samoorganizujących się mikronaczyń do modelu VMT stanowi znaczący przełom, ponieważ: 1) naśladuje strukturę i funkcję unaczynionych mas guza in vivo; 2) potrafi modelować kluczowe etapy przerzutów, w tym interakcje guz-śródbłonek i komórki zrębu; 3) ustanawia fizjologicznie selektywne bariery dla dostarczania składników odżywczych i leków, poprawiając farmaceutyczne badania przesiewowe; oraz 4) umożliwia bezpośrednią ocenę leków o właściwościach antyangiogennych i przeciwprzerzutowych. Odtwarzając dostarczanie in vivo składników odżywczych, leków i komórek odpornościowych w złożonym mikrośrodowisku 3D, platforma VMO/VMT jest fizjologicznie istotnym modelem, który można wykorzystać do przeprowadzania badań przesiewowych leków i badania biologii specyficznej dla raka, naczyń krwionośnych lub narządów. Co ważne, VMT wspomaga rozwój różnych typów nowotworów, w tym raka jelita grubego, czerniaka, raka piersi, glejaka, raka płuc, raka otrzewnej, raka jajnika i raka trzustki8,9,10,11,12,13. Oprócz tego, że jest tania, łatwa do założenia i przygotowana do eksperymentów o wysokiej przepustowości, platforma mikroprzepływowa jest w pełni kompatybilna optycznie z analizą obrazu interakcji guz-zręb w czasie rzeczywistym i reakcji na bodźce lub terapie. Każdy typ komórki w systemie jest oznaczony innym markerem fluorescencyjnym, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację i śledzenie zachowania komórek przez cały eksperyment, tworząc okno na dynamiczne mikrośrodowisko guza. Wcześniej wykazaliśmy, że VMT wierniej modeluje in vivo wzrost guza, architekturę, heterogeniczność, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki niż standardowe metody hodowli10. Co ważne, VMT wspiera wzrost i badanie komórek pochodzących od pacjentów, w tym komórek nowotworowych, co lepiej modeluje patologię guzów macierzystych niż standardowe hodowle sferoidalne i dalej rozwija wysiłki medycyny spersonalizowanej11. Manuskrypt ten przedstawia metody tworzenia VMT, prezentując jego użyteczność w badaniu nowotworów u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i wykonanie

  1. Projekt urządzenia
    1. W celu wykonania urządzenia mikroprzepływowego należy stworzyć formę z SU-8, nakładając warstwę SU-8 o grubości 20 µm metodą spin-coatingu na podłoże krzemowe (oczyszczone metodą RCA-1 i poddane działaniu 2% fluorowodoru (HF)), a następnie przeprowadzić pojedynczy etap fotolitografii z użyciem maski, zgodnie z wcześniejszym opisem8,9.
    2. Z formy SU-8 należy odlać replikę z polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 4 mm, aby uzyskać trwałą formę poliuretanową do kolejnych etapów produkcji. Można zastosować różne warianty projektowe8,9,10,1,12,13,14,15.
    3. W obecnej wersji urządzenie mikroprzepływowe zostało zaprojektowane tak, aby pasowało do standardowego formatu płytki 96-dołkowej i składało się z warstwy funkcjonalnej z PDMS o grubości 2 mm zawierającej 12 jednostek mikroprzepływowych, zamkniętych od dołu cienką (1/16 cala) przezroczystą membraną polimerową (Rysunek 1A).
    4. Należy upewnić się, że poszczególne jednostki tkankowe składają się z komory tkankowej flankowanej przez wlot (L1) i wylot (L2) do wprowadzania żelu, regulator ciśnienia (PR)16 oraz odseparowane kanały mikroprzepływowe połączone z dwoma wlotami i wylotami pożywki po każdej stronie (M1-M2, M3-M4; Rysunek 1B).
    5. Każdy wlot i wylot należy umieścić w pojedynczym dołku, który służy jako rezerwuar pożywki w celu ustalenia ciśnienia hydrostatycznego (10 mm H2O) w kanale mikroprzepływowym. Aby umożliwić anastomozę sieci naczyniowej z kanałami zewnętrznymi, należy połączyć kanały mikroprzepływowe z komorą tkankową za pomocą porów komunikacyjnych o szerokości 50 µm (6 na górze, 6 na dole).
      UWAGA: Rezystory mikroprzepływowe wytwarzają gradient ciśnienia śródmiąższowego o wartości 5 mm H2O w obrębie komory tkankowej, który staje się ciśnieniem wewnątrzświatowym po całkowitym uformowaniu sieci naczyniowej8,10. Kolejne procedury rozpoczynają się od w pełni zmontowanej płytki o wysokiej przepustowości.

figure-protocol-1
Rysunek 1Projekt platformy mikroprzepływowej. (A) Schemat montażu platformy przedstawia warstwę funkcjonalną z PDMS z 12 jednostkami urządzenia, przyłączoną do płytki 96-dołkowej bez dna i uszczelnioną cienką, przezroczystą membraną polimerową. Każda jednostka urządzenia zajmuje jedną kolumnę dołków na płytce. Pojedyncza jednostka urządzenia zaznaczona na czerwono została szczegółowo przedstawiona w punkcie (B). (BSchemat jednej jednostki urządzenia przedstawia pojedynczą komorę tkankową umieszczoną w jednym dołku płytki 96-dołkowej oraz dwa porty załadowcze z otworem wlotowym i wylotowym (L1-L2), wykonane za pomocą dziurkacza, aby umożliwić wprowadzenie mieszaniny komórkowej z macierzą. Wloty i wyloty medium (M1-M2, M3-M4) są wykonane za pomocą dziurkacza i znajdują się w dołkach służących jako zbiorniki z medium. Różne objętości medium wytwarzają gradient ciśnienia hydrostatycznego w obrębie komory tkankowej za pośrednictwem rozdzielonych kanałów mikroprzepływowych. Jednostka regulatora ciśnienia (PR) służy jako zawór przeciwwybuchowy żelu w celu ułatwienia procesu ładowania. Należy zauważyć, że urządzenie jest 200 µm głęboka, a komora tkankowa ma wymiary 2 mm x 6 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowania przed nakładaniem

  1. Hodowla komórek
    1. Utrzymywać komórki zgodnie z zaleceniami producenta w inkubatorze z nawilżeniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Wysiać do kolb T75 przetransdukowane EC, NHLF lub inne komórki fibroblastyczne/stromalne oraz pożądane komórki nowotworowe 3-4 dni przed załadunkiem, z gęstością określoną przez producenta i protokoły użytkownika. W tym protokole wysiać 1 x 106 komórek na kolbę dla każdego typu komórek. Hodować EC w pełnej pożywce Endothelial Growth Media 2 (EGM2), NHLF w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS, a komórki nowotworowe w odpowiedniej pożywce w zależności od typu komórek.
    3. Utrzymywać komórki, wymieniając odpowiednie pożywki co 2-3 dni i ponownie potwierdzając wydajność transdukcji lub znakowania poprzez wizualizację komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym. W dniu załadunku upewnić się, że EC osiągnęły 80%-10% konfluencji, natomiast NHLF są subkonfluencyjne na poziomie 70%-80%.
  2. Przygotowanie fibrynogenu
    1. Przygotować roztwór fibrynogenu o pożądanej stężeniu (zazwyczaj 5-8 mg/mL wspomaga tworzenie stabilnej sieci naczyniowej), uwzględniając procent krzepnięcia fibrynogenu. Obliczyć ilość potrzebnego fibrynogenu za pomocą następującego równania:
      Fibrynogen (mg) = (objętość (mL)) x (stężenie (mg/mL))/ (procent krzepnięcia)
    2. Rozpuścić fibrynogen w odpowiedniej objętości podstawowej pożywki dla komórek śródbłonka 2 (EBM2), ogrzanej do 37 °C, delikatnie stukując probówkę (nie używać mieszadła vortex). Inkubować fibrynogen w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby całkowicie go rozpuścić. Ważne: nie używać pożywki pełnej.
    3. Przefiltrować sterylnie roztwór fibrynogenu przez filtr 0,2 µm i podzielić na porcje o pożądanej objętości, zazwyczaj 40 µL na probówkę do mikrocentryfugi.
      ​UWAGA: Do mieszaniny fibrynogenu można dodać inne białka macierzy (np. kolageny, fibronektynę lub lamininę).

3. Nakładanie próbek

UWAGA: Załadunek jest ograniczony czasowo i powinien zostać przeprowadzony od początku (odrywanie komórek) do końca (dodanie medium do urządzeń) w ciągu około 1,5-1,75 h, aby zapewnić optymalne wyniki. Każdy krok jest opisany z sugerowanym czasem trwania, co ma pomóc użytkownikowi w zachowaniu harmonogramu.

  1. Przygotowanie materiałów (dzień ładowania)
    1. Umieścić następujące elementy w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 min: zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) lub bufor fosforanowy (PBS) do mycia komórek, odczyn do dysocjacji komórek, pożywki (np. EGM2, DMEM)
    2. Przechowywać następujące odczynniki w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu użycia: trombinę, lamininę (rozmrożoną przez noc w 4 °C).
    3. Rozmrozić alikwotyy fibrynogenu w temperaturze pokojowej. Przygotować alikwoty trombiny o objętości 1,5 µL w probówkach mikrocentryfugacyjnych 50 µL, po jednej probówce na każdą jednostkę urządzenia. Należy upewnić się, że alikwot trombiny znajduje się na dnie każdej probówki, aby ułatwić ładowanie.
    4. Umieścić sterylizowane promieniami UV płytki wysokoprzepustowe w desykatorze na co najmniej 30 min przed ładowaniem, aby usunąć powietrze uwięzione w układzie mikrofluidycznym.
  2. Przygotowanie komórek (start stopera = 0 min)
    1. Sprawdzić komórki pod mikroskopem przy powiększeniu 4x, aby potwierdzić stopień konfluencji i wydajność transdukcji.
    2. Przemyć każdą kolbę T75 z komórkami 2x przy użyciu 5 mL HBSS i całkowicie odessać płyn. Dodać 1 mL odczynu do dysocjacji do każdej kolby i inkubować w 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 min.
    3. Delikatnie opukać płytkę wnętrzem dłoni i sprawdzić, czy wszystkie komórki zostały oderwane.
    4. Wymyć komórki z kolby za pomocą 9 mL odpowiedniej pożywki i zebrać je do probówki stożkowej 15 mL. Natychmiast pobrać niewielki alikwot do liczenia komórek.
    5. Odwirować komórki przy 30 x g przez 3-5 min w 4 °C. W czasie wirowania policzyć komórki. Konfluentna kolba T75 z EC lub NHLF powinna dostarczyć co najmniej 2 x 106 komórek.
    6. Po wirowaniu odessać pożywkę i resuspender osad w odpowiedniej pożywce do stężenia 1 x 106 komórek/mL. Przechowywać komórki na lodzie.
  3. Przygotowanie mieszaniny komórek i fibrynogenu (stoper = start w 20 min)
    1. Ustalić liczbę urządzeń do załadowania, dodając 1-2 zapasowo na straty podczas pipetowania, i pomnożyć przez objętość mieszaniny komórek/fibrynogenu potrzebną na jedno urządzenie. Zależy to od konfiguracji urządzenia, ale dla projektu przedstawionego w tym artykule wymagane jest 6 µL na urządzenie.
    2. Stężenie każdego typu komórek należy ustalić eksperymentalnie. Jako punkt wyjścia zastosować EC w stężeniu około 7 x 106 komórek/mL oraz NHLF w stężeniu 3,5 x 106 komórek/mL. Stężenie komórek nowotworowych może znacznie się różnić w zależności od tempa ich wzrostu, ale zazwyczaj mieści się w zakresie 0,5-2 x 106 komórek/mL. Użyć poniższego równania do obliczenia potrzebnej liczby komórek:
      Liczba potrzebnych komórek = (objętość fibryny (µL))/100 µL x (stężenie komórek)
    3. Resuspender komórki do stężenia 1 x 106 komórek/mL i użyć poniższego równania, aby wyznaczyć potrzebną objętość komórek:
      Potrzebna objętość komórek (µL) = (liczba potrzebnych komórek)/10
    4. Zmieszać odpowiednie objętości EC, NHLF i komórek nowotworowych (tylko dla VMT) w probówce stożkowej i wirować przy 30 x g przez 3-5 min w 4 °C.
    5. Po wirowaniu ostrożnie odessać pożywkę i wypipetować resztki pożywki znajdujące się w pobliżu osadu. Delikatnie, ale dokładnie resuspender osad w obliczonej objętości fibrynogenu, dbając szczególnie o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przechowywać na lodzie.
    6. Przenieść sterylizowane płytki i alikwoty trombiny do komory dygestorium.
  4. Ładowanie urządzeń (stoper = start w 30-35 min)
    1. Za pomocą pipety P20 pobrać 6 µL mieszaniny komórek/fibryny. Należy co najmniej 5x pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Przechowywać mieszaninę na lodzie, aby spowolnić krzepnięcie.
    2. Delikatnie zmieszać komórki/fibrynę z jedną probówką trombiny, wprowadzając końcówkę pipety bezpośrednio do alikwotu trombiny na dnie probówki. Natychmiast pipetować w górę i w dół co najmniej 2x, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Fibryna zacznie krzepnąć po zmieszaniu z trombiną, dlatego należy szybko, ale uważnie wykonać kroki 3.4.3. i 3.4.4., zanim fibryna zżeluje w końcówce pipety (~3 s).
    3. Unieść płytkę wysokoprzepustową pod kątem i szybko wprowadzić końcówkę pipety do jednego z portów ładowania urządzenia (L1 lub L2). Patrz Rysunek 2A w celu zapoznania się ze schematem.
    4. Płynnym, jednostajnym ruchem nacisnąć tłok pipety do pierwszego stopnia, aby wstrzyknąć mieszaninę komórek/fibryny do komory tkankowej. Obserwować, czy żel całkowicie wypełnił komorę.
      UWAGA: Zastosowanie zbyt dużego nacisku w tym kroku może doprowadzić do wciśnięcia żelu do kanałów mikrofluidycznych na górze i/lub na dole komór tkankowych.
    5. Delikatnie położyć płytkę płasko w dygestorium, nie wyjmując końcówki pipety, nie zwalniając tłoka i nie poruszając pipetą. Przekręcić i zdjąć końcówkę z pipety P20 ręką, pozostawiając ją w otworze portu ładowania. Nie używać przycisku wypychania do usunięcia końcówki, ponieważ spowoduje to zbyt duży nacisk.
    6. Powtórzyć kroki 3.4.1-3.4.5 dla pozostałych urządzeń.
    7. Po zakończeniu ładowania pozostawić płytkę na 2 min bez ruchu w dygestorium.
    8. Usunąć końcówki pipet, delikatnie wykręcając i wyciągając je z portów ładowania. Nałożyć pokrywkę na płytkę.
    9. Inkubować całą płytkę przez 15-20 min w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić pełną polimeryzację żelu.
    10. Po inkubacji sprawdzić każdą jednostkę urządzenia pod mikroskopem. Upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w całej komorze bez pęcherzyków powietrza oraz że między komorą tkankową a kanałami mikrofluidycznymi istnieje wyraźna granica żelu, jak na Rysunku 2B-C.
  5. Powlekanie kanałów lamininą (stoper = start w 45-50 min)
    1. Po całkowitym stwardnieniu żelów wprowadzić lamininę do kanałów mikrofluidycznych, aby wspomóc anastomozę naczyniową.
    2. Za pomocą P20 wprowadzić 4 µL lamininy do każdego kanału mikrofluidycznego (górnego i dolnego) urządzenia. Wprowadzić końcówkę pipety do M1 lub M3 i powoli podać lamininę, upewniając się, że powleka ona cały górny kanał, a następnie powtórzyć dla M2 lub M4, aby powlec cały dolny kanał.
    3. Ustalić orientację, pipetując lamininę ze strony przeciwnej do regulatora ciśnienia, aby zapewnić odpowiednie ciśnienie do jej przepchnięcia. Jeśli jednak laminina nie przemieszcza się łatwo z jednej strony, usunąć końcówkę z jednej strony i przepchnąć lamininę z drugiej. Może być konieczne naciśnięcie tłoka pipety do drugiego stopnia, aby wytworzyć ciśnienie wystarczające do przepchnięcia lamininy przez cały kanał.
    4. Delikatnie usunąć końcówkę z wlotu/wylotu pożywki. Nie używać przycisku wypychania w P20.
    5. Powtórzyć kroki 3.5.1-3.5.4 dla każdego urządzenia i inkubować płytkę w 37 °C, 5% CO2 przez 10 min.
  6. Dodawanie pożywki (stoper = start mniej więcej w 1 h 10 min)
    1. Dodać 275 µL pełnej pożywki EGM2 do niepołączonych zbiorników z pożywką w dołkach w rzędach A i B lub G i H. Będzie to strona o wysokim poziomie; orientację należy ustalić, sprawiając, że dołki po stronie przeciwnej do regulatora ciśnienia będą miały początkowo większą objętość. Pożywka będzie spływać ze strony wysokiej pod wpływem grawitacji.
    2. Za pomocą pipety P20 wprowadzić 75 µL pożywki do wlotów/wylotów pożywki w dołkach zawierających 275 µL EGM2. Wprowadzić końcówkę do otworu wlotowego pożywki i powoli podać pożywkę, obserwując, czy przemieszcza się ona przez kanał i pojawia się po drugiej stronie.
    3. Usunąć końcówkę pipety i wprowadzić pozostałą w niej pożywkę do zbiornika, tak aby całkowita objętość po stronie wysokiej wynosiła 350 µL.
    4. Powtórzyć kroki 3.6.1-3.6.3 dla każdej jednostki urządzenia, w kanałach górnych i dolnych.
    5. Dodać 50 µL pożywki, aby całkowicie pokryć stronę niską (dołkach w rzędach A i B lub G i H), zależnie od opisanej powyżej orientacji. Upewnić się, że dno dołka jest pokryte równą warstwą pożywki. Patrz Rysunek 2D w celu zapoznania się ze schematem przedstawiającym objętości pożywki w zbiornikach.
  7. Usuwanie pęcherzyków powietrza (po ładowaniu)
    UWAGA: Usuwanie pęcherzyków jest krytycznym krokiem zapewniającym prawidłowy przepływ w każdym urządzeniu. W 2. dniu komórki endotelialne i fibroblasty zaczną się wydłużać w odpowiedzi na przepływ (Rysunek 2E).
    1. Po dodaniu całej pożywki inkubować płytki przez 1-2 h w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 przed sprawdzeniem obecności pęcherzyków powietrza w kanałach lub przy wlotach/wylotach pożywki.
    2. Zlokalizować pęcherzyki w kanałach pożywki pod mikroskopem i usunąć je poprzez ponowne wprowadzenie 75 µL pożywki do kanałów w celu wypchnięcia pęcherzyków na zewnątrz.
    3. Zlokalizować pęcherzyki wlotach/wylotach pożywki gołym okiem. Użyć pipety P20 do usunięcia pęcherzyków powietrza uwięzionych wlotach i wylotach pożywki poprzez naciśnięcie tłoka, wprowadzenie końcówki do otworu i wyciągnięcie pęcherzyka poprzez uniesienie tłoka w celu zastosowania podciśnienia i zasysania pęcherzyka.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schemat ładowania urządzenia. (A) Za pomocą pipety P20 mieszanina komórek i fibryny jest wprowadzana do komory tkankowej każdej jednostki urządzenia przez jeden z portów ładowania. (B) Mikrografia w jasnym polu przedstawia urządzenie mikroprzepływowe załadowane EC, fibroblastami i komórkami rakowymi w celu utworzenia VMT. Pasek skali = 50 µm. (C) Mikrografia fluorescencyjna urządzenia z punktu B, przedstawiająca EC na czerwono, guz na cyjanowo i fibroblasty na niebiesko. (D) Schemat przedstawia dodawanie pożywki do zbiorników, z 350 µL po stronie wysokiej i 50 µL po stronie niskiej w celu wygenerowania różnicy ciśnień hydrostatycznych. (E) 2. dzień hodowli VMT pokazuje fibroblasty i EC zaczynające się rozciągać w celu utworzenia sieci naczyniowej. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Konserwacja urządzenia i zastosowania eksperymentalne

  1. Konserwacja i leczenie farmakologiczne
    UWAGA: Aby utrzymać przepływ w systemie, ciśnienie hydrostatyczne musi być przywracane codziennie poprzez pipetowanie objętości medium ze strony niskiego ciśnienia z powrotem do strony wysokiego ciśnienia lub odwrotnie, zapewniając, aby całkowita objętość po stronie wysokiego ciśnienia wynosiła 350 µL. Kierunek przepływu jest zmieniany codziennie po drugim dniu tworzenia VMO lub VMT. Dodatkowe szczegóły dotyczące konserwacji i leczenia podano poniżej.
    1. Wymieniać medium co drugi dzień na kompletne EGM2, aż naczynia zostaną w pełni uformowane (dzień 5-6). Całkowicie odessać stare medium i uzupełnić studzienki wysokiego ciśnienia (350 µL) oraz studzienki niskiego ciśnienia (50 µL).
      UWAGA: Dla innych typów komórek można przeprowadzić eksperymentalne oznaczenie zoptymalizowanych składów mediów, co często obejmuje mieszankę 50:50 lub dodanie specyficznych komponentów do EGM2.
    2. Gdy sieć naczyniowa zostanie utworzona, a tkanka w pełni rozwinięta (dzień 4-7), przed użyciem urządzeń w eksperymentach należy przeprowadzić test perfuzji dekstranem (krok 4.2.1.). Należy używać tylko tych urządzeń, które wykazują wystarczającą perfuzję do komory tkankowej.
    3. W przypadku eksperymentów z zastosowaniem terapeutyków, w dniu rozpoczęcia leczenia należy wykonać zdjęcia we wszystkich kanałach fluorescencyjnych dla każdego urządzenia. Posłuży to jako poziom bazowy.
    4. Traktować urządzenia wybranym terapeutykiem, zastępując medium świeżym medium zawierającym rozcieńczony lek w pożądanej stężeniu. Należy upewnić się, że leki są rozcieńczone w odpowiednich rozpuszczalnikach zgodnie z zaleceniami producenta, jednak stężenie DMSO w mediach nie może przekroczyć 0,01%.
    5. Narażać urządzenia na działanie leku przez pożądany czas (zazwyczaj 48 h, ale czas ten może być dostosowany do farmakokinetyki).
    6. Obrazować każdy kanał każdego urządzenia w pożądanych odstępach czasu, aby monitorować odpowiedź na leczenie. Przechowywać płytki zgodnie ze wskazówkami w kroku 4.1.1 przez cały czas trwania eksperymentu.
    7. Po zakończeniu eksperymentu płytki należy wybielić i umieścić w pojemniku na odpady biologiczne, utrwalić 4% PFA do barwienia immunofluorescencyjnego (krok 4.3.) lub zebrać do izolacji żywych komórek lub RNA (krok 4.4.).
  2. Testy perfuzji
    1. Perfuzja dekstranu
      UWAGA: Przepuszczalność/drożność naczyniową można określić poprzez perfuzję sieci naczyniowej znakowanym fluorescencyjnie dekstranem o różnych masach cząsteczkowych (40 kD, 70 kD lub 150 kD). W zależności od znacznika fluorescencyjnego EC można stosować dekstran z FITC lub rodaminą.
      1. Przed perfuzją należy określić odpowiednią ekspozycję kanału FITC lub rodaminy, dodając kilka µL dekstranu do kanału płynnego lub komory pustego urządzenia. Ustawić czas ekspozycji tuż poniżej poziomu nasycenia, korzystając z oprogramowania mikroskopu do wyświetlenia histogramu intensywności pikseli, zapewniając zakres dynamiczny charakteryzujący się równomiernie rozłożonymi pikselami bez wyraźnej koncentracji wartości o wysokiej intensywności.
      2. Wyonać mikrografie wszystkich urządzeń w interesujących kanałach, w tym obraz tła wszystkich urządzeń w fluorescencyjnym kanale dekstranu, aby przeprowadzić kalibrację względem tła. Użyć tej samej ekspozycji, co określono powyżej, i wyśrodkować komorę tkankową w ramce obrazu, aby zapewnić spójność obrazów do kwantyfikacji.
      3. Przygotować główny roztwór stokowy FITC-dekstranu lub rodaminy-dekstranu o stężeniu 5 mg/mL w 1x DPBS. Roztwór ten można przechowywać w 4 °C.
      4. Aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńczyć roztwór stokowy 5 mg/mL do końcowego stężenia 50 µg/mL w EGM2.
      5. Zastąpić media w rezerwuarach rozcieńczonym roztworem dekstranu jako połowę maksymalnej objętości (175 µL do jednej studzienki jako stronę wysokiego ciśnienia w górnym lub dolnym kanale komory tkankowej). Zastąpić media w pozostałych studzienkach w taki sposób, aby niepołączona strona wysokiego ciśnienia otrzymała 175 µL świeżego EGM2 bez dekstranu, a studzienki po stronie niskiego ciśnienia miały tylko po 50 µL każda.
        UWAGA: Dekstran należy dodawać tylko po jednej stronie kanałów mikroprzepływowych (górnej lub dolnej), aby umożliwić wizualizację barwnika przemieszczającego się przez stronę wysokiego ciśnienia, do łoża naczyniowego i na zewnątrz przez stronę niskiego ciśśnienia.
      6. Pod mikroskopem obserwować przepływ fluorescencyjnego dekstranu przez sieć naczyniową. Zazwyczaj dzieje się to w ciągu około 2 min po dodaniu barwnika do rezerwuaru medium.
      7. Rozpocząć obrazowanie kanału fluorescencyjnego dekstranu (oraz innych kanałów, jeśli jest to pożądane). Jest to punkt czasowy T = 0. Wykonać dodatkowe obrazy w wielu punktach czasowych (zazwyczaj co 10 min) lub pojedynczy obraz końcowy.
    2. Perfuzja komórek
      UWAGA: W zależności od projektu badania przez naczynia można przeprowadzać perfuzję różnych typów komórek, w tym limfocytów lub makrofagów w badaniach immunologii nowotworów, a także komórek nowotworowych w badaniach przerzutów. Komórki muszą być znakowane fluorescencyjnie, aby umożliwić ich śledzenie w czasie.
      1. Przynajmniej 2 h przed perfuzją komórek przeprowadzić perfuzję dekstranu we wszystkich urządzeniach zgodnie z powyższym opisem. Krok ten jest istotny dla określenia drożności naczyń przed dodaniem komórek.
      2. Określić odpowiednią ekspozycję kamery dla perfundowanych komórek. Pobrać niewielką próbkę komórek do oględzin pod mikroskopem i ustawić czas ekspozycji dla danego markera fluorescencyjnego. Ustawić czas ekspozycji tuż poniżej poziomu nasycenia.
      3. Wykonać mikrografie wszystkich urządzeń w interesujących kanałach, w tym obraz tła wszystkich urządzeń w fluorescencyjnym kanale dekstranu, aby przeprowadzić kalibrację względem tła. Użyć tej samej ekspozycji, co określono w kroku 4.2.2.1.
      4. Potwierdzić, że dekstran całkowicie zdyfundował z komór tkankowych przed pobraniem komórek do perfuzji. Zebrać i przeliczyć interesujące komórki.
      5. Resuspender komórki z odpowiednią gęstością w EGM2. Na przykład limfocyty T są zazwyczaj dodawane w stężeniu około 1 x 106 komórek/mL, aby naśladować stężenie we krwi.
        UWAGA: EC są wrażliwe na skład mediów, ale mogą tolerować mieszankę do 50% z większością innych mediów. Przetestować wcześniej.
      6. Dodać 175 µL zawiesiny komórkowej do jednej studzienki po stronie wysokiego ciśnienia każdego urządzenia i dodać 175 µL kompletnego EGM2 do drugiej studzienki. Po stronie niskiego ciśnienia dodać 50 µL kompletnego medium EGM2 do obu studni.
      7. Pod mikroskopem obserwować przepływ fluorescencyjnych komórek przez sieć naczyniową. Zazwyczaj dzieje się to w ciągu około 2 min po dodaniu komórek do rezerwuaru medium.
      8. Po ustanowieniu przepływu komórek rozpocząć obrazowanie kanału fluorescencyjnego komórek (oraz innych kanałów, jeśli jest to pożądane). Jest to punkt czasowy T = 0. Wykonać dodatkowe obrazy w wielu punktach czasowych lub pojedynczy obraz końcowy, w zależności od projektu badania. Na przykład obrazowanie co 10 min pozwoli uzyskać przebiegi czasowe o wysokiej rozdzielczości, a obrazowanie co 6-12 h umożliwi śledzenie okresowych ruchów komórek.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
    1. Odessać media ze studzienek. Dodać 20 µL 4% PFA do obu studni strony wysokiego ciśnienia każdego urządzenia oraz 50 µL do strony niskiego ciśnienia. Pozostawić PFA do przepłynięcia przez komory przez 15 min w temperaturze pokojowej lub 30 min w 4°C.
    2. Podczas inkubacji przygotować płytkę 24-dołkową z 50 µL 1x PBS na studnią. Obliczyć, ile studni jest potrzebnych do zabarwienia każdego urządzenia.
    3. Całkowicie usunąć PFA ze studni. Odwrócić płytkę do góry dnem i ostrożnie usunąć plastikową warstwę wspierającą membranę.
      UWAGA: Barwienie IF można również przeprowadzić in situ bez usuwania membrany i urządzenia. W tym celu kroki barwienia należy przeprowadzać poprzez perfuzję reagentów przez VMO/VMT, zwiększając czas każdego etapu inkubacji około 6-krotnie.
    4. Bardzo delikatnie i ostrożnie oddzielić dolną warstwę membrany od warstwy funkcjonalnej urządzenia, aby odsłonić komory tkankowe, chwytając oba rogi i ciągnąc w dół powolnym, płynnym ruchem. Większość tkanki powinna pozostać w komorze tkankowej. Patrz Rysunek 3A.
    5. Użyć żyletki lub skalpela, aby przyłożyć wystarczającą siłę do całkowitego przecięcia warstwy funkcjonalnej i wyciąć mały prostokąt wokół każdego pojedynczego urządzenia, jak pokazano na Rysunku 3B.
    6. Wsunąć szpatułkę między warstwę funkcjonalną a płytkę z dołkami. Przyłożyć delikatny nacisk pod warstwą funkcjonalną, aby ostrożnie usunąć całą warstwę funkcjonalną zawierającą komorę tkankową z płytki.
    7. Umieścić każdy prostokątny kawałek warstwy funkcjonalnej PDMS zawierający tkankę stroną tkankową do dołu w pojedynczej studni zawierającej PBS.
    8. Gdy wszystkie jednostki znajdą się w studniach, przemyć PBS, umieszczając płytkę na łagodnym wstrząsacoorotowym przez 5 min, odsysając PBS ze studni i zastępując go 50 µL świeżego PBS. Powtórzyć łącznie 3 razy.
    9. Odessać PBS z każdej studni i przepuścić tkanki 50 µL 0,5% Triton-X w PBS, 2 razy po 10 min każdorazowo na łagodnym wstrząsacoorotowym. Usunąć roztwór permeabilizujący.
    10. Blokować w 500 µL 10% surowicy w 0,1% Triton-X na urządzenie przez 1 h w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu.
    11. Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne w 3% surowicy w 0,1% Triton-X do pożądanego stężenia i objętości. Usunąć roztwór blokujący i dodać tyle roztworu przeciwciał pierwotnych, aby całkowicie pokryć dno każdej studni i umożliwić swobodny ruch tkanek urządzenia (~20 µL). Przykryć płytkę przezroczystą folią.
    12. Inkubować płytkę na wstrząsacoorotowym przez noc w 4 °C. Następnego dnia doprowadzić płytkę z tkankami urządzeń z powrotem do temperatury pokojowej (~15 min).
    13. Odessać roztwór przeciwciał pierwotnych z każdej studni i przemyć komory 50 µL PBS, 3 razy po 5 min każdorazowo na łagodnym wstrząsacoorotowym.
    14. Dodać 20 µL przeciwciał wtórnych w 3% surowicy w 0,1% Triton-X w pożądanym stężeniu. Inkubować płytkę przy łagodnym wstrząsaniu przez 1 h w temperaturze pokojowej w ciemności.
    15. Odessać roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć PBS, 3 razy po 5 min każdorazowo przy łagodnym wstrząsaniu. Dodać roztwór 1x DAPI w 0,1% Triton-X na 10 min podczas wstrząsania w ciemności.
    16. Usunąć prostokątne wycięcia z urządzeń zawierające zabarwione tkanki z płytki za pomocą pęsety i położyć je stroną tkankową do góry na ręczniku papierowym.
    17. Napipetować kilka µL (~10 µL) roztworu antywyblakającego bezpośrednio na każdą komorę i szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pozostawić roztwór antywyblakający do utrwalenia na komorach przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie przystąpić do obrazowania.
  4. Izolacja tkanek i komórek do analiz molekularnych
    UWAGA: Każda płytka o wysokiej przepustowości będzie zawierać około 1-2 x 105 komórek, w zależności od punktu czasowego zbioru. Skalować liczbę powtórzeń eksperymentalnych, aby uwzględnić całkowitą liczbę komórek oraz potencjalne straty podczas zbioru.
    1. Analizy pojedynczych komórek
      1. Odessać media z każdej studni i odwrócić płytkę o wysokiej przepustowości tak, aby warstwa urządzenia była skierowana do góry.
      2. Usunąć plastikową warstwę wspierającą membranę. Bardzo delikatnie i ostrożnie oddzielić dolną membranę PDMS od warstwy funkcjonalnej urządzenia, aby odsłonić komory tkankowe, chwytając oba rogi i ciągnąc w dół powolnym, płynnym ruchem.
      3. Membrana może zostać usunięta nawet przy prawidłowym połączeniu. Większość tkanki powinna pozostać w komorze tkankowej po usunięciu membrany; jeśli jednak jakakolwiek część przyklei się do membrany, należy wykonać poniższe kroki na samej membranie.
      4. Przemyć każdą jednostkę urządzenia 50 µL HBSS lub PBS. Do każdej jednostki urządzenia dodać 10 µL reagentu dysocjującego i pozostawić go w formie kropli na górze urządzenia. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze 37 °C na 5 min.
      5. Po trawieniu użyć pipety P20 do pipetowania w górę i w dół w komorach tkankowych i zebrać tkanki w reagencie dysocjującym. Przesuwać końcówkę pipety w przód i w tył w każdym urządzeniu, aby zapewnić całkowite usunięcie tkanki, i zebrać ją do probówki stożkowej 15 mL z 500 µL EGM2 w celu neutralizacji reagentu dysocjującego.
      6. W celu całkowitego usunięcia pozostałych komórek z komory tkankowej dodać 500 µL EGM2 do każdej jednostki urządzenia i przemyć za pomocą pipety P20.
      7. Wirować roztwór z trawienia zawierający oderwane tkanki przy 30 x g przez 5 min w 4 °C, aby uzyskać osad z pojedynczych komórek i całych tkanek.
      8. Ostrożnie odessać media i dodać do tkanek 50 µL kolagenazy typu IV (1 mg/mL, 20 U/mL), hialuronidazy typu V (0,1 mg/mL) oraz DNazy typu IV (20 U/mL) w HBSS.
      9. Po delikatnej resuspensji pozostawić roztwór przez 2 min w temperaturze pokojowej przed ponownym delikatnym pipetowaniem w celu dysocjacji żelu.
      10. Przemyć mieszaninę z trawienia 10 mL EGM2 i wirować przy 30 x g przez 5 min w 4 °C. Resuspender komórki w 1x DPBS z 1% BSA lub HSA i przepuścić przez uprzednio zwilżony filtr 70 µm, wirując przy 20 x g przez 1 min.
      11. Przeliczyć komórki i dostosować objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 10 komórek na µL. Zawiesiny komórkowe można następnie poddać FACS, cytometrii przepływowej lub sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek.
    2. Izolacja RNA z całych tkanek
      1. Postępować zgodnie z powyższymi krokami 4.4.1.1 i 4.4.1.2.
      2. Dodać około 10 µL buforu do lizy RNA na każdą odsłoniętą komorę tkankową, zapewniając, że bufor gromadzi się bezpośrednio na tkankach. Nie używać więcej niż 10 µL buforu do lizy RNA łącznie.
      3. Inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej. Użyć pipety P20 do pipetowania w górę i w dół w każdej jednostce urządzenia i w razie potrzeby użyć końcówki pipety do zeskrobania resztek materiału z komory tkankowej.
      4. Przenieść jak największą ilość buforu do lizy do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Powtórzyć kroki 4.4.2.2.-4.4.2.3. dla pozostałych urządzeń i połączyć próbki w probówce 1,5 mL.
      5. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji RNA, w zależności od zestawu lub reagentów.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przygotowanie platformy do immunobarwienia. (A) Schemat w pełni zmontowanej platformy urządzenia z warstwą błony na górze. Aby usunąć błonę, należy ostrożnie i powolnym, delikatnym ruchem odciągnąć każdy narożnik zewnętrznej warstwy w dół. (B) Po całkowitym usunięciu warstwy błony należy użyć ostrza, skalpela lub noża, aby wyciąć prostokąty wokół komory tkankowej każdej jednostki urządzenia, dbając o to, by nie przeciąć samej tkanki. Następnie pod każdy prostokąt można wsunąć szpatułkę, aby oddzielić go od płyty i umieścić każdą jednostkę w pojedynczym dołku płytki 24-dołkowej z PBS do barwienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z opisanymi tutaj protokołami, opracowano VMO i VMT, wykorzystując komercyjnie zakupione EC, NHLF oraz, w przypadku VMT, linię komórek raka piersi potrójnie ujemnego MDA-MB-231. W celu symulacji przerzutów w opracowanych VMO przeprowadzono perfuzję komórek nowotworowych. W każdym modelu, do 5. dnia kokultury, w odpowiedzi na przepływ napędzany grawitacyjnie przez komorę tkankową samoistnie tworzy się sieć naczyniowa, która służy jako kanał do dostarczania składników odżywczych, środków terapeutycznych oraz komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Prawie każda tkanka w organizmie otrzymuje składniki odżywcze i tlen poprzez układ naczyniowy, co czyni go krytycznym komponentem w realistycznym modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków in vitro. Co więcej, szereg nowotworów i stanów chorobowych definiuje dysfunkcja oraz nadmierna przepuszczalność śródbłonka naczyniowego3. W szczególności w przypadku nowotworów naczynia związane z guzem są często słabo ukrwione, przerwane i nieszczelne, przez co stanowią barierę dla dostarczani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

CCWH posiada udziały w spółce Aracari Biosciences, Inc., która komercjalizuje wersję technologii opisanej w tym artykule. Warunki tego porozumienia zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w Irvine, zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów. Nie ma innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium dr Christophera Hughesa za ich cenny wkład w opisane procedury, a także naszym współpracownikom z laboratorium dr Abrahama Lee za pomoc w projektowaniu i produkcji platformy. Prace te zostały wsparte przez następujące granty: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) oraz TL1 TR001415 i W81XWH2110393 (SJH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja
(3-merkaptopropylo)trimetoksysilan, 95% Sigma-Aldrich175617-100G
Greiner Bio-One  μ Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki polistyrenoweGreiner Bio-One655096
metanol ≥ 99,8% ACSVWR Chemicals BDHBDH1135-1LP
MILTEX Sterylny jednorazowy dziurkacz do biopsji z tłokiem, średnica 1 mm,membrana Integra Miltex33-31AA-P/25
PDMSPAX IndustriesHT-6240
Środek do czyszczenia plazmy PDC-001Harrick PlasmaN/A
Smooth-Cast 385Smooth-OnN/A
SP Bel-Art Lab Companion Przezroczysty eksykator próżniowy z poliwęglanuBel-ArtF42400-4031
Standardowe pokrywki z pierścieniami kondensacyjnymi, płytka 96-dołkowaVWR82050-827
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)Dow4019862
Hodowla komórkowa/Ładowanie
BioTek Lionheart FX Zautomatyzowany MikroskopAgilent 
CELLvo Ludzkie śródbłonkowe komórki progenitoroweStemBioSysN/A
Kolagen I, ogon szczuraEnzo Life Sciences
Kolagenaza z Clostridium histolyticum (typ 4)Sigma-AldrichC5138
Corning Hank' s Zrównoważony roztwór soli, 1X bez wapnia i magnezuCorning21-021-CV
Corning  DMEM z L-Glutaminą, 4,5 g / L Glukoza i pirogronian soduCorning10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fibrynogen z osocza bydlęcegoNeta ScientificSIAL-341573
Fibronektyna osocze ludzkieSigma-AldrichF0895
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran (70kDa)Sigma-AldrichFD70S-1G
Żelatyna ze skóry świńskiejSigma-AldrichG1890
Hialuronidaza z jąder owiec (typ 4)Sigma-AldrichH6254
Laminin Mouse ProteinGibco23017015
Leica TCS SP8LeicaN/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – Normalne ludzkie fibroblasty płucLonzaCC-2512
Nikon Eclipse TiNikonN/A
Paraformaldehyd 4% w 0,1M buforze fosforanowym Solanka, pH 7,4Mikroskopia elektronowa Nauki 15735-90-1L
PBMCs - Jednojądrzaste komórki krwi obwodowejLonzaCC-2702
PBS, pH 7,4Gibco10010049
Premium Grade płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznieAvantor Seradigm97068-091
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144
Zestaw do mikroprzygotowania Quick-RNAZymo BadaniaR1051
Trombina z osocza bydlęcegoSigma-AldrichT4648
Triton X-100 (elektroforeza),Fisher BioReagentsBP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowaGibco12605028
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300062
VasculifeLifeline Cell TechnologiaLL-0003
CYT5MFAW

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
  4. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
  5. Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
  6. Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).
  7. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  8. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589(2016).
  9. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  10. Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
  11. Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
  12. Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601(2020).
  13. Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760(2022).
  14. Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
  15. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  16. Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
  17. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
  18. Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
  19. Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  22. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385(2011).
  23. Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618(2020).
  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Unaczyniony mikroguzmikro rodowisko guzaplatforma mikrofluidycznachip nowotworowyprzep yw dynamicznykom rki r db onkaekstrawazacja kom rek odporno ciowychmedycyna personalizowanaheterogeniczno guzaobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ci
Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.