Artykuł metodologiczny

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

DOI:

10.3791/65865

⸱

15 września 2023

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak potwierdzonych modeli raka, które podsumowują mikrośrodowisko nowotworów litych in vitro, pozostaje znaczącym wąskim gardłem dla przedklinicznych badań nad rakiem i rozwoju terapeutycznego. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy unaczyniony mikroguz (VMT), czyli chip nowotworowy, system mikrofizjologiczny, który realistycznie modeluje złożone mikrośrodowisko ludzkiego guza. VMT tworzy się de novo w platformie mikroprzepływowej poprzez wspólną hodowlę wielu typów komórek ludzkich w dynamicznych, fizjologicznych warunkach przepływu. Ten inżynieryjny konstrukt mikroguza zawiera żywą, perfundowaną sieć naczyniową, która podtrzymuje rosnącą masę guza, tak jak robią to nowo powstałe naczynia in vivo. Co ważne, leki i komórki odpornościowe muszą przejść przez warstwę śródbłonka, aby dotrzeć do guza, modelując in vivo fizjologiczne bariery dla dostarczania i skuteczności terapii. Ponieważ platforma VMT jest optycznie przezroczysta, obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamicznych procesów, takich jak wynaczynienie komórek odpornościowych i przerzuty, można uzyskać dzięki bezpośredniej wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie komórek w tkance. Co więcej, VMT zachowuje heterogeniczność guza in vivo, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki. Praktycznie każdy typ guza może być dostosowany do platformy, a pierwotne komórki ze świeżych tkanek chirurgicznych rosną i reagują na leczenie farmakologiczne w VMT, torując drogę do prawdziwie spersonalizowanej medycyny. W tym miejscu przedstawiono metody tworzenia VMT i wykorzystywania go do badań onkologicznych. To innowacyjne podejście otwiera nowe możliwości badania nowotworów i reakcji na leki, dostarczając naukowcom potężnego narzędzia do rozwoju badań nad rakiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak pozostaje głównym problemem zdrowotnym na całym świecie i jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Tylko w 2023 roku National Center for Health Statistics przewiduje ponad 1,9 miliona nowych przypadków raka i ponad 600 000 zgonów z powodu raka w USA1, podkreślając pilną potrzebę skutecznych metod leczenia. Jednak obecnie tylko 5,1% leków przeciwnowotworowych wchodzących w badania kliniczne ostatecznie uzyskuje aprobatę FDA. Niepowodzenie obiecujących kandydatów w pomyślnym przejściu przez badania kliniczne można częściowo przypisać zastosowaniu niefizjologicznych systemów modelowych, takich jak hodowle 2D i sferoidalne, podczas przedklinicznego opracowywania leków2. W tych klasycznych modelach nowotworowych brakuje istotnych składników mikrośrodowiska guza, takich jak nisza zrębowa, związane z nią komórki odpornościowe i perfundowane naczynia krwionośne, które są kluczowymi determinantami oporności terapeutycznej i progresji choroby. W związku z tym nowy system modelowy, który lepiej naśladuje ludzkie mikrośrodowisko guza in vivo, jest niezbędny do poprawy klinicznego przełożenia wyników przedklinicznych.

Dziedzina inżynierii tkankowej szybko się rozwija, dostarczając ulepszonych metod badania chorób ludzkich w warunkach laboratoryjnych. Jednym ze znaczących osiągnięć jest pojawienie się systemów mikrofizjologicznych (MPS), znanych również jako chipy narządowe lub chipy tkankowe, które są funkcjonalnymi, zminiaturyzowanymi ludzkimi narządami zdolnymi do replikacji zdrowych lub chorych warunków3,4,5. W tym kontekście, chipy nowotworowe, które są trójwymiarowymi, opartymi na mikroprzepływach modelami ludzkich nowotworów in vitro, zostały opracowane do badań onkologicznych2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Te zaawansowane modele uwzględniają sygnały biochemiczne i biofizyczne w dynamicznym mikrośrodowisku guza, umożliwiając naukowcom badanie zachowania guza i reakcji na leczenie w bardziej fizjologicznie odpowiednim kontekście. Jednak pomimo tych postępów, niewiele grup z powodzeniem wprowadziło żywy, funkcjonalny układ naczyniowy, szczególnie taki, który sam tworzy wzorce w odpowiedzi na przepływ fizjologiczny3,4,5,6. Włączenie funkcjonalnej sieci naczyniowej ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala na modelowanie barier fizycznych, które wpływają na dostarczanie leków lub komórek, naprowadzanie komórek do różnych mikrośrodowisk oraz transśródbłonkową migrację komórek nowotworowych, zrębowych i odpornościowych. Dzięki włączeniu tej funkcji, chip nowotworowy może lepiej reprezentować złożoność obserwowaną w mikrośrodowisku guza in vivo.

Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, opracowaliśmy nowatorską platformę do badań przesiewowych leków, która umożliwia tworzenie sieci mikronaczyń w urządzeniu mikroprzepływowym8,9,10,11,12,13,14,15, 16. Ta podstawowa platforma chipów narządowych, określana jako unaczyniony mikronarząd (VMO), może być dostosowana do praktycznie każdego układu narządów w celu odtworzenia oryginalnej fizjologii tkanek do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i zastosowań medycyny spersonalizowanej. VMO są ustanawiane przez wspólną hodowlę komórek śródbłonka tworzących kolonie śródbłonka pochodzących z komórek (ECFC-EC), HUVEC lub iPSC-EC (zwanych dalej EC) oraz wielu komórek zrębu w komorze, w tym normalnych ludzkich fibroblastów płuc (NHLF), które przebudowują macierz, oraz perycytów, które owijają i stabilizują naczynia. VMO można również ustanowić jako system modelowy raka poprzez kokulturację komórek nowotworowych wraz z powiązanym zrębem w celu utworzenia unaczynionego mikroguza (VMT)8,9,10,11,12,13, lub model chipa nowotworowego. Poprzez kohodowlę wielu typów komórek w dynamicznym środowisku przepływu, perfundowane sieci mikronaczyniowe tworzą się de novo w komorach tkankowych urządzenia, gdzie waskulogeneza jest ściśle regulowana przez natężenia przepływu śródmiąższowego14,15. Pożywka jest napędzana przez kanały mikroprzepływowe urządzenia przez hydrostatyczną głowicę ciśnieniową, która zaopatruje otaczające komórki komory tkankowej w składniki odżywcze wyłącznie przez mikronaczynia, o współczynniku przepuszczalności 1,2 x 10-7 cm/s, podobnym do tego, jaki obserwuje się dla naczyń włosowatych in vivo8.

Włączenie samoorganizujących się mikronaczyń do modelu VMT stanowi znaczący przełom, ponieważ: 1) naśladuje strukturę i funkcję unaczynionych mas guza in vivo; 2) potrafi modelować kluczowe etapy przerzutów, w tym interakcje guz-śródbłonek i komórki zrębu; 3) ustanawia fizjologicznie selektywne bariery dla dostarczania składników odżywczych i leków, poprawiając farmaceutyczne badania przesiewowe; oraz 4) umożliwia bezpośrednią ocenę leków o właściwościach antyangiogennych i przeciwprzerzutowych. Odtwarzając dostarczanie in vivo składników odżywczych, leków i komórek odpornościowych w złożonym mikrośrodowisku 3D, platforma VMO/VMT jest fizjologicznie istotnym modelem, który można wykorzystać do przeprowadzania badań przesiewowych leków i badania biologii specyficznej dla raka, naczyń krwionośnych lub narządów. Co ważne, VMT wspomaga rozwój różnych typów nowotworów, w tym raka jelita grubego, czerniaka, raka piersi, glejaka, raka płuc, raka otrzewnej, raka jajnika i raka trzustki8,9,10,11,12,13. Oprócz tego, że jest tania, łatwa do założenia i przygotowana do eksperymentów o wysokiej przepustowości, platforma mikroprzepływowa jest w pełni kompatybilna optycznie z analizą obrazu interakcji guz-zręb w czasie rzeczywistym i reakcji na bodźce lub terapie. Każdy typ komórki w systemie jest oznaczony innym markerem fluorescencyjnym, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację i śledzenie zachowania komórek przez cały eksperyment, tworząc okno na dynamiczne mikrośrodowisko guza. Wcześniej wykazaliśmy, że VMT wierniej modeluje in vivo wzrost guza, architekturę, heterogeniczność, sygnatury ekspresji genów i odpowiedzi na leki niż standardowe metody hodowli10. Co ważne, VMT wspiera wzrost i badanie komórek pochodzących od pacjentów, w tym komórek nowotworowych, co lepiej modeluje patologię guzów macierzystych niż standardowe hodowle sferoidalne i dalej rozwija wysiłki medycyny spersonalizowanej11. Manuskrypt ten przedstawia metody tworzenia VMT, prezentując jego użyteczność w badaniu nowotworów u ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i produkcja

  1. Konstrukcja urządzenia
    1. W celu wytworzenia urządzenia mikroprzepływowego utwórz formę SU-8 przy użyciu warstwy 200 μm SU-8 pokrytej spinowo na płytce krzemowej (oczyszczonej RCA-1 i poddanej 2% działaniu fluorowodoru (HF)), a następnie wykonaj pojedynczy etap fotolitografii maski, jak opisano wcześniej8,9.
    2. Odlej replikę polidimetylosiloksanu (PDMS) o grubości 4 mm z formy SU-8, aby wygenerować trwałą formę poliuretanową do dalszych etapów produkcji. Można stosować różne wersje projektu8,9,10,11,12,13,14,15.
    3. W obecnej iteracji zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe tak, aby było dostosowane do standardowego formatu płytki 96-dołkowej i składającej się z warstwy funkcyjnej PDMS o grubości 2 mm z 12 jednostkami urządzenia mikroprzepływowego otoczonymi cienką (1/16 cala) przezroczystą warstwą membrany polimerowej na spodzie (Rysunek 1A).
    4. Upewnij się, że poszczególne jednostki tkankowe składają się z komory tkankowej otoczonej wlotem i wylotem ładowania żelu (L1) i wylotem (L2), regulatora ciśnienia (PR)16 oraz odsprzężonych kanałów mikroprzepływowych podłączonych do 2 wlotów i wylotów mediów z każdej strony (M1-M2, M3-M4; Rysunek 1B).
    5. Umieść każdy wlot i wylot w jednej studzience, która służy jako zbiornik medium do wytworzenia ciśnienia hydrostatycznego (10 mm H2O) w poprzek kanału mikroprzepływowego. Aby umożliwić zespolenie sieci naczyniowej z kanałami zewnętrznymi, podłącz kanały mikroprzepływowe do komory tkankowej za pomocą porów komunikacyjnych o szerokości 50 μm (6 na górze, 6 na dole).
      UWAGA: Rezystory mikroprzepływowe tworzą gradient ciśnienia śródmiąższowego 5 mmH2Ow poprzek komory tkankowej, który staje się śródświetlny, gdy sieć naczyniowa jest w pełni uformowana8,10. Kolejne procedury rozpoczynają się od w pełni zmontowanej płyty o wysokiej przepustowości.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Konstrukcja platformy mikroprzepływowej. (A) Schemat zespołu platformy przedstawia warstwę cechową PDMS z 12 jednostkami urządzenia połączonymi z bezdenną 96-dołkową płytką i uszczelnioną cienką przezroczystą membraną polimerową. Każda jednostka urządzenia zajmuje kolumnę studzienek na płycie. Pojedynczy zespół urządzenia zaznaczony na czerwono jest pokazany ze szczegółami w (B). (B) Schemat jednego urządzenia przedstawia pojedynczą komorę na tkanki umieszczoną w jednym dołku płytki 96-dołkowej i dwóch portach załadunkowych z otworem wlotowym i wylotowym (L1-L2) wybitym w celu umożliwienia wprowadzenia mieszanki matrycy komórkowej. Wloty i wyloty medium (M1-M2, M3-M4) są dziurkowane i umieszczane w studniach, które służą jako zbiorniki mediów. Różne objętości pożywek tworzą gradient ciśnienia hydrostatycznego w całej komorze tkankowej za pośrednictwem oddzielonych kanałów mikroprzepływowych. Regulator ciśnienia (PR) służy jako żelowy zawór pękający w celu zwiększenia łatwości ładowania. Zwróć uwagę, że urządzenie ma głębokość 200 μm, a komora na tkanki ma wymiary 2 mm x 6 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowania przed załadunkiem

  1. Hodowla komórkowa
    1. Utrzymuj komórki zgodnie z zaleceniami producenta w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Kolby na płytkę T75 z transdukowanymi komórkami EC, NHLF lub innymi fibroblastami / komórkami zrębu i pożądanymi komórkami rakowymi na 3-4 dni przed załadowaniem w gęstości podanej przez producenta i protokoły użytkownika. W przypadku tego protokołu płytka 1 x 106 komórek na kolbę dla każdego typu komórki. Hodowla EC w kompletnych pożywkach Endothelial Growth Feed 2 (EGM2), NHLF w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS oraz komórki rakowe w odpowiednich pożywkach w zależności od typu komórki.
    3. Utrzymuj komórki, podając odpowiednie pożywki co 2-3 dni i potwierdź skuteczność transdukcji lub etykietowania, wizualizując komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. W dniu załadunku upewnij się, że EC jest zlewne w 80%-100%, podczas gdy NHLF jest zlewane w 70%-80%.
  2. Przygotowanie fibrynogenu
    1. Przygotuj roztwór fibrynogenu do pożądanego stężenia (zazwyczaj 5-8 mg/ml wspomaga tworzenie silnej sieci naczyniowej), biorąc pod uwagę procentową krzepliwość fibrynogenu. Oblicz potrzebną ilość fibrynogenu za pomocą następującego równania:
      Fibrynogen (mg) = (objętość (ml)) x (stężenie (mg/mL))/ (%) krzepnięcia
    2. Rozpuścić fibrynogen w odpowiedniej objętości śródbłonkowego podłoża podstawowego 2 (EBM2), ogrzanego do temperatury 37 °C, delikatnie przesuwając rurkę (nie wirować). Inkubować fibrynogen w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby całkowicie przeszedł w roztwór. Co ważne, nie należy używać kompletnego podłoża.
    3. Sterylny roztwór fibrynogenu z filtrem 0,22 μm i podwielokrotnością do żądanej objętości, zwykle 400 μl na probówkę mikrowirówki.
      UWAGA: Inne białka macierzy (np. kolageny, fibronektyna lub laminina) mogą być wzbogacane do mieszanki fibrynogenu.

3. Ładowanie próbek

UWAGA: Załadunek jest wrażliwy na czas i powinien być zakończony od początku (podnoszenie komórek) do końca (dodawanie mediów do urządzeń) w ciągu około 1,5-1,75 godziny, aby zapewnić optymalne wyniki. Każdy krok jest odnotowywany za pomocą sugerowanego licznika czasu, aby pomóc użytkownikowi utrzymać się na właściwym torze.

  1. Przygotowanie materiałów (dzień załadunku)
    1. W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-15 minut umieścić następujące materiały: zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do mycia komórek, odczynnik do dysocjacji komórek, pożywki (np. EGM2, DMEM)
    2. Następujące odczynniki należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C do czasu przygotowania do użycia: trombina, laminina (rozmrożone przez noc w temperaturze 4 °C).
    3. Rozmrozić podwielokrotność fibrynogenu w temperaturze pokojowej. Przygotować 1,5 μl porcji trombiny do probówek mikrowirówek o objętości 500 μl, po jednej probówce na jednostkę urządzenia. Upewnij się, że podwielokrotność trombiny znajduje się na dnie każdej probówki, aby ułatwić ładowanie.
    4. Umieść wysterylizowane promieniami UV płytki o wysokiej przepustowości w eksykatorze na co najmniej 30 minut przed załadowaniem, aby usunąć powietrze uwięzione w mikrofluidykach.
  2. Przygotowanie komórek (start timera = początek od 0 min)
    1. Sprawdź komórki pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić konfluencję i wydajność transdukcji.
    2. Przemyć każdą kolbę komórkową T75 2x 5 ml HBSS i całkowicie odessać. Dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do każdej kolby i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 minuty.
    3. Delikatnie postukaj w płytkę dłonią i sprawdź, czy wszystkie komórki zostały podniesione.
    4. Zmyć komórki z kolby 9 ml odpowiedniej pożywki i zebrać je do stożkowego naczynia o pojemności 15 ml. Natychmiast usuń małą porcję do zliczania komórek.
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania komórek policz komórki. Zlewająca się kolba T75 EC lub NHLF powinna dawać co najmniej 2 x 106 komórek.
    6. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w odpowiednim podłożu o stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Utrzymuj komórki na lodzie.
  3. Przygotowanie mieszaniny komórek i fibrynogenu (Timer = początek po 20 minutach)
    1. Określ, ile urządzeń zostanie załadowanych, dodając 1-2, aby uwzględnić straty w pipetowaniu, i pomnóż przez objętość mieszanki komórkowo-fibrynogenowej potrzebną na urządzenie. Będzie to zależeć od konfiguracji urządzenia, ale w przypadku projektu urządzenia przedstawionego w tym artykule wymagane jest 6 μl na urządzenie.
    2. Stężenie każdego typu komórek powinno być określone doświadczalnie. Jako punkt wyjścia załaduj EC w stężeniu około 7 x 106 komórek/ml i NHLF w stężeniu 3,5 x 106 komórek/ml. Stężenie komórek rakowych może się znacznie różnić w zależności od ich tempa wzrostu, ale zwykle mieści się w zakresie 0,5-2 x 106 komórek/ml. Użyj tego równania, aby obliczyć liczbę potrzebnych komórek:
      Liczba potrzebnych komórek = (objętość fibryny (μL))/1000 μL x (koncentracja komórek)
    3. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i użyć następującego równania, aby określić potrzebną objętość komórek:
      Objętość potrzebnych komórek (μL) = (liczba potrzebnych komórek)/1000
    4. Wymieszać odpowiednie objętości komórek EC, NHLF i rakowych (tylko dla VMT) w stożkowej probówce i odwirować przy 300 x g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Po odwirowaniu ostrożnie zassać pożywkę i odpipetować wszelkie pozostałości mediów w pobliżu granulki. Delikatnie, ale dokładnie ponownie zawiesić granulkę w obliczonej objętości fibrynogenu, zwracając szczególną uwagę, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Trzymaj na lodzie.
    6. Wprowadzić wysterylizowane płytki i porcje trombiny do okapu do hodowli tkankowych.
  4. Ładowanie urządzeń (Timer = start po 30-35 min)
    1. Za pomocą pipety P20 odpipetować 6 μl objętości z mieszaniny komórka i fibryna. Pamiętaj, aby pipetować mieszaninę w górę i w dół co najmniej 5 razy, aby zapewnić równomierną zawiesinę komórek. Trzymaj mieszankę na lodzie, aby spowolnić krzepnięcie.
    2. Delikatnie wymieszać komórkę/fibrynę z jedną probówką trombiny, wkładając końcówkę pipety bezpośrednio do podwielokrotności trombiny na dnie probówki. Natychmiast pipetować w górę i w dół co najmniej 2 razy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Fibryna zacznie krzepnąć po zmieszaniu z trombiną, więc szybko, ale celowo wykonaj kroki 3.4.3. oraz 3.4.4. zanim fibryna zżeluje się w końcówce pipety (~3 s).
    3. Podnieś płytkę o wysokiej przepustowości pod kątem i szybko włóż końcówkę pipety do jednego z portów ładowania urządzenia (L1 lub L2). Zobacz schemat Rysunek 2A.
    4. Płynnym, płynnym ruchem wcisnąć tłok pipety do pierwszego oporu, aby wstrzyknąć mieszaninę komórek i fibryny do komory tkankowej. Uważaj, aby żel całkowicie przeszedł przez komorę.
      UWAGA: Wywieranie zbyt dużego nacisku na tym etapie może prowadzić do pęknięcia żelu do kanałów mikroprzepływowych na górze i/lub na dole komór tkankowych.
    5. Delikatnie umieść płytkę z powrotem płasko w kapturze do hodowli tkankowej, nie zdejmując końcówki pipety, nie zwalniając tłoka pipety ani nie naruszając pracy pipety. Użyj ręki, aby przekręcić i wyjąć końcówkę pipety z P20 i pozostawić ją w otworze portu ładowania. Nie używaj przycisku wyrzutnika do wyjmowania końcówki, ponieważ spowoduje to zbyt duży nacisk.
    6. Wykonaj kroki 3.4.1-3.4.5 dla pozostałych urządzeń.
    7. Po zakończeniu ładowania pozostaw płytkę na 2 minuty bez przeszkód w kapturze do hodowli tkankowej.
    8. Wyjmij końcówki pipet, delikatnie przekręcając je i wyciągając z portów ładowania. Załóż pokrywkę na talerz.
    9. Inkubować całą płytkę przez 15-20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby żel mógł w pełni spolimeryzować.
    10. Po inkubacji sprawdź każdą jednostkę urządzenia pod mikroskopem. Sprawdź, czy komórki są równomiernie rozmieszczone w całej komorze bez pęcherzyków powietrza i czy istnieje wyraźnie widoczny interfejs żelu między komorą tkankową a kanałami mikroprzepływowymi, jak w Rysunek 2B-C.
  5. Powlekanie kanału lamininą (Timer = początek po 45-50 min)
    1. Po tym, jak żele są całkowicie stałe, wprowadź lamininę do kanałów mikroprzepływowych, aby pobudzić zespolenie naczyniowe.
    2. Za pomocą P20 wprowadź 4 μl lamininy do każdego kanału mikroprzepływowego (górnego i dolnego) urządzenia. Włóż końcówkę pipety do M1 lub M3 i powoli wydalaj lamininę, obserwując, czy laminina pokrywa cały górny kanał, a następnie powtórz dla M2 lub M4, aby pokryć cały dolny kanał.
    3. Określić orientację, pipetując lamininę ze strony przeciwnej do regulatora ciśnienia, aby zapewnić wystarczające ciśnienie do jej przepchnięcia. Jeśli jednak lamina nie przemieszcza się łatwo z jednej strony, zdejmij końcówkę z jednej strony i popchnij lamininę z drugiej strony. Przejście do drugiego zatrzymania pipety (tj. wciśnięcie tłoka do końca) może być konieczne do wytworzenia wystarczającego ciśnienia do przepchnięcia lamininy przez cały kanał.
    4. Delikatnie wyjmij końcówkę z wlotu/wylotu nośnika. Nie używaj przycisku wyrzutnika na P20.
    5. Powtórzyć czynności 3.5.1-3.5.4 dla każdego urządzenia i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 minut.
  6. Dodawanie mediów (Timer = początek po około 1 godz. 10 min)
    1. Dodać 275 μl kompletnych pożywek EGM2 do niesprzężonych zbiorników pożywki studzienek w rzędach A i B lub G i H. Będzie to wysoka strona, a orientację należy określić, sprawiając, że studzienki po stronie przeciwnej do regulatora ciśnienia mają dużą objętość, aby rozpocząć. Media będą wypychane z góry przez grawitację.
    2. Za pomocą pipety P200 wprowadzić 75 μl pożywki do wlotów/wylotów pożywki studzienek zawierających 275 μl EGM2. Włóż końcówkę do otworu wlotowego nośnika i powoli wydalaj medium, obserwując, jak media przemieszczają się przez kanał i bulgoczą po drugiej stronie.
    3. Zdjąć końcówkę pipety i wepchnąć pozostały z niej nośnik do zbiornika na nośnik tak, aby całkowita objętość po stronie wysokiej wynosiła 350 μl.
    4. Powtórz kroki 3.6.1-3.6.3 dla każdego urządzenia oraz górnego i dolnego kanału.
    5. Dodaj 50 μl pożywki, aby całkowicie pokryć dolną stronę, studzienki w rzędach A i B lub G i H, w zależności od orientacji opisanej powyżej. Upewnij się, że dno studni pokryte jest równą warstwą nośnika. Zapoznaj się z Rysunek 2D, aby zapoznać się ze schematem przedstawiającym objętości mediów w zbiornikach.
  7. Usuwanie pęcherzyków powietrza (po załadowaniu)
    UWAGA: Usuwanie pęcherzyków jest krytycznym krokiem zapewniającym prawidłowy przepływ w każdym urządzeniu. Do 2 dnia komórki śródbłonka i fibroblasty zaczną się rozciągać w odpowiedzi na przepływ (Rysunek 2E).
    1. Po dodaniu wszystkich pożywek inkubować płytki przez 1-2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed sprawdzeniem, czy w kanałach lub na wlotach/wylotach pożywki nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Wizualizuj pęcherzyki w kanałach pożywki pod mikroskopem i wydal, ponownie wprowadzając 75 μl pożywki do kanałów, aby wypchnąć pęcherzyki.
    3. Wizualizuj bąbelki we wlotach/wylotach pożywki na oko. Użyj pipety P200, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione na wlotach i wylotach pożywki, naciskając tłok w dół, wprowadzając końcówkę do otworu i wyciągając pęcherzyk, podnosząc tłok w celu zastosowania podciśnienia i zassania pęcherzyka.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schemat wczytywania urządzenia. (A) Za pomocą pipety P20 mieszaninę komórek i fibryny wprowadza się do komory tkankowej każdego urządzenia przez jeden z portów ładowania. (B) Mikrofotografia Brightfield pokazuje urządzenie mikroprzepływowe załadowane EC, fibroblasty i komórki rakowe w celu utworzenia VMT. Pasek skali = 500 μm. (C) Mikrografia fluorescencyjna urządzenia w B pokazująca EC na czerwono, guz na niebiesko i fibroblasty na niebiesko. (D) Schemat przedstawia dodawanie pożywki do zbiorników, z 350 μl po stronie wysokiej i 50 μl po stronie dolnej w celu wytworzenia ciśnienia hydrostatycznego. (E) Dzień 2 hodowli VMT pokazuje, że fibroblasty i EC zaczynają się rozciągać, tworząc sieć naczyniową. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Konserwacja urządzeń i aplikacje eksperymentalne

  1. Leczenie podtrzymujące i farmakologiczne
    UWAGA: Aby utrzymać przepływ w systemie, ciśnienie hydrostatyczne musi być przywracane codziennie poprzez pipetowanie objętości pożywki z dolnej strony z powrotem na wysoką lub odwrotnie, upewniając się, że całkowita objętość po stronie wysokiej pozostaje na poziomie 350 μl. Kierunek przepływu jest zmieniany codziennie po 2 dniu ustanowienia VMO lub VMT. Dodatkowe informacje dotyczące konserwacji i leczenia znajdują się poniżej.
    1. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień z EGM2 całkowicie, aż do pełnego ustabilizowania się układu naczyniowego (dzień 5-6). Całkowicie odessać stare media i wymienić studzienki wysokociśnieniowe (350 μl) i studzienki niskociśnieniowe (50 μl).
      UWAGA: Eksperymentalne oznaczanie zoptymalizowanych preparatów pożywek można przeprowadzić dla innych typów komórek, często obejmując mieszanie 50:50 lub dodawanie określonych składników do EGM2.
    2. Po utworzeniu sieci naczyniowej i pełnym rozwinięciu tkanki (dzień 4-7), przed użyciem urządzeń do eksperymentów należy wykonać test perfuzji dekstranu (krok 4.2.1.). Używaj wyłącznie urządzeń, które mają wystarczającą perfuzję do komory tkankowej.
    3. W przypadku eksperymentów z użyciem środków terapeutycznych, w dniu rozpoczęcia leczenia, należy wykonać zdjęcia we wszystkich kanałach fluorescencyjnych dla każdego urządzenia. Będzie to służyć jako punkt odniesienia.
    4. Traktuj urządzenia pożądanym środkiem terapeutycznym, zastępując pożywkę świeżą pożywką zawierającą rozcieńczony lek w pożądanym stężeniu. Upewnij się, że leki są rozcieńczane w odpowiednich nośnikach w zależności od zaleceń producenta, ale nie przekraczaj 0,01% DMSO w pożywce.
    5. Urządzenia należy wystawić na działanie leku przez żądany czas (zwykle 48 godzin, ale można to ustalić na podstawie farmakokinetyki).
    6. Zobrazuj każdy kanał każdego urządzenia w żądanym odstępie czasu, aby monitorować odpowiedź na leczenie. Utrzymuj płytki zgodnie ze wskazaniami w kroku 4.1.1 przez czas trwania eksperymentu.
    7. Po zakończeniu eksperymentu należy wybielić płytki i umieścić je w pojemniku stwarzającym zagrożenie biologiczne, utrwalić 4% PFA w celu barwienia immunofluorescencyjnego (krok 4.3.) lub zebrać w celu izolacji żywych komórek lub RNA (krok 4.4.).
  2. Testy perfuzyjne
    1. Perfuzja dekstranu
      UWAGA: Przepuszczalność/drożność naczyń można określić poprzez perfuzję sieci naczyniowej za pomocą znakowanego fluorescencyjnie dekstranu o różnej masie cząsteczkowej (40 kD, 70 kD lub 150 kD). FITC lub dekstran rodaminy mogą być stosowane w zależności od etykiety fluorescencyjnej WE.
      1. Przed perfuzją należy określić odpowiednią ekspozycję kanału FITC lub rodaminy, dodając kilka μl dekstranu do kanału płynowego lub komory pustego urządzenia. Ustaw czas ekspozycji tuż poniżej poziomu nasycenia za pomocą oprogramowania mikroskopowego do wyświetlenia histogramu intensywności pikseli, zapewniając zakres dynamiczny charakteryzujący się równomiernie rozmieszczonymi pikselami bez zauważalnej koncentracji wartości o wysokiej intensywności.
      2. Wykonaj mikrofotografie wszystkich urządzeń w kanałach zainteresowania, w tym obraz tła wszystkich urządzeń w kanale fluorescencyjnym dekstranu, aby skalibrować je na tle. Użyj tej samej ekspozycji, jak określono powyżej, i wyrównaj komorę tkankową na środku ramki obrazu, aby zapewnić spójne obrazy do oceny ilościowej.
      3. Przygotować główny zapas FITC-dekstranu lub rodaminy-dekstranu w stężeniu 5 mg/ml w 1x DPBS. Zapas ten można przechowywać w temperaturze 4 °C.
      4. Aby przygotować zapas roboczy, należy rozcieńczyć 5 mg/ml materiału w EGM2 do końcowego stężenia 50 μg/ml.
      5. Zastąp pożywkę w zbiornikach rozcieńczonym roztworem dekstranu jako połowę maksymalnej objętości (175 μl do jednego studzienki jako strona wysoka na górnym lub dolnym kanale komory tkankowej). Wymień pożywki w innych studzienkach tak, aby niesprzężona strona wysoka otrzymała 175 μl świeżego EGM2 bez dekstranu, a studzienki po dolnej stronie miały tylko 50 μl w każdym.
        UWAGA: Dekstran powinien być dodawany tylko po jednej stronie kanałów mikroprzepływowych (na górze lub na dole), aby umożliwić wizualizację barwnika przemieszczającego się przez stronę wysokiego ciśnienia, do łożyska naczyniowego i na zewnątrz po stronie niskiego ciśnienia.
      6. Pod mikroskopem obserwuj, czy fluorescencyjny dekstran przepływa przez sieć naczyniową. Zwykle następuje to w ciągu około 2 minut po dodaniu barwnika do zbiornika pożywki.
      7. Rozpocznij obrazowanie fluorescencyjnego kanału dekstranu (i innych kanałów, jeśli jest to pożądane). To jest punkt czasowy T = 0. Rób dodatkowe zdjęcia w wielu punktach czasowych (zwykle co 10 minut) lub pojedynczy obraz końcowy.
    2. Perfuzja komórek
      UWAGA: Różne typy komórek mogą być perfundowane przez naczynia krwionośne w zależności od projektu badania, w tym limfocyty lub makrofagi do badań immunologicznych nad rakiem, a także komórki rakowe do badań nad przerzutami. Komórki muszą być znakowane fluorescencyjnie, aby ułatwić śledzenie w czasie.
      1. Co najmniej 2 godziny przed perfuzją komórek należy przeprowadzić perfuzję dekstranu na wszystkich urządzeniach, jak opisano powyżej. Ten krok jest ważny, aby określić drożność naczyń krwionośnych przed dodaniem komórek.
      2. Określ odpowiednią ekspozycję kamery dla komórek, które mają być perfundowane. Weź małą próbkę komórek, aby wyświetlić ją pod mikroskopem i ustaw czas ekspozycji dla tego markera fluorescencyjnego. Ustaw czas ekspozycji tuż poniżej poziomu nasycenia.
      3. Wykonaj mikrofotografie wszystkich urządzeń w kanałach zainteresowania, w tym obraz tła wszystkich urządzeń w kanale fluorescencyjnym dekstranu, aby skalibrować je na tle. Należy zastosować taką samą ekspozycję, jak określono w kroku 4.2.2.1.
      4. Upewnij się, że dekstran całkowicie dyfundował z komór tkankowych przed pobraniem komórek do perfuzji. Zbierz i policz interesujące Cię komórki.
      5. Ponownie zawiesić komórki o odpowiedniej gęstości w EGM2. Na przykład limfocyty T są zwykle dodawane w ilości około 1 x 106 komórek/ml, aby naśladować stężenie we krwi.
        UWAGA: EC są wrażliwe na skład pożywki, ale tolerują do 50% mieszania z większością innych pożyw. Przetestuj wcześniej.
      6. Dodać 175 μl zawiesiny komórek do jednego dołka po górnej stronie każdego urządzenia i dodać 175 μl EGM2 do drugiego dołka. Na dole dodaj 50 μl kompletnej pożywki EGM2 do obu studzienek.
      7. Pod mikroskopem obserwuj, czy komórki fluorescencyjne przepływają przez sieć naczyniową. Zwykle następuje to w ciągu około 2 minut po dodaniu komórek do zbiornika pożywki.
      8. Po ustaleniu przepływu komórek rozpocznij obrazowanie fluorescencyjnego kanału komórkowego (i innych kanałów, jeśli jest to pożądane). To jest punkt czasowy T = 0. Wykonaj dodatkowe zdjęcia w wielu punktach czasowych lub pojedynczy obraz punktu końcowego, w zależności od projektu badania. Na przykład obrazowanie co 10 minut spowoduje uzyskanie przebiegów czasowych o wysokiej rozdzielczości lub co 6-12 godzin w celu śledzenia okresowych ruchów komórek.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
    1. Odsysać pożywki ze studzienek. Dodaj 200 μl 4% PFA do obu studzienek po stronie wysokiej każdego urządzenia i 50 μl po stronie dolnej. Pozwól PFA przepływać przez komory przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub 30 minut w temperaturze 4°C.
    2. Podczas inkubacji należy przygotować 24-dołkową płytkę z 500 μl 1x PBS na studzienkę. Oblicz, ile studzienek jest potrzebnych do zabarwienia każdego urządzenia.
    3. Całkowicie usuń PFA ze studzienek. Odwróć płytkę do góry nogami i ostrożnie usuń plastikowy spód z membrany.
      UWAGA: Barwienie IF można również przeprowadzić na miejscu bez usuwania membrany i urządzenia. W tym celu należy wykonać etapy barwienia poprzez perfuzję odczynników przez VMO/VMT i wydłużyć czas trwania każdego etapu inkubacji około 6-krotnie.
    4. Bardzo delikatnie i ostrożnie oderwij dolną warstwę membrany od warstwy charakterystycznej urządzenia, aby odsłonić komory tkankowe, chwytając oba rogi i pociągając w dół powolnym i płynnym ruchem. Większość tkanki powinna pozostać w komorze tkankowej. Proszę zapoznać się z Rysunek 3A.
    5. Użyj żyletki lub skalpela, aby przyłożyć wystarczającą siłę, aby całkowicie przeciąć warstwę elementów i wyciąć mały prostokąt wokół każdej pojedynczej jednostki urządzenia, jak pokazano na Rysunek 3B.
    6. Wciśnij szpatułkę między warstwę elementów a płytę studzienki. Delikatnie dociśnij pod warstwą elementarną, aby ostrożnie usunąć całą warstwę elementarną zawierającą komorę tkankową z płytki studzienki.
    7. Umieść każdy prostokątny fragment warstwy cech PDMS zawierający tkankę zadrukowaną stroną do dołu w pojedynczym dołku zawierającym PBS.
    8. Gdy wszystkie jednostki znajdą się w studzienkach, przemyj je PBS, umieszczając płytkę na delikatnym kołysku na 5 minut, odsysając PBS ze studzienki i zastępując go 500 μl świeżego PBS. Powtórz w sumie 3 prania.
    9. Odessać PBS z każdej studzienki i przepuszczalnie tkanki za pomocą 500 μl 0,5% Triton-X w PBS, 2x po 10 minut na delikatnym bujaku. Usuń roztwór przepuszczalny.
    10. Zablokuj 500 μl 10% surowicy w 0,1% Triton-X na urządzenie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
    11. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w 3% surowicy w 0,1% Triton-X do pożądanego stężenia i objętości. Usuń roztwór blokujący i dodaj tyle roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, aby całkowicie pokryć dno każdej studzienki i umożliwić swobodny ruch tkanek urządzenia (~200 μL). Przykryj talerz przezroczystą folią.
    12. Inkubować płytkę, kołysząc się przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia należy przywrócić temperaturę pokojową płytki zawierającej chusteczki urządzenia (~15 min).
    13. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z każdej studzienki i przemyć komory 500 μl PBS, 3x przez 5 minut każda na delikatnym bujaku.
    14. Dodać 200 μl przeciwciała drugorzędowego w 3% surowicy w 0,1% Triton-X w żądanym stężeniu. Inkubuj płytkę, delikatnie kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    15. Odessać roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć PBS, 3x po 5 minut z delikatnym kołysaniem. Dodaj roztwór 1x DAPI w 0,1% Triton-X przez 10 minut podczas bujania w ciemności.
    16. Usuń z płytki prostokątne wycięcia urządzenia zawierające poplamione chusteczki za pomocą pęsety i połóż chusteczkę do góry na ręczniku papierowym.
    17. Odpipetować kilka μl (~10 μL) roztworu zapobiegającego blaknięciu bezpośrednio na każdą komorę i szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków. Pozwól płynowi przeciwblaknąć do utwardzenia w komorach przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie kontynuuj obrazowanie.
  4. Izolacja tkanek i komórek do testów molekularnych
    UWAGA: Każda płyta o wysokiej przepustowości będzie zawierała około 1-2 x 105 komórek, w zależności od punktu czasowego zbioru. Skaluj liczbę powtórzeń eksperymentalnych, aby uwzględnić całkowitą liczbę komórek, a także potencjalne straty podczas zbioru.
    1. Analizy jednokomórkowe
      1. Zassaj pożywkę z każdej studzienki i odwróć płytkę o wysokiej przepustowości tak, aby warstwa urządzenia była skierowana do góry.
      2. Usuń plastikowy podkład z membrany. Bardzo delikatnie i ostrożnie oderwij dolną membranę PDMS od warstwy charakterystycznej urządzenia, aby odsłonić komory tkankowe, chwytając oba rogi i pociągając w dół powolnym i płynnym ruchem.
      3. Membranę można usunąć nawet przy odpowiednim klejeniu. Większość tkanki powinna pozostać w komorze tkankowej po usunięciu błony; Jeśli jednak jakakolwiek część zostanie przyklejona do membrany, wykonaj poniższe czynności na samej membranie.
      4. Umyj każdą jednostkę urządzenia 500 μl HBSS lub PBS. Do każdej jednostki urządzenia dodaj 100 μl odczynnika dysocjacyjnego i pozwól mu osiąść w postaci kropli na wierzchu urządzenia. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
      5. Po roztrawieniu użyj pipety P200, aby pipetować w górę iw dół przez komory tkankowe i zebrać tkanki w odczynniku dysocjacyjnym. Przesuwaj końcówkę pipety do przodu i do tyłu po każdym urządzeniu, aby zapewnić całkowite usunięcie tkanki i zebrać do stożkowego pojemnika o pojemności 15 ml z 500 μl EGM2 w celu zneutralizowania odczynnika dysocjacyjnego.
      6. W celu całkowitego usunięcia pozostałych komórek z komory tkankowej należy dodać 500 μl EGM2 do każdej jednostki urządzenia i przemyć pipetą P200.
      7. Odwirować roztwór wytrawiający zawierający usunięte tkanki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pojedynczych komórek i całych tkanek.
      8. Ostrożnie odessać pożywkę i dodać do tkanek 500 μl kolagenazy typu IV o stężeniu 1 mg/ml (200 U/ml), hialuronidazy typu V o stężeniu 0,1 mg/ml i 200 μl DNAzy typu IV w HBSS.
      9. Po delikatnym wymieszaniu pozostaw roztwór na 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie delikatnie pipetuj w celu dysocjacji żelu.
      10. Przemyć mieszaninę wytrawiającą 10 ml EGM2 i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 1x DPBS z 1% BSA lub HSA i przepuścić przez wstępnie zwilżony filtr 70 μm, wirując z prędkością 200 x g przez 1 min.
      11. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1000 komórek na μl. Zawiesiny komórkowe można następnie poddać FACS, cytometrii przepływowej lub sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.
    2. Izolacja RNA z całych tkanek
      1. Wykonaj kroki 4.4.1.1 i 4.4.1.2 powyżej.
      2. Dodaj około 10 μl buforu do lizy RNA na każdą odsłoniętą komorę tkankową, upewniając się, że bufor gromadzi się bezpośrednio na tkankach. Nie należy stosować łącznie więcej niż 100 μl buforu do lizy RNA.
      3. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Użyj P20 do pipetowania w górę iw dół na każdym urządzeniu i użyj końcówki pipety, aby zeskrobać resztki materiału z komory na tkanki, jeśli to konieczne.
      4. Przenieś jak najwięcej buforu do lizy do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz kroki 4.4.2.2.-4.4.2.3. dla pozostałych urządzeń i próbki zbiorcze do probówki o pojemności 1,5 ml.
      5. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolowania RNA, w zależności od zestawu lub odczynników.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Przygotowanie platformy do barwienia immunologicznego. (A) Schemat w pełni zmontowanej platformy urządzenia z warstwą membrany na górze. Aby usunąć membranę, ostrożnie pociągnij każdy róg zewnętrznej warstwy w dół stałym, delikatnym ruchem. (B) Po całkowitym usunięciu warstwy membrany użyj ostrza, skalpela lub noża, aby wyciąć prostokąty wokół komory tkankowej każdego urządzenia, uważając, aby nie wciąć się w samą tkankę. Szpatułka może być następnie zaklinowana pod każdym prostokątem, aby usunąć go z płytki i umieścić każdą jednostkę w jednym dołku 24-dołkowej płytki z PBS do barwienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z opisanymi tutaj protokołami, VMO i VMT zostały ustanowione przy użyciu zakupionego na rynek EC, NHLF, a dla VMT, potrójnie ujemnej linii komórkowej raka piersi MDA-MB-231. Ustalone VMO były również perfundowane komórkami rakowymi w celu naśladowania przerzutów. W każdym modelu, do 5 dnia kohodowli, sieć naczyniowa samoorganizuje się w odpowiedzi na napędzany grawitacją przepływ przez komorę tkankową, służąc jako kanał do dostarczania in vivo, takich jak dostarczanie składników odżywczych, terapii i kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie każda tkanka w organizmie otrzymuje składniki odżywcze i tlen przez układ krwionośny, co czyni ją kluczowym elementem realistycznego modelowania chorób i badań przesiewowych leków in vitro. Ponadto kilka nowotworów złośliwych i stanów chorobowych definiuje dysfunkcja śródbłonka naczyń krwionośnych i nadmierna przepuszczalność3. Warto zauważyć, że w przypadku raka unaczynienie związane z nowotworem jest często źle ukrwione, zakłócone i nieszczelne, działając w ten sposób jako barier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CCWH posiada udziały w spółce Aracari Biosciences, Inc., która komercjalizuje wersję technologii opisanej w tym artykule. Warunki tego porozumienia zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w Irvine, zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów. Nie ma innych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium dr Christophera Hughesa za ich cenny wkład w opisane procedury, a także naszym współpracownikom z laboratorium dr Abrahama Lee za pomoc w projektowaniu i produkcji platformy. Prace te zostały wsparte przez następujące granty: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) oraz TL1 TR001415 i W81XWH2110393 (SJH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja
(3-merkaptopropylo)trimetoksysilan, 95% Sigma-Aldrich175617-100G
Greiner Bio-One  μ Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki polistyrenoweGreiner Bio-One655096
metanol ≥ 99,8% ACSVWR Chemicals BDHBDH1135-1LP
MILTEX Sterylny jednorazowy dziurkacz do biopsji z tłokiem, średnica 1 mm,membrana Integra Miltex33-31AA-P/25
PDMSPAX IndustriesHT-6240
Środek do czyszczenia plazmy PDC-001Harrick PlasmaN/A
Smooth-Cast 385Smooth-OnN/A
SP Bel-Art Lab Companion Przezroczysty eksykator próżniowy z poliwęglanuBel-ArtF42400-4031
Standardowe pokrywki z pierścieniami kondensacyjnymi, płytka 96-dołkowaVWR82050-827
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych (PDMS)Dow4019862
Hodowla komórkowa/Ładowanie
BioTek Lionheart FX Zautomatyzowany MikroskopAgilent 
CELLvo Ludzkie śródbłonkowe komórki progenitoroweStemBioSysN/A
Kolagen I, ogon szczuraEnzo Life Sciences
Kolagenaza z Clostridium histolyticum (typ 4)Sigma-AldrichC5138
Corning Hank' s Zrównoważony roztwór soli, 1X bez wapnia i magnezuCorning21-021-CV
Corning  DMEM z L-Glutaminą, 4,5 g / L Glukoza i pirogronian soduCorning10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fibrynogen z osocza bydlęcegoNeta ScientificSIAL-341573
Fibronektyna osocze ludzkieSigma-AldrichF0895
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran (70kDa)Sigma-AldrichFD70S-1G
Żelatyna ze skóry świńskiejSigma-AldrichG1890
Hialuronidaza z jąder owiec (typ 4)Sigma-AldrichH6254
Laminin Mouse ProteinGibco23017015
Leica TCS SP8LeicaN/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – Normalne ludzkie fibroblasty płucLonzaCC-2512
Nikon Eclipse TiNikonN/A
Paraformaldehyd 4% w 0,1M buforze fosforanowym Solanka, pH 7,4Mikroskopia elektronowa Nauki 15735-90-1L
PBMCs - Jednojądrzaste komórki krwi obwodowejLonzaCC-2702
PBS, pH 7,4Gibco10010049
Premium Grade płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznieAvantor Seradigm97068-091
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144
Zestaw do mikroprzygotowania Quick-RNAZymo BadaniaR1051
Trombina z osocza bydlęcegoSigma-AldrichT4648
Triton X-100 (elektroforeza),Fisher BioReagentsBP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowaGibco12605028
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300062
VasculifeLifeline Cell TechnologiaLL-0003
CYT5MFAW

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  2. Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
  3. Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
  4. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
  5. Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
  6. Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).
  7. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  8. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589(2016).
  9. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
  10. Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
  11. Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
  12. Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601(2020).
  13. Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760(2022).
  14. Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
  15. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  16. Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
  17. Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
  18. Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
  19. Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  22. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385(2011).
  23. Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618(2020).
  24. Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
  25. COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Vascularized MicrotumorTumor MicroenvironmentMicrofluidic PlatformTumor ChipDynamic FlowEndothelial CellsImmune Cell ExtravasationPersonalized MedicineTumor HeterogeneityHigh Resolution Imaging

Powiązane artykuły