Artykuł metodologiczny

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

DOI:

10.3791/65874

⸱

10 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Cancer Institute, and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo złożoności przeszczepu komórek krwiotwórczych u ludzi, badacze często wykonują zastrzyki dożylne lub doudowe (IF) u myszy. W modelach mysich technika ta została zaadaptowana w celu zwiększenia efektywności wysiewu przeszczepionych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC). W artykule opisano szczegółową procedurę techniczną krok po kroku wstrzykiwania IF i następującej po niej aspiracji szpiku kostnego (BM) u myszy, która pozwala na seryjną charakterystykę komórek obecnych w BM. Metoda ta umożliwia przeszczepienie cennych próbek o małej liczbie komórek, które są szczególnie trudne do wszczepienia przez wstrzyknięcie dożylne. Procedura ta ułatwia tworzenie ksenoprzeszczepów, które są krytyczne dla analizy patologicznej. Chociaż łatwiej jest uzyskać dostęp do krwi obwodowej (PB), skład komórkowy PB nie odzwierciedla BM, który jest niszą dla HSPC. Dlatego procedury zapewniające dostęp do przedziału BM są niezbędne do badania hematopoezy. Wstrzyknięcie IF i seryjna aspiracja BM, jak opisano tutaj, pozwalają na prospektywne pobranie i scharakteryzowanie komórek wzbogaconych w BM, takich jak HSPC, bez poświęcania myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ krwionośny jest utrzymywany przez całe życie przez hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), które znajdują się w szpiku kostnym (BM)1,2. Aby badać dynamiczne zmiany w środowisku BM, ważne jest zrozumienie biologii zarówno normalnej, jak i złośliwej hematopoezy3,4. Przeszczepienie HSC bezpośrednio do ludzkiego BM daje wyższe wszczepienie niż infuzja krwi obwodowej (PB), ale wysoka złożoność procedury i zwiększone ryzyko infekcji wykluczają tę metodę z bycia częścią standardowej praktyki5. U myszy procedury, które ułatwiają dostęp do BM bez poświęcania zwierząt, zapewniają zasoby do seryjnego monitorowania hematopoezy. Opisana procedura ma na celu wyhodowanie myszy z wysokim wszczepieniem przeszczepionych komórek i umożliwienie seryjnego pobierania próbek BM żywych myszy. W tym artykule skupimy się na wytwarzaniu modeli ksenoprzeszczepów przy użyciu myszy z niedoborem odporności wszczepionych komórkami ludzkimi, które są trudniejsze do wyprodukowania niż modele allotransplantacji myszy-myszy. W porównaniu z konwencjonalnym przeszczepianiem krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez żyłę ogonową lub zaoczodołową, zaletą tej procedury jest wysokie wszczepienie komórkowe przy niewielkiej ilości materiału wyjściowego.

Chociaż iniekcja komórkowa doudowa (IF) do jamy BM myszy jest powszechnie stosowana do badania ludzkich HSPC in vivo6,7,8, formalna procedura krok po kroku ilustrująca/filmująca tę technikę nie została wcześniej opublikowana. Protokół ten umożliwia dużą liczbę przeszczepów z małej liczby przeszczepionych komórek oraz mechanizm seryjnego pobierania próbek z BM. Ponadto możliwe jest wykorzystanie tej metody do analizy wpływu wstrzykiwania leków bezpośrednio do jamy BM na leczenie chorób krwi. Opisana tutaj procedura pomaga uzyskać dostęp do BM, w którym znajdują się komórki krwiotwórcze, bez poświęcania myszy.

Ten protokół jest podobny do techniki używanej do aspiracji BM9. Kluczowa różnica polega na tym, że ten artykuł i towarzyszący mu protokół wideo szczegółowo opisują bezpieczną procedurę wstrzykiwania komórek do szpiku, podczas gdy poprzednie prace przeszczepiały komórki przez żyłę, a następnie przeprowadzały seryjną aspirację BM. Protokół ten umożliwia udane wszczepienie z niewielką liczbą linii komórkowych (Ryc. 1), normalne HSPC pochodzące z krwi pępowinowej (CB) (CD34 +) (Ryc. 2) i HSC (CD34 + CD38-CD45RA-CD90 +) ( Ryc. 3), normalne HSPC pochodzące z BM (CD34 + CD38-) (< silna klasa = "xfig" > Ryc. 4), białaczkowe komórki macierzyste pochodzące od pacjenta (CD34 +CD38-) (Figura 5), normalne HSPC pochodzące z CB (CD34+) z edytowanym genem CRISPR/Cas9 (CD34+) (Figura 6) i ostra białaczka szpikowa (AML)-iPSC (Figura 7). Szczególnie w przypadku normalnych HSC pochodzących z krwi pępowinowej mogliśmy z powodzeniem wykonać wszczepienie z zaledwie 10 komórek. Metoda ta jest szczególnie cenna w przypadku eksperymentów przeprowadzanych na rzadkich lub trudnych do wygenerowania populacjach komórek, takich jak niezmodyfikowana lub edytowana genetycznie pierwotna ludzka ostra białaczka szpikowa lub komórki CB. Co więcej, procedura ta opisuje skuteczną metodę seryjnej analizy przeszczepionych komórek, która może być natychmiast wykorzystana w dalszych eksperymentach. Aby uniknąć marnowania cennych próbek i zapewnić wstrzyknięcie IF, opisaliśmy również pokrótce procedury oparte na Akaluc10 praktyk, które pomogą utrwalić tę technikę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sześcio- do dziesięciotygodniowy mężczyzna lub samica NOD. W tym protokole użyto myszy Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), ale można go zastosować do wszystkich typów myszy. Napromienianie zależy od treści doświadczenia i rodzaju myszy, a to, czy należy napromieniać myszy, czy nie, zależy od celów badań. Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Panel Administracyjny ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi Uniwersytetu Stanforda (APLAC #22264). Wszystkie normalne populacje krwinek zostały posortowane na świeżo. Próbki ludzkiej AML uzyskano od pacjentów w Stanford Medical Center za świadomą zgodą, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. Iniekcja doudowa linii komórkowych, krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) lub białaczkowych komórek macierzystych (LSC)

UWAGA: Aby łatwo przeanalizować wstrzyknięte komórki za pomocą urządzenia do obrazowania, wygenerowano linię komórkową Akaluc/tdTomato-dodatni K562, a jako substrat użyto AkaLumine-HCl/Akaluc10. Jeśli sprzęt do obrazowania nie jest dostępny, komórki można znakować barwnikiem fluorescencyjnym za pomocą lentiwirusa lub PiggyBac i analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Niezależnie od szczegółów przygotowania komórek, posiadanie sposobu na udowodnienie, że komórki podane do szpiku kostnego niezawodnie dostały się do BM, jest ważne dla ulepszenia tej techniki (Rysunek 1).

  1. Przygotować zawiesiny komórek (do 3 × 106 krwinek) z 20 μl buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 2% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 2 mM EDTA) lub pożywkę do rozmrażania (IMDM + 20% FBS + długopis/paciorkowiec) w probówkach PCR lub 1,5 ml i przechowywać na lodzie przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza podczas zawieszania komórek za pomocą igły. Pęcherzyki należy usunąć w jak największym stopniu tuż przed wstrzyknięciem, ponieważ wstrzyknięcie pęcherzyków powietrza może spowodować nagłą śmierć myszy.
  2. Warunek 6-10-tygodniowych dorosłych myszy z 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, łącznie 2 Gy [tryb kontroli dawki]) do 48 godzin przed wstrzyknięciem komórek.
  3. Najpierw znieczulij myszy inhalacją izofluranu w komorze indukcyjnej i utrzymuj na poziomie 2% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1-2 l/min przez stożek nosowy, aby osiągnąć stały stan znieczulenia. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u nóg i powolnego, równomiernego oddechu i utrzymuj ten stan przez cały zabieg izofluranu.
    UWAGA: Monitoruj głębokość znieczulenia co 3-5 minut przez cały zabieg, aby upewnić się, że nie ma zmian w częstości akcji serca i oddechów w przypadku manipulacji chirurgicznej i/lub szczypania ucha, palców u nóg i ogona. Kolor błon śluzowych i skóry można wykorzystać jako wskaźnik natlenienia, ponieważ będą one różowawe, jeśli myszy są w dobrej kondycji. Zachowaj ostrożność, gdy na mysz umieszczane są nieprzezroczyste zasłony, ponieważ nie zawsze można zobaczyć, co dzieje się z myszą.
  4. Przed zabiegiem należy podać myszom podskórnie 10 mg/kg karprofenu, aby zminimalizować ból i ogrzać 0,5-1,0 ml 0,9% soli fizjologicznej w celu leczenia wspomagającego.
  5. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
  6. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej lub innej powierzchni kontrolowanej termostatycznie, aby zapobiec hipotermii podczas zabiegu.
    UWAGA: Po zabiegu używana jest poduszka grzewcza o regulowanej temperaturze. Temperatura ciała myszy wynosi zwykle 37-39 °C, a podkładka powinna być nieco niższa. W praktyce temperatura jest często ustawiana na 32-36 °C.
  7. Zdezynfekować całą nogę, w której znajduje się kość udowa, która ma zostać wstrzyknięta, trzema zestawami naprzemiennych peelingów (na przemian z powidonem lub chlorheksydyną lub chlorheksydyną oraz gąbkami z gazy nasączonymi 70% etanolem).
    UWAGA: 1) Jeśli operator jest leworęczny, lewa kość udowa myszy może być łatwiejsza do wstrzyknięcia niż prawa kość udowa. 2) W tym badaniu futro nie zostało usunięte do wstrzyknięć, aby uniknąć niepotrzebnego uszkodzenia skóry, a miejsce wkłucia igły można łatwo zlokalizować bez odcinania futra. Jednak u myszy z ciemną sierścią zlokalizowanie miejsca nakłucia może być trudne, w takim przypadku należy rozważyć odcięcie sierści, ponieważ rozpoczęcie wstrzyknięcia jest szybkie i łatwe.
  8. Delikatnie ściśnij kość udową kciukiem i palcem wskazującym, aby ustabilizować nogę. Popchnij kość piszczelową palcem serdecznym lub piątym, aby kość piszczelowa była zgięta od kości udowej. Umiejscowienie jest ważne dla pomyślnego wstrzyknięcia (rysunek uzupełniający S1-S5).
    UWAGA: Użyj kleszczy, aby uszczypnąć kość, aby zapobiec obrażeniom palców; Jednak wyczucie trzonu kości udowej może być trudne i wydłuży czas zabiegu.
  9. Wprowadzić pustą sterylną igłę 27 G (1/2 cala) z dołączoną strzykawką tuż pod ścięgnem rzepki, tak aby igła była bezpiecznie osadzona między dwoma kłykciami kości udowej. Użyj krawędzi igły i delikatnie dziobnij ścięgno rzepki na górze kości udowej kilka razy, aby znaleźć najlepsze miejsce do wkłucia igły (rysunek uzupełniający S1-S5).
    UWAGA: Przed wykonaniem tej procedury konieczna jest znajomość anatomii okolicy kolana myszy. Początkujący powinni poświęcić trochę czasu na zrozumienie anatomii tego obszaru i przećwiczyć procedurę na myszy poddanej eutanazji przed próbą na żywej myszy.
  10. Obrócić igłę na zewnątrz i do góry, aby upewnić się, że jest równoległa do trzonu kości udowej.
    UWAGA: Ten manewr zapewnia niezawodną drogę do jamy szpiku, ułatwia pobieranie zawartości szpiku z trzonu kości udowej i minimalizuje dyskomfort zwierzęcia związany z zabiegiem.
  11. Obracaj igłę w kółko, powoli posuwając się do jamy szpiku udowego. Wbijać igłę, aż zauważalne będzie zmniejszenie oporu. Potwierdzić prawidłowe ułożenie igły, delikatnie przesuwając strzykawkę na boki. Jeśli możliwe jest dotknięcie krawędzi igły palcami wychodzącymi poza kość, wróć do kroku 1.9 i znajdź inny kąt i miejsce, w którym chcesz przewiercić igłę.
    1. Upewnij się, że kąt wejścia igły jest prostopadły do powierzchni czołowej kości.
      UWAGA: Teoretycznie igła musi być wstrzykiwana równolegle do kości udowej i musi być ustawiona pod kątem 90° do końców kości. Jeśli występuje opór ze strony powierzchni wewnętrznej, oznacza to, że igła została prawidłowo umieszczona w jamie udowej. Aby upewnić się, że igła jest równoległa do kości, umieść światło z boku kości i obserwuj cień kości równolegle do trzonu igły. Zmniejszenie oporu po wejściu do jamy szpiku kostnego zależy od wieku myszy: im młodsza mysz, tym łatwiej jest rozpoznać spadek oporu.
  12. Wytworzyć podciśnienie, delikatnie pociągając tłok igły do tyłu, jednocześnie przesuwając igłę do przodu i do tyłu w jamie BM. Jeśli igła znajduje się w jamie BM, trochę krwi/szpiku wydostanie się do strzykawki.
    1. Jeśli krew/szpik nie jest widoczny, zmień igłę na nową i spróbuj znaleźć tę samą trasę.
      UWAGA: Powodem zmiany igły na nową jest to, że gdy kość zatka igłę, trudno jest sprawdzić przepływ wsteczny krwi/szpiku. Zminimalizowanie liczby dróg iniekcji do jamy BM ma kluczowe znaczenie, ponieważ komórki wstrzykiwane do szpiku kostnego mogą potencjalnie wyciekać z kości udowej przez poprzednie punkty wejścia. Jeśli konieczne jest wstrzyknięcie wieloma drogami iniekcji, ryzyko wycieku można zmniejszyć, wstrzykując komórki stopniowo, a nie za pomocą szybkiego bolusa.
  13. Powoli wyjąć igłę i wprowadzić strzykawkę zawierającą komórki tą samą drogą. Spróbuj wprowadzić igłę, aż się zatrzyma (na krawędzi jamy BM) i odciągnij nieco (1-2 mm) stamtąd, aby łatwo wstrzyknąć komórki. Przed wciśnięciem tłoka i uwolnieniem komórek należy lekko zassać i sprawdzić, czy nie ma krwi/szpiku, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona. Najpierw należy sprawdzić przepływ wsteczny krwi/szpiku, a następnie powoli wciskać strzykawkę, aby wstrzyknąć komórki.
    UWAGI: Bardzo ważne jest, aby pamiętać o trasie i kącie pierwszego wstrzyknięcia przy zmianie igły. Jeśli nie można znaleźć tej samej trasy, spróbuj ponownie z oryginalną igłą użytą do wykonania pierwszej trasy. W tym czasie można użyć nowej igły, ale jeśli używana jest oryginalna igła, zakleszczoną kość należy wypchnąć raz przed użyciem. Nie należy używać igły z komórkami w celu znalezienia nowej drogi wstrzyknięcia; W przeciwnym razie kawałki kości wbite w igłę mogą zapobiec dyspersji komórek. Chociaż wgłębienie BM jest bardzo małe, objętość wstrzyknięcia powinna być mniejsza niż 30 μl, biorąc pod uwagę martwą jamę.
    1. Należy upewnić się, że szybkość wstrzykiwania jest niska, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza ze strzykawki do szpiku kostnego i zapobiec wyciekaniu komórek z miejsca nakłucia. Jeśli podczas pchania strzykawki odczuwalny jest opór, należy przesuwać igłę w górę i w dół, aby znaleźć mniej oporne miejsce w jamie ustnej.
  14. Po pomyślnym wstrzyknięciu komórek do kości udowej wyjmij igłę i strzykawkę z myszy, utrzymując nacisk na strzykawkę.
    UWAGA: Spróbuj ponownie z drugą kością udową, jeśli nie można dokończyć wstrzyknięcia. Zabieg jest bardzo stresujący dla myszy, nawet w znieczuleniu. Zawsze monitoruj parametry życiowe (tętno i częstość oddechów) myszy i staraj się zakończyć procedurę tak szybko, jak to możliwe.
  15. Zdejmij mysz ze stożka nosowego i połóż ją na czystym ręczniku papierowym, aby zapobiec zachłyśnięciu się pościeli. Podczas odzyskiwania trzymaj mysz na poduszce grzewczej lub innej powierzchni kontrolowanej termostatycznie. Monitoruj wszystkie myszy, aby sprawdzić, czy wyzdrowiały po znieczuleniu przed ponownym umieszczeniem ich na stojaku na myszy.
    UWAGA: Po aspiracji nie powinno być żadnych komplikacji ani niepokoju, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Procedura zostanie zakończona, gdy znieczulone myszy wyzdrowieją i będą w stanie poruszać się oraz docierać do jedzenia i wody.
  16. Obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju lub infekcji po zabiegu przez następne 24 godziny. Oznaki niepokoju lub infekcji obejmują ciągłe krwawienie, niedokrwistość i letarg. Jeśli którykolwiek z tych objawów zostanie zauważony po zabiegu, należy poddać zwierzę (zwierzęta) eutanazji przez wdychanie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z protokołem postępowania ze zwierzętami.

2. Pobieranie komórek szpiku kostnego z kości udowej do analizy FACS

UWAGA: Procedura pobierania komórek BM od myszy jest bardzo podobna do metod opisanych w sekcji 1 i można się jej nauczyć z wcześniejszej literatury9,11,12. Poniżej znajduje się przegląd niektórych różnic między protokołami wstrzykiwania i aspiracji BM.

  1. Przygotować 500 μl PBS + 10 mM EDTA (pożywka zawiesinowa komórek: CSM) na próbkę w celu zawieszenia aspiracji BM.
  2. Zwilżyć strzykawkę o pojemności 0,5 ml 27 g CSM przed zassaniem BM. Napełnić strzykawkę 200-500 μl CSM i natychmiast ją wydalić. Powtórz tę procedurę 2-3 razy.
  3. Delikatnie zassać BM, wycofując tłok ze strzykawki, uzyskując 20-50 μl mysiego BM. Następnie całkowicie wyjmij igłę z kości udowej i zawieś zasysaną próbkę w CSM (500 μl w probówce o pojemności 1,5 ml) do następnego etapu barwienia. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i połóż ją na czystym ręczniku papierowym, aby zapobiec zachłyśnięciu się pościeli podczas rekonwalescencji. Monitoruj wszystkie myszy, aby sprawdzić, czy wyzdrowiały po znieczuleniu przed ponownym umieszczeniem ich na stojaku na myszy.
    UWAGA: Aspirację/pobieranie próbek BM można powtórzyć, ale powtórzenie procedury tego samego dnia musi być wykonane na przeciwległej kości udowej, aby zapobiec powtarzającym się urazom tej samej nogi. Chociaż istnieje niewiele informacji na temat częstości aspiracji BM, uważamy, że aspiracja BM kości udowej jest na ogół powtarzana co 4 tygodnie i może być wykonana co najmniej 3-4 razy łącznie bez żadnych problemów (np. infekcji) w oparciu o nasze doświadczenie. Należy jednak pamiętać, że szpik kostny po przeciwnej stronie przeszczepionego szpiku kostnego ma na ogół dolne wszczepienie komórkowe.
  4. Komórki osadu ze szpiku kostnego odsysa się przez 5 minut wirowania w temperaturze 300 × g, 4 °C.
  5. Odessać supernatant, dodać 0,5-1 ml buforu do lizy ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) do każdej probówki i wirować w celu ponownego zawieszenia komórek. Ułóż na lodzie na 5-10 min.
  6. Przefiltruj każdą rurkę przez nylonową siatkę do nowej tuby.
  7. Przepłucz probówkę 1 ml buforu FACS i dodaj ją przez nylonową siatkę również do nowej probówki.
  8. Granulki wirować przez 5 minut w temperaturze 300 × g, w temperaturze 4 °C.
  9. Odessać supernatant i dodać roztwór barwiący zawierający pożądane przeciwciała13. Umieść na lodzie na 20 min.
  10. Umyj komórki i przeanalizuj je zgodnie z konfiguracją eksperymentalną.
    1. Umyć komórki buforem FACS (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) i wybarwić je przeciwciałami przez 30 minut na lodzie w całkowitej objętości 50 μL. Bezpośrednio przed analizą lub sortowaniem przemyć i wybarwić komórki jodkiem propidyny (PI) w końcowym stężeniu 1 μg/ml. Wykonaj analizy po sortowaniu, aby zweryfikować czystość posortowanych populacji komórek.
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej są szczegółowo opisane w tabeli materiałów.
    2. Użyj następujących strategii bramkowania FACS ( Rysunek 2-< silna klasa = "xfig">7) do analizy przeszczepionych komórek ze szpiku kostnego myszy.
      1. Rozróżnianie populacji komórek według ich właściwości rozpraszania do przodu (rozmiar) i z boku (ziarnistość).
      2. Wykonaj dyskryminację dubletową, wykreślając FSC-H vs FSC-W, podążając za SSC-H vs SSC-W.
      3. Wyklucz martwe komórki.
      4. Rozróżnij populacje komórek według CD45 ludzkiego i mysiego CD45. Te kombinacje barwienia przeciwciał umożliwiają wykrycie ludzkich CD3, CD19 i CD33, a także w ludzkiej frakcji CD45.
        UWAGA: Przed barwieniem próbek należy pamiętać o użyciu mysich i ludzkich bloków Fc, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Zwykle barwimy blokami Fc (mysz + człowiek) przez 10 minut na lodzie, a następnie dodajemy przeciwciała bez mycia komórek. Zapoznaj się z instrukcjami każdej firmy dotyczącymi stosowania przeciwciał blokowych Fc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzeganie tych protokołów1,14,15,16,17,18,19,20, każda próbka została przeszczepiona i ustalono model myszy ksenoprzeszczepu. Celem eksperymentów było pokazanie iniekcji IF z kilkoma typami komórek ludzkich i po aspiracji/analizie szpiku kostnego u żyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele ksenoprzeszczepów mysich są ważne dla badania zarówno normalnej, jak i patologicznej hematopoezy u ludzi. BM jest źródłem hematopoezy3; dlatego badanie chorób hematologicznych wymaga udanego wszczepienia rzadkich ludzkich komórek macierzystych do mysiego BM. Do tej pory opisano metody przeszczepów, takie jak żyła ogonowa, żyła zaoczodołowa i wstrzyknięcie IF, i wiadomo, że każda z tych metod może przeszczepić przeszczepione komórki. Wstrzyknięcie IF jest metodą przeszczepu, która została za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.M. jest członkiem rad doradczych Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics i 858 Therapeutics oraz wynalazcą wielu patentów związanych z immunoterapią raka CD47 licencjonowanych przez Gilead Sciences. R.M. jest współzałożycielem i udziałowcem Pheast Therapeutics, MyeloGene i Orbital Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Majeti za ich pomoc, wsparcie, zachętę i inspirację przez te wszystkie lata. Dziękujemy Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej Instytutu Komórek Macierzystych Stanforda, Programowi Binns do Badań nad Krwią Pępowinową oraz pacjentom za oddanie próbek. W przypadku próbek od ludzi, normalny ludzki szpik kostny dawcy i komórki krwi obwodowej zostały pobrane prosto z AllCells lub Stanford Blood Center. Dziękujemy laboratorium Nakauchi na Uniwersytecie Stanforda za przekazanie plazmidu pBac-AkaLuc-tdTomato. Przede wszystkim chcielibyśmy podziękować weterynarzom i personelowi kontroli zwierząt w Centrum Usług Weterynaryjnych w Stanford, którzy opiekują się naszymi myszami. W szczególności Mike Alvares, kierownik centrum dla zwierząt, był tak dokładny w swoim zarządzaniu myszami, że nie jest przesadą stwierdzenie, że bez niego nasze badania nie byłyby możliwe.

Ta praca była wspierana przez granty NIH 1R01HL142637 i 1R01CA251331, Stanford Ludwig Center for Cancer Stem Cell Research and Medicine, oraz program Blood Cancer Discoveries Grant poprzez The Leukemia & Lymphoma Society, The Mark Foundation for Cancer Research i The Paul G. Allen Frontiers Group, wszystko dla R.M. R.M. jest laureatem nagrody Leukemia and Lymphoma Society Scholar Award. Y.N. był wspierany przez Nakayama Foundation for Human Science i Stanford Stypendium podoktorskie Dziekana Uniwersyteckiej Szkoły Medycznej. A.E. był wspierany przez NCI w ramach nagrody F32CA250304, Advanced Residency Training Program na Uniwersytecie Stanforda oraz American Society of Hematology Scholar Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1/2 ml, 27 gBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Bufor lizującyQualoty Biologiczny118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biologiczny promiennikKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorheksydynaNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Alkohol etylowy, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Surowica bydlęca płodu (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
cytometr przepływowy, AriaIIBeckton Dickinson (BD)sortowanie komórek
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Izofluran, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. Myszy Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USAbr/> Szczep #:005557Sześcio- do dziesięciotygodniowy samiec lub samica 
Maść okulistyczna, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen do wstrzykiwań (kaprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7,4domowej roboty
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Powidon-jodBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (w USA)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020Panel przeciwciał do wszczepienia (in vivo, mysi szpik kostny)
AntigenRozcieńczenie<
strong>Antygen: Anty-ludzki CD45
Fluorofor: V450
klon: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antygen: Anty-mysz CD45.1
Fluorofor: PE-Cy7
klon: A20		eBioscience25-0453-811:50
antygen:Anty-mysz TER-119
Fluorofor: PE-Cy5
klon: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antygen:Anty-ludzki CD3
Fluorofor: APC-Cy7
Klon: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antygen:Anty-ludzki CD19
Fluorofor: APC
Klon: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antygen:Anty-ludzki CD33
Fluorofor: PE
Klon: WM53		BD Biosciences5554501:25
żywy/martwy barwienieConc.
PIInvitrogen1 μ g/ml
Koraliki kompensacyjne
Kontrola negatywnaBD BiosciencesSzczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji
Anty-mysz Ig, κBD Biosciences Zobacz instrukcję, aby uzyskać szczegółowe informacje
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886(2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660(2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873(2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykni cie doszpikoweaspiracja szpiku kostnegohematopoetyczne kom rki macierzystemysi model ksenoprzeszczepuseryjna analiza szpiku kostnegoengraftment kom rekhematopoetyczne kom rki progenitorowetransplantacja szpiku kostnegobufor FACSobrazowanie bioluminescencyjne

Powiązane artykuły