Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przewód pokarmowy (GI) pełni szereg funkcji niezbędnych do życia. Wady wrodzone wpływające na jego rozwój mogą prowadzić do zaburzeń nerwowo-mięśniowych jelit, co podkreśla znaczenie zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiono metodę izolacji jelit z larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia w celu uzyskania żywych, żywotnych komórek, które można wykorzystać do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq). Protokół ten opiera się na ręcznym rozbiorze jelita danio pręgowanego, a następnie dysocjacji enzymatycznej z papainą. Następnie komórki są poddawane sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją, a żywe komórki są zbierane do sekwencjonowania scRNA. Dzięki tej metodzie udało nam się zidentyfikować różne typy komórek jelitowych, w tym komórki nabłonkowe, zrębowe, krwi, mięśniowe i odpornościowe, a także neurony jelitowe i glej. Dlatego uważamy, że jest to cenne źródło do badania składu przewodu pokarmowego w zdrowiu i chorobie przy użyciu danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Przewód pokarmowy (GI) to złożony system, który odgrywa istotną rolę w ogólnym zdrowiu i samopoczuciu. Odpowiada za trawienie i wchłanianie składników odżywczych, a także eliminację produktów przemiany materii1,2. Przewód pokarmowy składa się z wielu typów komórek, w tym komórek nabłonkowych, komórek mięśni gładkich, komórek odpornościowych i jelitowego układu nerwowego (ENS), które ściśle komunikują się ze sobą w celu regulacji i utrzymania prawidłowej funkcji jelit3,4,5. Wady w rozwoju przewodu pokarmowego mogą mieć daleko idące skutki w różnych aspektach, takich jak wchłanianie składników odżywczych, skład mikrobioty, oś jelitowo-mózgowa i ENS, prowadząc do kilku zaburzeń nerwowo-mięśniowych jelit, takich jak choroba Hirschsprunga i przewlekła rzekoma niedrożność jelit6,7. Zaburzenia te charakteryzują się ciężką dysmotoryką jelit spowodowaną zmianami w różnych kluczowych komórkach, takich jak komórki śródmiąższowe Cajal, komórki mięśni gładkich i ENS6,8,9. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego są nadal słabo poznane.
Danio pręgowany jest cennym organizmem modelowym do badania rozwoju i dysfunkcji przewodu pokarmowego ze względu na szybki rozwój embrionalny, przezroczystość w stadium embrionalnym i larwalnym oraz wykonalność genetyczną10,11,12,13,14. Dostępne są liczne transgeniczne linie danio pręgowanego wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych. Przykładem takiej linii jest tg(phox2bb:GFP) danio pręgowany, powszechnie używany do badania ENS, ponieważ wszystkie komórki phox2bb+, w tym neurony jelitowe, są oznaczone jako 15,16. Tutaj, korzystając z linii zebrywanego tg(phox2bb:GFP), przedstawiamy metodę izolacji jelitowej larw 5 dni po zapłodnieniu (dpf) do analizy sekwencjonowania RNA jednokomórkowego (scRNA-seq) (Rysunek 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty i hodowla danio pręgowanego były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Erasmusa MC i ustawodawstwa dotyczącego dobrostanu zwierząt. Wykorzystanie larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia należy do kategorii eksperymentów, które nie wymagają formalnego zatwierdzenia etycznego, zgodnie z holenderskimi przepisami.
1. Uzyskanie larw typu dzikiego i tg(phox2bb:GFP) 5 dni po zapłodnieniu (dpf)
- Rozpocznij hodowlę danio pręgowanego typu dzikiego i zbierz 50 jaj na buforowanym przez HEPES podłożu E3 (zwanym dalej E3) na 15-centymetrowej szalce Petriego. Użyj tych ryb jako kontroli negatywnej do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FAC).
- Rozpocznij hodowlę danio pręgowanego tg(phox2bb:GFP) i zbierz około 300 jaj w E3 na 15-centymetrowej szalce Petriego.
- Przechowywać zapłodnione jaja w E3 (maksymalnie 50 jaj/półkę) w cyklu 14 godzin/10 godzin światła/ciemności, w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.
- Po 1 dpf usuń niezapłodnione jaja i pozwól zapłodnionym rozwinąć się do 5 dpf.
- Wybierz larwy tg(phox2bb:GFP) przy 1 dpf.
2. Dysocjacja całych larw typu dzikiego
- Znieczulić 5 dpf larw 0,016% trikainą.
- Pokrój 30 danio pręgowanego na małe kawałki za pomocą żyletki na szalce Petriego zawierającej 1 ml 10x roztworu trypsyny-EDTA.
- Przenieś posiekanego danio pręgowanego do probówki mikrowirówkowej o całkowitej objętości 2 ml 10x roztworu trypsyny-EDTA i pozostaw na lodzie na 3 godziny. Pipetuj w górę i w dół pipetą P1000 co godzinę, aby stymulować dysocjację.
3. Izolacja jelit
- Umieścić 6-10 5 dpf larw znieczulonych 0,016% trikainą w rzędzie, na 1,8% agarozowej płytce (0,45 g agarozy w 25 ml E3), pod mikroskopem preparacyjnym
- Umieść jedną szpilkę owada w głowie danio pręgowanego.
- Usuń cały pozostały E3 za pomocą chusteczki.
- Odizoluj jelito za pomocą innej szpilki do owadów, nie naruszając żadnych innych narządów. Upewnij się, że żółtko zostało usunięte (rysunek uzupełniający S1A).
- Po wyizolowaniu należy sprawdzić jelito i w razie potrzeby usunąć cały materiał niejelitowy (np. skórę, tłuszcz, wątrobę).
- Zbierz jelito pęsetą i umieść je w probówce do mikrowirówki, zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), na lodzie.
UWAGA: Należy wyizolować co najmniej 244 jelita, utrzymując całkowity czas rozwarstwienia na poziomie 3 godzin. Jest to wykonalne, gdy dwie osoby pracują równolegle.
4. Dysocjacja jelit
- Bezpośrednio po rozebraniu wszystkich jelit należy odwirować probówkę do mikrowirówki z pełną prędkością (13 800 × g) przez 30 s.
- Usuń PBS/10% FCS, ale pozostaw niewielką ilość (~100 μL), aby zapobiec wysuszeniu jelit. Dodać 500 μl 2,17 mg/ml papainy do HBSS zawierającego CaCl2 i MgCl2, aby dysocjować komórki.
- Aktywuj papainę za pomocą 2,5 μl cysteiny (1 M).
- Inkubować jelita w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Pipetować w górę i w dół do połowy (po 5 minutach) w celu pobudzenia enzymatycznego trawienia tkanek.
- Przenieś komórki do probówki FACS za pomocą sitka do komórek 35 μm, wstępnie zwilżonego 0,5 ml PBS/10% FCS.
- Umyj sitko, dodając łącznie 2 ml PBS/10% FCS w krokach co 0,5 ml.
- Wirować przy 700 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl PBS/10% FCS.
- Dodać 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do znakowania martwych komórek (1:1,000) i inkubować przez 5 minut, aby umożliwić ich wykluczenie podczas FACS.
5. Wzbogacenie FACS
- Użyj próbki typu dzikiego, aby ustawić bramki posortowanej populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek na cytometrze przepływowym (rysunek uzupełniający S1B-E).
- Użyj dyszy 100 μm, ustaw precyzję sortowania na czystość i umieść probówkę zbiorczą zawierającą 200 μl PBS/5% FCS w maszynie FACS.
- Załaduj zawiesinę komórkową jelit i posortuj żywe (DAPI-ujemne), pojedyncze komórki do probówki zbiorczej (Rysunek 2C), wykluczając dublety (Rysunek 2B) i martwe komórki (Rysunek 2C).
UWAGA: W przypadku danio pręgowanego tg(phox2bb) proporcja komórek GFP+ jest sprawdzana tylko w celach informacyjnych, ponieważ wszystkie pojedyncze żywe komórki są sortowane. - Trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie po sortowaniu komórek.
- Policz zawiesinę komórek za pomocą hemocytometru, łącznie z kontrolą żywotności za pomocą błękitu trypanowego. Jeśli rentowność wynosi co najmniej 80%, przejdź do następnego kroku.
- Komórki są teraz gotowe do przetwarzania na scRNAseq (tj. 10-krotną platformę Genomics Chromium). Użyj około 20 000 komórek na próbkę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki zastosowaniu tego protokołu pomyślnie wyizolowano i zdysocjowano całe jelita larw w 5. dniu po zapłodnieniu (5 dpf). Wykorzystanie papainy jako enzymu dysocjującego pozwoliło znacząco zwiększyć żywotność komórek, co umożliwiło zarejestrowanie 46 139 zdarzeń obejmujących pojedyncze, żywe komórki (6,4% wszystkich komórek) z 244 wyizolowanych jelit (Ryc. 2A). W charakterze kontroli wykorzystano całe larwy typu dzikiego, aby upewnić się, że proces sortowania został zoptymalizowany, co umo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiono metodę izolacji i dysocjacji jelita 5 dpf larw danio pręgowanego za pomocą FACS. Dzięki tej metodzie różne typy komórek jelitowych zostały z powodzeniem zebrane i przeanalizowane za pomocą scRNA-seq, przy użyciu platformy 10x Genomics Chromium. Wybraliśmy linię danio pręgowanego tg (phox2bb: GFP), ponieważ chcieliśmy uzyskać wskazówkę, że żywotne komórki ENS również zostaną wyizolowane (Rysunek 2D). Należy jednak zauważyć, że metodę tę można łatwo rozsze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez przyjaciół Fundacji Sophia (SSWO WAR-63).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsyna (0,5%)-EDTA (0,2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 ml probówka okrągłodenna z nasadką sitka komórkowego | Falcon | 352235 | |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Probówka okrągłodenna 5 ml (probówki FACS) | zatrzask BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | Nie dotyczy | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Mikroskop preparacyjny | Olympus SZX16 | ||
| Sortownik FACSAria III | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS z CaCl2 i MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Szpilki do owadów | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Kot#T8154 |
Bibliografia
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070(2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290(2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).
- Kline, M. Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
