Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

DOI:

10.3791/65878

⸱

29 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nośniki substancji rozpuszczonych (SLC) to transportery błonowe, które importują i eksportują szereg endogennych i egzogennych substratów, w tym jony, składniki odżywcze, metabolity, neuroprzekaźniki i farmaceutyki. Pomimo tego, że stały się atrakcyjnymi celami terapeutycznymi i markerami choroby, ta grupa białek jest nadal stosunkowo słabo leczona przez obecne farmaceutyki. Projekty odkrywania leków dla tych transporterów są utrudnione przez ograniczoną wiedzę strukturalną, funkcjonalną i fizjologiczną, ostatecznie ze względu na trudności w ekspresji i oczyszczaniu tej klasy białek osadzonych w błonie. W tym miejscu demonstrujemy metody uzyskiwania miligramowych ilości ludzkich białek transportowych SLC o wysokiej czystości przy użyciu sekwencji genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów. W połączeniu z systematyczną eksploracją konstrukcji konstruktów i ekspresji o wysokiej przepustowości, protokoły te zapewniają zachowanie integralności strukturalnej i aktywności biochemicznej docelowych białek. Podkreślamy również krytyczne etapy ekspresji komórek eukariotycznych, oczyszczania powinowactwa i chromatografii wykluczającej wielkość tych białek. Ostatecznie ten przepływ pracy pozwala uzyskać czyste, funkcjonalnie aktywne i stabilne preparaty białkowe odpowiednie do określania struktury w wysokiej rozdzielczości, badań transportu, testów zaangażowania małych cząsteczek i wysokoprzepustowych badań przesiewowych in vitro.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe od dawna są celem zarówno dla badaczy, jak i przemysłu farmaceutycznego. Spośród nich nośniki substancji rozpuszczonych (SLC) są rodziną ponad 400 wtórnych genów transportowych zakodowanych w ludzkim genomie1. Transportery te biorą udział w imporcie i eksporcie wielu cząsteczek, w tym jonów2, neuroprzekaźników3, lipids4,5,6,7, aminokwasy8, składniki odżywcze9,10,11, oraz farmaceutyki12. Przy tak szerokim zakresie substratów, białka te są również zaangażowane w szereg patofizjologii poprzez transport toksyn13, transport i hamowanie przez narkotyki nadużywane14,15, lub szkodliwe mutacje16. Homologi bakteryjne posłużyły jako prototypy podstawowego mechanizmu transportu kilku rodzin SLC17,18,19,20,21,22,23,24,25. W przeciwieństwie do białek ludzkich, ortologi prokariotyczne są często lepiej wyrażane w dobrze poznanym systemie ekspresji Escherichia coli26,27 i są bardziej stabilne w mniejszych detergentach, które dają dobrze uporządkowane kryształy do krystalografii rentgenowskiej28. Jednak różnice w sekwencji i funkcjonalności komplikują wykorzystanie tych daleko spokrewnionych białek do odkrywania leków29,30. W związku z tym często potrzebne jest bezpośrednie badanie ludzkiego białka, aby rozszyfrować mechanizm działania leków ukierunkowanych na SLCs31,32,33,34,35. Podczas gdy ostatnie postępy w mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM) umożliwiły strukturalną charakterystykę SLC w warunkach bardziej natywnych36,37, trudności w ekspresji i oczyszczaniu tych białek pozostają wyzwaniem dla opracowania ukierunkowanych terapii i diagnostyki.

Aby złagodzić ten problem, konsorcjum RESOLUTE (re-solute.eu) opracowało zasoby i protokoły do ekspresji i oczyszczania na dużą skalę ludzkich białek z rodziny SLC38. Zaczynając od genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów, opracowaliśmy metody wysokoprzepustowego klonowania i badań przesiewowych konstruktów SLC. Metody te były systematycznie stosowane do całej rodziny SLC, geny sklonowano do systemu ekspresji wirusa BacMam i przetestowano ekspresję białka w ludzkich liniach komórkowych39 w oparciu o wcześniej opisane metody wysokoprzepustowego klonowania i testowania ekspresji40. Podsumowując, gen SLC jest klonowany z plazmidu pDONR221 do wektora pHTBV1.1. Konstrukt ten jest następnie wykorzystywany do transpozycji interesującego genu do wektora bakcydowego do transfekcji komórek owadów, który zawiera promotor wirusa cytomegalii i elementy wzmacniające ekspresję w komórkach ssaków. Powstały w ten sposób bakulowirus może być wykorzystany do transdukcji komórek ssaków w celu ekspresji docelowego białka SLC.

Dalej rozwijaliśmy ustandaryzowane metody ekspresji na dużą skalę i stabilnego oczyszczania wybranych SLC (Rysunek 1). Ten protokół zawiera wiele punktów kontrolnych, aby ułatwić skuteczne rozwiązywanie problemów i zminimalizować zmienność między eksperymentami. Warto zauważyć, że rutynowe monitorowanie ekspresji i lokalizacji białek, a także optymalizacja warunków oczyszczania na małą skalę dla poszczególnych celów, były wspomagane przez znaczniki Strep i Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

Ostatecznie, te chemicznie czyste i strukturalnie jednorodne próbki białek mogą być używane do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM), biochemicznych testów zaangażowania w cele, immunizacji w celu wytworzenia spoiwa i bezkomórkowych badań funkcjonalnych poprzez rekonstytucję do chemicznie zdefiniowanych liposomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie zoptymalizowane pod kątem kodonów geny RESOLUTE SLC zostały zdeponowane w AddGene43, do którego linki są dostępne na liście publicznych odczynników RESOLUTE44. Geny te zostały sklonowane do plazmidu pDONR221 i umożliwiają bezpośrednie klonowanie genów do wektora docelowego za pomocą klonowania rekombinacyjnego45. Aby zmaksymalizować równoległość, komórki bakteryjne, owadzie i ssaków są hodowane w formacie blokowym odpowiednio do produkcji bakcydów (sekcja 3), amplifikacji bakulowirusa (sekcja 5) i testowania ekspresji (sekcja 6). Na tych etapach wymagana jest wytrząsarka do mikroekspresji, aby zapewnić wystarczające wymieszanie i napowietrzenie.

1. (Wysokoprzepustowe) klonowanie SLC do pHTBV1.1 bacmid

UWAGA: Krok klonowania wykorzystuje protokół klonowania rekombinacyjnego do efektywnego klonowania i transformacji w Escherichia coli (E. coli) przy użyciu metody szoku cieplnego46. Protokół jest przeznaczony do wysokowydajnego i równoległego klonowania wielu celów lub konstrukcji, ale można go łatwo dostosować do mniejszych skal.

  1. Na 96-dołkowej płytce dodać 150 ng klonu pDONR221 SLC i 100 ng wektora pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Doprowadzić objętość reakcji do 8 μl za pomocą 10 mM Tris pH 8,0, a następnie dodać 2 μl mieszaniny enzymów rekombinacyjnych.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, dodać 1 μl proteinazy K i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Użyj 4 μl mieszaniny reakcyjnej do przekształcenia 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli MACH-1 przy użyciu metody szoku termicznego46 i pożywki SOC do odzysku. Płytkę na agarze LB zawierającym 5% sacharozy lub agarze SOC, uzupełnionym 100 μg/ml ampicyliny.
  4. Zidentyfikuj kolonie, w których znajduje się wektor pHTBV1.1 z wstawieniem genu SLC, używając odpowiednich starterów (patrz Tabela 1) i standardowych protokołów dla colony PCR47.
  5. Oczyść rekombinowany plazmid z pojedynczych kolonii z genem będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu.

2. Transpozycja

UWAGA: Następujące kroki są używane do transpozycji genów SLC z wektora pHTBV1.1 do bakidu do generowania bakulowirusa BacMam w komórkach Sf9. Korzystając z metody szoku cieplnego46, wektor pHTBV1.1 jest przekształcany w komórki E. coli kompetentne DH10Bac, które zawierają macierzysty bakmid z fuzją lacZ-mini-attTn7. Transpozycja zachodzi między elementami wektora pHTBV1.1 a macierzystym bakmidem w obecności białek transpozycyjnych dostarczanych przez plazmid pomocniczy48. Skład roztworów stosowanych w niniejszym protokole znajduje się w Tabeli 2.

  1. Używając 3 μl oczyszczonego DNA wektora pHTBV1.1 o stężeniu 100-200 ng/μl, przekształć DH10Bac metodą szoku cieplnego na 96-dołkowej płytce PCR. Odzyskać komórki, inkubując je w pożywce regeneracyjnej przez 4-5 godzin w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 700 obr./min w wytrząsarce do mikroekspresji.
  2. Rozprowadzić 50 μl przekształconych komórek na płytkach selekcyjnych DH10Bac. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, przykryte folią.
  3. Wybierz pojedynczą białą kolonię (zawierającą rekombinowane DNA) i pasuj do rozcieńczenia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

3. Wysokowydajna produkcja bakcydów

UWAGA: Protokół opisuje kroki ekstrakcji bakcydów za pomocą zestawu do oczyszczania 96-dołkowego bakmidu.

  1. Zaszczepić pojedyncze białe kolonie (wyizolowane z płytek smugowych do rozcieńczenia) do studzienek bloku 96 głębokich dołków, zawierających 1 ml pożywki 2x LB (Tabela 2).
  2. Przykryć porowatym uszczelnieniem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc przy prędkości 700 obr./min w wytrząsarce do mikroekspresji.
  3. Przygotować zapas glicerolu w komórkach, mieszając 120 μl kultury z 30 μl 60% glicerolu na płytce do mikromiareczkowania i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Odwirować blok studzienki głębinowej o stężeniu 2 600 × g przez 30 minut. Zdekantować supernatant do odpowiedniego pojemnika w celu odkażenia. Odwróć klocek i delikatnie postukaj w ręcznik papierowy. Dodać 250 μl roztworu 1 do każdego dołka bloku za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Zawiesić granulki; w razie potrzeby użyć pipety wielokanałowej.
  6. Dodaj 250 μl roztworu 2 do każdej studzienki i zamknij matą silikonową. Odwróć delikatnie 5x i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wiruj bardzo krótko.
  7. Dodać 300 μl roztworu 3 i zamknąć matą silikonową. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie, odwracając 5x.
  8. Umieścić próbkę na lodzie na 20 minut, następnie odwirować przy 2 600 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieść klarowny supernatant do nowego bloku 96-dołkowego. Ponownie odwirować w temperaturze 2 600 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  10. W świeżym bloku z 96 dołkami głębokimi dozuj 0,8 ml 100% izopropanolu na studzienkę. Dodać 0,8 ml supernatantów z odpowiednich studzienek.
  11. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut lub przez noc w temperaturze 4 °C, aby uzyskać więcej bakcydu.
  12. Wirować przy 2 600 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego spryskaj zewnętrzną część bloku 70% etanolem, otwórz blok i wyrzuć supernatant.
  14. Dodaj 500 μl 70% etanolu (v/v) do każdego dołka i delikatnie postukaj w blok, aby umyć osad. Przykryć samoprzylepną uszczelką z tworzywa sztucznego i odwirować w temperaturze 2 600 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Wewnątrz Szafy Bezpieczeństwa Biologicznego otwórz blok i wyrzuć supernatant. Bardzo delikatnie postukaj klockiem w ręcznik papierowy, aby usunąć etanol. Pozostaw blok do wyschnięcia wewnątrz okapu na 1-2 godziny lub w piekarniku o temperaturze 50 °C.
  16. Dodać 50 μl sterylnego buforu TE w celu ponownego zawieszenia DNA bakmida i uszczelnić za pomocą samoprzylepnej plastikowej uszczelki. Przenieść zawartość na płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V. Przechowywać DNA bakterii w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia oczyszczania testowego, a następnie przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Chociaż nie jest to rutynowo mierzone, generalnie można oczekiwać wydajności od 500 do 2,000 ng/μL bakimidowego DNA.
  17. Użyj standardowych metod PCR dla kolonii47 i następujących starterów wektorowych, aby przeprowadzić badania przesiewowe w poszukiwaniu bakterii, które pomyślnie włączyły gen docelowy:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    UWAGA: Amplikon będzie o około 700 pz większy niż gen docelowy.

4. Transfekcja

UWAGA: Te kroki są używane do transfekcji komórek owadów Sf9 z wytworzonym bakmidem, co powoduje, że komórki owadów wytwarzają cząsteczki bakulowirusa (P0).

  1. Hoduj komórki Sf9 w pożywce dla owadów bez surowicy do gęstości 2,0-2,4 × 106 komórek/ml. Rozcieńczyć komórki do 2 × 105 komórek/ml w pożywce dla owadów bez surowicy i dozować 1 ml rozcieńczonych komórek do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Dołącz tylko odczynnik do transfekcji, a także kontrolę tylko komórek. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie komórek.
  2. Zmieszać 38 μl na studzienkę pożywki z insektami bez surowicy z 2 μl na studzienkę odczynnika do transfekcji. Dozować 40 μl mieszaniny do 96-dołkowej sterylnej płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem. Dodać 2 μl rekombinowanego bakinowanego DNA w stężeniu 0,5-2,0 μg/μl, przykryć płytkę i inkubować w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego przez 15 minut.
  3. Dodać 160 μl pożywki dla owadów niezawierających surowicy do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania zawierającej mieszaninę odczynników do transfekcji DNA.
  4. Odessać pożywkę z komórek w kroku 4.1. Delikatnie dodać 200 μl mieszaniny odczynnika bakmidowego i pożywki do transfekcji na komórki, przykryć płytkę i inkubować przez 4 godziny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 27 °C.
  5. Do każdej studzienki dodaj 400 μl pożywki przeciw owadom bez surowicy uzupełnionej o 2% FBS. Aby zmniejszyć parowanie, przenieś płytkę do czystej plastikowej torby, ale nie zamykaj jej. Inkubować płytkę w temperaturze 27 °C przez 72 godziny w wilgotnym inkubatorze.
  6. Po 3 dniach przenieść pożywkę z płytki do sterylnego bloku z 96 dołkami i odwirować przy 1 500 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść oczyszczony supernatant zawierający bakulowirusa P0 do sterylnego bloku z 96 dołamkami głębokimi i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.

5. Amplifikacja bakulowirusa BacMam

UWAGA: Następujące kroki są używane do amplifikacji początkowego bakulowirusa P0 do szczepów wirusowych o wyższym mianie, a mianowicie P1, P2 i P3. Końcowe miano P3 jest odpowiednie dla transdukcji i ekspresji białka. Aby zapewnić wydajność i równoległość, protokół ten wykorzystuje stałe proporcje objętościowe do amplifikacji wirusa, które zostały empirycznie zoptymalizowane. Jeśli jednak następnie transdukowane komórki nie wykazują fluorescencji GFP i zwiększonej średnicy komórek pod mikroskopem lub jeśli ekspresja białka nie powiedzie się (patrz sekcje 6 i 8), amplifikacja bakulowirusa powinna zostać ponownie zoptymalizowana pod kątem niskiej wielokrotności infekcji na każdym etapie po ilościowym określeniu miana bakulowirusa49,50,51,52, a infekcja monitorowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej GFP i zwiększona średnica komórek53.

  1. Przygotuj zapas wirusa P1, hodując komórki Sf9 w pożywce dla owadów bez surowicy do gęstości 2 × 106 komórek/ml, dodaj 2% FBS i umieść komórki w bloku z 24 głębokimi dołkami w końcowej objętości 3 ml na studzienkę. Dodać 120 μl zapasu wirusa P0 do komórek.
  2. Inkubować blok w temperaturze 27 °C, wytrząsając z prędkością 450 obr./min w wytrząsarce do mikroekspresji przez 66-72 godziny. Odwirować blok przy 1 500 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant do 96 bloków głębokich. Przechowywać jako zapas wirusa P1 w temperaturze 4 °C z dala od światła.
  3. Przygotować zapas wirusa P2, infekując 50 ml komórek Sf9 (2 × 106 komórek/ml gęstości komórek), hodowanych w pożywce dla owadów bez surowicy uzupełnionej 2% FBS, z 250 μl zapasu wirusa P1. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C, wytrząsając przy 110 obr./min.
  4. Szczep wirusa P2 zebrać po 66–72 godzinach, wirując w temperaturze 1 500 × g przez 20 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
  5. Przygotuj zapas wirusa P3, infekując pożądaną objętość komórek Sf9 (2 × 106 komórek/ml gęstości komórek) zapasem wirusa P2 w skali 1:200 (v/v). Inkubować komórki w temperaturze 27 °C, wytrząsając przy 110 obr./min.
  6. Po 66–72 godzinach odwirować przy 1 500 × g przez 20 minut i zebrać wirusa P3 poprzez zebranie supernatantu i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.

6. Transdukcja do testowania wyrażeń

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje testowanie wyrażeń na małą skalę i może być zmodyfikowana do równoległego testowania wielu konstrukcji przy użyciu bloków głębokich studni.

  1. Przygotować 20% (w/v) roztwór glikolu polietylenowego, rozpuszczając 200 g PEG 10 000 i 12 g NaCl w 600 ml podwójnie destylowanego H2O. Wymieszać i doprowadzić do końcowej objętości 1 000 ml. Autoklaw roztworu.
  2. Dodać 300 μl zebranego wirusa P1 do studzienek w bloku z 24 studniami głębinowymi i 75 μl roztworu PEG do każdej studzienki. Inkubować blok w wytrząsarce do mikroekspresji w temperaturze 18 °C, wytrząsając z prędkością 300 obr./min przez 5 minut, a następnie przechowywać blok w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Ponownie wstrząsnąć blokiem przy 300 obr./min przez 30 min w temperaturze 18 °C i odwirować blok przy 3 000 × g przez 45 minut. Wyrzucić supernatant za pomocą pipety w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
  4. Przygotować dostosowane do zawiesiny komórki HEK293 w pożywce HEK293 o gęstości 2 × 106 komórek/ml i zasiać 3 ml do każdej studzienki zawierającej osad wirusa, uzupełniając 5 mM maślanu sodu.
  5. Inkubować blok w temperaturze 30 °C z 8% CO2 podczas wytrząsania z prędkością 200–250 obr./min przez 72 h.
    UWAGA: Zalecane przez dostawcę stężenia CO2 podczas hodowli komórkowej są różne dla linii komórkowych przystosowanych do zawiesiny i przodków HEK293, odpowiednio 8% i 5%.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 900 × g przez 20 minut i przemyć każdą studzienkę 1 ml PBS.
    UWAGA: Odessać 10 μl zawieszonych komórek i obejrzeć komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym z kostką filtrującą kompatybilną z GFP, aby ocenić ekspresję i lokalizację białka. Odessać 10-15 μl zawieszonych komórek i uruchomić żel SDS-PAGE dla całych komórek do wykrywania fluorescencji w żelu GFP54.
  7. Ponownie odwirować w temperaturze 900 × g przez 20 minut. Zamrażać granulki w temperaturze -80 °C.

7. Wysokowydajne oczyszczanie testowe na małą skalę

UWAGA: Poniższe kroki opisują proces szybkiego oczyszczania testu w formacie bloku 24-dołkowego do badania przesiewowego poziomów ekspresji poszczególnych SLC. Skład roztworów stosowanych w niniejszym protokole znajduje się w Tabeli 2.

  1. Dodaj 1 ml buforu do lizy HT do każdej studzienki pobranych komórek i przystąp do sonikacji na lodzie przez łączną długość 4 minut (cyklicznie 3 s włączenia/15 s wyłączenia) w 24-dołkowych blokach za pomocą 24-głowicowej sondy.
  2. Przenieś zawartość do bloku studzienki o głębokości 96 cm, dodaj 125 μl detergentu i zamknij silikonową uszczelką. Delikatnie obracaj blok w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Alternatywnie, dodać dodecylomaltozyd (DDM) i hemibursztynian cholesterolu (CHS) bezpośrednio do bloków 24-dołkowych i umieścić je na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 4 °C.
  3. Odwirować blok o stężeniu 2600 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowego bloku z 96 dołekami.
  4. Przygotuj 50% zapas żywicy Strep-Tactin o dużej pojemności, wstępnie zrównoważonej buforem do lizy.
  5. Do każdego dołka dodać 100 μl zawieszonego wywaru z żywicy.
  6. Przykryć blok silikonową uszczelką i obracać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, a następnie bardzo krótko odwirować (do 200 × g) w celu usunięcia cieczy przywierającej do pokrywy.
  7. Umieść 96-dołkową płytkę filtracyjną na pustym bloku i przenieś mieszaninę żywicy i supernatantu na płytę filtracyjną. Przepłukać studzienki bloku studni głębinowej 800 μl buforu płuczącego HT i przenieść do bloku filtracyjnego w celu zebrania maksymalnej ilości żywicy.
  8. Pozostawić bufor do przesączenia się lub odwirować na krótko przy stężeniu 200 × g i zebrać przepływ. Umieścić płytę filtracyjną na nowym bloku płuczącym i przemyć żywicę 800 μl buforu płuczącego HT, pozwalając buforowi przepłynąć (lub na krótko odwirować). Powtórzyć etap płukania jeszcze dwa razy i odwirować blok o sile 500 × g przez 3 minuty w celu usunięcia resztek buforu płuczącego HT.
  9. Umieść płytkę filtracyjną na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania. Dodać 50 μl buforu elucyjnego HT i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Eluować próbki przez odwirowanie z prędkością 500 × g przez 3 minuty.
  10. Uruchomić 15 μl eluowanej próbki na barwionym Coomassie żelu SDS-PAGE, aby sprawdzić ekspresję białka. Załadować pozostałe próbki eluentu do systemu chromatografii wykluczania wielkości (SEC) lub chromatografii wykluczania wielkości z detekcją fluorescencji (FSEC) w celu oceny monodyspersji białek w DDM / CHS.

8. Transdukcja dla ekspresji na dużą skalę

UWAGA: Poniższe kroki są standardowym protokołem RESOLUTE dla wyrażeń SLC. Poszczególne cele będą wymagały dalszej optymalizacji pod kątem czasu ekspresji, temperatury inkubacji i stężenia maślanu sodu. Ponadto rutynowo optymalizujemy wielorakość infekcji bakulowirusem, testując różne proporcje objętościowe wirusa P3 używanego do infekowania komórek HEK293 dostosowanych do zawiesiny w eksperymentach na małą skalę. Jest to efektywne czasowo, wykorzystuje techniki i sprzęt, którymi już dysponujemy, i bezpośrednio ocenia pożądany wynik eksperymentu. Jednak ta metoda empiryczna wymaga ponownej optymalizacji przy każdej amplifikacji wirusa P3, a inne metody są dostępne do ilościowego oznaczania cząstek bakulowirusa49,50,51,52.

  1. Zwiększ wymaganą objętość komórek HEK293 dostosowanych do zawiesiny w pożywce HEK293.
  2. Rozcieńczyć komórki HEK293 przystosowane do zawiesiny do 1 × 106 komórek/ml i rosnąć przez 24 godziny (przy 170 obr./min dla butelek rolkowych o pojemności 2 l i 105 obr./min dla butelek rolkowych o pojemności 3 l).
  3. Dodać 30 ml wirusa P3 na litr komórek i dodać 5 mM maślanu sodu. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin lub w temperaturze 30 °C przez 72 godziny.
  4. W trakcie i po okresie inkubacji kluczowym krokiem jest zbadanie komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu sprawdzenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego i żywotności komórek. Oceń ekspresję i lokalizację białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z kostką filtrującą zgodną z GFP.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 900 × g przez 20 minut.
  6. Umyj osad komórkowy, umieszczając go ponownie w 10-15 ml PBS na litr kultury komórkowej i ponownie osadzaj w temperaturze 900 × g przez 20 minut.
  7. Granulki komórek należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

9. Oczyszczanie białka

UWAGA: Poniżej znajduje się standardowa metoda RESOLUTE do oczyszczania SLC dla 5 L hodowli komórkowej. Dla każdego celu SLC należy empirycznie określić optymalny detergent. Należy wcześniej przygotować bufor bazowy, roztwór podstawowy detergentu, do mycia, elucji i SEC (Tabela 2). Wykaz testowanych standardowych detergentów znajduje się w tabeli 3. ATP i MgCl2 w buforze płuczącym zmniejszają zanieczyszczenie białkami szoku cieplnego.

  1. Dzień 1
    1. Rozmrozić zamrożone osady komórkowe w łaźni wodnej ustawionej na temperaturę pokojową.
    2. Przygotować bufor do solubilizacji ze 135 ml buforu zasadowego i trzema tabletkami koktajlu inhibitorów proteazy. Poczekaj, aż tabletki się rozpuszczą.
    3. Ponownie zawiesić rozmrożony osad za pomocą buforu do solubilizacji. Użyj 27 ml buforu do rozpuszczania na 10-15 g osadu komórkowego, dodaj DNazę i wlej do lodowatego homogenizatora Dounce. Homogenizować roztwór, przesuwając tłok w górę i w dół około 20 razy, utrzymując homogenizator na lodzie.
      UWAGA: Objętość reprodukcji będzie musiała zostać zoptymalizowana w oparciu o białko docelowe i masę osadu komórkowego, która będzie się różnić w zależności od gęstości komórek podczas zbioru. Komercyjna DNaza może być dodawana zgodnie z instrukcjami producenta. DNaza może być również wyrażana i oczyszczana we własnym zakresie przy użyciu ustalonych protokołów55.
    4. Dodać roztwór podstawowy detergentu do 1% stężenia końcowego.
      UWAGA: Kluczowym krokiem do optymalizacji oczyszczania białek jest określenie optymalnego detergentu do solubilizacji i oczyszczania SLC, który musi zostać zidentyfikowany empirycznie. Regularnie używaliśmy różnych detergentów; każdy pojedynczo i w połączeniu z hemibursztynianem cholesterolu, utrzymując stosunek masowy detergentu do CHS na poziomie 10:1.
    5. Przenieść mieszaninę solubilizacyjną do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Obracać powoli przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    6. Odwirować roztwór o stężeniu 50 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
    7. Zrównoważyć 4-6 ml objętości złoża żywicy Strep-Tactin z buforem podstawowym.
    8. Dodać zrównoważoną żywicę do rozpuszczonego supernatantu i obracać przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    9. Wlej roztwór do kolumny przepływu grawitacyjnego i pozwól roztworowi przepłynąć.
    10. Przemyć żywicę 30-krotnością objętości złoża buforu do płukania Strep w 3 równych krokach dotyczących objętości.
    11. Dodać 3-5 ml buforu elucyjnego, inkubować przez 15 minut i zebrać eluat. Powtórz ten krok jeszcze cztery razy, zbierając każdą frakcję elucyjną osobno.
      UWAGA: Kluczowym etapem jest elucja białek z żywicy Strep-Tactin, gdzie ważne jest, aby inkubować przez 15 minut po każdym dodaniu buforu elucyjnego. Zazwyczaj pierwsza frakcja eluatu zawiera niższe stężenie białka ze względu na rozcieńczenie buforu elucyjnego przez resztkowy bufor płuczący. W związku z tym pierwsza frakcja eluatu może zostać odrzucona, jeśli pożądane jest wyższe końcowe stężenie białka. Alternatywnie, stężenie białka we wszystkich seryjnych elucjach może być również analizowane za pomocą SDS-PAGE w celu optymalizacji protokołu.
    12. Zmierz stężenie białka za pomocą spektroskopii absorbancji UV, połącz pożądane frakcje elucyjne i dodaj proteazę 3C w stosunku 1:5 (w/w) do 1:10 (w/w).
    13. Obracaj powoli przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kroki 9.1.12 i 9.1.13 są konieczne tylko wtedy, gdy znacznik GFP wymaga usunięcia. Jeśli usunięcie tagu nie jest wymagane, przejdź bezpośrednio do kroku 9.2.4. Alternatywnie, białko można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, aby kontynuować go następnego dnia. Ponadto, w przypadku SLC o zmniejszonej stabilności, stężenie proteazy, okres inkubacji i temperatura mogą wymagać optymalizacji. Proteaza 3C jest aktywna w szerokim zakresie temperatur i pozwala na optymalizację najlepiej dopasowaną do różnych SLC.
  2. Dzień 2
    1. Zrównoważyć 2-4 ml objętości złoża żywicy powinowactwa do metalu kobaltowego z buforem SEC.
    2. Dodać zrównoważoną żywicę o powinowactwie do metalu kobaltowego do mieszaniny reakcyjnej 3C przez noc i obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    3. Wlej roztwór do kolumny przepływu grawitacyjnego i zbierz przepływ.
    4. Zagęścić przepływ w filtrze odśrodkowym o sile 100 kDa, wirując z prędkością 3 000 × g w temperaturze 4 °C i delikatnie mieszać próbkę co 5 minut, aż do osiągnięcia żądanej objętości wtrysku SEC.
    5. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej na bazie dekstran-agarozy przy użyciu buforu SEC. Procedurę SEC należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C (komora chłodzona lub komora chłodnicza).
      UWAGA: Kluczowy krok: W zależności od stanu oligomerycznego SLC, do przeprowadzenia SEC można użyć innej kolumny, takiej jak kolumna chromatografii wykluczającej na bazie agarozy.
    6. Wstrzyknąć próbkę do pętli próbki i uruchomić program SEC z natężeniem przepływu takim, aby ciśnienie w kolumnie było poniżej specyfikacji producenta kolumny. Za pomocą kolektora frakcji automatycznie zbieraj frakcje o pojemności 0,3 ml przez cały przebieg SEC.
    7. Zebrać frakcje szczytowe, zmierzyć absorbancję promieniowania UV i zagęścić w odciętym koncentratorze odśrodkowym o mocy 100 kDa do wymaganej objętości/stężenia, wirując z prędkością 3 000 × g w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geny SLC mogą być klonowane z plazmidów RESOLUTE pDONR do wektorów BacMam do ekspresji ssaków
Opisane protokoły klonowania, ekspresji i oczyszczania okazały się skuteczne w przypadku wielu transporterów SLC w wielu fałdach białkowych. Niemniej jednak procedury obejmują kilka punktów kontrolnych do monitorowania postępów, co pozwala na optymalizację w celu uwzględnienia różnic w ekspresji, fałdowaniu białek, stabilności zależnej od lipidów i detergentów oraz wrażliwości na warunki buforowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój terapii ukierunkowanych na SLC pozostaje zahamowany ze względu na brak systematycznej charakterystyki funkcji transportera. Doprowadziło to do nieproporcjonalnie mniejszej liczby leków ukierunkowanych na tę klasę białek w porównaniu z GPCR i kanałami jonowymi63, pomimo ich licznych ról w procesach normalnych i patofizjologicznych. RESOLUTE to międzynarodowe konsorcjum, którego celem jest opracowanie najnowocześniejszych technik i narzędzi badawczych w celu przyspieszenia i usprawnienia obec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana w ramach projektu RESOLUTE. Projekt RESOLUTE otrzymał dofinansowanie ze środków Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy w zakresie Leków Innowacyjnych 2 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 777372. Wspólne przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA. Niniejszy artykuł odzwierciedla jedynie poglądy autorów i ani IMI, ani Unia Europejska, ani EFPIA nie ponoszą odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w nim informacji. Plazmid pHTBV został udostępniony dzięki uprzejmości prof. Fredericka Boyce'a (Harvard).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Proteaza 3CProdukowane we własnym zakresie
koncentratory odśrodkowe o sile 50 lub 100 kDaSartoriusVS0242
5-cykloheksylo-1-pentylo-β-D-maltozydAnatraceC325CYMAL-5
96-dołkowy zestaw do oczyszczania bakimówMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-dołkowy blok (2 ml)Greiner Bio-One780271
Samoprzylepne uszczelki plastikoweQiagen19570Podkładki taśmowe
Kolumna chromatograficzna wykluczająca wielkość agarozyCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
DNAzy benzonazyProdukowane we własnym zakresie
BisTrisSigma AldrichB9754
Hemibursztynian cholesrylu Sól TrisAnatraceCH210CHS
Żywica kobaltowa o powinowactwie do metaluTakara Bio635653TALON Żywica powinowactwa do metalu
D(+)-biotynaSigma Aldrich851209
Kolumna chromatograficzna wykluczająca wielkość dekstranu-agarozyCytiva28990944Superdex 200 Zwiększ 10/300 GL
DigitoninaApollo ScientificBID3301
Odbij tkankę młynek (40 ml)DWK Nauki Przyrodnicze357546
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTASigma Aldrich4693132001cOmpete, wolny od EDTA Koktajl inhibitorów proteazy
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlicerolSigma AldrichG5516
Gliko-diosgeninaAnatraceGDN101GDN
Grawitacyjne kolumny przepływoweCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 średniThermo Fisher12338018FreeStyle 293 średni
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrofilowa, obojętna krzemionka UHPLC kolumnaSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4,6 x 150
ImidazolSigma Aldrich56750
Odczynnik do transfekcji owadówSigma Aldrich71259Odczynnik
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Sześciowodny chlorek magnezuSigma AldrichM2670
Wytrząsarka do mikroekspresjiGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-dimetyloamino-N-tlenekAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β- D-glukopiranozydAnatraceO311DOGNG
Glikol oktaetylenowy Monododecyl
Anatrace		O330C12E8
Oktylowa glukoza Glikol neopentylowyAnatraceNG311OGNG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma AldrichD8537DPBS
Eter polioksyetylenowy(10)dodecylowyAnatraceAP1210C12E10
Eter polioksyetylenowy(9)dodecylowyAnatraceAPO129C12E9
Porowate uszczelnienie do płytek do kultur tkankowychVWR60941-084Folie ze sztucznego jedwabiu do kultur biologicznych
Proteinaza KNew England BiolabsP8107S
Mieszanka enzymów rekombinacyjnychThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Pożywka dla owadów bez surowicyGibco10902088Sf-900 II Pożywka bez surowicy
Maślan soduSigma Aldrich303410
Sonicator 24-głowicowa sondaSonics630-0579
Jednostka zasilająca SonicatorSonicsVCX 750
Żywica Strep-TactinIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow żywica o dużej pojemności
SacharozaSigma AldrichS7903
Monododekanian sacharozyAnatraceS350DDS
Komórki HEK293 dostosowane do zawieszeniaOdczynnikA14527Expi293F
Odczynnik do transfekcjiSigma Aldrich70967GeneJuice
do transfekcji Thermo Fisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969(2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134(2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751(2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350(2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814(2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533(2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357(2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82(2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821(2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253(2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817(2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714(2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685(2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317(2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Solute CarriersMembrane TransportersProtein ExpressionProtein PurificationHigh Throughput ScreeningAffinity PurificationSize Exclusion ChromatographySDS PAGE ElectrophoresisFluorescence MicroscopyDrug Discovery

Powiązane artykuły