Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

DOI:

10.3791/65890

⸱

11 sierpnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Oral Pathology, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Research Center of Oral Biomaterials and Digital Medical Devices, 2Research Unit of Precision Pathologic Diagnosis in Tumors of the Oral and Maxillofacial Regions, Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU034), 3Central Laboratory, Peking University School and Hospital of Stomatology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwłóknienie podśluzówkowe jamy ustnej (OSF) jest powszechnym rodzajem potencjalnie złośliwego zaburzenia w jamie ustnej. Zanik nabłonka i zwłóknienie blaszki właściwej i błony podśluzowej często stwierdza się na szkiełkach histopatologicznych. Zaproponowano, że dysplazja nabłonkowa, atrofia nabłonka i fibroblasty starcze są związane ze złośliwą transformacją OSF. Jednak ze względu na niejednorodność potencjalnie złośliwych chorób jamy ustnej i raka płaskonabłonkowego jamy ustnej trudno jest zidentyfikować specyficzne mechanizmy molekularne transformacji złośliwej w OSF. W tym miejscu przedstawiono metodę uzyskania niewielkiej liczby komórek nabłonkowych lub mezenchymalnych przenoszących dane morfologiczne i informacje przestrzenne za pomocą mikrodysekcji laserowej na szkiełkach tkankowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Za pomocą mikroskopu możemy precyzyjnie uchwycić w mikroskali (~500 komórek) dysplastyczną lub zanikową tkankę nabłonkową oraz zwłóknioną tkankę podnabłonkową. Wyekstrahowane komórki można ocenić za pomocą sekwencjonowania genomu lub transkryptomu w celu uzyskania danych genomowych i transkryptomicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi. Takie podejście eliminuje niejednorodność masowego sekwencjonowania tkanek OSF i interferencję powodowaną przez komórki w obszarach niezmienionych chorobowo, umożliwiając precyzyjną analizę przestrzenno-omiczną tkanki OSF.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwłóknienie błony podśluzówkowej jamy ustnej (OSF) jest przewlekłą, podstępną chorobą, która rozwija się głównie w błonie śluzowej policzka i powoduje ograniczone otwieranie ust1. Podczas gdy OSF jest chorobą wieloczynnikową, żucie orzechów areki lub betelu jest główną przyczyną OSF2,3. Ze względu na ten specyficzny geograficznie zwyczaj, OSF jest skoncentrowany głównie w populacjach w Azji Południowo-Wschodniej i Południowej3. Typowe cechy histologiczne OSF obejmują nieprawidłowe odkładanie się kolagenu w tkance łącznej pod nabłonkiem błony śluzowej jamy ustnej, zwężenie naczyń i okluzję1. Tkanka nabłonkowa OSF może wykazywać objawy atrofii lub przerostu, a nawet dysplazji w połączeniu z leukoplakią jamy ustnej4,5.

OSF jest zdefiniowany przez Światową Organizację Zdrowia jako powszechne potencjalnie złośliwe zaburzenie jamy ustnej (OPMD), które wykazuje potencjał do progresji do raka płaskonabłonkowego jamy ustnej ze współczynnikiem transformacji złośliwej 4%-6%6,7,8,9. Mechanizm leżący u podstaw złośliwej transformacji OSF jest złożony10. Nieprawidłowy rozrost nabłonka, w tym zarówno dysplazja, jak i atrofia, zwiększa potencjał kancerogenezy, a starcze fibroblasty w zrębie mogą być zaangażowane w złośliwą progresję OSF poprzez indukowanie przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) przez reaktywne formy tlenu (ROS) i inne cząsteczki10.

Technologie analiz przestrzenno-omicznych wygenerowały dane multiomiczne z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi, które dostarczyły wglądu w mechanizmy raka11,12,13. W tym miejscu przedstawiamy protokół przechwytywania populacji komórek związanych z morfologią z tkanki OSF zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie za pomocą mikrodysekcji laserowej. Analizy multiomiczne tych próbek mogą przezwyciężyć wyzwania związane z heterogenicznością wewnątrztkankową i zwiększyć zrozumienie patologii molekularnej i mechanizmów transformacji złośliwej w OSF14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szkoły i Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów. Próbki tkanek użyte w tym badaniu zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Schemat badania jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie próbki

  1. Pociąć utrwalone w formalinie tkanki zwłóknienia podśluzówkowego jamy ustnej zanurzone w parafinie na ciągłe odcinki o grubości 3 μm i 10 μm na mikrotomie.
  2. Rozłóż sekcje w wodzie, a następnie wyłowij na zjeżdżalnie. Zamocuj sekcje 3 μM i 10 μm odpowiednio na szkiełkach mikroskopowych adhezyjnych (slajd A) i szkiełkach z membraną PEN (slajd B).
  3. Umieść szkiełka na płycie grzejnej w temperaturze 60 °C na 2 godziny.

2. Barwienie hematoksyliną-eozyną

  1. Umieść szkiełka A i B w ksylenie (UWAGA) na 10 minut i powtórz ten krok trzykrotnie.
  2. Hydrate szkiełka A i B w stopniowanych roztworach etanolu w kolejności 100%, 100%, 90%, 80% i 70% przez 1 minutę w każdym stężeniu.
  3. Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s
  4. Umieść szkiełka A i B w roztworze barwnika hematoksyliny Harris na 90 s.
  5. Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.
  6. Umieść szkiełka A i B w roztworze div-hematoksyliny (UWAGA) na 2 s.
  7. Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.
  8. Umieść szkiełka w A i B w 1% roztworze re-blue na 2 sekundy.
  9. Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.
  10. Umieść szkiełka w roztworze eozyny na 2 sekundy.
  11. Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.
  12. Odwodnić szkiełka w stopniowanych roztworach etanolu w kolejności 70%, 80%, 90%, 100% i 100% przez 2 s w każdym stężeniu.
  13. Umieść szkiełko A w ksylenie na 3 minuty i powtórz ten krok dwukrotnie.
  14. Dodaj kroplę podłoża montażowego (UWAGA) do suwaka A i przykryj go szkłem nakrywkowym.

3. Obserwacja morfologii histologicznej i mikrodysekcja laserowa

  1. Zainicjuj system i oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej ( Rysunek 2).
  2. Umieść szkiełko A na stoliku szkiełkowym i obserwuj morfologię histologiczną, aby zidentyfikować obszar zainteresowania dla mikrodysekcji laserowej.
  3. Wyjmij slajd A i umieść slajd B odwrotnie na stoliku slajdu.
  4. Kliknij przycisk Unload (Rysunek 2), aby wypchnąć urządzenie zbierające. Włóż probówkę z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) do urządzenia zbierającego i upewnij się, że probówka jest zamocowana. Kliknij przycisk OK (Rysunek 3).
  5. Wybierz nasadkę, klikając odpowiednie czerwone kółko oznaczające Urządzenie zbierające: Zaślepki rur. Wybrane kółko zmieni kolor na zielony.
  6. Kliknij przycisk Rysuj i przycisk Rysuj + Wytnij i użyj myszy, aby naszkicować obszar zainteresowania.
  7. Kliknij przycisk Start Cut, aby uchwycić obszar zainteresowania; przechwycona próbka zostanie pobrana przez nasadkę (Rysunek 4).
    8. Kliknij dolny przycisk, aby upewnić się, że przechwycona próbka została zebrana (Rysunek 5).
  9. Kliknij przycisk Próbka, aby przechwycić następną próbkę.
  10. Kliknij przycisk Rozładuj, aby rozładować probówkę PCR z pobraną próbką.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonując laserową mikrosekcję tkanek OSF, pobraliśmy próbki nabłonka dysplastycznego, zrębu pod nabłonkiem dysplastycznym, nabłonka zanikowego i zrębu pod zanikową tkanką nabłonkową (Rysunek 1). Dzięki ekstrakcji DNA i sekwencjonowaniu całego genomu o niskiej głębokości, byliśmy w stanie przeanalizować zmiany liczby kopii związane z morfologią (CNA)15. CNA jest powszechną formą niestabilności genomowej związaną ze zwiększonym ryzykiem transformacji złośliwej w OPMD

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole tym poinformowano o procesie pozyskiwania próbek tkanek OSF wraz z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi w celu dalszych analiz przestrzenno-omicznych za pomocą mikrodysekcji laserowej. Na podstawie reprezentatywnych wyników zidentyfikowaliśmy różne wzorce CNA wśród różnych próbek związanych z morfologią.

OSF, rodzaj OPMD, jest częstym stanem przedrakowym raka płaskonabłonkowego jamy ustnej6. Doniesiono, że niestabilność genomu jest związana z rozwoj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Narodowej Fundacji Nauk o Naturze Chin (81671006, 81300894), Funduszu Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (2019-I2M-5-038), Krajowego projektu budowy kluczowej dyscypliny klinicznej (PKUSSNKP-202102), Funduszu Innowacji dla Wybitnych Doktorantów Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego (BMU2022BSS001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka mikroskopowe adhezyjneCITOTESTREF.188105
Div-haematoxylinYiLi20230326
Roztwór eozynyBASOBA4098
Odczynnikdo PEKINGUnr 32061
Roztwór barwnika hematoksyliny HarrisYiLi20230326
Płyta grzejnaLEICAHI1220
System mikrodysekcji laserowejMaszyna LEICALMD7
Mikrosystem mikroanalizy laserowejLEICA8.2.3.7603
Oprogramowanie Micromount medium montażoweLEICAREF.3801731
Szklana osłona mikroskopuCITOTESTREF.10212450C
MikrotomLEICARM2235
Probówki do PCRSzkiełka membranowe AXYGEN16421959
PENLEICANo.11505158
Re-blue solutionYiLi20230326
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogenREF.10977-015
ODCZYNNIK DO PEKINGOWANIAKSYLENUNR 33535
etanolu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
  2. Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949(2022).
  3. Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
  4. Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).
  5. Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
  6. Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
  7. Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619(2021).
  8. Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).
  9. Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
  10. Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).
  11. Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).
  12. Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
  13. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  14. Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).
  15. Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
  16. Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
  17. Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
  18. Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).
  19. Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).
  20. Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
  21. Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).
  22. Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
  23. Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).
  24. Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
  25. Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
  26. Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Formalin Fixed ParaffinSpatial OmicsEpithelial DysplasiaTissue MicrodissectionCopy Number AlterationsHistopathological SlidesGenomic SequencingTranscriptome Sequencing

Powiązane artykuły