Method Article

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

DOI:

10.3791/65898

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Reproductive Medicine, First Hospital of Jilin University, 2Center of Prenatal Diagnosis, First Hospital of Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okrągłe plemniki, charakteryzujące się haploidalną zawartością genetyczną, reprezentują komórki prekursorowe dojrzałych plemników. Dzięki innowacyjnej technice iniekcji okrągłych plemników (ROSI) oocyty mogą być z powodzeniem zapłodnione i rozwinięte w zdolne do życia płody. Przełomowym kamieniem milowym osiągniętym w 1995 roku było narodziny pierwszego płodu myszy dzięki technologii ROSI. Od tego czasu ROSI stało się kluczowym narzędziem do odkrywania skomplikowanych mechanizmów rządzących rozwojem embrionalnym i ma znaczny potencjał w różnych zastosowaniach, w tym w przyspieszeniu generacji myszy i produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy. W 1996 roku osiągnięto kamień milowy, kiedy pierwszy ludzki płód urodził się dzięki technologii ROSI. Jednak kliniczne zastosowania tej metody wykazały zmienny wzorzec sukcesu i porażki. Do tej pory technologia ROSI nie znalazła szerokiego zastosowania w praktyce klinicznej, przede wszystkim ze względu na niską sprawność porodową i niewystarczającą walidację bezpieczeństwa płodu. Niniejszy artykuł zawiera wyczerpujące omówienie precyzyjnych metod wykonywania ROSI u myszy, mając na celu rzucenie nowego światła na badania podstawowe i ich potencjalne zastosowania kliniczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Końcowy etap spermatogenezy polega na przekształceniu okrągłego plemnika w pełnowartościowy plemnik, charakteryzujący się wyraźnymi strukturami głowy, szyi i wydłużonego ogona1. Transformacja ta obejmuje znaczące zmiany w morfologii komórki, takie jak kondensacja chromatyny w jądrze, zastąpienie histonów przez protaminę, tworzenie akrosomów, rozwój osłonki mitochondrialnej, migracja i utrata centrioli, tworzenie struktury ogona i usuwanie resztek komórkowych2.

W 1992 roku pierwszy ludzki płód został pomyślnie urodzony dzięki technologii iniekcji plemnika docytoplazmatycznego (ICSI)3. Od tego czasu naukowcy badają potencjał wykorzystania okrągłych plemników, które mają taki sam haploidalny skład genetyczny jak dojrzałe plemniki, do zapłodnienia oocytów i podtrzymania ciąż zdolnych do życia2,4. Następnie, w 1996 roku, dostarczono pierwszy ludzki płód poczęty za pomocą technologii okrągłego wstrzykiwania spermatydy (ROSI)5,6. Warto zauważyć, że badania z udziałem ICSI i ROSI u myszy pozostawały w tyle za badaniami na ludziach ze względu na podatność błony oocytów myszy na uszkodzenia podczas procesu iniekcji. Ten problem został pomyślnie rozwiązany dzięki wprowadzeniu urządzenia do łamania membrany piezoelektrycznej. W związku z tym w 1995 roku narodziła się pierwsza mysz poczęta w technologii ROSI. Dodatkowo, prowadzone są również badania nad ROSI u różnych innych zwierząt7,8.

Obecnie badania nad ROSI koncentrują się głównie wokół następujących aspektów: zastosowania klinicznego, wyjaśnienia mechanizmów i strategii zwiększających efektywność rozwojową, wraz z szerszymi zastosowaniami technologii ROSI. W kontekście zastosowań klinicznych, pomimo narodzin pierwszego ludzkiego płodu ROSI przez ROSI w 1996 roku, postęp był naznaczony serią sukcesów i porażek9,10,11,12. Do tej pory technologia ROSI nie osiągnęła powszechnego wdrożenia klinicznego, głównie ze względu na jej niską skuteczność i potrzebę dalszej walidacji pod kątem bezpieczeństwa płodów poczętych za pomocą technologii ROSI. Niepełne statystyki wskazują, że na całym świecie urodziło się mniej niż 200 ludzkich płodów poczętych przez ROSI. Punkt zwrotny w zrozumieniu potencjału technologii ROSI nastąpił w 2015 roku, kiedy Tanaka i współpracownicy poinformowali o udanym narodzinach 14 płodów dzięki technologii ROSI, wzbudzając ponowne zaufanie do jej klinicznego zastosowania i wykonalności13,14. Technologia ROSI jest bardzo obiecująca, jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów związanych z biologią rozrodu, szczególnie u pacjentów z azoospermią nieobturacyjną. Oprócz zastosowań klinicznych, ROSI służy jako cenne narzędzie do badania skomplikowanych mechanizmów rozwoju embrionalnego15,16,17.

Przeprowadzono liczne badania na zwierzętach w celu zbadania podstawowych czynników przyczyniających się do niskiej skuteczności ROSI w osiąganiu pełnego rozwoju embrionalnego. Czynniki te obejmują wybór metod wspomaganej aktywacji oocytów (AOA) i ich czas, nieprawidłowości w stabilności genomu, a w szczególności nieprawidłowości w modyfikacjach epigenetycznych. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że okrągłe plemniki są niedojrzałymi komórkami rozrodczymi, znacznie różniącymi się od dojrzałych plemników pod różnymi względami fizjologicznymi. Mizuki Sakamoto i współpracownicy wskazali, że H3K27me3, pochodzący z okrągłych plemników, jest związany z chromatyną, która jest mniej dostępna i prowadzi do upośledzenia ekspresji genów w zarodkach ROSI18. W powiązanym badaniu przeprowadzonym przez Jing Wang i współpracowników, defekty przeprogramowania w zarodkach ROSI w stadium przedjądrowym były głównie związane z nieprawidłową ekspresją kohorty genów odpowiedzialnych za aktywację mniejszego genomu zygotycznego19. Odkryli również, że wprowadzenie selektywnego euchromatycznego inhibitora metylotransferazy lizyny histonowej 2, A366, może potencjalnie zwiększyć ogólne tempo rozwoju około dwukrotnie.

Mysz jest jednym z najcenniejszych zwierząt modelowych do badania rozwoju embrionalnego. W tym artykule omówiono, jak wykonać ROSI na myszach. Ten kompleksowy protokół obejmuje wybór odpowiednich myszy, szczegółowe procedury indukcji owulacji, techniki AOA, techniki iniekcji oraz przygotowanie myszy zastępczych. Ponadto przedstawiono analizę porównawczą wpływu dwóch schematów iniekcji na efektywność porodu: AOA, a następnie ROSI (A-ROSI; pierwszy schemat) i ROSI, po którym następuje AOA (ROSI-A; drugi schemat). Naszym celem jest zachęcenie badaczy do przeprowadzania eksperymentów ROSI na myszach z większą precyzją, oferując solidniejsze wsparcie dla ich zastosowania klinicznego i podstawowych badań nad mechanizmami rozwoju embrionalnego.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), C57BL/6 i myszy ICR użyte w tym eksperymencie zostały zakupione od Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd. (Pekin, Chiny). Wszystkie zabiegi na zwierzętach były zgodne z procedurami i standardami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komisję Etyki Zwierząt Doświadczalnych Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Jilin (numer zgody: 20200435).

1. Przygotowanie odpowiednich odczynników

  1. Zaopatrz się w niektóre odczynniki w handlu, a pozostałe przygotuj samodzielnie.
    1. UzyskaćM2, system buforowy do przetwarzania in vitro okrągłych spermatyd (RS), plemników i oocytów od dostawcy.
    2. Przygotuj pożywkę C.L. Chatot, C.A. Ziomek i B.D. Bavister (CZB) wolną odCa2+ dla AOA zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem20.
    3. Otrzymać od dostawcy pożywkę zoptymalizowaną pod kątem potasa jednostronnego uzupełnioną roztworem aminokwasów (KSOMaa) do hodowli zarodków.
    4. Przygotować hialuronidazę o stężeniu roboczym 0,1% (1 g/l), rozpuszczając 0,1 g hialuronidazy w 1 ml wody zarodkowej. Pobrać 10 μl stężonego roztworu do przechowywania i rozpuścić w 990 mlM2, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
    5. Przygotuj poliwinylopirolidon (PVP) o średniej masie cząsteczkowej 360 000 i stężeniu masowym 12%, rozpuszczając 1,2 g PVP w 10 mlM2. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
    6. Przechowywać roztwór podstawowy cytochalazyny B (CB) (2 μl), rozpuszczalny w 18 μl DMSO w temperaturze -20 °C. Pobrać 5 μl stężonego roztworu do przechowywania i rozpuścić w 995 mlM2. Otrzymany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.

2. Przygotowanie oocytów

  1. Aklimatyzuj samice myszy B6D2F1 w wieku 6-8 tygodni do nowego środowiska przez co najmniej 1 tydzień. Wstrzyknąć dootrzewnowo 7,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) o godz. 17, a następnie 7,5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) 48 godzin później. Upewnij się, że po wstrzyknięciu nie ma kontaktu z samcami myszy.
    UWAGA: Podana godzina (17:00) nie jest obowiązkowa. To tylko dla wygody pracy. 14 godzin po godzinie 17 to 7 rano, kiedy oocyty są gotowe i wykonuje się iniekcję, więc czas iniekcji jest zaplanowany na poranek. Czas rozpoczęcia iniekcji można dostosować zgodnie z codziennym harmonogramem laboratorium.
  2. Po 14 godzinach od wstrzyknięcia HCG należy poddać myszy eutanazji metodą zwichnięcia szyjki macicy. Otwórz jamę brzuszną i zlokalizuj macicę. Zidentyfikuj jajniki wzdłuż macicy i przetnij jajowody w pobliżu jajników za pomocą nożyczek. Powtórzyć tę samą procedurę po drugiej stronie i umieścić jajowody wM2, który jest wcześniej podgrzewany w temperaturze 37 °C.
  3. Pod mikroskopem pionowym (10x) zlokalizuj powiększoną część jajowodu, która ma przezroczysty i spuchnięty wygląd. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby zabezpieczyć jajowód podczas przecinania powiększonej części, zbierając kompleksy wzgórków koronalnych oocytów (OCCC).
  4. Umieść OCCC w podgrzanym roztworze operacyjnymM2 zawierającym 0,1% hialuronidazy i usuń komórki ziarniste, delikatnie przedmuchując je przez pipetę doustną.
    UWAGA: Trzymaj OCCC w 0,1% hialuronidazie przez krótki czas, około 2 minuty, jeśli to konieczne.
  5. Po usunięciu komórek ziarnistych przenieś oocyt do KSOMaa, przepłucz 3x i umieść w inkubatorze dwutlenku węgla do późniejszego użycia (37 °C, 5% CO2 ).

3. Przygotowanie okrągłych plemników i plemników

  1. Zbierz okrągłe plemniki i plemniki z jądra i najądrza samców myszy C57BL / 6 (odpowiednio 8-10 tygodni).
    1. W przypadku plemników należy poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Otwórz jamę brzuszną, zlokalizuj najądrze w pobliżu jądra i delikatnie wytnij nożyczkami.
    2. Umieścić najądrza w podłożuM2 i delikatnie wyciąć za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aby plemniki mogły wypłynąć pod mikroskopem pionowym (10x).
    3. Zasysać przepływające plemniki i zawiesinęM2 na dno probówki zawierającej 0,5 mlM2, umożliwiając plemnikom naturalny przepływ w górę. Odłóż je na bok do późniejszego wykorzystania.
    4. W przypadku okrągłych spermatyd usuń jądra z jamy brzusznej i umieść je w M2. Delikatnie przeciąć białą błonę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i wycisnąć zawiłe kanaliki nasienne pod pionowym mikroskopem (10x).
    5. Ostrożnie wyciąć kanaliki nasienne za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 1 ml. Usunąć zawiesinę i przefiltrować za pomocą sita o oczkach 400 (38 μm).
  2. Przefiltrowane komórki odwirować, odrzucić supernatant i dodać 200 μl Hoechst 33342 do barwienia, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  3. Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), aby odróżnić okrągłe spermatydy od innych typów komórek. Umieść wybarwione komórki w probówce do cytometrii przepływowej i wykonaj okrągłe badanie przesiewowe spermatydów.
    1. Różne modele maszyn do cytometrii przepływowej mają różne parametry regulacyjne i mogą być komunikowane z pomocą techniczną podczas pracy. W pierwszym kroku dostosuj napięcie i wybierz populację komórek zgodnie z rozproszeniem do przodu (FSS) i rozproszeniem bocznym (SSC; patrz tabela uzupełniająca 1).
    2. W drugim kroku usuń zrosty komórek zgodnie z FSC i wyzwól szerokość impulsu.
    3. W trzecim kroku wybierz docelowe haploidalne okrągłe spermatydy. Hoechst 33342 wiąże się z DNA, a komórki o różnej ploidalności wykazują różną intensywność fluorescencji. Ustaw długość fali wzbudzenia na 355. Wybierz dwa kanały detekcji, 460/50 i 670/30, pod laserem o długości fali 355, aby sortować okrągłe spermatydy. Następnie należy przechowywać posortowane okrągłe spermatydy w lodówce o temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Możliwa jest również bezpośrednia selekcja okrągłych spermatyd na podstawie ich morfologii pod mikroskopem, ale wymagane jest szkolenie, aby zapewnić dokładność selekcji.

4. Okrągła iniekcja spermatydu (ROSI)

  1. Zabieg ROSI należy przeprowadzić przy użyciu mikroskopu odwróconego z systemem mikromanipulacji.
  2. Na wstępnym etapie przygotowania należy wykonać igły do przytrzymywania i wstrzykiwania zgodnie z wcześniej opisaną procedurą21. Wewnętrzna średnica igły do wstrzykiwań powinna wynosić 6-7 μm, przeznaczona do ekstrakcji okrągłych spermatydów, a igły do przytrzymywania powinna mieć średnicę wewnętrzną 20 μm do zabezpieczenia oocytu.
  3. W kolejnym etapie przygotowania należy utworzyć naczynie iniekcyjne, umieszczając 10 μl kropelekM2 zawierających CB w celu zmiękczenia oocytów oraz 10 μl kropelekM2 w celu przechowywania okrągłych spermatyd. Użyj kropelek PVP, aby zwilżyć i oczyścić igły do wstrzykiwań.
    UWAGA: Dodanie CB w tym miejscu nie jest koniecznym krokiem, ale dodanie CB może znacznie poprawić wskaźnik przeżycia po wstrzyknięciu.
  4. Ekstrakcję okrągłych spermatyd za pomocą igły do wstrzykiwań.
  5. Obróć oocyt za pomocą igły do trzymania, ustawiając ciało polarne oocytu w pozycji godziny 12 lub 6
    6. .
  6. Ostrożnie umieścić igłę do wstrzykiwań w pozycji godziny 3 na oocycie, ściśle przylegając do osłonki przejrzystej. Użyj urządzenia PiezoXpert, aby utworzyć otwór w osłonie przejrzystej. Dostosuj siłę od małej do dużej, czyli w przybliżeniu intensywność = 5 i prędkość = 15 tutaj.
  7. Delikatnie przesunąć igłę do wstrzykiwań przez osłonkę przejrzystą i wejść poziomo do oocytu. Gdy przejdzie przez środek oocytu, zastosuj piezoelektryczny (intensywność = 1 i prędkość = 1), co spowoduje pęknięcie błony oocytu i stopniowe wstrzyknięcie okrągłego spermatydu do cytoplazmy oocytu.
  8. Wyjąć igłę do wstrzykiwań i pobrać niewielką ilość błony oocytu w pobliżu otworu, aby ją uszczelnić. Ten krok jest kluczowy, ponieważ brak uszczelnienia spowodowałby wyciek cytoplazmatyczny i śmierć oocytów.
    UWAGA: Warto zauważyć, że ROSI wymagało AOA przed lub po wstrzyknięciu okrągłych spermidadów, co omówiliśmy w kolejnych sekcjach.

5. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)

  1. Wykonaj te same czynności dla ICSI, co dla ROSI, przy czym jedyną różnicą jest średnica igły iniekcyjnej ICSI, która wynosi 9-10 μm.
  2. Umieść plemniki na pasie startowym PVP, aby zmniejszyć ich prędkość pływania i ułatwić ekstrakcję plemników.
  3. Wykonaj oddzielenie głowy i ogona plemników dla ICSI. Odessać plemniki z ogona i umieścić szyjkę plemnika dokładnie u wylotu igły do wstrzykiwań. Zastosuj piezoelektryczny (w razie potrzeby można użyć wielu piezoelektrycznych, intensywność = 5 i prędkość = 15), aby oddzielić głowę i ogon plemników.

6. Wspomagana aktywacja oocytów (AOA)

  1. Zgodnie z protokołem należy przygotować pożywkę CZB bez wapnia i magnezu.
  2. Użyć sześciowodnego chlorku strontu (SrCl26H2O) o masie cząsteczkowej 266,62 w stężeniu 10 mM. Aby go przygotować, rozpuść 0,26662 g SrCl26H2O w 1 ml wody z zarodków. W momencie użycia dodać 10 μl stężonego roztworu do przechowywania do 990 μl pożywki CZB wolnej od Ca2+ i natychmiast zużyć.
  3. Umieścić oocyty w pożywce CZB wolnej od Ca2+ zawierającej SrCl26H2O w celu aktywacji; każda kropla ma objętość 20 μl i za każdym razem umieszcza się 20 oocytów. Inkubować przez 20 minut.
  4. Jednocześnie ustal grupę aktywacji partenogenezy bez wstrzykiwania okrągłych plemników lub plemników. Należy zauważyć, że grupa aktywacji partenogenezy jest pokazana bez analizy statystycznej, a grupa kontrolna to ICSI.

7. Transfer zarodków

  1. Trzymaj podwiązane samce i samice myszy ICR w stosunku 1: 2. Następnego ranka zbadaj samice myszy pod kątem obecności czopa dopochwowego i wybierz te z czopem dopochwowym do przeszczepu.
  2. Przenieśne zarodki składające się z zarodków dwukomórkowych należy wstrzyknąć poprzedniego ranka i przenieść je następnego popołudnia.
  3. Wykonaj nacięcie na grzbiecie samicy myszy, odsłoń biały tłuszcz i jajniki, a następnie zlokalizuj powiększoną część jajowodu pod mikroskopem pionowym (10x).
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml utwórz otwór w powiększonej części jajowodu i odessaj zarodki przez pipetę doustną. Delikatnie wprowadź zarodki w kierunku macicy. Zszyj ranę za pomocą modeli 4 x 10 zakrzywionych igieł z nitką o grubości 5-0 (0,09-0,11 mm). Szew wykonany jest w dwóch warstwach, z jedną warstwą na otrzewną i jedną warstwą na skórę zewnętrzną.
  5. W przypadku myszy zastępczych wykonaj cesarskie cięcie w oparciu o harmonogram eksperymentu. Poddaj myszy eutanazji metodą zwichnięcia szyjki macicy, zdezynfekuj alkoholem i otwórz jamę brzuszną. Delikatnie i szybko rozetnij macicę i otwórz jamy owodniowej, aby pokazać płód i łożysko. Usuń pępowinę i odetnij od strony blisko płodu; Płód był karmiony przez ten sam okres karmienia piersią, co myszy.
    UWAGA: Ze względu na konieczność obliczenia współczynnika urodzeń, cesarskie cięcie jest dokładniejsze pod względem zdolności produkcyjnej. W przypadku porodu naturalnego potomstwo może zostać zjedzone przez matkę, co skutkuje niedokładnymi statystykami. Cesarskie cięcie wykonuje się na myszach zastępczych przeszczepionych we wczesnym stadium, a eutanazyjne cięcie cesarskie wykonuje się przed porodem.

8. Analiza statystyczna

  1. Użyj GraphPad Prism 5 do analizy. Dane są wyrażone w średniej ± SD; P < 0,05 oznacza różnicę statystyczną, a P < 0,01 wskazuje na istotną różnicę statystyczną.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpoczęliśmy nasze badanie, badając wpływ AOA na zdolność rozwojową embrionów. Schematyczna ilustracja eksperymentalnego projektu jest pokazana w Rysunek 1A. Przed wstrzyknięciem plemnika oocyty przeszły albo AOA (A-ICSI), albo pozostały nieleczone (ICSI). Szczegółowe dane dotyczące rozwoju embrionalnego przedstawiono w tabeli 1. Wyniki nie wykazały istotnych różnic w rozszczepieniu, blastocyście lub wskaźnikach urodzeń między grupami A-ICSI i ICSI (P > 0,05; Rysunek 1B). Wyniki te wskazują, że AOA przy użyciu 10 mM SrCl2 przez 20 minut nie wpłynęło na potencjał rozwojowy zarodków.

Wcześniej informowano, że nie było zauważalnych różnic w efektywności rozwojowej zarodków ROSI wybranych ani przez FACS, ani przez bezpośrednie badanie wzrokowe pod mikroskopem22. W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy technologię FACS do identyfikacji RS (ryc. 2A,B). Pod mikroskopem okrągłe spermatydy myszy miały średnicę około 10 μm i wykazywały strukturę jąderka przypominającą wystające jądro w środku (Ryc. 2C). Zakładamy, że selekcja za pomocą FACS jest dokładniejsza niż bezpośrednie badanie wzrokowe pod mikroskopem. Ponadto literatura wspiera bezpośrednią eksplorację RS poprzez różnice morfologiczne. Zarodki ROSI zostały wygenerowane przy użyciu dwóch różnych metod: grupy A-ROSI, w której oocyty poddano AOA przed wstrzyknięciem okrągłego plemnika, oraz grupy ROSI-A, w której oocyty poddano AOA po wstrzyknięciu okrągłego plemnika. Schemat ideowy projektu eksperymentalnego jest pokazany w Rysunek 1C. Warto zauważyć, że nie stwierdzono istotnych różnic w częstości rozszczepienia i blastocyst między grupami A-ROSI, ROSI-A i ICSI (P > 0,05; Rysunek 1D). Częstość występowania blastocyst w grupach A-ROSI, ROSI-A i ICSI była istotnie wyższa niż w grupie aktywacyjnej (P < 0,05; Rysunek 1D). Jednak wskaźnik urodzeń w grupie ROSI był niższy niż w grupie ICSI, niezależnie od tego, czy oocyty były aktywowane przed czy po wstrzyknięciu (P < 0,05; Rysunek 1D). Co ważne, wskaźnik urodzeń w grupie A-ROSI był nieco wyższy niż w grupie ROSI-A (Rysunek 1D). Bardziej szczegółowe informacje na temat rozwoju zarodków przedstawiono w tabeli 1.

figure-results-1
Rysunek 1: Zarodki ROSI wykazywały zmniejszoną efektywność rozwojową w porównaniu do zarodków ICSI. (A) Schematyczna ilustracja protokołu eksperymentalnego oceniającego wpływ aktywacji na rozwój embrionalny ICSI. Niebieski = oocyty nie zostały aktywowane; Żółty = Oocyty zostały aktywowane. (B) Sprawność rozwojowa zarodków pochodzących z A-ICSI i ICSI. (C) Schematyczne ilustrowanie protokołu doświadczalnego dla generowania różnych typów zarodków. (D) Sprawność rozwojowa zarodków pochodzących z A-ROSI, ROSI-A, A i ICSI. **, P < 0,01. Skróty: A = Aktywacja E = Dzień embrionalny; ROSI = Okrągłe wstrzyknięcie spermatydy; ICSI = Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika. Słupki błędów pokazują odchylenie standardowe. Porównanie wskaźników odbywa się za pomocą testu chi-kwadrat. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Okrągłe spermatydy zostały wybrane za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej. (A) Diagram sortowania cytometrycznego przepływu został wykorzystany do selekcji okrągłych spermatydów. (B) Reprezentatywne obrazy przedstawiające wybór okrągłych spermatydów. Podziałka: 10 μm. Skróty: FSC = Forward Scatter; SSC = rozproszenie boczne; 355 to długość fali wzbudzenia; 460/50 i 670/30 to dwa kanały detekcji lasera o długości fali 355. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

GrupyRozwój przedimplantacyjnyRozwój po implantacji
ReplikujeWspółczynnik rozszczepienia (%)Częstość występowania blastocyst (%)Transferowane zarodki 2-komórkowe/ Liczba biorców Przyrost naturalny (%)
A-ICSI (A-ICSI)599,33 (149/150)75,17 (112/149)49/548.98 (24/49)
A-ROSI599,33 (149/150)73.83 (110/149)44/518,18 (8/44) **
ROSI-A598.00 (147/150)64,63 (95/147)45/513,33 (6/45) **
aktywacja5100,00 (150/150)godz. 12.00 (18/150) **51/50,00 (0/51) **
Specyfikacja ICSI598.00 (147/150)73.47 (108/147)46/552.17 (24/46)

Tabela 1. Sprawność rozwojowa zarodków pochodzących z różnych grup.

Tabela uzupełniająca 1. Odsetek różnych populacji komórek posortowanych za pomocą cytometrii przepływowej. Część P3 to okrągłe spermatydy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspomagana aktywacja oocytów
Krytycznym warunkiem wstępnym ROSI jest AOA, ponieważ same okrągłe plemniki nie mogą zainicjować aktywacji oocytów. Obecnie najbardziej ugruntowaną metodą u myszy jest użycie chlorku strontu23,24, podczas gdy najbardziej zaawansowana aplikacja u ludzi wykorzystuje aktywację elektryczną13,14. Duże znaczenie ma również czas aktywacji oocytów. Jak podano w literaturze, najbardziej optymalne podejście do aktywacji u myszy polega na początkowej aktywacji oocytu, a następnie wstrzyknięciu okrągłego plemnika25. Kontrastuje to z konwencjonalnym procesem zapłodnienia, w którym plemniki początkowo dostają się do oocytów, a następnie uwalniają fosfolipazę C ζ w celu aktywacji oocytu26. Specjalistyczne badania przeprowadzone przez Satoshi Kishigami i współpracowników podkreślają różnicową zdolność ROSI do tworzenia męskiego jądra w oocytach przed lub po aktywacji. Aby osiągnąć efektywne tempo produkcji potomstwa, oba rodzaje iniekcji muszą zostać przeprowadzone przed wejściem oocytów w fazęG1 25.

Średnica igły do wstrzykiwań
W kontekście ROSI należy zauważyć, że większa średnica igły iniekcyjnej niekoniecznie przekłada się na lepsze wyniki. Używana igła iniekcyjna ma średnicę 6-7 μm, nieco mniejszą niż okrągła spermada. Dlatego, gdy odsysany jest okrągły spermatyd, błona komórkowa jest poddawana efektowi ściskania, co może prowadzić do bezpośredniego odsłonięcia jądra. Ta bezpośrednia ekspozycja może sprzyjać depolimeryzacji, a następnie tworzeniu się męskiego przedjądrza27.

Zabieg uszczelniający
Oocyty myszy wykazują mniejszą lepkość cytoplazmatyczną w porównaniu z innymi gatunkami. Nawet niewielka przerwa w błonie komórkowej może spowodować łatwe wypłynięcie cytoplazmy, co skutkuje zwyrodnieniem oocytów28. Aby zmniejszyć ryzyko, po wstrzyknięciu okrągłego spermatydu do cytoplazmy oocytów i wyjęciu igły do wstrzykiwań, konieczne jest odessanie niewielkiej części błony komórkowej w pobliżu otworu błony komórkowej oocytu w celu uszczelnienia przestrzeni, podobnie jak w procedurze w ICSI21. Ten proces uszczelniania znacznie zmniejsza ryzyko zwyrodnienia oocytów.

Zastosowanie ROSI jako modelu
Poza zastosowaniami klinicznymi, technologia ROSI ma wiele innych zastosowań jako model. Może przyspieszyć pokolenie myszy razy29, uratować śmiertelność samic wynikającą z dziedziczonej po ojcu delecji Xist u myszy17, wygenerować myszy po wstrzyknięciu okrągłego plemnika do haploidalnych partenogenetycznych blastomerówdwukomórkowych 15, wygenerować transgeniczne potomstwo myszy16 i zachować płodność u dorastających dzieci przed leczeniem raka30,31. Rzetelne badania nad mysim ROSI mogą znacząco przyczynić się do postępu w badaniach nad zdrowiem reprodukcyjnym.

Ograniczenia artykułu
Niniejszy artykuł służy jako przewodnik metodologiczny z kilkoma ograniczeniami, w tym brakiem bezpośredniej selekcji porównawczej RS pod mikroskopem do wstrzykiwań oraz postrzeganym brakiem innowacji.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych lub innych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy naszą wdzięczność Wenjie Zhao za jej nieocenioną pomoc w sortowaniu plemników za pomocą cytometrii przepływowej oraz Fang Wang za jej ekspertyzę w transferze embrionów myszy. Prace te otrzymały częściowe wsparcie ze strony Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jilin (nr 1). YDZJ202301ZYTS461). Dziękujemy firmie Bullet Edits Limited za redakcję językową i korektę manuskryptu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl22H2O SigmaC7902 Przygotowanie CZB
Glukoza SigmaG6152 Przygotowanie CZB
HEPES-Na (podstawowy) SigmaH3784 Przygotowanie CZB
Hoechst 33342Beyotime C1025FACS
ludzka gonadotropina kosmówkowa (HCG)Ningbo Second Hormone CompanyHCGLeki wspomagające owulację
HialuronidazaSigmaH3506Usuwanie komórek ziarnistych wokół oocytu
KCl SigmaP5405Przygotowanie CZB
KH2PO4 SigmaP5655 Przygotowanie CZB
KSOMaaCaisson LabsIVL04-100MLPożywka zoptymalizowana pod kątem optymalnego spalania potasu uzupełniona aminokwasami
L-glutaminą SigmaG8540 Przygotowanie CZB
M2SigmaM7167-50MLPłyn eksploatacyjny
MgSO47H2O SigmaM1880 Przygotowanie CZB
Na2-EDTA2H2O SigmaE5134 Przygotowanie CZB
NaCl SigmaS5886Przygotowanie CZB
NaHCO3SigmaS5761 Przygotowanie CZB
Mleczan 60% syrop d = 1,32 g/LSigmaL7900 Przygotowanie CZB
Na-pirogronian SigmaP4562 Przygotowanie CZB
Końcówki do wierteł piezoelektrycznych (ICSI) Eppendorf piezoXpertPęknięcie błony piezoelektrycznej
gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG)Ningbo Second Hormone CompanyPMSGLeki wspomagające owulację
PVA SigmaP8136Przygotowanie CZB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword. Front Immunol. 5, 534(2014).">Redgrove, K. A., McLaughlin, E. A. The role of the immune response in Chlamydia trachomatis infection of the male genital tract: A double-edged sword. Front Immunol. 5, 534(2014).
  2. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: Its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online. 10 (2), 247-288 (2005).">Yanagimachi, R. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: Its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online. 10 (2), 247-288 (2005).
  3. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).">Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  4. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development. 121 (8), 2397-2405 (1995).">Kimura, Y., Yanagimachi, R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development. 121 (8), 2397-2405 (1995).
  5. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to non-obstructive azoospermia. Human Reprod. 11 (4), 780-783 (1996).">Tesarik, J., et al. Spermatid injection into human oocytes. II. Clinical application in the treatment of infertility due to non-obstructive azoospermia. Human Reprod. 11 (4), 780-783 (1996).
  6. Spermatid injection into human oocytes. I. Laboratory techniques and special features of zygote development. Human Reprod. 11 (4), 772-779 (1996).">Tesarik, J., Mendoza, C. Spermatid injection into human oocytes. I. Laboratory techniques and special features of zygote development. Human Reprod. 11 (4), 772-779 (1996).
  7. Activation regimens for full-term development of rabbit oocytes injected with round spermatids. Mol Reprod Dev. 76 (6), 573-579 (2009).">Hirabayashi, M., et al. Activation regimens for full-term development of rabbit oocytes injected with round spermatids. Mol Reprod Dev. 76 (6), 573-579 (2009).
  8. Birth of a marmoset following injection of elongated spermatid from a prepubertal male. Mol Reprod Dev. 86 (8), 928-930 (2019).">Ogonuki, N., et al. Birth of a marmoset following injection of elongated spermatid from a prepubertal male. Mol Reprod Dev. 86 (8), 928-930 (2019).
  9. Forty years of IVF. Fertil Steril. 110 (2), 185(2018).">Niederberger, C., et al. Forty years of IVF. Fertil Steril. 110 (2), 185(2018).
  10. Round spermatid injection. Urol Clin North Am. 47 (2), 175-183 (2020).">Gross, K. X., Hanson, B. M., Hotaling, J. M. Round spermatid injection. Urol Clin North Am. 47 (2), 175-183 (2020).
  11. Round spermatid injection into human oocytes: a systematic review and meta-analysis. Asian J Androl. 23 (4), 363-369 (2021).">Hanson, B. M., et al. Round spermatid injection into human oocytes: a systematic review and meta-analysis. Asian J Androl. 23 (4), 363-369 (2021).
  12. Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI). Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).">Tekayev, M., Vuruskan, A. K. Clinical values and advances in round spermatid injection (ROSI). Reprod Biol. 21 (3), 100530(2021).
  13. Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14629-14634 (2015).">Tanaka, A., et al. Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14629-14634 (2015).
  14. Ninety babies born after round spermatid injection into oocytes: survey of their development from fertilization to 2 years of age. Fertil Steril. 110 (3), 443-451 (2018).">Tanaka, A., et al. Ninety babies born after round spermatid injection into oocytes: survey of their development from fertilization to 2 years of age. Fertil Steril. 110 (3), 443-451 (2018).
  15. Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres. Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).">Yang, H., Shi, L., Chen, C. D., Li, J. Mice generated after round spermatid injection into haploid two-cell blastomeres. Cell Res. 21 (5), 854-858 (2011).
  16. Transgenic mouse offspring generated by ROSI. J Reprod Dev. 62 (1), 37-42 (2016).">Moreira, P., et al. Transgenic mouse offspring generated by ROSI. J Reprod Dev. 62 (1), 37-42 (2016).
  17. Round spermatid injection rescues female lethality of a paternally inherited Xist deletion in mouse. PLoS Genet. 12 (10), e1006358(2016).">Federici, F., et al. Round spermatid injection rescues female lethality of a paternally inherited Xist deletion in mouse. PLoS Genet. 12 (10), e1006358(2016).
  18. Paternally inherited H3K27me3 affects chromatin accessibility in mouse embryos produced by round spermatid injection. Development. 149 (18), 200696(2022).">Sakamoto, M., et al. Paternally inherited H3K27me3 affects chromatin accessibility in mouse embryos produced by round spermatid injection. Development. 149 (18), 200696(2022).
  19. Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection. Sci Adv. 8, (2022).">Wang, J., et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the reprogramming defects in embryos generated by round spermatid injection. Sci Adv. 8, (2022).
  20. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).">Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (1), (2018).
  21. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).">Yoshida, N., Perry, A. C. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  22. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2013).">Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2013).
  23. Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection. Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).">Kong, P., et al. Effects of the histone deacetylase inhibitor 'Scriptaid' on the developmental competence of mouse embryos generated through round spermatid injection. Hum Reprod. 32 (1), 76-87 (2017).
  24. Tricostatin A-treated round spermatid enhances preimplantation embryo developmental competency following round spermatid injection in mice. Zygote. 30 (3), 373-379 (2022).">Hosseini, S., Salehi, M. Tricostatin A-treated round spermatid enhances preimplantation embryo developmental competency following round spermatid injection in mice. Zygote. 30 (3), 373-379 (2022).
  25. Similar time restriction for intracytoplasmic sperm injection and round spermatid injection into activated oocytes for efficient offspring production. Biol Reprod. 70 (6), 1863-1869 (2004).">Kishigami, S., Wakayama, S., Nguyen, V. T., Wakayama, T. Similar time restriction for intracytoplasmic sperm injection and round spermatid injection into activated oocytes for efficient offspring production. Biol Reprod. 70 (6), 1863-1869 (2004).
  26. Oocyte activation during round spermatid injection: state of the art. Reprod Biomed Online. 45 (2), 211-218 (2022).">Tao, Y. Oocyte activation during round spermatid injection: state of the art. Reprod Biomed Online. 45 (2), 211-218 (2022).
  27. Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells. Int Rev Cytol. 246, 189-229 (2005).">Ogura, A., Ogonuki, N., Miki, H., Inoue, K. Microinsemination and nuclear transfer using male germ cells. Int Rev Cytol. 246, 189-229 (2005).
  28. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).">Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod. 52 (4), 709-720 (1995).
  29. A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells. PLoS One. 4 (3), e4943(2009).">Ogonuki, N., et al. A high-speed congenic strategy using first-wave male germ cells. PLoS One. 4 (3), e4943(2009).
  30. Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report. Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).">Abdelaal, O., et al. Fertility preservation for pediatric male cancer patients: illustrating contemporary and future options; a case report. Transl Androl Urol. 10 (1), 520-526 (2021).
  31. Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility. J Tissue Eng. 12, (2021).">Eyni, H., et al. Advanced bioengineering of male germ stem cells to preserve fertility. J Tissue Eng. 12, (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Round Spermatid InjectionMouse ROSIOocyte ActivationIntracytoplasmic Sperm InjectionEmbryonic DevelopmentFlow CytometrySpermatid IsolationOocyte MicroinjectionAssisted ReproductionGenetically Modified Mice

Related Articles