Artykuł metodologiczny

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

DOI:

10.3791/65906

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriofagi (fagi) to wirusy, które infekują bakterie o specyficzności gatunkowej i szczepowej i są najliczniejszymi jednostkami biologicznymi we wszystkich znanych ekosystemach. W społecznościach bakteryjnych, takich jak te występujące w mikrobiocie jelitowej, fagi są zaangażowane w regulację dynamiki populacji mikrobioty i napędzanie ewolucji bakterii. W ostatniej dekadzie ponownie wzrosło zainteresowanie badaniami nad fagami, częściowo ze względu na specyficzne dla gospodarza zdolności fagów litycznych do zabijania, które stanowią obiecujące narzędzie do przeciwdziałania rosnącemu zagrożeniu ze strony bakterii opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe. Co więcej, ostatnie badania wykazujące, że fagi przylegają do śluzu jelitowego, sugerują, że mogą one odgrywać ochronną rolę w zapobieganiu inwazji bakterii do leżącego poniżej nabłonka. Co ważne, podobnie jak mikrobiomy bakteryjne, zaburzone fageomy są związane z pogorszeniem wyników w chorobach takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Wcześniejsze badania wykazały, że fagi mogą modulować mikrobiom zwierząt i ludzi poprzez przeszczepy filtratu kałowego, korzystnie wpływając na zdrowie gospodarza. Wraz z tą ostatnią falą badań pojawia się konieczność ustanowienia i standaryzacji protokołów badania fagów w kontekście mikrobiomu jelitowego. Protokół ten zapewnia zestaw procedur do badania izolowanych fagów T4 i ich gospodarza bakteryjnego, Escherichia coli, w kontekście mysiego przewodu pokarmowego. Opisane tutaj metody opisują, jak zacząć od lizatu fagowego, podawać go myszom i oceniać wpływ na poziom bakteryjnego gospodarza i faga. Protokół ten może być modyfikowany i stosowany do innych par-bakteria i stanowi punkt wyjścia do badania dynamiki gospodarz-in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriofagi lub fagi to wirusy, które infekują i zabijają bakterie o specyficzności gatunkowej i szczepowej1. Fagi odgrywają ważną rolę w złożonych społecznościach bakteryjnych, takich jak mikrobiota jelitowa, gdzie są zaangażowane w regulację dynamiki populacji i napędzanie sprawności bakterii2. W ciągu ostatniej dekady ponownie wzrosło zainteresowanie badaniami nad fagami ze względu na wzrost liczby patogenów opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe3 oraz potencjał terapii fagowej jako alternatywnej strategii leczenia. W ostatnich latach koktajle fagów litycznych były stosowane dożylnie z pewnym powodzeniem w poważnych, opornych na antybiotyki bakteryjnych infekcjach septycznych u ludzi3,4. Doustna terapia fagowa została również zaproponowana jako potencjalna alternatywa dla antybiotyków w leczeniu infekcji jelitowych i stanów zapalnych. Ponadto fagi są zaangażowane w sukces przeszczepów filtratu kałowego (FFT), które są preparatami mikrobioty kałowej, które zostały przefiltrowane w celu usunięcia bakterii, w leczeniu nawracających infekcji Clostridioides difficile (rCDI)5,6, choroby zapalne jelit (IBD)7,8 i martwicze zapalenie jelit u wcześniaków9. Biorąc pod uwagę te wyniki, ważne jest, aby wziąć pod uwagę interakcje zarówno między fagami a mikrobiotą jelitową, jak i fagami a gospodarzem ssaków, ponieważ dodanie nowych fagów do istniejącej wcześniej społeczności może mieć pośredni wpływ na społeczność jako całość, a nie tylko na bakterie docelowe2,10.

Badanie interakcji fagów z ich docelowymi bakteriami in vitro okazało się przydatne do zrozumienia mechanizmów i wpływu interakcji fagów i bakterii w jelitach. W tym ustawieniu wykazano, że fagi T4 specyficzne dla Escherichia coli z rzędu Caudovirales wymagają domen podobnych do immunoglobuliny (Ig) zlokalizowanych w wysoce antygenowych białkach kapsydu zewnętrznego (Hoc) na powierzchni wirionu, aby przylegać do śluzu jelitowego11. Dodatkowo, testy transwell wykazały, że fagi T4 są zdolne do interakcji z kulturami komórek nabłonkowych i przemieszczania się przez warstwy komórkowe przez makropinocytozę12,13. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że fagi mogą wchodzić w interakcje ze swoim gospodarzem metazoanowym, mimo że nie są zdolne do infekowania komórek eukariotycznych. Modele te, choć użyteczne, nie obejmują pełnego zakresu złożonych interakcji zachodzących w ekosystemie jelitowym, które są wymagane do kompleksowego zbadania trójstronnej interakcji między fagami, bakteriami i gospodarzem metazoanu.

Modele myszy są ważnym narzędziem do badania fagów w złożonych środowiskach. Pożądanym zastosowaniem podawania fagów jest alternatywna strategia leczenia zakażeń opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe lub patobiontów związanych z przewlekłymi chorobami zapalnymi, w tym IBD. Jednak pojawiająca się literatura sugeruje, że zachowanie fagów in vitro nie odzwierciedla w pełni funkcji in vivo. Buttimer i wsp.14 wykazali, że koktajl fagowy był w stanie zubożyć docelowe bakterie w uproszczonym konsorcjum mikrobioty ludzkiej in vitro, ale nie mógł być replikowany in vivo u myszy gnotobiotycznych skolonizowanych tym samym konsorcjum bakterio-. Co więcej, w konwencjonalnym mikrobiomie myszy T7 doprowadził do selektywnego zubożenia docelowych bakterii jelitowych, chociaż z czasem zaobserwowano stopniowe odzyskiwanie, co wskazuje na wyewoluowaną oporność15. Inne badania wykazały współistnienie podawanych doustnie fagów i ich docelowych szczepów bakteryjnych in vivo2,16. Rzeczywiście, poza współistnieniem fagów i bakterii, podawanie fagów doprowadziło do rozległych zmian w ogólnym składzie i funkcji społeczności mikrobioty2,16. Jest to istotne w warunkach chorobowych, ponieważ kilka badań wykazało powiązania między zwiększoną względną liczebnością Caudovirales a IBD7,8,17, które były niezależne od zmian w liczebności bakterii7. Nie wiadomo, czy jest to czynnik napędzający, czy konsekwencja patogenezy choroby.

Historyczne skupienie badań nad fagami skupiało się na związku między fagiem a jego docelową bakterią. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę potencjalne interakcje między fagiem a błoną śluzową, nabłonkiem i układem odpornościowym gospodarza metazoan. Wszystkie te interakcje odgrywają ważną rolę w ogólnej odpowiedzi na zakażenie fagami jelitowymi. Aby to wykazać, fagi badano na myszach wolnych od zarazków (GF), aby wyjaśnić ich wpływ na układ odpornościowy bez ingerencji ze strony mikrobioty8. W tym systemie kwasy nukleinowe fagowe były wykrywane przez receptory Toll-podobne (TLR) zlokalizowane w endosomach fagocytarnych komórek odpornościowych (makrofagów i komórek dendrytycznych). To aktywowało sygnalizację w dół i stymulowało zależną od limfocytów T produkcję interferonu (IFN)-γ8 lub IFNs18. Co więcej, Fluckiger i wsp.19 angażowali limfocyty T CD8 + pamięci w rozpoznawanie antygenów kodowanych przez fagi (profagów), co skutkowało reaktywnością krzyżową limfocytów T z antygenami nowotworowymi, co skutkowało zmniejszeniem obciążenia guza. Wreszcie, produkcja przeciwciał specyficznych dla fagów została udokumentowana w badaniach na myszach, w których fagi były dostarczane do modeli zwierzęcych w sposób ciągły przez wodę pitną8,20, lub przez powtarzane doustne zgłębnik przez kilka miesięcy20, wykazując zdolność białek fagowych do promowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Chociaż te tryby inokulacji fagów pozwalają na optymalne i ciągłe pobudzanie układu odpornościowego, mogą nie reprezentować naturalnie występujących interakcji między fagami a środowiskiem jelitowym, ani kinetyki doustnej terapii fagowej. Do tej pory w ograniczonej liczbie badań analizowano interakcje faga z pojedynczym gatunkiem bakterii w monokolonizowanych modelach myszy21. Jednak monokolonizowane myszy okazały się kluczowe w rozszyfrowywaniu specyficznego dla mikroorganizmów wpływu poszczególnych gatunków na przewód pokarmowy (GI) i rozwój układu odpornościowego22,23,24, i mogą jeszcze okazać się przydatne w zrozumieniu trójstronnych interakcji między fagami, ich docelowymi bakteriami i gospodarzem metazoanu.

Ekscytujące, wciąż jest wiele do nauczenia się na temat interakcji między fagami jelitowymi a bakteriami komensalnymi jelit, a także interakcji, które zachodzą między gospodarzem metazoanu a fagami, które w nim rezydują. Protokół ten zapewnia zestaw procedur do badania izolowanego faga T4 i jego bakteryjnego odpowiednika, E. coli (K-12, BW25113), przy użyciu gnotobiotycznego modelu myszy. Te ustandaryzowane procedury stanowią również podstawę do optymalizacji innych diad fagowo-bakteryjnych poprzez dostosowanie parametrów wzrostu do par zainteresowania. Opisane tutaj metody określają: (1) Przygotowanie faga T4 i lizatów nośnika do doustnego zgłębnika myszy; (2) Doustne podawanie faga T4 monokolonizowanym myszom gnotobiotycznym E. coli; (3) Monitorowanie poziomów fagów T4 w kale i tkankach myszy w czasie.

Dla prezentowanych tutaj reprezentatywnych wyników, oczyszczone lizaty fagów T4 zostały rozmnożone z zapasów banku fagów utrzymywanego przez Rohwer Lab. Metoda rozmnażania faga T4 metodą Phage-on-Tap została dostosowana25, zgodnie z tym protokołem. Metoda pozwala w ciągu trzech dni uzyskać zapasy fagów o wysokim mianie i niskiej zawartości endotoksyn. Stosując to podejście, rutynowo zebrano 10 ml ≥10 10 jednostek tworzących płytkę (pfu)/ml faga T4 z < 0,5 jednostki endotoksyny (EU)/ml. Zalecane poziomy endotoksyn do podawania doustnego lub dożylnego myszom wynoszą odpowiednio ≤20 EU/ml i ≤ 5 EU/kg/h (lub 0,1 UE podawane w ciągu 1 godziny dla myszy o masie 20 g), co czyni ją odpowiednią metodą przygotowania fagów do inokulacji in vivo. Wszystkie stada fagów przechowywano w temperaturze 4 °C w buforze fagowym z soli magnezowej (SM) (receptura podana w kroku 1.1.5.1). E. coli była hodowana w pożywkach LB. Dla różnych par-bakteria na podstawie tego protokołu można dostosować różne podłoża hodowlane i warunki wzrostu. Fagi mogą być również pozyskiwane ze środowiska, takiego jak ścieki, woda morska, gleba i zawartość jelitowa, i mogą być izolowane i oczyszczane zgodnie z Sambrook and Russell26 przed przygotowaniem przy użyciu odpowiednich warunków wzrostu i rozmnażania dla każdej pary-gospodarz będącej przedmiotem zainteresowania25. Alternatywnie, fagi można uzyskać ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów) lub z banków fagów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami UBC i zatwierdzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego protokoły (A23-0113, B19-0038). Myszy umieszczono na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w warunkach wolnych od patogenów w Centrum Modelowania Chorób. Myszy C57BL/6 hodowano w obiekcie w sterylnym izolatorze z elastyczną folią, dostarczanym ze sterylną dietą dla myszy, wodą, ściółką i materiałem gniazdowym. Myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu dzień/noc. Myszy eksperymentalne, zarówno samce, jak i samice, były dopasowane w każdym eksperymencie, w wieku od 6 do 12 tygodni i ważące 15-30 g we wszystkich eksperymentach.

1. Przygotowanie fagów i lizatów nośnikowych do doustnego podawania przez zgłębnik myszom

  1. Oczyszczanie fagów i wytwarzanie zapasów
    UWAGA: W tym badaniu fagi T4 są hodowane i natłuszczane przez posiew na trawniku bakterii przy użyciu metody pojedynczej warstwy agaru, opisanej poniżej. Metoda podwójnej warstwy agaru została opisana wcześniej25,27 i może być również stosowana z podobną skutecznością. Do tego protokołu wybrano metodę pojedynczej warstwy agaru, ponieważ zapewnia ona lepszą widoczność płytki nazębnej28.
    1. Hoduj E. coli w 5 ml sterylnego podłoża LB w sterylnych probówkach do hodowli polistyrenu lub szkła (z nakrętkami). Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez noc, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
    2. Przygotuj miękki agar w szklanej butelce z podłożem, autoklawując LB 0,5% agarem i schładzając do 50 °C lub niższej (pozostając płynem) przed suplementacją. Przygotuj wystarczającą ilość miękkiego agaru na 15 ml na płytkę.
    3. Uzupełnić miękki agarMgSO4 i CaCl2 do końcowego stężenia 1 mM dla każdego z nich. Dodaj 100 μl nocnej kultury E. coli na każde 3 ml miękkiego agaru. Delikatnie wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, aby homogenizować suplementy i kulturę w miękkim agarze.
      UWAGA: Spójność objętości i gęstości E. coli, która jest dodawana do preparatu z miękkiego agaru, ma kluczowe znaczenie (przedstawione w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników).
    4. Dodać 15 ml miękkiego agaru + E. coli na szalkę Petriego (średnica 15 cm) za pomocą pipety serologicznej. Pozwól, aby płytki zastygły w temperaturze pokojowej do użytku tego samego dnia.
      UWAGA: Talerze zastygną w ciągu około 20 minut przy otwartych pokrywkach. Agar pozostanie miękki, ale nie przesunie się, gdy płytki zostaną odwrócone.
    5. Przygotować 8-10 seryjnych rozcieńczeń źródłowego faga T4 w czynnikach 10 przez rozcieńczenie w buforze SM. Umieścić 5 μl każdego rozcieńczenia na płytkach. Pozostawić plamy do wyschnięcia, odwrócić i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
      1. Aby przygotować bufor fagowy soli magnezowej (SM), w 1 l dejonizowanegoH2O, rozpuść 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4·7H2O i 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Następnego dnia E. coli powinna była wyrosnąć na trawnik na miękkim agarze LB. Blaszki miażdżycowe lub oczyszczone obszary wzrostu widoczne na trawniku E. coli pojawią się w miejscu, w którym doszło do zabicia fagów zakażonych gospodarzy E. coli. Każda tabliczka reprezentuje jednostkę tworzącą płytkę (pfu).
    6. Wybierz pojedynczą płytkę nazębną z miękkiej płytki agarowej, wciskając sterylną końcówkę pipety w środek płytki nazębnej, tworząc zatyczkę agarową na końcu końcówki. Zawiesić korek płytki nazębnej w 1 ml buforu SM w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Wiruj probówkę z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby wymieszać.
    7. Odwirować probówkę o masie 4000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z lizatu. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
    8. Aby rozmnożyć izolowany, powtórz kroki 1.1.1-1.1.3. Dodać 100 μl wyizolowanego faga do 15 ml podwielokrotności miękkiego agaru zawierającego E. coli w stożkowej probówce. Odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać i wlej agar na szalkę Petriego.
    9. Pozostawić płytki do wyschnięcia przed odwróceniem i inkubacją przez noc w temperaturze 37 °C. Przygotować płytkę kontrolną trawnika bez faga, aby potwierdzić żywotność E. coli.
      UWAGA: Po całonocnej inkubacji na płytce kontrolnej powinien znajdować się trawnik z E. coli, podczas gdy na płytce zawierającej fagi powinna być całkowicie zlizowana.
    10. Aby wyekstrahować faga z płytki, dodaj 5 ml buforu SM do powierzchni płytki oczyszczonej z faga i wstrząsaj z prędkością 70 obr./min na kołysku przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Zebrać bufor z płytki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 4000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z płytki agarowej.
    12. Zebrać podstawowy lizat fagowy T4 do nowej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu miareczkowania i rozmnażania.
      UWAGA: Fagi T4 są stabilne przez ponad 10 lat25; Jednak stabilność będzie zależeć od rodzaju faga i warunków przechowywania. Miano faga będzie się również różnić w zależności od czasu przechowywania. Fagi są wrażliwe na zamrażanie. Dlatego zaleca się kriokonserwację w ciekłym azocie i unikanie cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to uszkodzić fagi, zmniejszając miano fagów25.
    13. Mianować lizat podstawowy faga T4, aby określić stężenie w pfu/ml, zgodnie z wcześniejszym opisem25,29,30. Stado fagów T4 o wysokim mianie będzie zawierać 10,8 pfu/ml lub więcej.
  2. Przygotowanie eksperymentalnych lizatów fagowych
    1. Hodowla E. coli w 5 ml pożywki LB w sterylnych probówkach hodowlanych z polistyrenu lub szkła (z nakrętkami). Inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
    2. Subkultura nocnej kultury E. coli w stosunku 1:50 w 100 ml pożywki LB w szklanej kolbie stożkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min, aż bakterie osiągną wczesną lub środkową fazę wykładniczą (ok. 1,5 h).
      UWAGA: Wstępną krzywą wzrostu można przeprowadzić w celu wyznaczenia gęstości optycznej w zakresie 600 nm (OD600), w którym kultura bakteryjna znajduje się w fazie wykładniczej. Sugeruje się hodowlę w szklanej stożkowej probówce, ponieważ ostatnie dowody wykazały, że fagi są w stanie przylegać do tworzyw sztucznych, takich jak polipropylen31.
    3. Dodać 100 μl faga T4 o wysokim mianie z etapu 1.1 do subkultury E. coli i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 3 godziny lub do momentu, gdy nowy lizat przestanie być mętny. Zebrać lizat fagowy T4 do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i albo przejść bezpośrednio do etapów oczyszczania, albo, jeśli to konieczne, przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia.
      UWAGA: Większy rozmiar wybuchu faga (wskazujący na wyższą średnią liczbę wirionów uwalnianych w cyklu replikacji) wymaga dłuższego okresu inkubacji subkultury bakteryjnej w kroku 1.2.2. Zapewnia to zwiększoną gęstość bakterii przed wystrzeleniem z zapasami fagów.
    4. Odwiruj lizaty przy 4000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać wszelkie pozostałe bakterie i resztki komórkowe. Przefiltrować-wysterylizować powstały supernatant za pomocą nylonowego filtra 0,22 μm i przenieść filtrat do nowych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    5. Dodaj 0,1 objętości chloroformu do każdej objętości przefiltrowanego lizatu fagowego T4, aby zabić wszelkie pozostałe bakterie i zapobiec ich rozwojowi. Krótko wirować, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Fagi otoczkowe lipidami są wrażliwe na chloroform, który może obniżać miano fagów25. W razie potrzeby pomiń ten krok.
      UWAGA: Chloroform jest toksycznym rozpuszczalnikiem organicznym, który jest niebezpieczny w przypadku wdychania, spożycia lub wchłaniania przez skórę. Podczas pracy z chloroformem należy używać dygestorium i odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE). Podczas pracy z chloroformem należy używać szkła zamiast polistyrenowych pipet serologicznych, ponieważ nie jest on kompatybilny z większością tworzyw sztucznych. Chloroform można umieścić w polipropylenowych stożkowych probówkach wirówkowych dla stopni 1.2.5-1.2.6, ale nie należy go przechowywać przez długi czas w probówkach z tworzywa sztucznego.
    6. Odwirować lizat przy 4000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia chloroformu od lizatu. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieś górną warstwę lizatu do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, nie naruszając leżącej pod spodem warstwy chloroformu. Wyrzucić odpady chloroformu do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne odpady ciekłe. Przechowywać lizaty w temperaturze 4 °C do czasu wymiany stężenia i buforu następnego dnia.
    7. Skoncentrować lizaty fagowe w filtrze odśrodkowym o sile 100 kDa (patrz tabela materiałów), dodając 13 ml lizatu fagowego do górnego zbiornika urządzenia i odwirowując przy 4000 x g przez 5 minut lub do momentu, gdy większość lizatu przejdzie przez filtr do dolnego zbiornika.
      UWAGA: Staraj się mieć około 2 ml lizatu pod koniec czasu wirowania. Wraz ze wzrostem stężenia faga w filtrze z dodatkiem lizatu, czas wirowania prawdopodobnie się wydłuży. Odśrodkowe urządzenia filtrujące mają fizyczny martwy punkt, który zapobiega ich wirowaniu na sucho32. Nie pozwól, aby membrana filtra wyschła, jeśli planowane jest dalsze użytkowanie (tj. poprzez usunięcie całego płynu z górnego zbiornika). Czas wirowania może się różnić w zależności od rodzaju faga i miana.
    8. Za pomocą pipety P200 lub P1000 delikatnie odpipetuj pozostałe ~2 ml lizatu w górę iw dół w górnym zbiorniku, aby odblokować membranę filtra po każdym wirowaniu. Wyrzucić filtrat z dolnego zbiornika do pojemnika na odpady, pozostawiając skoncentrowany w górnym zbiorniku.
    9. Powtarzać kroki 1.2.7-1.2.8, aż cała objętość lizatu fagowego zostanie przepuszczona przez urządzenie filtrujące, z ~2 ml skoncentrowanego faga zatrzymanego w górnym zbiorniku po każdym wirowaniu.
    10. Odblokuj membranę filtra po ostatnim wirowaniu, pipetując pozostały lizat (~ 2 ml) w górnym zbiorniku w górę iw dół. Przemyć (wymiana buforowa) przez dodanie 12 ml buforu SM do górnego zbiornika i odwirować przy 4000 x g przez 10 minut lub do momentu, gdy większość buforu przejdzie przez filtr.
    11. Odrzucić filtrat i powtórzyć etap przemywania (krok 1.2.10). Zawiesić pozostałe 2 ml lizatu w buforze SM do końcowej objętości 10 ml (lub mniejszej) w celu długotrwałego przechowywania. Przenieść lizat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu usunięcia endotoksyn.
      UWAGA: Określenie miana faga na tym etapie jest opcjonalne, aby upewnić się, że lizat fagowy został skoncentrowany (> 108 pfu/ml) oraz w celu określenia utraty faga podczas procesu usuwania endotoksyn.
    12. Usunąć zanieczyszczające endotoksyny z lizatu fagowego T4, dodając 0,4 objętości 1-oktanolu (patrz tabela materiałów) do całkowitej objętości lizatu.
      UWAGA: Endotoksyny są usuwane, ponieważ są wysoce immunostymulujące, a zatem ich obecność może prowadzić do indukcji niezależnej od fagów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej25.
      UWAGA: 1-Octanol jest aromatycznym, organicznym, łatwopalnym związkiem o silnym zapachu i działa drażniąco na oczy. Podczas pracy z 1-oktanolem należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Wszystkie prace należy wykonywać pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania pary. Użyj folii uszczelniającej, aby zapobiec wyciekaniu rur podczas pracy poza wyciągiem.
    13. Uszczelnij pokrywę stożkowej rurki wirówkowej folią uszczelniającą, aby zapobiec wyciekom. Wytrząsać z prędkością 120 obr./min na platformie lub wytrząsarce kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny, bez wstrząsania.
    14. Wirować przy 4000 x g przez 10 minut w celu oddzielenia lizatu oczyszczonego z endotoksyn od 1-oktanolu. Warstwa 1-oktanolu będzie unosić się na wierzchu lizatu. Użyj pipety P1000, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej 1-oktanolu i wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne/łatwopalne odpady płynne.
    15. Za pomocą igły 18 G i strzykawki o pojemności 10 ml zebrać lizat fagowy pod pozostałą warstwą 1-oktanolu, uważając, aby nie zebrać warstwy 1-oktanolu. Przechowywać lizat w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania prędkości próżni.
    16. Przenieść 1 ml podwielokrotności lizatu fagowego T4 do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Szybkie odkurzanie z otwartymi pokrywkami na 4000 x g w temperaturze pokojowej w celu odparowania pozostałości 1-oktanolu z lizatu. Przyspieszaj odkurzanie przez 3 godziny lub do momentu, gdy objętość lizatu faga zostanie zmniejszona o 30%25. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu miareczkowania.
    17. Mianować lizat fagowy w celu określenia stężenia w pfu/ml. Rozcieńczyć otrzymany lizat fagowy T4 w buforze SM do pożądanego stężenia i ponownie mianować w celu potwierdzenia.
    18. Określ ilościowo endotoksyny obecne w lizacie fagowym T4 za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego chromogennej endotoksyny zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Porównaj poziomy endotoksyn w końcowym lizacie fagowym z próbką sprzed usunięcia endotoksyny, kontrolami nośnika, buforem i wodą pitną dla myszy.
      UWAGA: Zestaw do oznaczania ilościowego endotoksyn chromogennych jest inaktywowany przez 1-octanol25. Wykonaj kroki próżni szybkościowej, aby usunąć 1-oktanol (krok 1.2.16) przed ilościowym określeniem endotoksyn. Zawartość endotoksyn w wodzie destylowanej szacuje się na 20 EU/mL25; Jednak zawartość endotoksyn w wodzie pitnej dla myszy może się różnić w zależności od obiektu. Jeśli poziom endotoksyn w lizacie fagowym przekracza ilość obecną w wodzie pitnej, należy rozważyć powtórzenie etapów usuwania endotoksyn (1.2.12-1.2.16).
    19. Skoncentrowane, oczyszczone z endotoksyn lizaty fagowe T4 należy przechowywać w buforze SM w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie lizatu bakteryjnego bez fagów do kontroli pojazdów
    UWAGA: Wolny od fagów lizat bakteryjny można przygotować jako nośnik do kontroli wszelkich skutków spowodowanych zanieczyszczeniami bakteryjnymi (np. endotoksyną) powstającymi podczas produkcji lizatu fagowego w kroku 1.2, co może mieć wpływ na wyniki eksperymentalne po zaszczepieniu myszy.
    1. Z nocnej hodowli E. coli, subkulturuj E. coli 1:50 w 100 ml pożywki LB. Bez dodawania faga należy kontynuować hodowlę bakterii, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 3 godziny lub dopasowując czas inkubacji lizatu fagowego wytworzonego w kroku 1.2.
    2. Przenieść kulturę E. coli do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i lizować komórki za pomocą sondy sonikatora (patrz Tabela Materiałów) na lodzie o częstotliwości 30 kHz przez 30 impulsów sekundowych (3x) w celu ręcznej lizy komórek bakteryjnych.
    3. Postępuj zgodnie z pozostałą częścią protokołu zgodnie z krokiem 1.2, zaczynając od kroku 1.2.4, w tym wszystkimi krokami czyszczenia, mycia i usuwania endotoksyn.
      UWAGA: Podczas zagęszczania za pomocą filtra odśrodkowego lizat nośnika będzie przepływał przez filtr szybciej niż lizat fagowy, ze względu na brak faga. Dlatego należy skrócić czas wirowania z 5 minut do 2-5 minut, aby membrana ultrafiltra nie wyschła podczas długotrwałego wirowania.
    4. Mianować lizat nośnika, aby potwierdzić, że nie zawiera on fagów.
    5. Użyj zestawu do oznaczania ilościowego endotoksyn chromogennych zgodnie z instrukcjami producenta, aby zmierzyć poziom endotoksyn w lizacie nośnika. Rozcieńczyć lizat nośnika w buforze SM, aby dopasować poziomy endotoksyn w lizacie fagowym.
  4. Alternatywne kontrole eksperymentalne: przygotowanie inaktywowanego termicznie lizatu fagowego
    UWAGA: Alternatywą dla lizatu bakteryjnego bez fagów jest inaktywowany termicznie lizat fagowy. Inaktywacja termiczna dysocjuje wiriony fagowe, podczas gdy resztkowe endotoksyny, takie jak lipopolisacharydy (LPS), są stabilne termicznie8,33. Metoda ta została użyta przez Gogokhia et al.8 w celu określenia, czy nienaruszone, żywotne wiriony fagowe są wymagane do aktywacji immunologicznej. Zachęca się badaczy do przetestowania obu metod (bez fagów lub inaktywowanych termicznie) i określenia, która kontrola jest najbardziej odpowiednia dla ich potrzeb eksperymentalnych. Niezależnie od tego, który z nich zostanie wybrany, ważne jest, aby przyznać, że jest mało prawdopodobne, aby kontrola buforowa była odpowiednia ze względu na znaczne manipulacje, które są wymagane do zagęszczenia i oczyszczenia stada fagów.
    1. Przenieś wymaganą objętość oczyszczonego, oczyszczonego i rozcieńczonego lizatu fagowego T4 z kroku 1.2 (100 μl na mysz) do sterylnych probówek do mikrowirówek wyposażonych w zamki pokrywy.
    2. Podgrzewaj lizaty na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez 15 min16.
    3. OPCJONALNIE: Jeśli wymagane jest usunięcie fagów/bakteryjnych kwasów nukleinowych, należy przeprowadzić zabieg DNazy I i RNazy A zgodnie z Jakočiūnė i Moodley34. Krótko:
      1. Dodaj 50 μl buforu 10x DNazy I, 1 μl DNazy I (1 U/μL) i 1 μl RNazy A (10 mg/ml) (patrz tabela materiałów) do 450 μl inaktywowanego termicznie lizatu fagowego.
      2. Inkubować lizaty w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny w bloku grzewczym, bez wstrząsania.
      3. Dezaktywuj DNazę I i RNazę A, dodając 20 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)34.
    4. Trzymaj lizaty w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby ostygły i połącz lizaty, jeśli używanych jest wiele probówek. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu miareczkowania.
    5. Wykonaj miano faga, aby potwierdzić, że w lizacie nie ma żywego faga T4. Przechowywać inaktywowane termicznie lizaty w temperaturze 4 °C.
    6. Użyj zestawu do oznaczania ilościowego endotoksyn chromogennych zgodnie z instrukcjami producenta, aby zmierzyć poziom endotoksyn w lizacie inaktywowanym termicznie. Rozcieńczyć inaktywowany termicznie lizat w buforze SM zgodnie z poziomami endotoksyn obecnymi w dopasowanym lizacie fagowym.

2. Podawanie i monitorowanie faga T4 u myszy monokolonizowanych E. coli

  1. Monokolonizacja myszy E. coli
    1. Przygotuj E. coli do podania myszom GF8 poprzez hodowlę E. coli pobranych z pojedynczej kolonii na pożywce LB przez noc.
    2. W surowych, sterylnych warunkach35, podaj 200 μl kultury E. coli myszom GF trzymanym w sterylnych izolatorach winylowych lub hermetycznych klatkach z wykluczeniem biologicznym za pomocą zgłębnika doustnego. W przypadku stosowania bakterii aerotolerancyjnych, myszy mogą być również skolonizowane przez zastosowanie 200 μl kultury bakteryjnej na grzbiet każdej myszy.
      UWAGA: Dawka inokulacji będzie zależna od szczepu, ponieważ różne bakterie wykazują różną zdolność przetrwania pH36,37. Zucoloto et al.35 zalecają inokulację 1 x 108 jtk na zwierzę. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki uzyskano od myszy zaszczepionych nocną hodowlą (jtk nie został określony). Można przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia dawki, która powoduje niezawodną kolonizację interesującego szczepu myszy. Na ilość bakterii, które mają być podawane przez zgłębnik doustny, może mieć wpływ wiek i waga myszy. Skonsultuj się z indywidualnym laboratoryjnym lub instytucjonalnym protokołem etyki zwierząt, aby uzyskać maksymalne dopuszczalne dawki. Sugerowana tutaj objętość opiera się na naddatku na zgłębnik wynoszącym 10% masy ciała myszy (np. maksymalnie 200 μl dla myszy o wadze 20 g). Niektóre gatunki bakterii nie tolerują kwasowości żołądka i nie kolonizują jelit. Rozważ najpierw zgrubienie 100 μL 1 M NaHCO3 w celu zneutralizowania kwasów żołądkowych2. W przypadku stosowania ścisłego beztlenowca do kolonizacji, mikrob będzie musiał być hodowany w warunkach beztlenowych i przenoszony do gnotobiotycznego obiektu dla zwierząt w indywidualnie przygotowanych, hermetycznych pojemnikach (1 na każdą mysz). Każdą zgłębnik należy wykonywać szybko po otwarciu pojemnika, aby ograniczyć utratę żywotności mikrobiologicznej z powodu ekspozycji na tlen.
    3. Monitoruj myszy pod kątem niekorzystnych skutków zdrowotnych.
      UWAGA: W przypadku wystąpienia niekorzystnych skutków zdrowotnych należy zapoznać się z normami ustalonymi przez odpowiednią placówkę opieki nad zwierzętami. Możliwe niekorzystne skutki zdrowotne obejmują między innymi: (1) Zachłyśnięcie płynu przez zgłębnik: objawy obejmują wydalanie pęcherzyków przez nos, oddychanie "otwartymi ustami" / sapanie. (2) Perforacja przełyku: objawy obejmują szybkie pogorszenie stanu zdrowia, garbienie się, letarg, prowadzące do śmierci zwierzęcia w ciągu 24 godzin. (3) Zapalenie przełyku spowodowane powtarzającymi się zgłębnikami: objawy obejmują trudności z wkłuciem igły do zgłębnika. (4) Biegunka spowodowana zmianami w mikrobiomie.
    4. Potwierdź kolonizację bakteryjną w osadach kałowych poprzez hodowlę co najmniej raz w tygodniu i/lub sekwencjonowanie 16S rRNA35.
      UWAGA: Jeśli kolonizujesz hodowców w izolatorze gnotobiotycznym w celu produkcji myszy doświadczalnych, zaplanuj z co najmniej 9-tygodniowym wyprzedzeniem pokolenie 6-tygodniowego pierwszego pokolenia myszy eksperymentalnych (F1). Alternatywnie, dorosłe myszy GF mogą być monokolonizowane. W tym podejściu zaleca się odczekanie 7 tygodni po kolonizacji przed inokulacją faga, ponieważ jest to czas potrzebny do ustabilizowania się błony śluzowej jelit po wprowadzeniu złożonej mikrobioty do myszy GF mice38.
  2. Doustna inokulacja faga T4 monokolonizowanym myszom E. coli
    1. Rozcieńczyć lizaty fagów T4 i kontrole nośnika do określonego stężenia w buforze SM. Zgodnie z Hsu et al.2, rozcieńczyć lizaty fagów, aby umożliwić podawanie 2 x 106 pfu na mysz2.
      UWAGA: Można zastosować wyższe lub niższe stężenie faga w zależności od stabilności faga in vivo. Dawki 2 x 102, 2 x 104 i 2 x 106 pfu faga T4 na mysz spowodowały stabilną i długotrwałą kolonizację w jelitach, która nie wydawała się być zależna od dawki (pokazano w sekcji wyników reprezentatywnych). Kinetyka fagów i bakterii powinna być zatem pilotowana in vivo przed eksperymentami na dużą skalę.
    2. W sterylnych, gnotobiotycznych warunkach, zgłębnik każdej myszy podaje 100 μl autoklawowanego 1 M NaHCO3 w celu zneutralizowania kwasów żołądkowych. Odczekaj 10 minut, a następnie pobierz 100 μl lizatu fagowego T4 lub kontroluj pojazd.
    3. Monitoruj myszy pod kątem niekorzystnych skutków zdrowotnych.

3. Monitorowanie poziomów fagów T4 in vivo

UWAGA: Po zaszczepieniu myszy fagami, stężenie zarówno fagów, jak i docelowych bakterii może być mierzone w próbkach kału lub tkanek. Dostarcza to informacji na temat kinetyki infekcji fagowej i dynamiki kolonizacji obu organizmów.

  1. Posiewanie punktowe faga T4 w celu określenia stężenia w granulkach kału
    1. Zbierz granulki kału od każdej myszy do sterylnych, wstępnie zważonych probówek mikrowirówek, aby zmierzyć poziom fagów T4 i E. coli. Przechowuj probówki na lodzie do momentu poszycia.
      UWAGA: Umieść próbki na lodzie w okresie przejściowym między pobraniem a posiewem, aby spowolnić rozwój bakterii aerotolerancyjnych. W ciągu kilku godzin może nadal dochodzić do rozwoju bakterii tlenowych lub pewnej śmierci bakterii beztlenowych z powodu ekspozycji na tlen, co może prowadzić do wypaczonej liczby bakterii. Dlatego posiewanie bakterii i fagów należy przeprowadzić jak najszybciej po pobraniu próbki. Obowiązkowe bakterie beztlenowe nie tolerują ekspozycji na tlen. W celu zachowania próbki należy pobrać do szczelnie zamkniętych probówek i przenieść probówki do komory beztlenowej tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. Jeśli w próbkach kału nie zostanie wykryty wzrost, rozważ alternatywy, takie jak 16S rRNA qPCR do ilościowego oznaczania bakterii.
    2. Zapisz końcowe masy każdej probówki i oblicz masę próbki, odejmując początkową masę probówki. Zostanie to wykorzystane do normalizacji stężenia fagów T4 i E. coli do masy próbki (odpowiednio pfu/g lub jtk/g).
    3. Dodaj 1 ml sterylnego buforu SM do każdej probówki i dokładnie zwiruj z maksymalną prędkością (>1 min), aby homogenizować granulki kału. Jeżeli próbka jest mniejsza niż 15 mg, można dodać mniejszą objętość buforu SM. Zapisać objętość buforu SM dodanego do każdej próbki w celu obliczenia jtk/g lub pfu/g próbki.
    4. Przygotować serię 8 (lub więcej w zależności od oczekiwanego stężenia fagów) seryjnych rozcieńczeń po 20 μl każdej próbki w 180 μl buforze SM, w mnożniku 10. Każdą homogenizowaną próbkę należy krótko zmieszać w celu wymieszania przed dodaniem do pierwszej probówki/studzienki. Pipetę należy mieszać między każdym dodawaniem i wymieniać końcówki między każdym rozcieńczeniem, aby zapobiec zawyżaniu liczby fagów lub bakterii poprzez przenoszenie próbki.
      UWAGA: Jeśli włókna i zanieczyszczenia obecne w próbce utrudniają pipetowanie, dodaj dodatkowy bufor do zawiesiny kału, aby jeszcze bardziej rozcieńczyć próbkę podstawową.
    5. Umieścić 5 μl każdego rozcieńczenia na miękkich płytkach agarowych LB zawierających E. coli (do oznaczania płytek fagowych) lub płytek agarowych LB (1,5% agaru, do oznaczania kolonii bakteryjnych) w celu oznaczenia stężenia faga T4 i E. coli w każdej próbce. Aby uzyskać dokładność, należy umieścić każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
      UWAGA: W przypadku przygotowywania seryjnych rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, do pipetowania każdej kolumny seryjnie rozcieńczanej próbki na płytki można użyć 8-kanałowej pipety wielokanałowej P20. Zmieniaj końcówki między każdym rozcieńczeniem, nawet jeśli przechodzisz od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej skoncentrowanego, ponieważ może przylegać do ścianek końcówki pipety i zmieniać ilość faga dodawanego do każdej nowej studzienki31.
    6. Poczekaj, aż każde miejsce wyschnie przed odwróceniem płytki i umieszczeniem jej w inkubatorze. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Dla każdej próbki należy wybrać rozcieńczenie, w którym znajduje się 3-30 policzalnych blaszek na plamkę. Policz i zapisz liczbę blaszek w miejscu i użyte rozcieńczenie.
    8. Obliczyć pfu/g próbki, dzieląc liczbę blaszek przez objętość posiażdżoną w każdym punkcie, aby otrzymać pfu/μl. Pomnóż to przez współczynnik rozcieńczenia i przez objętość buforu SM dodanego do każdej próbki, aby otrzymać pfu/próbkę. Na koniec podziel przez masę próbki, aby otrzymać pfu/g30.
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
  2. Pobieranie próbek tkanek w eksperymentalnych punktach końcowych
    1. W każdym wybranym punkcie czasowym poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem etyki zwierząt i zbierz zawartość jelita ślepego, treść jelita cienkiego i grubego oraz wszelkie interesujące nas tkanki do sterylnych, wstępnie zważonych probówek mikrowirówek okrągłodennych o pojemności 2 ml.
    2. Zapisz końcowe masy każdej probówki, aby obliczyć masę próbki. Chusteczki i zawartość jelita ślepego należy przechowywać na lodzie do tego samego dnia posiewu.
    3. Dodać sterylny bufor SM do każdej probówki i zapisać dodane objętości.
    4. W przypadku treści jelitowej i jelitowej należy dokładnie (>1 min) pobrać próbki wirowo zgodnie z krokiem 3.1.3.
    5. W przypadku próbek tkanek dodaj jeden sterylny metalowy koralik do każdej probówki. Homogenizować tkanki za pomocą lizera tkankowego (patrz tabela materiałów) przy 20 Hz przez 5 minut lub do momentu, gdy tkanki zostaną zdysocjowane, a zawiesina stanie się jednorodna.
      UWAGA: Jeśli próbki nie homogenizują się dobrze, należy rozważyć zwiększenie objętości dodawanego buforu SM, wydłużenie czasu homogenizacji lub zwiększenie częstotliwości homogenizacji do 30 Hz. Homogenizator tkankowy może być również używany do dysocjacji tkanek, umożliwiając jednocześnie regenerację bakterii i fagów39,40. Homogenizatory pracują z wyższymi częstotliwościami niż lizery tkankowe przy zachowaniu integralności bakterii.
    6. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej próbki w czynnikach 10 i przeprowadzić posiew punktowy w celu określenia stężenia fagów E. coli i T4 w każdej próbce, jak opisano w kroku 3.1.4-3.1.841.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać interakcje między diadą faga T4/E. coli w jelicie mysim, przygotowano, oczyszczono i oczyszczono fagi T4 i lizaty nośnika (Rysunek 1A). Lizaty fagów T4 nachylano za pomocą testu płytki nazębnej i rozcieńczano do 2 x 107 pfu / ml (2 x 106 pfu / mysz) w buforze SM. Lizaty nośnika zostały również nachylone w celu potwierdzenia braku żywej obecności faga i rozcieńczone w tej samej objętości buforu SM co lizat fagowy T4. Poziomy endotoksyn określono ilościowo w rozcieńczonych lizatach przy użyciu zestawu do oznaczania ilościowego chromogennych endotoksyn. Fagi T4, fagi inaktywowane termicznie i lizaty nośnikowe miały poziomy endotoksyn poniżej dopuszczalnych poziomów dla wody pitnej (<20 EU/ml)25 (Rysunek 1B). Ponieważ lizat nośnika zawierał podobną ilość endotoksyny jak lizat faga T4, uznano, że jest to odpowiednia kontrola. Inaktywowany termicznie lizat fagowy (2 x 107 pfu / ml przed obróbką cieplną) miał mniej endotoksyny niż zarówno nośnik, jak i lizat fagowy T4. Zgodnie z instrukcjami zestawu, próbki, które zostały poddane działaniu 1-oktanolu, zostały przetestowane pod kątem zahamowania testu poprzez dodanie wzorca endotoksyny do lizatu nośnika (nośnik wzbogacony), aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 EU/ml. Poziomy endotoksyn w pojazdach z dodatkami minus poziomy endotoksyn w nośniku wynosiły 0,5 EU/ml ±25%, zgodnie z zaleceniami producenta (Rysunek 1B). Wykazało to, że 1-oktanol został skutecznie usunięty i że nie było zahamowania testu spowodowanego przez lizaty, które mogłoby zakłócić wyniki testu.

E. coli K-12 (BW25113) monokolonizowane myszy C57BL/6 były hodowane w sterylnym izolatorze winylowym z elastycznej folii w warunkach gnotobiotycznych (Rysunek 2A). Myszy z pokolenia F0 zostały skolonizowane bakterią E. coli poprzez jej dodanie do ich środowiska i wspólne zamieszkiwanie. Do eksperymentów wykorzystano tylko potomstwo (pokolenie F1 i F2), które było skolonizowane E. coli od urodzenia poprzez transmisję pionową i wspólne zamieszkiwanie. Strategia ta kontrolowała zmiany w układzie odpornościowym, produkcji śluzu i rozwoju przewodu pokarmowego, które zachodzą w odpowiedzi na inokulację bakteryjną22,37, umożliwiając w ten sposób pomiar zmian, które zachodzą tylko z powodu wprowadzenia fagów. Po osiągnięciu dojrzałości myszy eksperymentalne przeniesiono do sterylnych izoklatek, gdzie każda z nich otrzymała 2 x 106 pfu faga T4 lub równą objętość lizatu nośnika przez zgłębnik doustny w wieku 6-8 tygodni. Liczebność fagów T4 i E. coli monitorowano przez cztery tygodnie poprzez pobieranie granulek kału i testy posiewu punktowego na agarze 0,5% (miękkim) lub 1,5% agarze odpowiednio. W trakcie tego eksperymentu T4 i E. coli były w stanie współistnieć bez zubożenia którejkolwiek z populacji (Rysunek 2B, C). Doustne podawanie faga T4 w niższych dawkach 2 x 102 i 2 x 104 pfu / mysz nie zmniejszyło zdolności faga T4 do kolonizacji jelita w porównaniu z 2 x 106 pfu (Rysunek 2D). Podobnie, nie zaobserwowano zależnego od dawki wpływu inokulacji T4 na poziom E. coli (Ryc. 2E).

Co ważne, stwierdzono, że spójność w posiewaniu między próbkami jest kluczowa dla liczby płytek. Na przykład, podczas dodawania bakterii do miękkiego agaru, stwierdzono, że gęstość bakterii miała duży wpływ na wynik testu. Dodanie E. coli, które było subhodowane przez 1 godzinę, 1,5 godziny lub 2 godziny, spowodowało niższą liczbę blaszek miażdżycowych niż w przypadku dodania E. coli subkulturowanej przez 2,8 godziny lub dłużej. Co więcej, kwantyfikacja płytki ustabilizowała się na poziomie ~1 x 109 pfu / ml, gdy E. coli była hodowana przez 2,8 h do 16 h (przez noc), co stanowiło około 5-krotny wzrost w porównaniu z wartością obliczoną z 1 h subkultury (~ 2 x 108 pfu / ml) (Figura 3A). Zamiast podhodowli, docelowe bakterie można zaszczepić w miękkim agarze z nocnych kultur. W tym przypadku objętość 16-godzinnej (nocnej) kultury E. coli, która została zaszczepiona w miękkim agarze, wpływa na liczbę blaszek nazębnych (Ryc. 3B). Wyniki te wskazują, że gęstość E. coli w agarze może wpływać na liczbę testów płytkowych. W obu podejściach wyniki kwantyfikacji fagów utrzymywały się na tym samym poziomie (10-9 pfu/ml), co sugeruje, że bakterie docelowe muszą mieć wystarczająco dużą gęstość w miękkim agarze , aby zapewnić dokładność zliczania płytek.

Razem wzięte, te wyniki podkreślają znaczenie zrozumienia kinetyki fagów i bakterii poprzez eksperymenty pilotażowe in vitro i in vivo przed wykonaniem eksperymentalnych manipulacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie lizatów fagowych. (A) Proces uruchamiania lizatu fagowego z fagów o wysokim mianie. Lizaty rozmnożono, oczyszczano, zagęszczano, a endotoksyny usuwano. Zanieczyszczający 1-oktanol został usunięty za pomocą szybkiej próżni. (B) Endotoksyny oznaczono ilościowo w lizatach fagowych i nośnikach przy użyciu zestawu do oznaczania ilościowego endotoksyn chromogennych. Przerywane niebieskie linie wskazują górną i dolną granicę, aby obalić inhibicję produktu w kontroli inhibicji produktu (0,5 EU/ml ± 25%). Każdy punkt reprezentuje jedną z dwóch replik technicznych. Wysokość słupka reprezentuje średnią z replik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Generowanie monokolonizowanych myszy i monitorowanie poziomu fagów i bakterii w granulkach kału. (A) Proces kolonizacji myszy wolnych od zarazków pojedynczym gatunkiem bakterii i generacji myszy monokolonizowanych F1 i F2. (B-E) Poziomy faga T4 i E. coli wykryte w kałach myszy C57BL / 6, które urodziły się monokolonizowane E. coli i zostały zaszczepione fagiem T4 w wieku 6-8 tygodni. W dniu 0 (przed kolonizacją) i we wskazanych dniach po kolonizacji poziomy fagów T4 mierzono za pomocą posiewu punktowego i testów płytki nazębnej przy użyciu metody pojedynczej warstwy agaru. Poziomy E. coli mierzono przez posiew punktowy na agarze 1,5% LB. (B, C) Kinetyka poziomów faga (B) T4 i (C) E. coli w odzyskanych granulkach kału po inokulacji 2 x 106 pfu faga T4 lub lizatu nośnika (znormalizowane pod względem objętości i poziomu endotoksyn). (D, E) (D) Poziomy fagów T4 i (E) E. coli w odzyskanych granulkach kału po inokulacji fagiem T4 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu lub 2 x 106 pfu. Słupki błędów reprezentują średnią i błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Rozwiązywanie problemów z dokładnością w testach płytki nazębnej. (A) Miano lizatu fagów T4 przy użyciu nocnych kultur lub subkultur E. coli do przygotowania miękkiego agaru (0,5% agaru, LB). Subkultury wykonano przy użyciu rozcieńczenia 1:50 nocnej kultury E. coli do świeżego LB. 5 ml miękkich preparatów agarowych zaszczepiono 100 μl E. coli i 20 μl faga T4. CaCl2 iMgSO4 nie zostały dodane do miękkiego agaru w tych testach, ale można je dodać w razie potrzeby. Czas trwania subkultury E. coli poniżej 2,8 godziny skutkował niższym pozornym mianem faga. (B) Miano lizatu fagowego T4 przy użyciu różnych gęstości E. coli w preparacie miękkiego agaru. Dodanie różnych objętości E. coli z nocnej hodowli (nie z subhodowli, jak w A) do miękkiego agaru spowodowało różne pozorne miana fagów. Słupki błędów reprezentują obliczoną niepewność miana faga. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie fagów w mikrobiomie stanowi poważne wyzwanie w porównaniu z ich bakteryjnymi odpowiednikami. W szczególności fagi nie zawierają konserwatywnego markera filogenetycznego wspólnego dla wszystkich fagów podobnych do podjednostek rybosomalnych 16S i 18S, które pozwalają na łatwe sekwencjonowanie i identyfikację gatunków prokariotycznych i eukariotycznych, odpowiednio42. Jednak wraz z postępami w podejściach do sekwencjonowania nowej generacji, w tym zwiększaniem długości odczytu, przepustowością i malejącymi kosztami, następuje szybka ekspansja baz danych genomów bakteriofagów 42,43,44. Dzięki wielu pracom przygotowawczym nad odkryciem fagów, badania nad fagami są teraz bardziej dostępne niż kiedykolwiek. Jako kluczowi członkowie mikrobiomu jelitowego i najbardziej zróżnicowane genetycznie organizmy na Ziemi, fagi stanowią ekscytujący punkt widzenia dla nowych badań nad złożonością mikrobiomu. Opisane tutaj protokoły koncentrują się na badaniu znanych gatunków fagów u myszy skolonizowanych przez ich docelowe bakterie. Należy zauważyć, że protokoły te stanowią wytyczne do badania fagów in vivo i mogą być rozszerzane wraz z rozwojem pola.

Badania nad bakteriofagami w leczeniu infekcji bakteryjnych w dużej mierze wyszły z mody wraz z pojawieniem się antybiotyków w latach czterdziestych XX wieku. Jednak nadmierne przepisywanie i niewłaściwe stosowanie antybiotyków przyspieszyło pojawienie się patogenów wielolekoopornych, które stanowią poważny problem zdrowia publicznego3. Fagi stanowią atrakcyjną potencjalną alternatywę dla antybiotyków ze względu na ich wysoki stopień swoistości gospodarza3. Co ważne, ponieważ fagi w naturalny sposób zamieszkują jako członkowie ludzkiego mikrobiomu jelitowego, konieczne jest najpierw zrozumienie ról, jakie fagi odgrywają w tych złożonych środowiskach. Podczas gdy w wielu badaniach badano związek między fagiem a jego docelowymi bakteriami in vitro, ważne jest, aby rozważyć, w jaki sposób te relacje mogą utrzymać się w krajobrazie przewodu pokarmowego. Podobnie jak w badaniach eksploracyjnych dotyczących bakteryjnych składników mikrobioty, uproszczone modele mysie, takie jak GF i myszy monokolonizowane, pozwalają nam wyizolować wpływ faga na gatunek docelowy i sposób, w jaki ten związek przyczynia się do odpowiedzi immunologicznej. Jest to ważny krok w kierunku terapii fagowej, ponieważ niektóre fagi mogą nie przynosić korzyści po wprowadzeniu do jelit. Na przykład Pseudomonas aeruginosa Pf4 zaostrza chorobę wywoływaną przez gospodarza, hamując zarówno przeciwbakteryjne odpowiedzi immunologiczne, jak i migrację keratynocytów, co skutkuje upośledzeniem gojenia się ran18,45. Opisane tutaj procedury mają na celu standaryzację technik badania fagów jako członków mysiej mikrobioty. Nawiązując do pionierskich badań nad wpływem mikrobioty na gospodarza metazoanu, kontynuowane badania nad fagami w kontekście mikrobioty mogą okazać się ekscytujące i znaczące dla szerszego zrozumienia multibiomu46.

Ograniczenia
Opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem badania konkurencji między fagiem T4 a jego docelowymi bakteriami, E. coli, gdy fagi T4 są podawane przez zgłębnik doustny myszom monokolonizowanym E. coli . Podobnie jak bakterie, różne gatunki fagów zachowują się różnie od siebie, mając różne czasy replikacji, rozmiary serii i zakresy celów bakteryjnych47. Dlatego też, badając inne pary-bakterie w podobnych modelach zwierzęcych, należy zadbać o optymalizację tych protokołów na wszystkich etapach. Na przykład fagi o dłuższym czasie replikacji i/lub mniejszym rozmiarze serii mogą wymagać dłuższej inkubacji z ich celem bakteryjnym w celu wytworzenia lizatu o wysokim mianie. Podobnie, może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji płytki w przypadku testów płytki nazębnej. Ponadto fagi o krótkim czasie replikacji i/lub dużym rozmiarze serii mogą wymagać krótszej inkubacji płytki, ponieważ inkubacja przez noc może powodować przerost płytki nazębnej. Jeżeli warunki rozmnażania nie są znane dla konkretnego faga będącego przedmiotem zainteresowania, przed rozpoczęciem prac in vivo należy stworzyć podstawy do określenia warunków wzrostu48.

Domeny ig-podobne znajdujące się w białkach kapsydu Hoc faga T4 ułatwiają przyleganie do śluzu jelitowego11. W zależności od zdolności wiązania śluzu przez wybranego faga, kinetyka poziomów bakterii fagowych w próbkach kału może różnić się od wyników pokazanych na rysunku 2B-E. Na przykład w systemach gut-on-a-chip wykazano, że fagi zawierające nienaruszone białka Hoc miały zwiększoną zdolność zabijania E. coli w porównaniu z fagiem11 z niedoborem Hoc. Chociaż podejrzewa się, że fagi T4 są zatrzymywane poprzez wiązanie śluzu in vivo 11,12,13, nie można wykluczyć wpływu ponownego zaszczepienia poprzez koprofagiczne zachowanie myszy. Efekty te można zmniejszyć, stosując druciane dna koszykowe lub często zmieniając klatki. Ponieważ domeny Ig-podobne nie zostały zidentyfikowane w fagach ssDNA lub RNA49, interesujące będzie wyodrębnienie innych strategii stosowanych przez fagi w celu utrzymania pobytu w błonie śluzowej jelita.

Wreszcie, te badania eksploracyjne dotyczyły interakcji-bakteria-gospodarz tylko w homeostazie. W zwierzęcych modelach chorób u ludzi nie wiadomo, w jaki sposób zmiany w integralności bariery jelitowej, takie jak IBD, mogą wpływać na te interakcje. Ostatnie badania wykazały, że fagi Caudovirales mają zwiększone bogactwo i różnorodność u pacjentów z IBD 7,8. W modelach mysich wykazano, że ciągłe leczenie fagami zaostrzało eksperymentalne zapalenie jelita grubego8 wywołane przez siarczan sodu dekstranu (DSS). Pozostaje do ustalenia, w jaki sposób interakcje-bakteria-gospodarz przebiegają w środowiskach zapalnych i czy upośledzona integralność bariery ułatwia stan zapalny wywołany przez fagi.

Rozwiązywanie problemów i metody alternatywne

Modele myszy
Monokolonizowane modele myszy pozwalają na badanie pojedynczego gatunku bakterii na temat fizjologii gospodarza16. Badania z udziałem myszy monokolonizowanych odegrały kluczową rolę w wyjaśnieniu, w jaki sposób mikrobiota wpływa na układ odpornościowy22. Jako system modelowy, myszy monokolonizowane nie podsumowują fizjologii swoich konwencjonalnych odpowiedników mikrobioty. Bardziej podobne do myszy GF, myszy monokolonizowane E. coli mają zmniejszoną produkcję śluzu (podobnie jak myszy GF50) i niedojrzały układ odpornościowy23. Jednak monokolonizowane myszy okazały się nieocenione w odkrywaniu specyficznego dla drobnoustrojów wpływu poszczególnych gatunków na przewód pokarmowy i rozwój układu odpornościowego. Klasycznym przykładem jest odkrycie, że segmentowane bakterie nitkowate (SFB) są silnymi induktorami komórek pomocniczych 17 T CD4 + u myszy24. W odniesieniu do śluzu istnieje specyficzny wpływ drobnoustrojów na transkrypcję genu śluzu51i grubość śluzu50. Chociaż ograniczone, monokolonizowane myszy dają możliwość zbadania wpływu jednej pary-bakteria na gospodarza ssaków w kontrolowanym modelu. Co ważne, fagi mogą i powinny być badane w kontekście złożonej mikrobioty. W chwili pisania tego tekstu niewiele badań dotyczyło wpływu drapieżnictwa fagowego na gatunki bakterii komensalnych w konwencjonalnym mikrobiomie. Jest to przyszłe zastosowanie protokołów przedstawionych w tym artykule, które można dostosować w celu ułatwienia tych badań.

Stosowanie odpowiednich urządzeń sterujących w pojeździe
Odpowiednie kontrole są niezbędne w każdym eksperymencie. W tym przypadku zdefiniowano odpowiedni nośnik do doustnego podawania myszom, który kontroluje wieloetapowe czyszczenie i oczyszczanie lizatów fagów T4. Ważnym wymogiem jest to, aby kontrola nośnika zawierała taki sam poziom endotoksyn bakteryjnych jak lizat fagowy, w celu kontrolowania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem endotoksyn. Chloroform i 1-oktanol są dodawane do lizatu w ramach procesu oczyszczania, a następnie usuwane. Aby kontrolować potencjalne reakcje immunologiczne, które mogą być generowane na śladowe poziomy tych chemikaliów, można wytworzyć lizat bakteryjny wolny od fagów jako kontrolę nośnika. Fagi T4 i lizaty nośnikowe zawierały bardzo niskie stężenie endotoksyn bakteryjnych, znacznie poniżej poziomów dozwolonych w wodzie pitnej25 (ryc. 1B). Można stosować alternatywne kontrole, które mogą być modyfikowane w celu dopasowania do zamierzonego pytania badawczego. Najprościej rzecz ujmując, można użyć buforu fagowego zawierającego równoważną ilość endotoksyny, chociaż nie uwzględnia to wieloetapowych procesów czyszczenia i oczyszczania. Gogokhia i wsp.8opisali użycie inaktywowanego termicznie faga jako kontroli, czy białko fagowe bez DNA jest wystarczające do wywołania odpowiedzi immunologicznej. W naszych rękach inaktywowany termicznie miał niższy poziom endotoksyny niż lizat faga T4 (ryc. 1B), a zatem nie był używany do kontrolowania poziomu endotoksyn w tym badaniu. Zachęcamy jednak do testowania obu protokołów w celu określenia, która metoda jest najbardziej odpowiednia dla indywidualnych celów eksperymentalnych. Jeżeli nośnik i lizaty faga T4 różnią się znacznie pod względem ilości obecnej endotoksyny, lizat zawierający niższe poziomy można uzupełnić oczyszczoną endotoksyną. 1-oktanol jest dodawany do lizatów podczas procesu oczyszczania, ale dezaktywuje test zestawu do oznaczania ilościowego chromogennej endotoksyny. Ważne jest, aby przetestować hamowanie produktu przez potencjalnie zakłócające substancje w próbce, aby upewnić się, że pomiary endotoksyn są dokładne. Jeśli podejrzewa się zahamowanie produktu, możliwe jest, że próbka nie była odkurzana wystarczająco szybko. Jeśli problemy nie ustąpią, można zastosować dializę w celu usunięcia pozostałego 1-oktanolu25.

Droga podania i dawka
Ze względu na zdolność faga T4 do wiązania śluzu, modele mysie inokulowano pojedynczą doustną dawką zgłębnika. Celem tego było monitorowanie czasu trwania jednoczesnego zamieszkiwania fagów i E. coli w przewodzie pokarmowym; Opisano jednak inne podejścia do badania fagów w modelach in vivo. Na przykład woda pitna wzbogacona w fagi została wykorzystana do zapewnienia ciągłego dostarczania fagów myszom 8,20. Zaletą tej metody podawania jest to, że fagi są stale uzupełniane, nawet przy braku gospodarza bakteryjnego, jak wykazano przez Gogokhia i wsp.8. Ten projekt eksperymentalny pozwolił na ocenę odpowiedzi immunologicznej na fagi pod nieobecność bakterii i zapewnił ciągłą stymulację immunologiczną w trakcie eksperymentu. Z fizjologicznego punktu widzenia metoda ta nie odzwierciedla naturalnego przebiegu infekcji fagowej ani kolonizacji fagowej środowiska jelitowego, ale dostarcza ważnych informacji na temat tego, w jaki sposób powtarzająca się ekspozycja na fagi może wzmocnić układ odpornościowy. Ma to znaczenie w kontekście rozwoju terapii fagowej, ponieważ koktajle fagowe mogą być dostarczane jako leczenie zakażeń bakteryjnych jelit, podobnie jak w przypadku antybiotyków. W kontekście pary fagów T4-E. coli stwierdzono, że zmniejszenie dawki faga T4 podawanej doustnie monokolonizowanym myszom nie zmieniło poziomu fagów kałowych ani bakterii (ryc. 2D, E). Dlatego w tym przypadku dawka inokulacji faga T4 nie jest kluczowa dla utrzymania stabilnej kolonizacji faga T4-E. coli w jelicie myszy dwukolonizowanych. Należy zauważyć, że najniższa podana dawka wynosiła 200 pfu/mysz, a najwyższa dawka wynosiła 2 x 106 pfu/mysz (zgodnie z Hsu i wsp.)2. W związku z tym dane potwierdzające kinetykę fagów T4-E. coli poza tym zakresem są niedostępne w tym badaniu.

Miana fagów punktowych i całopłytkowych
Do pomiaru poziomów fagów T4 w kale i tkankach, przedstawione tutaj protokoły opierają się na technikach posiewu punktowego, a nie na testach płytki nazębnej na całej płytce, co może przyczynić się do zmienności poziomów fagów między myszami (Figura 2B). W technikach całych płytek płytki są liczone na większym obszarze, co pozwala na dokładniejsze określenie ilościowe. Jednakże odpowiednie rozcieńczenie każdej próbki musi być zazwyczaj z góry określone przez powlekanie punktowe. Ponieważ próbki były badane w dniu pobrania próbki, posiew punktowy uznano za najwłaściwszą metodę dla podejścia o większej przepustowości. Dlatego rozdzielczość tych danych jest najdokładniej reprezentowana przez rząd wielkości faga w każdej próbce. W przypadku precyzyjnych pomiarów fagów należy wziąć pod uwagę dodatkowe kwestie dotyczące każdego faga. Dokładniejsze pomiary można uzyskać za pomocą testów na całej płytce lub przy użyciu mniejszych zakresów rozcieńczeń seryjnych dla każdej próbki. Jeśli metody te nadal prowadzą do zmiennej liczby fagów lub bakterii docelowych, rozsądne byłoby ocena, czy unikalne interakcje między fagiem a bakteriami mogą wyjaśnić różnice między poszczególnymi myszami za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego lub innych metod eksperymentalnej oceny koewolucji i oporności. Jak podaje Bonilla i wsp.25, podczas przygotowywania miękkiego agaru do testów płytki nazębnej ważne jest, aby zachować spójność z ilością dodanego gospodarza bakteryjnego25. Jak pokazano na rysunku 3, nawet stosunkowo niewielkie zmiany w czasie hodowli bakterii (rysunek 3A) i gęstości (rysunek 3B) mogą wpływać na dokładność testów płytki nazębnej. Wyniki te mogą być różne dla innych par-bakteria, a podobne eksperymenty są zalecane na początku pracy z nowymi organizmami. Dodatkowo, w przypadku nowych par-bakteria, należy przeprowadzić eksperymenty eksploracyjne w celu określenia charakterystyki wzrostu każdej z nich. Na przykład krzywe wzrostu można wykonać w celu określenia opóźnienia, faz wykładniczych i stacjonarnych oraz tempa wzrostu bakterii. Jednoetapowy eksperyment wzrostu można wykorzystać do określenia okresu utajonego (czasu do lizy) i wielkości impulsu (liczby fagów uwalnianych podczas lizy bakterii) fagów52,53.

Alternatywny pomiar fagów T4 metodą qPCR
Ilościowe określanie faga można przeprowadzić za pomocą testów płytki nazębnej, jak opisano powyżej, lub za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Te dwa podejścia mają ważne rozróżnienie: testy płytek określają liczbę żywotnych fagów zdolnych do infekowania i zabijania swoich gospodarzy bakteryjnych, podczas gdy qPCR określa ilościowo materiał genetyczny specyficzny dla faga (jako wskaźnik zastępczy liczby obecnych fagów), ale nie dostarcza informacji o żywotności i zakaźności faga. qPCR przeprowadzono w celu porównania kwantyfikacji kopii genów fagowych z płytkami utworzonymi w testach płytek przy użyciu starterów opisanych przez Hsu i wsp.2 (Figura 4). DNA faga T4 wyekstrahowano i amplifikowano z zawartości jelita ślepego myszy dwukolonizowanych fagiem T4 / E. coli . U większości myszy testy qPCR i płytki nazębnej wykryły podobne poziomy faga T4 w treści jelita ślepego (Figura 4A, B). Podczas gdy wykryto pewną amplifikację w treści jelita ślepego zaszczepionego nośnikiem, obliczone kopie genów / g były poniżej granicy wykrywalności (LOD) (Figura 4A). Brak ilościowych fagów w tych próbkach został potwierdzony za pomocą elektroforezy żelowej. Produkty genu fagowego T4 (96 pz) były łatwo wizualizowane w DNA wyizolowanym z treści jelita ślepego myszy zaszczepionych T4, ale były nieobecne w kontrolach nośnika (Figura 4C).

W tych testach kopie genu faga T4 wykryto w treści jelita ślepego jednej myszy skolonizowanej fagiem T4 za pomocą qPCR (Figura 4A, strzałka) pomimo niemożności wykrycia T4 w testach płytki nazębnej z tej samej próbki (Figura 4B, strzałka). Wyniki te sugerują, że cząsteczki wirusa, które nie tworzą blaszek miażdżycowych, mogą powstawać in vivo, albo w wyniku produkcji wadliwych cząstek wirusa, albo koewolucji fagów i/lub bakterii. Techniki posiewu bakteryjnego na twardym agarze można zastosować do określenia podatności bakterii kałowych na14. Sugerujemy, że wykrywanie za pośrednictwem qPCR może być cennym dodatkiem do przepływów pracy fagów in vivo , ponieważ może być bardziej odporne na ewolucję fagów w środowisku jelitowym, biorąc pod uwagę, że jest ukierunkowane na krótkie, konserwatywne sekwencje genów. Bezstronne podejścia, takie jak metagenomika, są cenne dla badania koewolucji fagów i bakterii oraz względnej liczebności, ale ostatecznie mogą być bardziej kosztowne.

figure-discussion-1
Rycina 4: Wykrywanie faga T 4 za pomocą qPCR. (A,B) Obciążenia fagami T4 mierzono za pomocą (A) bezwzględnego testu qPCR lub (B) płytki w treści jelita ślepego myszy C57BL / 6 skolonizowanych przez E. coli w 29 dniu po inokulacji fagiem lub nośnikiem T4. Strzałka wskazuje wyniki od pojedynczej myszy, która miała wykrywalne kopie genomu T4, ale nie zawierała wirusa plaqueable w treści jelita ślepego. (C) Elektroforeza żelowa produktów PCR wykazująca obecność pasma 96 pz w próbkach jelita ślepego zaszczepionych fagami T4, ale nie w próbkach zaszczepionych nośnikiem. Zastosowano drabinę DNA o sile 100 pz. LOD = granica wykrywalności. Słupki błędu reprezentują średnią i SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Aplikacji
Bakteriofagi stanowią ponad 90% cząsteczek wirusopodobnych obecnych w mikrobiomie44; Jednak wpływ fagów na mikrobiom jelitowy jest słabo poznany. Wstępne badania nad bakteryjnym składnikiem mikrobiomu polegały na izolowaniu poszczególnych gatunków i badaniu ich wpływu na dojrzewanie immunologiczne 22,24. Podobne badania phageomu stanowią trudne, ale konieczne zadanie i wymóg uzyskania wszechstronnego zrozumienia multibiomu46. Chociaż rozwój terapii fagowej koncentruje się na leczeniu septycznych infekcji bakteryjnych, ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób dodanie koktajlu fagowego do przewodu pokarmowego może zmienić ekosystem jelitowy. Ponadto należy ocenić bezpieczeństwo terapeutycznych koktajli fagowych poprzez wygenerowanie profilu immunologicznego. Fagi badano jako potencjalne metody leczenia zakażeń bakteryjnych jelit, takich jak C. difficile5 i Salmonella enterica serotypTyphimurium 54. Ostatnie badania wykazały również, że FFT są równie lub bardziej skuteczne w leczeniu martwiczego zapalenia jelit u wcześniaków9, co sugeruje, że składnik wirusowy przeszczepów mikrobioty kałowej (FMT) może odgrywać aktywną rolę w zmniejszaniu choroby. Kontynuowane badania nad rolą fagów w mikrobiomie są uzasadnione w celu dalszego rozwoju terapii fagowych przeciwko patogenom jelitowym, ale także w celu lepszego informowania o FMT jako leczeniu choroby. Dzięki standaryzacji metod badania fagów in vivo, przejrzystość i odtwarzalność w badaniach nad fagami zostaną zwiększone, a także wskazówki dla osób rozszerzających swoje prace na modele mysie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy przyznają, że ziemia, na której przeprowadzili te badania, jest tradycyjnym, rodowym i niescedowanym terytorium Narodu xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Ziemia, na której się znajduje, zawsze była miejscem nauki dla ludu Musqueam, który przez tysiąclecia przekazywał swoją kulturę, historię i tradycje z pokolenia na pokolenie w tym miejscu. Zachęcamy innych do bliższego poznania ojczyzny, w której żyją i pracują w https://native-land.ca. Autorzy potwierdzają wsparcie ze strony Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) Kanadyjskich Stypendiów dla Absolwentów - Magistra (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, do MH), Programu Discovery Grants Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (RGPIN-2019-04591 do CT, RGPIN-2016-04282 do LCO), Kanadyjskiego Instytutu Badań Zaawansowanych / Ludzi i Mikrobiomu (FL-001253 Appt 3362, do CT), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, do CT), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 do LCO) oraz Canadian Foundation for Innovation (34673 do LCO i 38277 do CT). Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne ze strony Centrum Modelowania Chorób UBC i ubcFLOW, które jest wspierane przez Inicjatywę Odporności Biologicznej UBC GREx, a także członkom laboratoriów Osborne i Tropini za krytyczne dyskusje i ocenę manuskryptu. Rysunek 1A i Rysunek 2A zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-oktanol (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżnioweMillipore Sigma 
Agaroza (klasa nisko-EEO/wielozadaniowa/biologii molekularnej)Odczynniki Fisher BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 filtr odśrodkowy, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® Rury, SSTBD Medyczne365967
hermetyczne klatki biowykluczające (klatki ISO) Techiplast1245ISOCAGE
C1000 Dotyk&handel; Termocykler z 96-dołkowym modułem szybkiej reakcjiBioRad1851196
Dwuwodny chlorek wapnia (białe kryształy do proszku)Fisher BioReagentsBP510-500
Locks do probówki 1,5 ml 100/pkAndwin Scientific 
Chloroform (etanol jako środek konserwujący/certyfikowany ACS)FisherC298-500
Koraliki stalowe powlekane miedzią (4,5 mm)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & Zestaw chusteczek higienicznych (50)Thermo Scientific 69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo Scientific K1081
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, roztwór soli disodowej, do biologii molekularnej, 0,5 M w H2OSigmaAldrich E7889
Fisher BioReagents&handel; Agar, proszek / płatki, odczynniki Fisher BioReagents i handel;  Odczynniki FisherBP1423-500
Odczynniki Fisher i handel; Pożywki mikrobiologiczne: bulion LB (proszek) - Lennox Fisher BioreagentsBP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermo Scientific SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
Filtry HEPA do pokryw izoklatowych, AUTOKLAWOWALNE FILTRY H14 DO ISO NAPROMIENIOWANY LINIOWOTechiplastUISOHEPAXTBOX-300
Siarczan magnezu siedmiowodnyFisher BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 Wytrząsarka inkubowanaThermo Scientific 8354-30-0009
Podłoża mikrobiologiczne: bulion LB (proszek) - LennoxFisher BioReagentsBP1427-500
Probówki do mikrowirówek z zatrzaskiem blokującym, 2mlFisher14-666-315
Folia uszczelniająca ParafilmBemisPM-996
Zapasy fagówCarolina Biological Supply nie dotyczy
PicoLab® Dieta mysia 20 EXTLabDiet5R58
Pierce™ Zestaw Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo Scientific 
RNaza A (17 500 U)Qiagen19101
Zestaw DNaz wolnych od RNazQiagen 79254
Wodorowęglan sodu (drobny biały proszek)Fisher ChemicalBP328-500
Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS)Sonikator Fisher ChemicalS271
(sonda model CL-18; źródło zasilania model FB50)Fisher scentific n/a
Sterylny izolator z elastyczną folią Klasa Biologicznie czysta nie dotyczy
SYBR™ Bezpieczny barwnik żelowy DNAInvitrogenS33102
T100 Termocykler BioRad1861096
starter fagowy T4, naprzód (CCACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
starter fagowy T4, naprzód (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris-HCl, roztwór 1M, pH 8,0, klasa biologii molekularnej, UltrapureThermo Scientific 
Woda, (bez DNASE, RNAZY)Odczynniki Fisher BP2484100
SCGP00525 Cap 16812612A39552SAAJ22638AE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287(2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083(2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324(2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607(2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261(2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387(2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27(2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536(2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323(2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699(2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222(2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656(2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490(2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292(2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402(2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika gospodarz fagmikrobiom jelitowyprzygotowanie lizatu fagowegotest plackowygnotobiotyczny model mysirozcie czenia seryjneenumeracja fag w

Powiązane artykuły