Artykuł metodologiczny

Optymalizacja hodowli komórek nabłonka soczewek pierwotnych myszy: kompleksowy przewodnik po trypsynizacji

DOI:

10.3791/65912

⸱

21 czerwca 2024

 ,  , 
1Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 2North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wideo do hodowli komórek nabłonka soczewki pierwotnej (LEC), mający na celu poprawę odtwarzalności i pomoc w badaniach nad zaćmą i zmętnieniem torebki tylnej (PCO). Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące rozwarstwiania soczewek, izolacji LEC i walidacji, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w tej dziedzinie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe soczewki (LEC) odgrywają wiele ważnych ról w utrzymaniu homeostazy i normalnej funkcji soczewki. LEC determinują wzrost, rozwój, rozmiar i przezroczystość obiektywu. I odwrotnie, dysfunkcyjne LEC mogą prowadzić do powstawania zaćmy i zmętnienia torebki tylnej (PCO). W związku z tym ustanowienie solidnego pierwotnego systemu hodowli LEC jest ważne dla naukowców zajmujących się opracowywaniem soczewek, biochemią, terapią zaćmy i profilaktyką PCO. Jednak uprawa pierwotnych LEC od dawna stanowi wyzwanie ze względu na ich ograniczoną dostępność, powolne tempo proliferacji i delikatną naturę.

To badanie rozwiązuje te problemy, prezentując kompleksowy protokół dla podstawowej kultury LEC. Protokół obejmuje podstawowe kroki, takie jak opracowanie zoptymalizowanej pożywki hodowlanej, precyzyjna izolacja kapsułek soczewek, techniki trypsynizacji, procedury subhodowli, protokoły zbioru oraz wytyczne dotyczące przechowywania i wysyłki. Przez cały proces hodowli morfologię komórek monitorowano za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.

Aby potwierdzić autentyczność hodowanych LEC, przeprowadzono testy immunofluorescencyjne w celu wykrycia obecności i subkomórkowej dystrybucji krytycznych białek soczewki, a mianowicie αA- i γ-krystaliny. Ten szczegółowy protokół wyposaża naukowców w cenne zasoby do hodowli i charakterystyki pierwotnych LEC, umożliwiając postęp w naszym zrozumieniu biologii soczewek i rozwój strategii terapeutycznych dla zaburzeń związanych z soczewkami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soczewka oka odgrywa kluczową rolę w widzeniu, skupiając światło wpadające na siatkówkę. Składa się z przezroczystej, beznaczyniowej struktury złożonej z wyspecjalizowanych komórek, wśród których kluczowymi graczami są komórki nabłonka soczewek (LEC). Soczewki LEC znajdują się na przedniej powierzchni soczewki i są odpowiedzialne za utrzymanie jej przezroczystości, regulację bilansu wodnego oraz udział we wzroście i rozwoju soczewki1,2. LEC to unikalny rodzaj komórek znajdujących się w przedniej części soczewki, odgrywających kluczową rolę w utrzymaniu przejrzystości i funkcji soczewki poprzez ciągłe wytwarzanie włókien soczewki przez całe życie.

Zaćma charakteryzuje się postępującym zmętnieniem soczewki, co skutkuje zniekształceniem i rozpraszaniem światła, co prowadzi do pogorszenia widzenia3,4. Dokładne mechanizmy leżące u podstaw powstawania zaćmy są złożone i wieloczynnikowe, obejmują różne procesy komórkowe i molekularne, takie jak promieniowanie UV, uszkodzenia oksydacyjne i glikacja5,6. Stwierdzono, że LEC znacząco przyczyniają się do rozwoju zaćmy, co czyni je istotnym przedmiotem badań1,2,7,8,9.

Ponadto, jednym z najbardziej palących problemów w okulistyce jest stosunkowo wysoka częstość występowania zmętnienia torebki tylnej (PCO), znanego również jako zaćma wtórna. PCO pozostaje najczęstszym powikłaniem po operacji zaćmy, dotykając do 20-40% dorosłych pacjentów i 100% dzieci w ciągu 5 lat po operacji10. PCO jest głównie spowodowane przez resztkowe LEC, które pozostają w torebce torebkowej po ekstrakcji zaćmy. Komórki te przechodzą wieloaspektową transformację patofizjologiczną, obejmującą nie tylko przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), ale także różnicowanie LEC do włókien soczewkowych, w wyniku czego powstaje populacja komórek, która jest mieszaniną LEC, włókien i miofibroblastów11,12,13. Przekształcone komórki namnażają się i migrują przez tylną torebkę soczewki, co prowadzi do upośledzenia widzenia. Zrozumienie mechanizmów zachowania i kontroli LEC w modelach hodowlanych może dostarczyć cennych informacji na temat zapobiegania i leczenia PCO. Dlatego ten protokół hodowli LEC stanowi istotne narzędzie dla badaczy okulistów, którzy chcą zbadać, zrozumieć i ostatecznie zwalczyć to powszechne powikłanie pooperacyjne.

Aby rozwikłać zawiłości biologii LEC i jej rolę w powstawaniu zaćmy i PCO, konieczne jest stworzenie solidnych i powtarzalnych systemów hodowli komórek pierwotnych in vitro. Pierwotna hodowla LEC zapewnia naukowcom kontrolowane środowisko do badania funkcji, sygnalizacji i charakterystyki molekularnej LEC. Ponadto pozwala na badanie procesów komórkowych i skutków różnych warunków eksperymentalnych, dostarczając cennych informacji na temat fizjologii i patologii soczewki.

Wcześniejsze badania wzbogaciły naszą wiedzę na temat technik kultury LEC14,15,16,17,18,19,20. Chociaż w badaniach tych zastosowano różne metodologie i przyniosły znaczące wyniki dotyczące zachowania i charakterystyki LEC, w obecnej literaturze brakuje kompleksowego i dostępnego protokołu nagrywania wideo do hodowli LEC. To ograniczenie może utrudniać początkującym badaczom dokładne odtworzenie technik i może prowadzić do niespójności i różnic w wynikach eksperymentalnych. Dostarczając protokół nagrywania wideo, niniejsza praca badawcza ma na celu wypełnienie tej luki i zapewnienie ustandaryzowanego zasobu, który może zwiększyć odtwarzalność i ułatwić transfer wiedzy w dziedzinie kultury LEC.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Zgoda proceduralna została udzielona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Północnego Teksasu (numer protokołu: IACUC-2022-0008). W badaniach tych wykorzystano młode myszy C57BL/6J, zwykle w wieku poniżej 2 tygodni

.

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej i rozwarstwienie soczewki

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1 ml 50 mg/ml gentamycyny do 450 ml DMEM.
  2. Humanitarna eutanazja myszy C57BL/6J w wieku poniżej 2 tygodni.
    UWAGA: Przeprowadziliśmy eutanazję metodą inhalacji CO2 . Optymalne natężenie przepływu dla systemów eutanazji CO2 powinno przemieszczać się od 30% do 70% objętości komory lub klatki/min.
  3. Delikatnie usuń powieki za pomocą nożyczek chirurgicznych i delikatnie dociśnij zakrzywioną pęsetą po przeciwnych stronach oczodołu, powodując wysunięcie oka na zewnątrz. Wykonaj ostrożne nacięcie na rogówce za pomocą noża do zaćmy i ostrożnie wyjmij soczewkę za pomocą zakrzywionej pęsety, upewniając się, że soczewka ani jej torebka nie są uszkodzone.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wykonywania tych czynności, aby zachować integralność kapsułki obiektywu. Ze względu na delikatną naturę soczewki ważne jest, aby używać narzędzi preparacyjnych z zakrzywionymi i końcówkami, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia soczewki.
  4. Użyj zakrzywionej pęsety z końcówkami, aby przenieść soczewki do plastikowego naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm wypełnionego 5 ml wstępnie podgrzanego i sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco zawierającego 10 μg/ml gentamycyny.
  5. Delikatnie przepłucz soczewki roztworem DPBS zawierającym 10 μg/ml gentamycyny, aby usunąć wszelkie potencjalne zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia, przygotować soczewki do dalszej obróbki i utrzymać sterylne środowisko hodowli.
  6. Aby uzyskać odpowiednią liczbę LEC, należy połączyć cztery soczewki dla 24-dołkowej płytki hodowlanej i sześć soczewek dla 6-dołkowej płytki hodowlanej.

2. Izolacja LEC

  1. Po zakończeniu procesu płukania umieść soczewkę na kawałku bibuły filtracyjnej, pozwalając jej wyschnąć.
  2. Gdy soczewka odpowiednio wyschnie, przenieś ją ostrożnie na pokrywę szalki Petriego, przygotowując się do wyjęcia kapsułki z soczewką.
  3. Obróć soczewkę do góry, upewniając się, że przedni segment jest skierowany do góry. Używając pęsety do przytrzymania przedniej torebki, użyj kleszczyków capsulorhexis w dominującej ręce, aby utworzyć małe rozdarcie w torebce. Delikatnie pociągnij oba narzędzia w przeciwnych kierunkach, aby wyjąć kapsułkę i włóż ją do DPBS, aż wszystkie sekcje soczewek zostaną zakończone.
    UWAGA: Aby uniknąć jakichkolwiek rozbieżności, badacze powinni niezwłocznie przeanalizować każdą kapsułkę nabłonka soczewki i tymczasowo przechowywać je w DPBS. Dopiero po zakończeniu wszystkich sekcji kapsułki są zbiorczo przenoszone do trypsyny utrzymywanej w temperaturze 37 °C, zapewniając zsynchronizowaną i równomierną ekspozycję.
  4. Ostrożnie przenieś kapsułkę soczewki do płytki 6-dołkowej. Dodaj 1 ml 0,05% roztworu trypsyny do każdej studzienki, aby zainicjować proces trawienia enzymatycznego.
  5. Delikatnie wymieszaj roztwór trypsyny, aby zapewnić równomierne przenikanie. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozostawić kapsułkę do trawienia przez 8-10 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten krok ułatwia rozpad tkanki torebki soczewki, a następnie uwolnienie pojedynczych komórek nabłonka.
  6. Po inkubacji ostrożnie zmielić strawioną torebkę soczewki za pomocą nożyczek preparujących, aby rozbić wszelkie pozostałe grudki tkanek i przyspieszyć separację komórek.
    UWAGA: Kładzie się nacisk na dokładność mielenia tkanek, aby zapewnić skuteczne uwalnianie komórek z trawionych kapsułek soczewek.
  7. Dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, aby ugasić trypsynę. Przenieść próbki tkanek do probówki wirówkowej i odwirować przy 1 000 × g przez 5 minut.
  8. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu komórkowego. Użyj 1 ml pożywki hodowlanej, aby ponownie zawiesić komórki i umieścić je w 24-dołkowej płytce.
  9. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.

3. Subkultura LECs

  1. Gdy komórki osiągną zbieżność, usuń pożywkę z naczynia hodowlanego. Przystąp do przemywania komórek 2x 1 ml DPBS.
  2. Dodać 200 μl roztworu trypsyny-EDTA i umieścić komórki w inkubatorze na 5 minut.
  3. Po inkubacji wyjąć komórki z inkubatora i obejrzeć je pod mikroskopem, aby potwierdzić, że odłączyły się od naczynia hodowlanego i zaczęły unosić się na wodzie.
  4. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej i delikatnie pipetuj komórki 3-5 razy, aby odłączyć wszystkie komórki.
  5. Przenieść komórki do probówek wirowych i wirować przy 1 000 × g przez 5 minut.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce wzrostowej.
  7. W razie potrzeby policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  8. Podziel zawiesinę komórkową w stosunku 1:2 lub 1:3 w celu hodowli.
  9. Gdy kultura ponownie zacznie się zlewać, powtórz wyżej wymienione procedury.
    UWAGA: LEC rozwijają się w warunkach hodowli o dużej gęstości. Unikaj nadmiernego rozcieńczania komórek, ponieważ może to utrudnić ich wzrost.

4. Przechowywanie i wysyłka

UWAGA: Idealny numer komórki do przechowywania to ~1 × 106.

  1. Dokładnie umyj komórki 3x 1 ml DPBS. Po umyciu dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA i umieścić komórki w inkubatorze na 5 minut.
  2. Dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i wirować pod ciśnieniem 1 000 × g przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej składającej się w 90% z FBS i 10% DMSO, dążąc do uzyskania gęstości komórek 1 × 106 komórek/ml. Przenieś zawiesinę komórek do kriowialu.
  4. Natychmiast przenieś komórki do środowiska o temperaturze -20 °C na 1 godzinę, a następnie przez noc do -80 °C, przed trwałym przechowywaniem w ciekłym azocie.
    UWAGA: Jeśli ciekły azot jest niedostępny, ogniwa można przechowywać w temperaturze -80 °C po początkowej godzinie w temperaturze -20 °C.
  5. Jeśli wymagana jest przesyłka, wyślij komórki w kriowiale w opakowaniu z suchym lodem do dostawy z dnia na dzień.
  6. Po otrzymaniu komórek należy zapewnić szybki powrót do zdrowia i umieścić komórki w subkulturze. Jeśli natychmiastowa hodowla nie jest możliwa, przenieś komórki do ciekłego azotu w celu przedłużonego przechowywania.
    UWAGA: Jeśli ogniwa mają zostać wysłane, upewnij się, że próbki są głęboko zakopane w suchym lodzie, aby zapobiec potencjalnym uszkodzeniom spowodowanym wahaniami temperatury.

5. Walidacja LECs

  1. Umieść LEC w naczyniach hodowlanych o średnicy 35 mm ze szkłami nakrywkowymi i hoduj je przez około 48 godzin.
  2. Przemyć ogniwa 2x PBS i utrwalić komórki zimnym metanolem przez 10 minut w temperaturze -20 °C.
  3. Przemywać utrwalone komórki PBS przez 3 x 5 minut i inkubować utrwalone komórki z buforem blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
  4. Po zablokowaniu inkubować komórki przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami (αA-krystaliną, γ-krystaliną i przeciwciałami PROX1) indywidualnie rozcieńczonymi w stosunku 1:50 w buforze rozcieńczalnika.
  5. Przemywać komórki przez 3 x 5 minut PBS i inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:100 w buforze rozcieńczalnika przez 1 godzinę.
  6. Myć komórki przez 3 x 5 minut PBS i barwić komórki 5 μg/ml Hoechst 33342 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić jądra.
  7. Myj komórki przez 2 x 5 minut PBS, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego i uchwycić obrazy fluorescencyjne komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu kanału DAPI dla jąder i kanału FITC dla αA-, γ-krystaliny i PROX1.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 2, postępując zgodnie z tym protokołem, pierwotne LEC myszy C57BL/6J przylegały do szalek w ciągu 4 godzin. Warto zauważyć, że widoczne były pozostałości innych tkanek, takich jak odcinki tylnej torebki i komórki włókna soczewki. Jednak te niezamierzone elementy nie przyczepiały się do naczynia i dlatego można je było usunąć poprzez zmianę pożywki hodowlanej. Następnie, między trzecim a piątym dniem, LEC rozpoczęły fazę proliferacji. Szybki wzrost, charakterystyczny dla logarytmicznej fazy proliferacji, można było zaobserwować między siódmym a dziesiątym dniem. W przypadkach, gdy komórki nie przechodzą do fazy szybkiego wzrostu, może być wskazane włączenie suplementów wzrostu, takich jak EpiCGS-a, do pożywki hodowlanej. Ponadto zaobserwowaliśmy, że komórki wykazują szybsze tempo wzrostu w pożywce zawierającej 20% FBS w porównaniu do 10% FBS. Niższe stężenie FBS zazwyczaj sprzyja wolniejszemu wzrostowi, odzwierciedlając cechy centralnego nabłonka soczewki, podczas gdy stężenie FBS na poziomie 20% replikuje atrybuty strefy proliferacyjnej soczewki.

Według Reddy'ego i wsp. oraz Andleya i wsp., którzy opracowali unieśmiertelnioną linię komórkową B3 ludzkiego nabłonka soczewki, oczekuje się, że LEC powinny wyrażać różne białka specyficzne dla soczewki, takie jak αA- i γ-krystaliny2,21. Dlatego w tym badaniu zastosowaliśmy krystaliny αA i γ jako markery komórkowe, aby potwierdzić tożsamość komórek jako LEC. LEC w pierwszych trzech pasażach hodowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Pierwszorzędowe przeciwciała specyficzne dla αA- i γ-krystaliny użyto do inkubacji komórek przez noc. Jak pokazano w Rysunek 3, komórki te wykazywały silną ekspresję zarówno αA-, jak i γ-krystaliny, dostarczając ostatecznych dowodów na to, że są to komórki nabłonkowe pochodzące z soczewki. Dodatkowo użyliśmy PROX1 jako dobrze znanego markera dla komórek światłowodowych do oznaczania głównych LEC. Dane wskazały, że te LEC wykazały ujemne zabarwienie dla PROX1, potwierdzając, że komórki te są komórkami nabłonkowymi i nie uległy jeszcze różnicowaniu w komórki włókniste.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy krok po kroku dla kultury LEC. Rysunek przedstawia sekwencyjne etapy związane z hodowlą komórek nabłonka soczewki pierwotnej. Krok 1 polega na utworzeniu małego rozdarcia w torebce przedniej. Krok 2 polega na delikatnym wyjęciu kapsułki obiektywu. W kroku 3 kapsułkę z soczewką ostrożnie przenosi się na 24-dołkową płytkę i inkubuje z 0,05% roztworem trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po inkubacji strawiona torebka soczewki jest mielona za pomocą nożyczek preparujących, aby ułatwić separację komórek. Krok 4 polega na wygaszaniu trypsyny poprzez dodanie 0,5 ml pożywki hodowlanej zawierającej 20% FBS do probówki wirówkowej i odwirowanie próbek tkanek o masie 1000 × g przez 5 minut. Krok 5 wymaga ponownego zawieszenia komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i wysiania ich na 24-dołkową płytkę. Wreszcie, Krok 6 obejmuje zmianę pożywki hodowlanej co 2-3 dni, aby wspomóc wzrost i utrzymanie komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Skróty: LECs = komórki nabłonka soczewki; FBS = płodowa surowica bydlęca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wzorzec wzrostu LEC w czasie. Zmiany morfologiczne komórek nabłonka soczewki pierwotnej w różnych punktach czasowych ich wzrostu zarejestrowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Obrazy wykonane w dniach 1, 2, 3, 5, 7 i 10 przedstawiają ewoluującą morfologię komórek, zapewniając wgląd w rozwój i zachowanie komórek nabłonka soczewki w czasie. Czerwona strzałka wskazująca lokalizację aktywnie proliferujących komórek nabłonka soczewki. Podziałka = 100 μm. Skrót: LECs = komórki nabłonka soczewki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Walidacja LEC. (A) Barwienie immunologiczne αA-krystaliny w mysich LEC. Pierwotne mLEC wybarwiono Hoechst 33342 (niebieski) i przeciwciałem αA-krystalinowym (zielonym). (B) Barwienie immunologiczne γ-krystaliny w mysich LEC. (C) Barwienie immunologiczne PROX1 w mysich LEC. Pierwotne mLEC wybarwiono przeciwciałem Hoechst 33342 (niebieskim) i PROX1 (zielonym). Podziałka = 50 μm. Skrót: LECs = komórki nabłonka soczewki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawiony w tym dokumencie zawiera kompleksowy przewodnik krok po kroku dotyczący udanej izolacji, kultury i subkultury pierwotnych LEC, wraz z dołączoną dokumentacją wideo. Szczegółowy przewodnik wizualny wraz z pisemnymi instrukcjami zwiększa przejrzystość i dostępność protokołu, promując jego stosowanie i odtwarzalność wśród badaczy w tej dziedzinie. Ostatecznym celem jest przyczynienie się do poszerzenia wiedzy na temat roli LEC w powstawaniu zaćmy i PCO, powszechnym powikłaniu po operacji zaćmy.

Porównując pierwotne LEC z liniami komórkowymi nabłonka soczewki, takimi jak HLE-B3 i SRA01/04, każdy z nich przedstawia unikalne zalety i wyzwania w kontekście badawczym. Linia komórkowa HLE-B3, wraz z SRA01/04, reprezentuje kategorię linii komórkowych, które, choć są łatwe w obsłudze i trwałe, często wykazują zmiany genetyczne i fenotypowe ze względu na ich ciągłą replikację i przedłużone warunki hodowli. Może to prowadzić do znacznych różnic w stosunku do funkcji pierwotnych LEC, a tym samym do zmniejszenia autentyczności ich odpowiedzi. I odwrotnie, pierwotne LEC, bezpośrednio izolowane z żywej tkanki od pacjentów lub zwierząt badawczych, dokładniej odzwierciedlają naturalne środowisko komórkowe i nieodłączne reakcje soczewki in vivo. Pomimo dodatkowej złożoności ich ekstrakcji i hodowli, są one często preferowane w badaniach wymagających dużego znaczenia fizjologicznego, ponieważ zapewniają dokładniejsze i bardziej wiarygodne wyniki.

Podczas przestrzegania tego protokołu należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów. W badaniach tych wykorzystano młode myszy C57BL/6J, zwykle w wieku poniżej 2 tygodni. Zaobserwowaliśmy, że LEC zebrane od tych młodych myszy wykazywały bardziej energiczny wzrost w porównaniu z LEC od myszy w wieku 2 miesięcy lub starszych. Wskazuje to na ujemną korelację między wiekiem myszy a wzrostem komórek.

Wypreparowanie soczewki z oka myszy jest delikatnym zadaniem, wymagającym ostrożnego użycia narzędzi preparacyjnych w celu zachowania integralności soczewki i jej torebki. Procedura opisana w sekcji 1 protokołu zapewnia, że soczewka zostanie pomyślnie usunięta przy minimalnych uszkodzeniach. Chociaż utrzymanie zdrowia i integralności kapsułki obiektywu jest wyzwaniem, nie można lekceważyć jej znaczenia, ponieważ wszelkie uszkodzenia mogą potencjalnie wpłynąć na jakość i ilość izolowanych LEC. Warto zauważyć, że większość podziałów komórkowych zwykle zachodzi w strefie kiełkowania w pobliżu obszaru równikowego w soczewce, obszarze niełatwo dostępnym do hodowli. Według Zetterberga i wsp., chociaż centralna część nabłonka soczewki wykazuje minimalną aktywność mitotyczną w normalnych warunkach, eksperymenty wykorzystujące znakowanie trytiowaną tymidyną (3H-Tdr) oznaczyły te centralnie umieszczone komórki nabłonka soczewki jako potencjalne komórki macierzyste17,22. Komórki macierzyste wykazują odrębne cechy, takie jak nieograniczona zdolność do proliferacji, pomimo niskiego tempa proliferacji w standardowych warunkach. W związku z tym centralna część nabłonka soczewki może zapewniać lepszą reprezentację zdolności proliferacyjnych LEC niż strefa kiełkowania.

Izolacja LEC, jak opisano szczegółowo w sekcji 2 protokołu, stanowi kluczowy krok w tej procedurze eksperymentalnej. Integralne działania, w tym usunięcie torebki soczewki, trawienie enzymatyczne i fragmentacja tkanki, są starannie wykonywane w celu oddzielenia pojedynczych komórek nabłonka od torebki. Jednym z krytycznych elementów w tym procesie jest czas trawienia trypsyny. Zaleca się, aby okres trawienia wynosił od 8 do 10 minut. Jeśli okres ten zostanie skrócony do mniej niż 5 minut, może to spowodować niepełną separację komórek. I odwrotnie, nadmierne wydłużenie tego okresu może znacznie zagrozić żywotności komórek. Strategiczny wybór zastosowania trypsyny-EDTA jako odczynnika do dysocjacji komórek, w połączeniu z pożywką hodowlaną DMEM uzupełnioną 20% FBS i 10 μg/ml gentamycyny, optymalizuje uwalnianie komórek i późniejszą proliferację, jednocześnie zmniejszając potencjalne ryzyko zanieczyszczenia.

Antybiotyki są często stosowane w celu zapobiegania skażeniu bakteryjnemu podczas pierwotnych hodowli LEC. Jednak wybór antybiotyków powinien być ostrożny. Powszechnie stosowane antybiotyki, takie jak penicylina i streptomycyna, a także środki przeciwgrzybicze, mogą potencjalnie wpływać na żywotność LEC. Alternatywnie zaleca się stosowanie roztworu gentamycyny o stężeniu 10 μg/ml w celu uzyskania optymalnego wzrostu LEC.

Co więcej, utrzymanie wysokiej gęstości komórek jest kolejnym kluczowym czynnikiem udanej pierwotnej hodowli LEC. W przeciwieństwie do ustalonych linii komórkowych, pierwotne LEC potrzebują większej gęstości komórek do optymalnego wzrostu. Wynika to przede wszystkim z ich zależności od skutecznej komunikacji międzykomórkowej, ułatwionej przez bezpośredni kontakt lub sygnalizację parakrynną, która pomaga utrzymać ich status różnicowania i funkcję. Wysoka gęstość komórek łagodzi również niekorzystne skutki "szoku hodowlanego", stanu, w którym występują komórki pierwotne po wyizolowaniu i umieszczeniu w środowisku in vitro znacznie różniącym się odich pochodzenia in vivo. Naśladując środowisko bardziej zbliżone do środowiska in vivo, wysoka gęstość komórek zwiększa wskaźniki przeżycia. Dodatkowo gęstość ta pomaga ustalić gradient stężeń czynników wzrostu i cytokin, który wspomaga wzrost i funkcję komórek. Biorąc pod uwagę, że wiele komórek pierwotnych jest zależnych od zakotwiczenia, wymagających przyłączenia powierzchniowego do proliferacji, wysoka gęstość komórek zapewnia odpowiednią liczbę sąsiednich komórek do adhezji, sprzyjając w ten sposób zdrowemu wzrostowi. W związku z tym regulacja gęstości komórek jest kluczowym czynnikiem w hodowli komórek pierwotnych ze względu na jej znaczący wpływ na komunikację, przeżycie i proliferację komórek. Zaleca się wybór mniejszych naczyń do hodowli, takich jak płytki 24-dołkowe lub 6-dołkowe, aby stworzyć idealne środowisko dla LEC. Przestrzeganie tego protokołu zazwyczaj powoduje, że LEC osiągają stan zlewania się ~ 10-14 dni po uprawie. Zalecamy stosowanie LEC przy małej liczbie przejść, najlepiej między P0 a P6, aby zapewnić najbardziej naturalne zachowanie w eksperymentach. Powyżej 7-10 pasaży LEC mogą wykazywać zmniejszony wzrost i mogą nie reagować na warunki eksperymentalne w taki sam sposób, jak komórki w dolnych pasażach.

Stężenie w surowicy jest bezpośrednio związane z szybkością wzrostu komórek. Niższe poziomy FBS z większym prawdopodobieństwem indukują wolniejszy wzrost, przypominając cechy nabłonka centralnego. W przeciwieństwie do tego, wyższe poziomy FBS naśladują warunki panujące w strefie proliferacyjnej. Jeśli wzrost komórek jest powolny, co może się zdarzyć, gdy LEC muszą zostać wyizolowane ze starszych lub genetycznie zmodyfikowanych zwierząt, korzystne może być zwiększenie FBS do 20% lub dodanie suplementu wzrostu, takiego jak EpiCGS-a (5 ml, patrz tabela materiałów) do pożywki hodowlanej. To wzbogacenie surowicy i suplementu może zwiększyć proliferację komórek i promować optymalny wzrost komórek nabłonkowych.

Protokół przechowywania i wysyłki (sekcja 5 protokołu) uwzględnia wyzwania związane z konserwacją i transportem żywych komórek. Wybór podłoża do zamrażania ma kluczowe znaczenie dla przetrwania LEC podczas przechowywania i transportu. Eksperymentowaliśmy z różnymi pożywkami do zamrażania, w tym 70% kompletną pożywką hodowlaną + 20% FBS + 10% DMSO; 90% FBS + 10% DMSO; oraz pożywka do zamrażania bez DMSO i surowicy. Dowody z naszych eksperymentów sugerują, że roztwór składający się w 10% z DMSO i w 90% z FBS wykazuje lepszą wydajność w zachowaniu żywotności komórek. Wykorzystując tę specyficzną formułę, udało nam się utrzymać pierwotne LEC w magazynie w temperaturze -80 °C przez okres przekraczający 10 lat, demonstrując solidność tego podejścia i jego zdolność do ułatwiania rewitalizacji komórek po przechowywaniu.

αA-krystalina i γ-krystalina zostały użyte jako markery dla LEC. PROX1 został wykorzystany jako marker dla komórek światłowodowych soczewki. Dodatkowe markery, takie jak PAX6, FOXE3 i E-kadheryna, mogą być również wykorzystane do scharakteryzowania fenotypu LEC. Jeśli naukowcy są zainteresowani badaniem EMT, αSMA powinien być używany jako marker. Istotne jest dostosowanie czasów inkubacji i rozcieńczeń zgodnie ze szczególnymi wymaganiami doświadczenia i zaleceniami przewidzianymi dla odpowiednich zastosowanych przeciwciał.

Chociaż badanie to przedstawia solidną metodologię hodowli pierwotnych LEC, ważne jest, aby uznać jej ograniczenia. Podczas gdy początkowo wyizolowane komórki są pierwotnymi LEC, wszelkie procedury subhodowli, trypsynizacji i reanimacji doprowadzą do zmian w ich statusie. Opracowany przez nas protokół wykorzystuje przede wszystkim soczewkę myszy jako źródło LEC; jednak LEC można również hodować z innych źródeł, w tym próbek pacjentów z zaćmą, oczu z banku oczu lub pacjentów z różnymi chorobami oczu, w tym jaskrą i retinopatią cukrzycową17,24. LEC pobrane od osób starszych lub z określonymi schorzeniami oczu mogą nie być zgodne z protokołem tak skutecznie, jak komórki od młodszych, zdrowszych odpowiedników. Hodowla LEC od starszych lub genetycznie zmodyfikowanych osobników lub zwierząt może wymagać optymalizacji pożywki hodowlanej, potencjalnie poprzez zwiększenie FBS do 20% lub włączenie dodatkowych czynników wzrostu. Ponadto wcześniejsze badania Menko i wsp., przeprowadzone na pierwotnych hodowlach komórek nabłonkowych embrionalnych soczewek piskląt, wykazały spontaniczne różnicowanie zachodzące po drugim dniu hodowli25. Dlatego badacze powinni zachować ostrożność i rozważyć różnice w metodologiach, zwłaszcza jeśli badanie różnicowania jest ich głównym celem badawczym.

Do hodowli pierwotnych LEC można wykorzystać różne metody. Na przykład metody opracowane przez Ibarakiego i wsp., Sundelina i wsp. oraz Andjelica i wsp. polegają na hodowli pierwotnych LEC bezpośrednio na szalce Petriego przy użyciu przedniej części torebki soczewki pobranej podczas operacji zaćmy 16,17,19,20. Takie podejście utrzymuje naturalne kontakty międzykomórkowe i macierz zewnątrzkomórkową, zapewniając wysokie znaczenie fizjologiczne, które ma kluczowe znaczenie w stanach takich jak PCO. Alternatywnie, metoda eksplantatu soczewki, taka jak opisana przez Zelenkę i wsp., zachowuje natywną architekturę tkankową, umożliwiając badania, które są bardziej istotne fizjologicznie, szczególnie korzystne dla badania końcowego różnicowania LEC, interakcji komórkowych i procesów rozwoju soczewki, zapewniając szczegółowe zrozumienie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych i molekularnych podczas różnicowania26.

W przeciwieństwie do tego, metoda trypsynizacji opisana w tym protokole wytwarza jednolitą zawiesinę pojedynczej komórki, upraszczając równomierne wysiewanie i precyzyjne liczenie komórek, co jest korzystne dla niektórych eksperymentów, takich jak testy żywotności i proliferacji komórek, badania przesiewowe leków i analiza szlaku sygnalizacji komórkowej. Jednak ważne jest, aby przyznać, że chociaż metoda ta ułatwia kontrolowane i precyzyjne badania ze względu na jednolitą populację komórek, może zmienić zachowanie komórek i zagrozić fizjologicznemu znaczeniu obserwowanemu w metodach eksplantacji i hodowli bezpośredniej ze względu na przetwarzanie enzymatyczne. Dla naukowców skupionych wyłącznie na badaniu komórek nabłonkowych metoda ta okazuje się bardzo przydatna i wygodna, oferując wiarygodny wgląd w cechy i zachowania tych komórek. Jednak dla tych, których badania naukowe obejmują różnicowanie komórek, konieczne staje się rozważenie alternatywnych metod, takich jak techniki eksplantacji, lub dostosowanie i optymalizacja obecnej, aby objąć te aspekty.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten został opracowany z dokładnym uwzględnieniem specyficznych potrzeb i wymagań LEC. Każdy krok, od sekcji po walidację, jest starannie opracowany, aby utrzymać żywotność i funkcjonalność komórek. W rezultacie może być cennym przewodnikiem dla naukowców badających LEC i ich rolę w fizjologii i patologii oka. Przyszłe badania mogą dostosować i zmodyfikować ten protokół, aby zbadać różne aspekty biologii LEC, zapewniając platformę dla dalszych postępów w zrozumieniu chorób związanych z soczewkami i rozwoju nowych strategii terapeutycznych w zapobieganiu zaćmie i PCO.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NEI R21EY033941 (do Hongli Wu); Departament Obrony W81XWH2010896 (do Hongli Wu); R15GM123463-02 (do Kayli Green i Hongli Wu)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAThermo Fisher#25300054Do dysocjacji LEC
Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch#715-545-150Do walidacji komórek
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003Do walidacji komórek
Bufor do rozcieńczania przeciwciałLicor#927-60001Do walidacji komórek
Nóż bezpiecznyBeaver-Visitec International#3782235Do wypreparowania
soczewekBufor blokującyLicor#927-60001Do walidacji komórek
Kleszczyki do kapsułekTitan Medical InstrumentsTMF-124Do izolacji kapsułek soczewek
DMEMSigma AldrichD6429Do pożywki hodowlanej
LEC DMSOSigma Aldrich#D2650Do wytwarzania podłoża do zamrażania 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco Thermo Fisher#J67802Do preparowania soczewek
Pęseta DumontRoboz Instrument chirurgicznyRS-4976Do izolacji kapsułki
soczewki EpiCGS-a (opcjonalnie)ScienCell4182Do podłoża hodowlanego LEC
FBSIGMA AldrichF2442Do podłoża hodowlanego LEC
Gentamycyna (50  mg / mL)Sigma-AldrichG1397Do pożywki hodowlanej LEC
roztwór Hoechst 33342Thermo Fisher#62249Do walidacji komórek
Nożyczki do mikropreparacjiNarzędzie chirurgiczne Roboz RS-5983Do preparowania soczewek
Pęseta mikropreparcyjnaRoboz Surgical Instrument Złącze RS5137 Do wypreparowania soczewek
Przeciwciało PROX1Thermo Fisher11067-2-APDo walidacji komórek
Nożyczki sprężynowe do mikropreparowania VannasInstrument chirurgiczny RobozRS-5608Do izolacji kapsułki
soczewki i alfa; Przeciwciało A-krystalinoweSanta Cruzsc-28306Do walidacji komórek 
γ-krystaliczne przeciwciałoSanta Cruzsc-365256Do walidacji komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
  2. Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S. Jr, Huang, Q. L. Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).
  3. Lee, C. M., Afshari, N. A. The global state of cataract blindness. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).
  4. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  5. Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts. Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).
  6. Lou, M. F. Redox regulation in the lens. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).
  7. Charakidas, A., et al. Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract. European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).
  8. Lou, M. F. Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens. Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973(2022).
  9. Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture. Cell Biochemistry & Function. 25 (3), 317-321 (2007).
  10. Zhang, Y., et al. Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification. Pharmaceutics. 14 (7), 1343(2022).
  11. Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. Posterior capsule opacification: A review of experimental studies. Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847(2021).
  12. Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention. Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).
  13. Wei, Z., et al. Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification. Cells. 11 (13), 2001(2022).
  14. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis. Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).
  15. Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture. Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).
  16. Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients. Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).
  17. Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification. The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).
  18. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  19. Andjelic, S., et al. Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification. Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).
  20. Andjelic, S., et al. A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies. Journal of Immunology Research. 2014, 232659(2014).
  21. Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T. Jr, Fleming, T. P. Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).
  22. Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).
  23. Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures. Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).
  24. Haykin, V., et al. Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).
  25. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  26. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. Journal of Visualized Experiments. (31), 1591(2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki nab onka soczewkihodowla soczewki mysiejpierwotna hodowla kom rekizolacja torebki soczewkitechnika trypsynizacjiformowanie si za myzm tnienie tylnej torebkimikroskopia kontrastowatest immunofluorescencyjnyenzymy antyoksydacyjne

Powiązane artykuły