Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65921

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Streszczenie

Bariera krew-mózg (BBB) jest kluczowym fizjologicznym składnikiem ośrodkowego układu nerwowego (OUN), przechowującym składniki odżywcze, usuwającym odpady i chroniącym mózg przed patogenami. Nieodłączne właściwości barierowe bariery krew-mózg stanowią wyzwanie dla dostarczania leków terapeutycznych do OUN w celu leczenia chorób neurologicznych. Upośledzona funkcja bariery krew-mózg jest związana z chorobą neurologiczną. Angiopatia amyloidowa mózgu (CAA), czyli odkładanie się amyloidu w układzie naczyniowym mózgu prowadzące do upośledzenia BBB, jest chorobą współistniejącą w większości przypadków choroby Alzheimera (AD), co sugeruje, że dysfunkcja lub rozpad BBB może być zaangażowany w neurodegenerację. Ze względu na ograniczony dostęp do tkanki ludzkiej bariery krew-mózg, mechanizmy, które przyczyniają się do prawidłowego funkcjonowania bariery krew-mózg i zwyrodnienia bariery krew-mózg, pozostają nieznane. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy ludzką pluripotencjalną barierę krew-mózg pochodzącą z komórek macierzystych (iBBB) poprzez włączenie komórek śródbłonka, perycytów i astrocytów do matrycy 3D. iBBB samoorganizuje się, aby podsumować anatomię i interakcje komórkowe obecne w BBB. Wysiewanie iBBB amyloidem wychwytuje kluczowe aspekty CAA. Ponadto iBBB oferuje elastyczną platformę do modulowania czynników genetycznych i środowiskowych związanych z chorobami naczyń mózgowych i neurodegeneracją, aby zbadać, w jaki sposób genetyka i styl życia wpływają na ryzyko choroby. Wreszcie, iBBB może być używany do badań przesiewowych leków i badań chemii medycznej w celu optymalizacji dostarczania terapeutycznego do OUN. W tym protokole opisujemy różnicowanie trzech typów komórek (komórek śródbłonka, perycytów i astrocytów) powstających z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak składać zróżnicowane komórki w iBBB oraz jak modelować CAA in vitro przy użyciu egzogennego amyloidu. Model ten pokonuje wyzwanie związane z badaniem żywej ludzkiej tkanki mózgowej za pomocą systemu, który charakteryzuje się zarówno biologiczną wiernością, jak i elastycznością eksperymentalną, a także umożliwia badanie ludzkiej bariery krew-mózg i jej roli w neurodegeneracji.

Wprowadzenie

Bariera krew-mózg (BBB) to kluczowa sieć mikronaczyniowa oddzielająca ośrodkowy układ nerwowy (OUN) od peryferii, aby utrzymać idealne środowisko dla prawidłowego funkcjonowania neuronów. Odgrywa kluczową rolę w regulowaniu napływu i odpływu substancji do OUN poprzez utrzymanie homeostazy metabolicznej1,2,3,4, oczyszczanie odpadów4,5,6, oraz ochrona mózgu przed patogenami i toksynami7,8.

Podstawowym typem komórki BBB jest komórka śródbłonka (EC). Komórki śródbłonka, wywodzące się z linii mezodermy, tworzą ściany układu krwionośnego1,9. Mikronaczyniowe EC tworzą ze sobą ścisłe połączenia, aby znacznie zmniejszyć przepuszczalność swojej błony10,11,12,13,14 jednocześnie wyrażając transportery, aby ułatwić przepływ składników odżywczych do i z CNS1,4,12,14. Mikronaczyniowe EC są otoczone przez komórki szkieletowe perycytów (PC), które regulują funkcję mikronaczyniową i homeostazę oraz mają kluczowe znaczenie dla regulacji przepuszczalności bariery krew-mózg dla cząsteczek i komórek odpornościowych15,16,17. Astrocyt, główny typ komórek glejowych, jest ostatnim typem komórek składającym się z bariery krew-mózg. Stopy końcowe astrocytów owijają się wokół cew naczyniowych EC-PC, podczas gdy ciała komórek rozciągają się do miąższu mózgu, tworząc połączenie między neuronami a układem naczyniowym1. Na końcach astrocytów zlokalizowane są odrębne transportery substancji rozpuszczonych i substratów (np. akwaporyna 4 [AQP-4]), które odgrywają kluczową rolę w funkcji BBB18,19,20,21.

BBB ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowego funkcjonowania mózgu w zdrowiu, a dysfunkcja BBB została zgłoszona w wielu chorobach neurologicznych, w tym w chorobie Alzheimera (AD)22,23,24,25, stwardnienie rozsiane 7,26,27,28, epilepsy29,30, oraz stroke31,32. Coraz częściej uznaje się, że nieprawidłowości naczyniowo-mózgowe odgrywają kluczową rolę w neurodegeneracji, przyczyniając się do zwiększonej podatności na zdarzenia niedokrwienne i krwotoczne. Na przykład ponad 90% pacjentów z chorobą Alzheimera cierpi na mózgową angiopatię amyloidową (CAA), stan charakteryzujący się odkładaniem się β amyloidowej (Aβ) wzdłuż naczyń mózgowych. CAA zwiększa przepuszczalność BBB i zmniejsza funkcję BBB, pozostawiając OUN podatnym na niedokrwienie, zdarzenia krwotoczne i przyspieszony spadek funkcji poznawczych33.

Niedawno opracowaliśmy model in vitro ludzkiego BBB, pochodzącego z indukowanych przez pacjenta pluripotencjalnych komórek macierzystych, który zawiera ECs, PC i astrocyty zamknięte w matrycy 3D (Rysunek 1A). iBBB podsumowuje fizjologicznie istotne interakcje, w tym tworzenie rurki naczyniowej i lokalizację stóp końcowych astrocytów z unaczynieniem24. Zastosowaliśmy iBBB do modelowania podatności CAA, w której pośredniczy APOE4 (Rysunek 1B). Umożliwiło nam to zidentyfikowanie przyczynowych mechanizmów komórkowych i molekularnych, za pomocą których APOE4 promuje CAA, i wykorzystanie tych spostrzeżeń do opracowania strategii terapeutycznych, które zmniejszają patologię CAA i poprawiają uczenie się i pamięć in vivo u myszy APOE424. W tym miejscu udostępniamy szczegółowy protokół i samouczek wideo dotyczący rekonstrukcji bariery krew-mózg na podstawie ludzkich iPSC i modelowania CAA in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Różnicowanie iPSC na komórki iBBB

UWAGA: Te protokoły różnicowania zostały wcześniej opisane w Mesentier-Louro et al.34.

  1. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych
    1. Rozmrozić matrycę błony o zredukowanym czynniku wzrostu (GF) przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć 500 μl matrycy błony podstawnej w 49,5 ml DMEM. Utrzymuj ten roztwór w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji roztworu powlekającego.
    2. Dodaj 1-2 ml na dołek z 6-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej. Pozostawić roztwór powlekający na co najmniej 20 minut w temperaturze 37 °C przed zastąpieniem go odpowiednią podgrzaną pożywką hodowlaną.
  2. Różnicowanie ludzkich iPSC w komórki śródbłonka indukowane przez ETV2
    Czas: 8 dni < br / > UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Blanchard et al.24 i Qian et al.35. Używamy indukowanej doksycykliną ekspresji czynnika transkrypcyjnego ETV2, zgodnie z opisem Wang i wsp.36, aby poprawić wydajność. ETV2 wprowadzono za pomocą plazmidu PiggyBac, a następnie komórki transfekowano.
    1. Hoduj iPSC na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o obniżonej GF w pożywce z pluripotencjalnych komórek macierzystych bez podawania, aż komórki osiągną ~70% konfluencji.
      UWAGA: Zalecamy utrzymanie indukowalnych iPSC z selekcją plazmidu PiggyBac (tj. puromycyny)
    2. Dzień 0: Dysocjacja komórek za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy przez 5 minut. Przenieś zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do pożywki komórek macierzystych. Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki z komórek macierzystych i pokryć komórki w ilości 20 800 komórek/cm2 na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w pożywce z komórek macierzystych uzupełnionej 10 μM Y27632.
    3. Dzień 1: Zastąp pożywkę DeSR1 [DMEM/F12 + suplement glutaminy, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% penicyliny-streptomycyny (P/S)], uzupełnioną 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 i 5 μg/ml doksycykliny.
    4. Dzień 3: Zastąp pożywkę DeSR2 [DMEM/F12 + suplement glutaminy, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] uzupełnioną 5 μg/ml doksycykliny.
    5. Dzień 5: Zastąp pożywkę hECSR [pożywka wolna od ludzkiej śródbłonka, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] uzupełnioną 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM forskoliny i 5 μg/ml doksycykliny.
    6. Dzień 7: Zastąp pożywkę hECSR uzupełnioną 50 ng / ml vegf-a, 2 μM forskoliny i 5 μg / ml doksycykliny.
    7. Dzień 8: Rozdziel EC 1:3 za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy i ponownie wysiewaj na świeżych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej o obniżonej GF w hECSR uzupełnionej 50 ng / ml VEGF-A i 5 μg / ml doksycykliny.
      UWAGA: Jest to najlepszy moment na enkapsulację EC w iBBB w celu jednolitego tworzenia naczyń krwionośnych.
    8. Dzień 10+: Karmić komórki co 2-3 dni hECSR uzupełnionym 50 ng/ml VEGF-A i 5 μg/ml doksycykliny. Kontynuuj dzielenie komórek w stosunku 1:3 za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy, gdy płytki się zlewają.
      UWAGA: EC pochodzące z iPSC można zamrozić w dowolnym momencie, począwszy od dnia 8. Podnieś komórki, jakby do przejścia. Zawiesić osad w pożywce zamrażającej EC [60% zamiennik surowicy nokautującej (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ng/mL VEGF-A i 10 μM Y27632], dzieląc komórki w stosunku 1:3 i zamrozić za pomocą pojemnika do zamrażania w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na płytkach pokrytych matrycą membrany podstawnej o zredukowanej zawartości GF w hECSR uzupełnionym 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml doksycykliny.
    9. Potwierdź różnicowanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu za pomocą immunocytochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko CD31 / PECAM1 lub VE-kadherynie (Figura 2A).
  3. Różnicowanie ludzkich iPSC w perycyty
    Czas: 6 dni < br / > UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z Patsch et al.36.
    1. Hoduj iPSC na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w warunkach wolnych od pożywki w pożywce z komórek macierzystych, aż komórki osiągną ~70% konfluencji.
    2. Dzień 0: Dysocjacja komórek za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy przez 5 minut. Przenieś zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do pożywki komórek macierzystych. Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki z komórek macierzystych i pokryć komórki w ilości 37 000-40 000 komórek/cm2 (w zależności od linii komórkowej) na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w pożywce dla komórek macierzystych uzupełnionej 10 μM Y27632.
    3. Dzień 1: Zastąp pożywkę N2B27 [50% DMEM/F12 + suplement glutaminy, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, suplement glutaminy, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S] uzupełnioną 25 ng/ml BMP4 i 8 uM CHIR99021.
    4. Dni 3-4: Zastąp pożywkę N2B27 uzupełnioną 2 ng/ml aktywiny A i 10 ng/ml PDGF-BB i podawaj codziennie.
    5. Dzień 5: Podziel PC mieszaniną proteazy i kolagenazy i nasion na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną w ilości 35 000 komórek/cm2 w N2B27 uzupełnionych 10 ng / mL PDGF-BB.
      UWAGA: Podziel komórki tylko wtedy, gdy się zlewają. Niektóre linie mogą wymagać kilku dni więcej, zanim będą gotowe do podziału; Kontynuuj codzienną zmianę pożywki, aż komórki zaczną się zlewać.
    6. Rozbudowa komputerów w N2B27 uzupełniona o 10 ng/mL PDGF-BB, wymiana nośników co 2-3 dni. Usuń PDGF-BB z pożywki, gdy komórki ponownie osiągną zbieżność i przejdą drugie pasaże.
      UWAGA: Perycyty są gotowe do użycia w iBBB po drugim pasażu. Po rozwinięciu komputery mogą zostać zamrożone. Podnieś komórki tak, jakby miały przejść, ponownie zawieś osad komórek w pożywce do zamrażania [90% KSR i 10% DMSO] i zamroź za pomocą pojemnika do zamrażania w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na 0,1% płytkach pokrytych żelatyną w temperaturze 35 000 komórek/cm2 w N2B27.
    7. Potwierdź różnicowanie perycytów za pomocą immunocytochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko PDGFRB i NG2 (Figura 2B).
  4. Różnicowanie ludzkich komórek iPS w progenitorowe komórki nerwowe (NPC) i astrocyty
    Czas: łącznie 45 dni (15 dni dla NPC, a następnie 30 dni dla astrocytów)
    UWAGA: Protokół różnicowania NPC został zaadaptowany z Chambers et al.38, a różnicowanie astrocytów jest zgodne z opisem w TCW et al.39.
    1. Hoduj iPSC na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w warunkach wolnych od pożywki w pożywce z komórek macierzystych, aż komórki osiągną ~70% konfluencji.
    2. Dysocjację komórek za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy przez 5 minut. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej rurki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do pożywki komórek macierzystych. Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki z komórek macierzystych i pokryć komórki w ilości 100 000 komórek/cm2 na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w pożywce z komórkami macierzystymi uzupełnionymi 10 μM Y27632.
    3. Wymień pożywkę z komórkami macierzystymi następnego dnia. Kontynuuj karmienie komórek co drugi dzień, aż osiągną >95% zbieżności (3-4 dni w zależności od linii komórkowej).
    4. NPC Dzień 0: Zastąp pożywkę N2B27 [50% DMEM/F12 + suplement glutaminy, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, suplement glutaminy, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P/S] uzupełniony o 10 μM SB43152 i 100 nM LDN193189.
    5. NPC Dni 1-9: Codziennie karm komórki N2B27 uzupełnionym o 10 μM SB43152 i 100 nM LDN193189.
    6. NPC Dzień 10: Rozdziel NPC 1:3 za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy oraz nasion na świeżych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o obniżonej GF w N2B27 uzupełnionej 20 ng / ml zasady FGF i 10 μM Y27632.
    7. NPC Dni 11 - 13: Codziennie karm NPC N2B27 uzupełnionym 20 ng/ml FGF-basic.
    8. NPC Dzień 14: Rozdziel NPC 1:3 za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy i ponownie wysiewaj na świeżych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zredukowanej GF w N2B27 uzupełnionej 20 ng/ml FGF-zasadową i 10 μM Y27632.
    9. NPC Dzień 15/Astrocyt Dzień 0: To jest Dzień 0 różnicowania astrocytów. Nakarm komórki kompletną pożywką Astrocyte (AM).
      UWAGA: NPC mogą być utrzymywane w N2B27 uzupełnionym 20 ng / ml FGF-basic i pasażowane po zlewaniu się. Aby zamrozić NPC, ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce do zamrażania [90% KSR i 10% DMSO], podziel komórki 1:3 i zamroź za pomocą pojemnika do zamrażania w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na płytkach pokrytych membraną podstawną o zmniejszonej GF w N2B27 uzupełnionych 20 ng/ml bFGF i 10 μM Y27632.
    10. Astrocyty Dni 1-30: Karmić komórki co 2-3 dni rano. Gdy komórki są >90% zlewane, pasaż przy użyciu mieszaniny proteazy i kolagenazy i płytki z prędkością 15 000 komórek / cm2 na świeżych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej GF o zmniejszonej zawartości GF w AM.
      UWAGA: Astrocyty powinny być w pełni zróżnicowane w ciągu 30 dni. Astrocyty można zamrozić w pożywkach zamrażających [90% KSR i 10% DMSO] w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF w AM w temperaturze 25 000-35> 000 komórek/cm2.
    11. Potwierdź różnicowanie NPC za pomocą immunocytochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko Nestin i SOX2. Potwierdź różnicowanie astrocytów za pomocą immunocytochemii przy użyciu przeciwciał przeciwko S100B i CD44 (Figura 2C).

2. Montaż iBBB

  1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu (GF) przez noc w temperaturze 4 °C. Nie należy rozcieńczać tej matrycy w DMEM, ponieważ iBBB są zamknięte w 100% zredukowanej matrycy membrany podstawnej GF. Każdy iBBB wymaga 50 μl matrycy.
  2. Zdysocjować zróżnicowane EC za pomocą mieszaniny proteazy i kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do hECSR (Human Endothelial Sursurowica-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Zawiesić osad komórkowy w hECSR.
    UWAGA: Użyj stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml, która jest wystarczająco duża, aby pomieścić objętość zdysocjowanych komórek i pożywki. Komórki można również podzielić na wiele probówek, a następnie ponownie połączyć po ponownym zawieszeniu.
  3. Zdysocjować zróżnicowane PC za pomocą mieszaniny proteazy-kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do N2B27 (50% DMEM/F12 + suplement glutaminy, 50% Neurobasen, 1x MEM-NEAA, 0,5x suplement glutaminy, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicylina-streptomycyna [P/S]). Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić osad ogniwa w N2B27.
  4. Zdysocjować zróżnicowane astrocyty za pomocą mieszaniny proteazy-kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej rurki o stosunku 1:3 mieszaniny proteazy-kolagenazy do pełnego podłoża astrocytów (AM). Wiruj komórki na 300 × g przez 3 minuty. Ponownie zawieś osad komórkowy w AM.
  5. Za pomocą hemocytometru policz każdy typ komórek. Rozcieńczyć każdy rodzaj zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 1 ×10 6 komórek/ml w odpowiednim podłożu.
  6. Połącz obliczoną liczbę komórek dla każdego typu komórek w stożkowej probówce: 50 μl iBBB wymaga 2,5 × 105 EC, 5 ×10 4 PC i 5 × 104 astrocytów. Uwzględnij o 10% więcej komórek niż obliczona, aby uwzględnić błędy pipetowania. Odwiruj mieszaninę komórek na 300 × g przez 3 min.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się umieszczenie resztek komórek każdego typu komórek w monokulturach 2D w celu utrwalenia i barwienia w celu kontroli jakości komórek wejściowych. Płytkę z każdym typem komórek w ilości 35 000 komórek/cm2 na wcześniej przygotowanych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej o zmniejszonej GF i utrwalić po 3-4 dniach. Patrz Tabela 1 dla przeciwciał specyficznych dla typu komórki.
  7. Odessać pożywkę z osadu komórkowego, pozostawiając około 50 μl supernatantu nad osadem komórkowym. Za pomocą P200 delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w pozostałym podłożu, aby utworzyć jednokomórkową zawiesinę.
  8. Wymieszać zawiesinę komórkową w wystarczającej ilości zredukowanej matrycy błony podstawnej GF uzupełnionej 10 ng / ml VEGF-A dla żądanej liczby iBBB w 50 μl zredukowanej macierzy błony podstawnej GF na iBBB, uważając, aby jednorodnie wymieszać komórki, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby utrzymać komórki i macierz błony podstawnej o zmniejszonej wartości GF na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
  9. Odpipetować 50 μl zredukowanej mieszaniny GF z membraną podstawną do dołka 48-dołkowego naczynia hodowlanego ze szklanym dnem. Rozprowadź objętość równomiernie na dnie naczynia (Rysunek 1C).
  10. Inkubować iBBB w temperaturze 37 °C przez 30–40 minut, aby umożliwić polimeryzację zredukowanej macierzy błony podstawnej GF, zamykając komórki w matrycy.
  11. Dodaj 500 μl AM uzupełnionego 10 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml doksycykliny i 10 μM Y27632.
  12. Następnego dnia zmień pożywkę na AM uzupełnioną 10 ng/ml VEGF-A. Kontynuuj zmianę podłoża co 2-3 dni. Po 2 tygodniach przerwij suplementację VEGF-A; iBBB są gotowe do dalszych testów po 2 tygodniach.

3. Wywoływanie mózgowej angiopatii amyloidowej (CAA) za pomocą włókienek Aβ

  1. Przygotować roztwory podstawowe amyloidu-β1-40 i amyloidu-β1-42 w temperaturze 200 μM w PBS.
  2. Dodać Aβ do pożywki iBBB na 2-tygodniowych iBBB do końcowego stężenia 20 nM. Inkubować komórki w pożywce z dodatkiem Aβ przez 96 godzin (4 dni).
  3. Po 96 godzinach usunąć podłoże i kontynuować mocowanie (sekcja 4).

4. Naprawianie i barwienie iBBB

  1. Aby utrwalić iBBB, usuń pożywkę, przemyj w 1 ml PBS i inkubuj w 500 μl 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć 4% roztwór paraformaldehydu i płukać przez 4 x (co najmniej) 15 minut w 1 ml PBS.
  3. Próbki należy przepuszczać w 0,3% PBST (PBS z 0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  4. Inkubować kultury w buforze blokującym (5% normalnej surowicy w 0,3% PBST) w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Rodzaj użytej surowicy zależy od gatunku gospodarza dla zastosowanych przeciwciał drugorzędowych. Na przykład, jeśli gatunkiem gospodarza dla przeciwciał drugorzędowych jest koza, użyj normalnej koziej surowicy; Jeśli gatunkiem żywiciela jest osioł, użyj normalnej surowicy osła. Można to również zrobić przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe do zalecanego lub oznaczonego stężenia w buforze blokującym.
  6. Zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowym rozcieńczeniem przeciwciała. Upewnij się, że iBBB są całkowicie zanurzone w roztworze przeciwciał w celu równomiernej inkubacji; 100-150 μL wystarcza do pokrycia 50 μL iBBB w 48-dołkowym naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  7. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe. Myj iBBB przez 3 x 10-20 min w 0,3% PBS.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe do zalecanego lub oznaczonego stężenia w buforze blokującym. Dodatkowo dodaj barwnik jądrowy, taki jak Hoechst, do roztworu przeciwciała drugorzędowego w zalecanym lub określonym stężeniu.
  9. Zastąp ostatnie przemycie PBS wtórnym rozcieńczeniem przeciwciał. Upewnij się, że iBBB są całkowicie zanurzone w roztworze przeciwciał w celu równomiernej inkubacji; 100-150 μL wystarcza do pokrycia 50 μL iBBB w 48-dołkowym naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Można to również zrobić przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  10. Myj iBBB 4-5x przez co najmniej 1 godzinę na pranie w PBS. Przechowywać w PBS lub podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu w temperaturze 4 °C, aż próbki zostaną zobrazowane.
  11. Aby wykonać obraz pod mikroskopem odwróconym, należy przechowywać iBBB w płytkach lub naczyniach ze szklanym dnem. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na szklanej studzience, aby utrzymać iBBB na miejscu ( Rysunek 1D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowo uformowany iBBB zestala się w pojedynczy półprzezroczysty dysk (Rysunek 3A). To normalne, że iBBB odkleja się od powierzchni, na którą został po raz pierwszy odpipetowany, po kilku dniach. Nie można tego uniknąć, ale nie stanowi to poważnego problemu dla prawidłowego tworzenia iBBB, jeśli podczas zmiany pożywki zachowa się ostrożność, aby przypadkowo nie zassać iBBB. Po 24 godzinach, równomiernie rozmieszczone, pojedyncze komórki można zidentyfikować pod mikroskopem jasnego pola (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dysfunkcja bariery krew-mózg jest chorobą współistniejącą i potencjalnie przyczyną lub czynnikiem zaostrzającym w wielu chorobach neurologicznych 7,40,41. Jednak prawie niemożliwe jest zbadanie biologii molekularnej i komórkowej leżącej u podstaw dysfunkcji i rozpadu bariery krew-mózg u ludzi z chorobą nerwowo-naczyniową. Indukowalny BBB (iBBB) przedstawiony w tym protokole zapewnia system in vitro, który podsumowuje wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation oraz Brain Injury Association of America. C.G. jest wspierany przez NIH F31NS130909. Rysunek 1A został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało amyloidowe i beta 6e10BiolegendSIG-39320Używane w 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 Przeciwciała drugorzędoweInvitrogenRóżnestosowane w 1:1000
Fibryl amyloid-beta 40AnaSpecAS-24235
Fibryl Amyloid-beta 42AnaSpecAS-20276
Przeciwciało Aquaporin-4InvitrogenPA5-53234Stosowany w 1:300
Pożywki podstawowe i suplementy AstrocytyScienCell1801
B-27 suplement bez surowicyGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 z podłożem GlutaMAXGibco10565018
DoksycyklinaMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G medium do montażu ślizgowegoVWR100502-406
ForskolinR& D Systems1099/10
GeltrexTM Podstawa o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV z kwalifikacją hESC GibcoA1413302
48-dołkowe naczynia hodowlane ze szklanym dnemMattek CorporationP48G-1.5-6-F
Suplement GlutaMAXGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Pożywka bez ludzkiej śródbłonkaGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimalna niezbędna pożywka Nieistotny roztwór aminokwasów (MEM-NEAA) Gibco11140050
Suplement N-2Gibco17502048
Podłoże neurobazalneGibco21103049
Normalna surowica osłaMillipore-SigmaS30-100mLUżyj surowicy, aby dopasować przeciwciało wtórne gospodarza
Paraformaldehyd (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (receptor beta-płytkowego czynnika wzrostu)R& Systemy DAF385Stosowany w 1:500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), pH 7,4Gibco10010031
Pecam1 (cząsteczka adhezji komórek śródbłonka płytek krwi 1)R& D SystemsAF806Używany w 1:500
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
plazmid PiggyBac (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  Katalog #168805
Przeciwciało S100BSigma-AldrichS2532-100uLUżywane w 1:500
SB43152Reprocell04-0010
TioflavinT Chem Impex22870Stosowany w 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-kadheryna (CD144)przeciwciało R& Systemy DAF938Używany w 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Rozcieńczenie = 1:500

Bibliografia

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model in vitropluripotencjalne kom rki macierzystekom rki r db onkar nicowanie w astrocytyr nicowanie w perycytypatologia amyloidowachoroby naczyniowe m zguprzesiewowe badanie lek wneurodegeneracja

Powiązane artykuły