Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65922

⸱

26 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, 4HUN-REN-DE Cell Biology and Signaling Research Group

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Streszczenie

Immunoterapia oparta na przeciwciałach monoklonalnych, ukierunkowana na antygeny nowotworowe, jest teraz podstawą leczenia raka. Jednym z klinicznie istotnych mechanizmów działania przeciwciał jest cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), w której przeciwciało wiąże się z komórkami nowotworowymi i angażuje komórkowy składnik układu odpornościowego, np. komórki NK (natural killer), w celu zabicia komórek nowotworowych. Skuteczność tych terapii można poprawić, identyfikując związki adiuwantowe, które zwiększają wrażliwość komórek nowotworowych lub siłę działania komórek odpornościowych. Ponadto nieodkryte interakcje lekowe u pacjentów z rakiem leczonych jednocześnie z powodu wcześniejszych schorzeń lub objawów związanych z rakiem mogą decydować o powodzeniu terapii przeciwciałami; Dlatego takie niepożądane interakcje z lekami muszą zostać wyeliminowane. Mając na uwadze te cele, stworzyliśmy model ADCC raka i opisaliśmy tutaj prosty protokół poszukiwania leków modulujących ADCC. Ponieważ modele 3D, takie jak sferoidy komórek rakowych, są lepsze od kultur 2D w przewidywaniu in vivo odpowiedzi nowotworów na terapie przeciwnowotworowe, sferoidalne kokultury komórek raka piersi HER2 + JIMT-1 z ekspresją EGFP i NK92. Linie komórkowe CD16 zostały utworzone i indukowane za pomocą trastuzumabu, przeciwciała monoklonalnego klinicznie zatwierdzonego przeciwko HER2-dodatniemu rakowi piersi. Sferoidy JIMT-1 pozwolono na tworzenie się w odpychających komórki 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U. W dniu 3 dodano komórki NK i trastuzumab. Sferoidy zostały następnie wybarwione aneksyną V-Alexa 647 w celu zmierzenia apoptotycznej śmierci komórki, którą określono ilościowo w strefie peryferowej sferoid za pomocą automatycznego mikroskopu. Przydatność naszego testu do identyfikacji cząsteczek modulujących ADCC została wykazana poprzez wykazanie, że Sunitinib, receptorowy inhibitor kinazy tyrozynowej zatwierdzony przez FDA przeciwko rakowi z przerzutami, prawie całkowicie znosi ADCC. Generowanie sferoid oraz potoki akwizycji i analizy obrazów są kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi pod kątem związków modulujących ADCC w sferoidach komórek nowotworowych.

Wprowadzenie

Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) są powszechnie stosowanymi modelami trójwymiarowymi (3D), które powstają w wyniku tendencji komórek adherentnych do agregacji i stanowią ważne narzędzie do uzyskania wglądu w mechanizmy biologii komórek nowotworowych. Mogą być one generowane z szerokiej gamy typów komórek za pomocą licznych technik, takich jak hodowle 3D w środowisku ciekłym oraz na rusztowaniach (scaffold-based)1. Ich główną zaletą w stosunku do monolayerowych modeli 2D jest to, że odwzorowują one główne cechy guzów in vivo , a mianowicie organizację strukturalną i hipoksję, naśladując biologiczne zachowanie komórek nowotworowych, zwłaszcza mechanizmy prowadzące do ucieczki terapeutycznej i oporności na leki2. Ponieważ zatem MCTS mogą poprawić przewidywalność toksyczności i wrażliwości na leki, są one szeroko wykorzystywane do badania nowotworów w 3D i mogą wspomóc opracowanie skutecznych leków na różne rodzaje raka3.

Aby badać jakąkolwiek chorobę, niezbędne są odpowiednie i wygodne modele. Tworzenie modeli do badań nad immunologią nowotworów jest trudne, ponieważ układ odpornościowy składa się z wielu typów komórek. Każdy typ komórek posiada kilka podtypów oraz szerokie spektrum stanów aktywacji. Te różne typy komórek odpornościowych oddziałują z komórkami nowotworowymi i innymi składnikami guza, co w ostateczności wpływa na przebieg choroby. Metody hodowli komórkowych 2D in vitro nie odtwarzają tych złożonych interakcji komórkowych, ponieważ brakuje im możliwości translacji i nie są one w stanie przewidzieć działania leku na poziomie systemowym (np. w tkankach)4,5. Co więcej, modele mysie również mają poważne ograniczenia ze względu na fundamentalne różnice między ludzkim a mysim układem odpornościowym. Systemy hodowli 3D mogą zatem wypełnić obecne luki w dostępnych modelach, zapewniając alternatywną metodę i poprawiając nasze zrozumienie immunologii nowotworów6. W szczególności modele sferoidów mogą być wykorzystywane do testowania immunoterapii, głównie w celu oceny skuteczności przesiewania leków i przeciwciał terapeutycznych w zwiększaniu infiltracji komórek odpornościowych oraz efektów przeciwnowotworowych przeciwko celom sferoidalnym7. Ponadto szeroko wykazano potencjał MCTS składających się z komórek w różnych stanach metabolicznych i proliferacyjnych do badania interakcji między komórkami zrębu (np. limfocytami, makrofagami, fibroblastami) a komórkami nowotworowymi oraz do opracowywania nowych strategii przeciwnowotworowych8. Zatem istnieje kluczowa potrzeba opracowania predykcyjnych i dokładnych platform w celu usprawnienia procesu testowania leków, z uwzględnieniem patofizjologii mikrośrodowiska guza.

Rak piersi (BC) jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet na całym świecie. Klasyfikacja kliniczna tej heterogennej choroby opiera się na obecności receptorów transmembrane, np. receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) (zbiorczo nazywanych receptorami hormonalnymi, HR), a także na nadekspresji lub amplifikacji białka/onkogenu receptora ludzkiego czynnika wzrostu naskórka 2 (HER2). Na podstawie immunohistochemicznej ekspresji tych receptorów powszechnie wyróżnia się cztery podtypy: luminalny A (HR+/HER2-), luminalny B (HR+/HER2+), HER2-dodatni (HR-/HER2+) oraz potrójnie ujemny rak piersi (HR-/HER2-). Grupa HER2+ stanowi 10-15% przypadków BC i charakteryzuje się wysoką ekspresją HER2 przy braku ER i PR, co wiąże się z gorszym rokowaniem w porównaniu do guzów luminalnych i wymaga zastosowania specyficznych leków skierowanych przeciwko białku HER2/neu9.

Rozwój raka piersi (BC) jest procesem wieloetapowym, a wczesna diagnoza jest niezbędna dla skutecznego leczenia tej choroby10. Jednak mimo niedawno wprowadzonych spersonalizowanych opcji leczenia raka piersi (np. terapii endokrynnych i przeciwciał anty-HER2), BC nadal stanowi wyzwanie dla onkologów. Podobnie jak chirurgia, chemioterapia i radioterapia, te spersonalizowane terapie mogą wywoływać poważne działania niepożądane, a pacjenci mogą rozwinąć oporność na te środki, co sprawia, że wyznaczenie najlepszej strategii jest długoterminowym wyzwaniem11,12. W związku z tym lepsze zrozumienie oddziaływań między guzem a jego mikrośrodowiskiem jest niezbędne i ma szansę wskazać nowe kierunki rozwoju innowacyjnych metod leczenia, które uwzględnią specyfikę różnych podtypów raka piersi13. W szerokiej populacji pacjentów z guzami wykazującymi ekspresję HER2 badana jest nowa fala immunoterapii, takich jak koniugaty przeciwciało-lek, adoptywna terapia limfocytami T, szczepionki oraz nowe przeciwciała monoklonalne (mAbs) skierowane przeciwko HER214.

Trastuzumab, na przykład, stanowi efektywną metodę leczenia HER2+ BC. W ramach swojego mechanizmu działania Trastuzumab pośredniczy w aktywnościach zależnych od receptorów fragmentu krystalizowalnego gamma (FcγR). Receptory FcγR różnią się powinowactwem do fragmentu Fc oraz rodzajem inicjowanej przez nie odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja FcγRIIIa (CD16A) na komórkach natural killer (NK) jest kluczowa dla pośredniczenia w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), natomiast pobudzenie FcγRIIa (CD32A) i FcγRIIIa na makrofagach indukuje fagocytozę komórkową zależną od przeciwciał (ADCP)15. Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że myszy pozbawione receptorów FcγRI (CD64) i FcγRIII (CD16) nie były w stanie zainicjować ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom specyficznym dla guza, co wskazuje, że ADCC jest prawdopodobnie głównym mechanizmem działania przeciwciała monoklonalnego Trastuzumab16.

Ponieważ komórki NK wykorzystują przeciwciała związane z komórkami nowotworowymi do niszczenia komórek rakowych poprzez ADCC, ekspresja receptorów Fc jest kluczowa dla skutecznego leczenia Trastuzumabem17 (Rysunek 1). Ponadto ich działanie jest efektywnie równoważone przez stymulację receptorów aktywujących i hamujących, np. receptorów KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptors)18.

Interakcja komórki NK z komórką nowotworową za pośrednictwem receptora Fcγ w procesie ADCC; schemat komórkowy dla badania immunologicznego.
Rysunek 1. Mechanizm ADCC w kontekście odpowiedzi przeciwnowotworowej. Receptor Fcγ komórki NK (natural killer) rozpoznaje region Fc przeciwciała, które uprzednio związało się z antygenem powierzchniowym komórki nowotworowej. Ta synapsa immunologiczna prowadzi do degranulacji komórki NK, która uwalnia mediatory cytotoksyczne, takie jak granzymy i perforyny. Cząsteczki te przyczyniają się do tworzenia porów w błonie komórkowej i aktywują szlaki apoptotyczne, powodując programowaną śmierć komórki docelowej (obraz utworzony za pomocą Biorender.com). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rozwój immunoterapii w przypadku raka piersi HER2+ stanowi ewoluującą dziedzinę. W tym kontekście należy wziąć pod uwagę interakcje między różnymi komponentami układu odpornościowego. Co więcej, w poprzednich publikacjach szeroko testowano terapie skojarzone, obejmujące wszystkie rodzaje tradycyjnych terapii, immunoterapii lub terapii komórkowych, w celu zidentyfikowania kombinacji o działaniu synergicznym19.

Kilka modeli 3D raka piersi z nadekspresją HER2 (HER2+ BC) było wcześniej wykorzystywanych w badaniach nad nowymi lekami. Na przykład Balalaeva i wsp. wykorzystali sferoidy SKBR-3 z nadekspresją HER2 do oceny cytotoksyczności immunotoksyny 4D5scFv-PE40 skierowanej przeciwko HER220. W innym badaniu opracowano system hodowli 3D HER2+ BC oparty na Matrigelu w celu pomiaru wzrostu komórek w odpowiedzi na Trastuzumab oraz leki endokrynne21. Badania te podkreślają znaczenie modeli sferoidów nowotworowych komórek rakowych z nadekspresją HER2 jako skutecznej strategii służącej do klinicznej poprawy odpowiedzi terapeutycznej22.

Nasza grupa zidentyfikowała wcześniej Sunitynib, wielocelowy inhibitor tyrozynowej kinazy, jako inhibitor zależnej od Trastuzumabu cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) w komórkach raka piersi JIMT-1 HER2+ w teście hodowli 2D. Badanie wykazało, że Sunitynib indukuje autofagię i upośledza funkcję zabijania komórek NK, obniżając ekspresję HER2 i zwiększając przyleganie powierzchniowe komórek JIMT-117.

W niniejszej pracy opracowaliśmy nowy trójwymiarowy (3D) sferoidalny model ADCC (komórki NK.92.CD16+Trastuzumab+komórki nowotworowe JIMT-1-EGFP) do zastosowań w badaniach wysokoprzepustowych, a w celu walidacji powyższych wyników jako związku modelowego wykorzystano sunitinib. W pierwszej kolejności wygenerowaliśmy komórki JIMT-1 wykazujące ekspresję EGFP17, a następnie z tych komórek wyhodowaliśmy sferoidy. ADCC indukowano za pomocą komórek NK wraz z trastuzumabem, a sferoidy utrzymywano w hodowli w obecności lub w nieobecności badanych związków przez 24 h (Rysunek 2). Ilościowa ocena ADCC opiera się na detekcji apoptycznej śmierci komórek nowotworowych (barwienie aneksyną V) z wykorzystaniem systemu analizy wysokotreściowej (High-Content Analysis).

Schemat procesu ADCC: komórka NK, interakcja z guzem, przeciwciało Trastuzumab, analiza tworzenia sferoidów.
Rycina 2. ADCC w 3D systemie kokultury sferoidów. Nasze warunki eksperymentalne opierają się na systemie sferoidów 3D, który pozwala na dokładniejsze modelowanie mikrośrodowiska in vivo w porównaniu do modeli 2D. Komórki raka piersi JIMT-1 EGFP wysiano na wklęsłe dno odstraszające komórki, aby utworzyły okrągłe skupiska komórkowe, zwane sferoidami. Następnie zainicjowano ADCC poprzez dodanie komórek naturalnych zabójców NK92.CD16 (stosunek E:T = 20:1) oraz przeciwciała monoklonalnego anty-HER2, Trastuzumabu. Model eksperymentalny okazał się wydajny i łatwy w zastosowaniu do identyfikacji związków testowych modyfikujących ADCC (obraz utworzony za pomocą Biorender.com). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykazaliśmy, że pozyskiwanie danych w ten sposób może odbywać się w czasie rzeczywistym i jest statystycznie wiarygodne do zastosowania w wysokoprzepustowych badaniach wysokotreściowych (high-content screening) w procesie odkrywania leków przeciwnowotworowych. Co istotne, model ten umożliwia rozszerzoną walidację większego zestawu związków i może być zastosowany w kilku interesujących badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja modelu sferoidalnego białka fluorescencyjnego wzmocnionego JIMT-1 (EGFP)

  1. Aby utworzyć dno odpychające komórki w kształcie litery U, pokryj 96-dołkową płytkę 0,5% roztworem agarozy-PBS (30 μl/basenik). Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez około 30-45 minut.
  2. Umyj komórki JIMT-1-EGFP dwukrotnie 2 ml sterylnego PBS (generacja linii komórkowej JIMT1-EGFP została opisana w poprzedniej publikacji17). Do hodowli komórkowej należy użyć kolb do hodowli tkankowych T25 i pożywki JIMT-1 (pożywka DMEM/F-12 uzupełniona 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,3 U/ml insuliny (100 IU / ml, Humulin R) i 1% penicyliny-streptomycyny).
  3. Dodać 2 ml trypsyny-EDTA do kolby i inkubować przez 10 minut w inkubatorze CO2 .
  4. Postukaj w kolbę, aby sprawdzić, czy komórki JIMT-1 odczepiły się po czasie inkubacji.
  5. Użyj 2 ml pożywki JIMT-1, aby zatrzymać trawienie i zebrać zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Policz komórki w komorze Bürkera za pomocą 0,4% błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek) i dostosuj liczbę komórek do 20 000 komórek/ml.
  7. Pobrać pipetą 100 μl zawiesiny komórek (2000 komórek/basenik) do każdego dołka płytki 96-dołkowej (wstępnie pokrytej 0,5% roztworem agarozy-PBS, jak wskazano w 1.1).
  8. Pozostawić komórki do zbicia się w bryły podczas 3-dniowej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
  9. Regularnie sprawdzaj rozmiar i kształt sferoid za pomocą odwróconego mikroskopu.

2. Powłoka płyty HCS

UWAGA: Aby zapobiec przyczepianiu się sferoid JIMT-1-EGFP do szklanej powierzchni płyty, kluczowe jest pokrycie płytki o wysokiej zawartości (HCS) (inaczej analiza wysokiej zawartości nie byłaby możliwa).

  1. W 3 dniu po indukcji sferoid pokryć 96-dołkową płytkę przesiewową o wysokiej zawartości Pluronic-F127 (0,5% w DMSO, 50 μL/basenik) i inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odessać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć studzienki pożywką wolną od surowicy DMEM/F-12 (100 μl/studzienkę).

3. Przeniesienie sferoid na płytkę HCS

  1. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś sferoidy w trzech porcjach na 96-dołkową płytkę HCS ze szklanym dnem.

4. Wstępne traktowanie sferoid JIMT-1 EGFP związkami testowymi

  1. Dodać badany związek (np. sunitynib rozcieńczony w DMSO w stężeniu 40 μM) pipetując 10 μl/studzienkę i dodać 10 μl świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych (CTL).
  2. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze z użyciem CO2 w temperaturze 37 °C.

5. Indukcja ADCC poprzez dodanie komórek efektorowych

UWAGA: Komórki CD16.176V.NK92 (zwane dalej komórkami NK) hodowano w α-MEM z dodatkiem 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-pirogronianu, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 100 IU/ml IL-2.

  1. Zebrać komórki NK z kolby do probówki o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego (80 μl barwnika + 20 μl zawiesiny komórek) i dostosuj gęstość komórek do stosunku efektora do celu (E:T) 20:1 (40 000 komórek NK/dołek).
  2. Wybarwić komórki NK za pomocą 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL w 1 ml pożywki α-MEM NK) i umieścić je w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
  3. Odwirować komórki NK przy 150 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej dwukrotnie, aby zmyć nadmiar barwnika 1 ml pożywki α-MEM.
  4. Zawiesić osad komórek NK w 1 ml świeżej pożywki JIMT-1.
  5. Dodać barwione komórki NK wraz z przeciwciałem anty-HER2 (Ab) (trastuzumab, rozpuszczony w sterylnym destylowanymH2O) do docelowych sferoidów JIMT-1 przez pipetowanie 55 μl/studzienkę komórek NK barwionych CTB i 55 μl/studzienkę 10 μg/ml Ab w pożywce JIMT-1 (całkowita objętość leczenia dodanego do ADCC wynosi 110 μL/studzienkę, a końcowe stężenie sunitynibu wynosi 20 μM).
    UWAGA: Przy wyborze stężenia Ab i stosunku E:T opieraliśmy się na naszej poprzedniej publikacji17. Przeprowadzono wstępne eksperymenty z różnymi stosunkami E:T i stężeniami trastuzumabu, aby ocenić, który z nich jest najbardziej skuteczny w indukowaniu ADCC w sferoidach (rysunek uzupełniający S1).
  6. Dodać 110 μl/studzienkę świeżej pożywki JIMT-1 do studzienek kontrolnych (CTL).
  7. Inkubować płytkę przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ponieważ wiadomo, że komórki NK92 odgrywają niespecyficzne funkcje cytotoksyczne, do kontroli należy stosować komórki JIMT-1 inkubowane zarówno z samymi komórkami NK, jak i z kontrolną izotypem lub F(ab')2 Ab. W tym przypadku F(ab')2-trastuzumab (TR-F(ab')2) był używany jako ujemny CTL. Fragment TR-F(ab')2 przygotowano zgodnie z raportem Tóth et al.19 i dodano w tej samej objętości co trastuzumab wraz z komórkami NK, jak opisano w 5.5. Stężenie dostosowano do 6,6 μg/ml, co odpowiada stężeniu równomolowemu z Trastuzumab23.

6. Aneksyna V-647 barwienie sferoidów

  1. Aby zmierzyć apoptozę śmierci komórki, wybarwić sferoidy koniugatem Annexin V-Alexa Fluor 647 przez 1 godzinę w pożywce JIMT-1 (1:100), pipetując 50 μl / studzienkę.

7. Obrazowanie

UWAGA: Płyta jest obrazowana po 24 godzinach od dodania komórek efektorowych NK do komórek docelowych. Do obrazowania używany jest analizator wysokiej zawartości i oprogramowanie do analizy obrazu.

  1. Wybierz rodzaj mikropłytki z listy płytek za pomocą opcji Typ płytki. Użyj 96-dołkowej płytki przesiewowej o wysokiej zawartości (HCS).
  2. Wybierz autofokus z dwoma szczytami, ponieważ test jest przeprowadzany na płytkach z obiektywem 10x z aperturą numeryczną 0,3 (NA), korzystając odpowiednio z opcji autofokusa i obiektywu. Wybierz tryb konfokalny z opcją Opt. Mode i zastosuj Binning 2 za pomocą opcji Binning.
  3. W przypadku sferoid obrazowania wybierz odpowiednie kanały za pomocą opcji Wybór kanału. Do wykrywania komórek JIMT-1 transdukowanych przez EGFP należy wybrać EGFP (czas integracji 200 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 2,0 μm; np.: 488 nm em: 500-550 nm), a do wykrywania komórek apoptotycznych należy użyć Alexa 647 (czas integracji 100 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 10,0 μm; np.: 640 nm em: 650-760 nm). Aby zobrazować komórki NK w sferoidach, wybierz następujący kanał: DAPI (czas integracji 100 ms, moc lasera 50%, wysokość stosu 2,0 μm; np.: 405 nm em: 435-480 nm).
  4. W opcji Wybór układu wybierz stosy Z, ponieważ komórki w sferoidach zwykle znajdują się na różnych płaszczyznach ogniskowych mikroskopu. 10 płaszczyzn (o odległości 10 μm) wystarcza do pokrycia całego obszaru sferoidalnego. Ustaw wartości pierwszej i ostatniej płaszczyzny odpowiednio na 0 μm i 90 μm.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem pomiaru można wykonać przykładowe zdjęcia za pomocą funkcji migawki w celu sprawdzenia prawidłowych ustawień.
  5. Ustaw liczbę dołków i pól do obrazowania za pomocą opcji Zdefiniuj układ.

8. Analiza o wysokiej zawartości (HCA)

UWAGA: Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony lub eksportuj obrazy do analizy za pomocą preferowanego oprogramowania innej firmy. W celu analizy skuteczności ADCC mierzy się intensywność fluorescencji załącznika V 647. Komórki docelowe zabijane przez ADCC pojawiają się w obszarze peryferyjnym sferoid. Dlatego komórki dodatnie aneksyny V są mierzone w tym sferoidalnym "pierścieniu". W celu walidacji tej metody przeprowadzono analizy z różnymi parametrami, aby ocenić, która z nich jest najbardziej wiarygodna i daje najlepsze wyniki (rysunek uzupełniający S2). Na filmie pokazano studzienkę ADCC, aby krok po kroku zademonstrować proces analizy obrazu.

  1. Zidentyfikuj sferoidy na podstawie fluorescencji EGFP komórek JIMT-1 za pomocą opcji Znajdź regiony tekstury i odfiltruj je według rozmiaru (> 25 000 μm2).
  2. Usuń obiekty obramowania za pomocą opcji Wybierz populację.
  3. Ponieważ komórki dodatnie (apoptotyczne) aneksyny V pojawiają się na obrzeżach sferoid, zmierz intensywność aneksyny w tym apoptotycznym "pierścieniu", wybranym przez opcję Wybierz region (granica zewnętrzna -90%), aby określić śmierć komórki apoptotycznej.
  4. Wartości intensywności załącznika V należy wyrazić jako średnie natężenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wygenerowano komórki JIMT-1 wykazujące ekspresję EGFP, a następnie z tych komórek wyhodowano sferoidy. W качестве związku testowego zastosowano sunitynib, ponieważ wcześniej wykazano, że wpływa on na przebieg ADCC17. Sferoidom pozwolono na agregację przez 72 h. W 3. dniu do sferoidów dodano 10 µg/mL trastuzumabu (lub ekimolarną dawkę 6,6 µg/mL TR-F(ab')219) oraz komórki NK (20:1) w obecności lub przy braku 20 µM sunitynibu (wstępna inkubacja przez 1 h), na łączny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo znacznej poprawy w leczeniu BC w ciągu ostatnich kilku dekad, pacjenci nadal regularnie rozwijają oporność na leki lub doświadczają negatywnych skutków ubocznych24. Wysoka zachorowalność i śmiertelność związane z BC wymagają ciągłych badań nad mechanizmami molekularnymi leżącymi u ich podstaw, a także solidnych platform przesiewowych w celu identyfikacji nowych cząsteczek, które mogą być przydatne w rozwoju terapeutycznym25. Strategie te wymagają testów translacyjnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Podziękowania

LV otrzymało dofinansowanie z grantów Krajowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 i K147482. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z Węgierskiej Sieci Badawczej HUN-REN. Komórki CD16.176V.NK-92 uzyskano od dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Filadelfia, PA, w imieniu Brink Biologics, lnc. San Diego, Kalifornia), są chronione patentami na całym świecie i były licencjonowane przez Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Autorzy są wdzięczni Györgyowi Verebowi i Árpádowi Szöőrowi za pomoc w wykorzystaniu linii komórkowej NK-92 i TR-F(ab')2 oraz za porady techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe szklane dno Nośnik komórek Ultra mikropłytkiPerkinElmer, Waltham, MA, USALLC6055302 do pomiarów sferoid
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychTPP92096do wysiewu komórek
i pożywki alfa-MEMSigmaM8042w pożywce NK
AgarozaSigmaA9539do wysiewu sferoid
Aneksyna V-Alexa Fluo 647 koniugatInvitrogen-ThermoFisher ScientificA23204do pomiaru apoptozy za pomocą komórek HCS
CD16.176 V.NK-92Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA w imieniu Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)ATCC CRL-2407do hodowli komórkowych
Cell Tracker BlueInvitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)C2110do barwienia komórek NK
DMEM/ F-12 mediumSigmaD8437w podłożu JIMT1-EGFP
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418do powlekania płytki HCS przed przeniesieniem sferoid
Surowica bydlęca płodu (FBS)BiosurowicaFB-1090/500JIMT-1-EGFP i pożywka NK
GlutaminaGibco35,050– 061w medium NK
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USAdo analizy statystycznej
Oprogramowanie HarmonyPerkinElmer, Waltham, MA, USAdla HCA
IL-2Proleukin, Novartis Hungá ria Kft., Budapeszt, WęgryPHC0026w pożywce NK
Insulina (Humulin R)Eli LillyHI0219JIMT-1-EGFP podłoże
JIMT-1 komórkido hodowli komórkowej
MEM Aminokwasy endogenne (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050w pożywce NK
Na-pirogronianLonzaBE13-115Ew pożywce NK
Sprzęt do analizy wysokiej zawartości Opera PhenixPerkinElmer, Waltham, MA, USAHH14001000dla HCA
PBS (Posphate buforowana sól fizjologiczna)LonzaBE17-517Qdo płukania komórek
Penicylina-StreptomycynaBiosuraLM-A4118JIMT-1-EGFP i pożywka NK
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFPInvitrogen, (Prof. Jó zsef Tfigure-materials-1zsé r, Uniwersytet w Debreczynie)dla linii komórkowej JIMT-1-EGFP
Pluronic-F127SigmaP2443do powlekania płytki HCS przed przeniesieniem sferoid
Jabłczan sunitynibuSigmaAldrichPZ0012do leczenia
Trastuzumab Ab (humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-HER2)Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapeszt, WęgryNDC-63459-303-43do leczenia
Trastuzumab-F(ab')2Dar od prof. Gyö rgy Vereb i Á rp&aaostry; d Szö figure-materials-2r Wydział Biofizyki i Biologii Komórki, Uniwersytet w Debreczyniedo zabiegów
Błękit trypanowy 0,4% roztwórSigmaT8154do zliczania komórek
Trypsin-EDTA 1X w PBSBiosuraLM-T1706do odrywania komórek
raka piersi

Bibliografia

  1. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  2. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293(2017).
  3. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects. Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926(2022).
  4. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  5. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  6. Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. 3D culture systems for exploring cancer immunology. Cancers (Basel). 13 (1), 56(2020).
  7. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  8. Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Front Immunol. 11, 603640(2020).
  9. Li, Y., et al. Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more. Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315(2021).
  10. Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
  11. Sun, Y. S., et al. Risk factors and preventions of breast cancer. Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).
  12. Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan. BMC Cancer. 22 (1), 849(2022).
  13. Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. Breast cancer treatments: Updates and new challenges. J Pers Med. 11 (8), 808(2021).
  14. Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond. NPJ Breast Cancer. 6, 10(2020).
  15. Musolino, A., et al. Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy. J Immunother Cancer. 10 (1), e003171(2022).
  16. Petricevic, B., et al. Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients. J Transl Med. 11, 307(2013).
  17. Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).
  18. Barok, M., et al. Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor. Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).
  19. Toth, G., et al. The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).
  20. Ehlers, F. aI., et al. ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response. Cancers (Basel). 13 (13), 3232(2021).
  21. Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. 3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response. BMC Cancer. 16, 345(2016).
  22. Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro. Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).
  23. Selis, F., et al. Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen. Int J Mol Sci. 17 (4), 491(2016).
  24. Johnston, R. L., et al. High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations. Breast Cancer Res. 18 (1), 18(2016).
  25. Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning. J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).
  26. Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer. SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).
  27. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Cytotoksyczność zależna od przeciwciałtest komórek NKterapia trastuzumabemwysokoprzepustowy screening obrazowyapoptyczna śmierć komórekkokultura sferoidówscreening interakcji lekowychbarwienie aneksyną Vnowotwór HER2-dodatni
Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.