Artykuł metodologiczny

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

DOI:

10.3791/65938

⸱

29 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje niezawodny i skuteczny model in vitro bariery mózgowo-krwiennej. Metoda wykorzystuje mysie komórki śródbłonka naczyniowego mózgu bEnd.3 i mierzy transbłonowy opór elektryczny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczna struktura fizjologiczna złożona z komórek śródbłonka mikronaczyniowego, astrocytów i perycytów. Koordynując interakcję między ograniczonym transportem szkodliwych substancji, wchłanianiem składników odżywczych i usuwaniem metabolitów w mózgu, bariera krew-mózg jest niezbędna do utrzymania homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Budowanie modeli in vitro bariery krew-mózg jest cennym narzędziem do badania patofizjologii zaburzeń neurologicznych i tworzenia terapii farmakologicznych. W badaniu tym opisano procedurę tworzenia monowarstwowego modelu komórkowego BBB in vitro poprzez wysiewanie komórek bEnd.3 do górnej komory 24-dołkowej płytki. Aby ocenić integralność funkcji bariery komórkowej, konwencjonalny woltomierz komórek nabłonkowych użyto do rejestrowania transbłonowego oporu elektrycznego normalnych komórek i komórek niedotlenionych wywołanych przez CoCl2 w czasie rzeczywistym. Przewidujemy, że powyższe eksperymenty dostarczą skutecznych pomysłów na stworzenie modeli in vitro choroby krew-mózg oraz leków stosowanych w leczeniu zaburzeń chorób ośrodkowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB to unikalny biologiczny interfejs między krążeniem krwi a tkanką nerwową, która składa się z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, perycytów, astrocytów, neuronów i innych struktur komórkowych1. Przepływ jonów, substancji chemicznych i komórek między krwią a mózgiem jest ściśle regulowany przez tę barierę. Ta homeostaza chroni tkanki nerwowe przed toksynami i patogenami, a jednocześnie umożliwia prawidłowe działanie nerwów mózgu2,3. Utrzymanie integralności bariery krew-mózg może skutecznie zapobiegać rozwojowi i postępowi zaburzeń wpływających na ośrodkowy układ nerwowy, takich jak dysfunkcja neuronów, obrzęk i zapalenie nerwów4. Jednak unikalne właściwości fizjologiczne bariery krew-mózg zapobiegają przedostawaniu się ponad 98% leków małocząsteczkowych i 100% farmaceutyków wielkocząsteczkowych do ośrodkowego układu nerwowego5. W związku z tym zwiększenie przenikania leków przez barierę krew-mózg podczas opracowywania leków na ośrodkowy układ nerwowy jest niezbędne do osiągnięcia skuteczności terapeutycznej6,7. Mimo że symulacje komputerowe substratów znacznie zwiększyły prawdopodobieństwo przekroczenia bariery krew-mózg przez kandydatów na leki, nadal potrzebne są wiarygodne i niedrogie modele BBB in vitro/in vivo, aby sprostać potrzebom badań naukowych8.

Szybką i przystępną techniką wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków jest model in vitro9. Aby rzucić światło na podstawowe procesy wpływu leków na czynność bariery krew-mózg oraz ich rolę w rozwoju i progresji choroby, stworzono serię uproszczonych modeli BBB in vitro. Obecnie powszechnymi modelami BBB in vitro są modele jednowarstwowe, kokulturowe, dynamiczne i mikroprzepływowe10,11,12, zbudowane z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych i astrocytów, perycytów lub mikrogleju13,14. Chociaż hodowle komórkowe 3D są bardziej zgodne z fizjologiczną strukturą BBB15, ich zastosowanie jako metody badań przesiewowych leków w kierunku BBB jest nadal ograniczone przez ich skomplikowany projekt i słabą odtwarzalność. Natomiast monowarstwowy model in vitro jest najczęściej wykorzystywany do badań BBB i ma zastosowanie do określania ekspresji transporterów błonowych i białek połączeń ścisłych w poszczególnych komórkach.

Transmembranowy pomiar oporu elektrycznego (TEER) jest techniką oceny i monitorowania warstwy komórek w poprzek oporu oraz oceny integralności komórek i przepuszczalności bariery. Poprzez jednoczesne wprowadzenie dwóch elektrod do pożywki wzrostowej lub roztworu buforowego po obu stronach monowarstwy, możliwe jest zmierzenie prądu przemiennego lub impedancji elektrycznej przez zwartą warstwę ogniwa16,17. W celu określenia, czy model BBB in vitro został prawidłowo utworzony, pomiar TEER będzie zwykle stosowany jako złoty standard18. Z drugiej strony, trend działania leków na przepuszczalność BBB można dokładnie przewidzieć, mierząc zmianę oporu elektrycznego warstwy komórkowej po włączeniu leku19. Na przykład Feng i in. odkryli, że katalpol (główny aktywny monomer rehmanniae) może skutecznie odwrócić indukowaną lipopolisacharydem regulację w dół białek połączeń ścisłych w BBB i podnieść wartość TEER warstwy komórek śródbłonka mózgu myszy20.

Reakcja neurozapalna jest zazwyczaj główną przyczyną braku równowagi homeostazy BBB21. Leczenie niedotlenienia w celu wywołania uszkodzenia neurozapalnego jest główną metodą niszczenia bariery krew-mózg, obejmującą głównie metody fizyczne i metody odczynników chemicznych. Pierwszy z nich wykorzystuje przede wszystkim inkubator składający się z trzech gazów do zmiany zawartości tlenu w środowisku wzrostu komórek w celu symulacji warunków niedotlenienia22, podczas gdy drugi osiąga się poprzez sztuczne wprowadzenie odczynników deoksy, takich jak CoCl2, do pożywki do hodowli komórkowej23. Komórki pozostaną w stanie odtlenionym, jeśli Fe2+ zostanie podstawiony przez Co2+ w hemie. Jeśli Fe2 + zostanie podstawiony przez Co2 + w grupie katalitycznej, aktywność hydroksylazy proliny i hydroksylazy asparaginianowej zostanie zahamowana, co spowoduje akumulację czynnika indukowanego hipoksją-1α (HIF-1α) 24. W przypadku uporczywego niedotlenienia defosforylacja HIF-1α w cytoplazmie wyzwala śmierć komórki i aktywuje czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, co ostatecznie zwiększa przepuszczalność naczyń. W poprzednich badaniach25,26, wykazano, że niedotlenienie może znacznie zmniejszyć ekspresję białek ścisłego połączenia śródbłonka, aby zwiększyć przepuszczalność BBB. W tym badaniu zmierzono krzywą czasowo-oporności komórek bEnd.3 wysianych na 24-dołkowych płytkach w celu stworzenia prostego modelu BBB. Korzystając z tego modelu, scharakteryzowaliśmy zmiany w TEER komórek po interwencji CoCl2 w celu skonstruowania modelu komórkowego, który można wykorzystać do badań przesiewowych leków pod kątem ochrony BBB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Komórki śródbłonka pochodzące z mózgu myszy.3 (bEnd.3) zostały zaszczepione w komorach 24-dołkowej płytki, aby skonstruować prosty model BBB in vitro w określonych warunkach podłoża. TEER normalnych komórek i komórek niedotlenionych mierzono za pomocą miernika TEER (Rysunek 1 i Rysunek 2).

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych DMEM zawierającą FBS (10%, v/v), 100 j./ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotować 100 mM roztworu podstawowego CoCl2, dodając 1,30 mg CoCl2 do 100 μl roztworu DMSO.
    UWAGA: Wszystkie powyższe roztwory przechowywano w temperaturze 4 °C, a roztwór podstawowy rozcieńczano zgodnie z pożądanym stężeniem przed użyciem.
  3. Przygotować 5% roztwór podchlorynu sodu (v/v), dodając 2 ml roztworu podchlorynu sodu do 38 ml podwójnie destylowanej wody.

2. Hodowla komórkowa i żywotność komórek

  1. Zasiew: 1 ml komórek bEnd.3 w naczyniu hodowlanym (100 mm) zawierającym pożywkę DMEM o gęstości 1 x 106 komórek/ml i hodowla w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2 do 3 dni i subkulturuj komórki 2 razy w tygodniu.
  2. Po tym, jak komórki bEnd.3 osiągną 80% konfluencji, traw komórki z 0,25% trypsyny przez 30 sekund.
  3. Wykonać zawiesinę komórek bEnd.3 o gęstości 7 x 104 komórek/ml za pomocą pożywki DMEM przez licznik komórek. Następnie wysiewaj 100 μl zawiesiny komórek bEnd.3 na 96-dołkowej płytce.
  4. Po adhezji komórek oczyścić komórki PBS i wyhodować komórki za pomocą 100 μl pożywki hodowlanej lub pożywki zawierającej lek (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) przez 24 godziny w tych samych warunkach. Po wyjęciu pożywki z płytki studzienki i oczyszczeniu jej PBS, dodać 100 μl roztworu CCK-8.
    UWAGA: Nie generuj pęcherzyków w studni, które wpłyną na wartości gęstości optycznej (OD).
  5. Umieścić 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę. Zmierzyć absorbancję 96-dołkowych płytek przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Aby uniknąć różnic wewnątrzgrupowych, płytki studzienki zostały schłodzone do temperatury pokojowej przed wykryciem.
  6. Obliczyć żywotność komórek indukowaną różnymi stężeniami CoCl2 zgodnie ze wzorem [Lek OD- Ślepa próba OD] / [Kontrola OD-Ślepa próba OD] x 100%. Wybierz stężenie CoCl2 ze znaczącą różnicą w zmniejszeniu żywotności komórek w porównaniu z grupą kontrolną do następnego eksperymentu.

3. Montaż modelu

  1. Przepłukać górną komorę płytek 24-dołkowych roztworem PBS.
    UWAGA: Komórki rosły i łączyły się na dnie górnej komory 24-dołkowej płytki, a ciasne połączenia między komórkami stopniowo się tworzyły, aby odgrywać rolę bariery. Jeśli komórki śródbłonka użyte w niektórych badaniach nie są w stanie samodzielnie utworzyć pełnej bariery na błonach PET, przed inokulacją komórek wymagane jest pokrycie błon roztworem kolagenu dożylnie.
  2. Wymieszaj komórki bEnd.3 z podłożem DMEM, aby uzyskać zawiesinę o gęstości 5 x 105 komórek/ml za pomocą mieszalnika wirowego. Następnie wysiewaj 200 μl zawiesiny komórek bEnd.3 na membranie PET w górnej komorze 24-dołkowej płytki (0,33 cm2, wielkość porów membrany 0,4 μm).
    UWAGA: Badanie pilotażowe tego protokołu nie wykazało różnicy w wynikach przy użyciu od 5 do 10 pasaży komórek bEnd.3 do eksperymentów. Aby zapewnić prawdopodobieństwo pomyślnego modelowania, należy zapoznać się z interwałem liczby komórek w tym protokole.
  3. Dodać 1200 μl kompletnego podłoża do dolnej komory płytki, aby upewnić się, że ciśnienie osmotyczne górnej i dolnej komory ma tendencję do stabilizacji. Istnieją różnice w objętości dodawanego podłoża w zależności od rodzaju; Upewnij się, że poziom cieczy w górnej i dolnej komorze jest spłukiwany.
  4. Zmieniaj medium w górnej i dolnej komorze o stałej porze każdego dnia i jednocześnie monitoruj wartość rezystancji.
    1. Podczas zmiany pożywki integralność warstwy komórkowej zostanie uszkodzona przez sztuczny dotyk lub nadmierny ruch. Aby uniknąć powyższej sytuacji, powoli usuń stare medium z jednej strony za pomocą pipety podciśnieniowej i powoli dodaj nowe medium wzdłuż ścianki podczas wymiany płynu.

4. Pomiar TEER

  1. Przed rozpoczęciem pracy umieść rezystor, 5% roztwór podchlorynu sodu, 75% etanol i podwójnie destylowany roztwór wody w ultra czystym stole. Włącz naświetlanie promieniami UV na 30 minut, aby wyeliminować resztki bakterii i patogenów.
  2. Umieść elektrody w 5% roztworze podchlorynu sodu, powoli wstrząsając przez 3 s do 5 s, a następnie zanurz w 75% etanolu na 15 minut. Na koniec przenieś do PBS lub roztworu wody podwójnie destylowanej do momentu użycia.
  3. Włącz przełącznik z tyłu miernika rezystora komórkowego, kliknij Wybierz płytkę zgodnie z parametrami w tabeli 1 i wybierz płytkę 24-dołkową.
  4. W zależności od potrzeb operacji wybierz odpowiednią sekwencję wykrywania. W tym badaniu wybraliśmy procedurę A1.
  5. Włóż rezystor kΩ do prawej wtyczki, aby skalibrować przyrząd. Jeśli wynik kalibracji wynosi 1000 ± 5 Ω, należy uznać dokładność przyrządu za normalną.
    1. Jeśli wynik kalibracji nie wynosi 1000 Ω, kliknij Jednostki trybu w głównym interfejsie, aby wybrać OHMS, a następnie kliknij Kalibruj na ekranie głównym, aby ponownie skalibrować przyrząd.
  6. Wyciągnij rezystor kΩ po prawej stronie i zastąp elektrodę pomiarową przewodem połączeniowym.
  7. Umieść elektrodę na 24-dołkowej płytce bez wysiewu komórek pionowo i kliknij Blank Handling na głównym ekranie urządzenia. Wartość tła oporu płytki bez komórek zasiewanych wynosi około 134,4 Ω.
  8. Włóż dwie elektrody do górnej i dolnej komory płytki zasiewanej z komórkami tak, aby warstwa ogniw znajdowała się między nimi, a następnie zapisz wartość rezystancji, delikatnie naciskając pedał.
    1. Upewnij się, że elektroda nie dotyka ogniw w górnej komorze i na dole dolnej komory. Czas namaczania elektrody w roztworze nie ma wpływu na wartość rezystancji, a jedynie należy upewnić się, że elektroda znajduje się we właściwej pozycji.
  9. Wartości TEER (Ωcm2) obliczyć mnożąc wartości oporu elektrycznego (omy) przez dolną powierzchnię (cm2) górnej komory, jak w równaniu:
    TEER (Ωcm2) = Rezystancja (Ω) xwkładka S (cm2)
  10. Narysuj wykres liniowy czasu TEER (w dniach). Gdy wartość rezystancji nie wzrasta dalej w czasie (mierzona w dniach), należy wziąć pod uwagę, że ogniwo utworzyło barierę.
    NOTW: Jednowarstwowy model BBB komórek bEnd.3 zostanie z powodzeniem skonstruowany poprzez hodowlę komórek bEND.3 z parametrami w tym badaniu przez około 6 dni. TEER jednowarstwowego modelu komórkowego bEnd.3 wynosił od 16,49 ± 2,12 Ωcm2 do 27,59 ± 1,50 Ωcm2 w ciągu 6 dni (n=8, średnia ± SD).

5. Niszczenie barier i analiza statystyczna

  1. Zgodnie z krzywą TEER - czas należy wybrać studzienki z funkcją bariery i podzielić je na grupę kontrolną i grupę CoCl2 (n = 4).
  2. Dodać pożywkę hodowlaną i pożywkę zawierającą 300 μM CoCl2 (200 μL) odpowiednio do grupy kontrolnej i górnej komory grupy CoCl2.
  3. Wykryć wartości oporności grupy kontrolnej i grupy CoCl2 po 12 godzinach i 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, stosując procedurę opisaną w kroku 4.
  4. Użyj komercyjnego oprogramowania, aby zmapować trend wartości TEER bariery komórek hodowanych z lub bez 300 μM CoCl2
    5. .
  5. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeanalizować różnicę w wartościach oporności między komórkami traktowanymi CoCl2 a normalnymi komórkami (n = 4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pozwalał na rejestrowanie zmian wartości rezystancji komórek zgodnie z parametrami ustawionymi w mierniku rezystora transśródbłonkowego. Żywotność komórek bEnd.3 (liczba żywych komórek) traktowanych różnymi stężeniami CoCl2 przeprowadzono badanie przesiewowe za pomocą testu CCK-8. Większe uszkodzenia komórek wytwarzane przez CoCl2 były reprezentowane przez niższą żywotność komórek. Stwierdziliśmy, że 300 μM CoCl2 było znacząco cytotoksyczne in vitro i to stężenie zos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg, jeden z najbardziej rozwiniętych narządów ciała, kontroluje szeroki zakres skomplikowanych procesów fizjologicznych, w tym pamięć, funkcje poznawcze, słuch, węchi ruch. Mózg jest jednocześnie jednym z najbardziej skomplikowanych i chorych narządów ludzkiego ciała. Występowanie wielu zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego wykazuje tendencję wzrostową z roku na rok ze względu na takie czynniki, jak zanieczyszczenie powietrza, nieregularne wzorce żywieniowe i inne czynniki 27,28,29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82274207 i 82104533), Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Ningxia (2023BEG02012) oraz Projektu Promocji Badań Xinglin Scholar Uniwersytetu TCM w Chengdu (XKTD2022013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka transwellCorning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µ m)10522023
75 % etanoluChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd2023052901
96-dołkowa płytkaGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd220412-078-B
bEnd.3 komórkiHunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0049
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)Boster Biological Technology Co., LtdBG0025
Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Chlorek kobaltu (CoCl2)Sigma15862
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
(1x)Gibco ThermoFisher Scientific8121587
Surowica bydlęcapłodu Oprogramowanie Gibco ThermoFisher Scientific2166090RP
GraphPad PrismOprogramowanie GraphPad9.0.0(121)
Matrigel (zawiera kolagen IV)MedChemexpressHY-K6002
Czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpectraMax iD5
Oprogramowanie OriginPro 8OriginLab Corporationv8.0724(B724)
Penicylina-Streptomycyna (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1x)Gibco ThermoFisher Scientific8120485
Podchloryn soduChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd2022091501
Miernik rezystancji transbłonowejWorld Precision Instruments LLCVOM3 (wersja 1.6)
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412(2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062(2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892(2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110(2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19(2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734(2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355(2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660(2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015(2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240(2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455(2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992(2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462(2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera krew m zgkom rki bEnd 3funkcja barierowamodel BBB in vitrobia ko po cze cis ychhipoksja indukowana chlorkiem kobaltutest ywotno ci kom rekp ytka 24 do kowawoltomierz epitelialny

Powiązane artykuły