Method Article

Pomiar zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu za pomocą dwóch bioczujników opartych na impedancji w odpowiedzi na komórki nowotworowe i cytokiny

DOI:

10.3791/65959

⸱

September 22nd, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy technikę korzystania z biosensorów opartych na impedancji: ECIS i cellZscope, do pomiaru siły bariery śródbłonka mózgu. Szczegółowo opisujemy przygotowanie i technikę dodawania różnych bodźców do modelu śródbłonka mózgu in vitro. Mierzymy, rejestrujemy i przedstawiamy reprezentatywną analizę wyników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg (BBB) chroni miąższ mózgu przed szkodliwymi patogenami we krwi. Bariera krew-mózg składa się z jednostki nerwowo-naczyniowej, składającej się z perycytów, wyrostków stopy astrocytarnej i ściśle przylegających komórek śródbłonka. W tym przypadku komórki śródbłonka mózgu tworzą pierwszą linię bariery przed patogenami przenoszonymi przez krew. W stanach takich jak rak i zapalenie nerwów czynniki krążące we krwi mogą zakłócić tę barierę. Postęp choroby znacznie się pogarsza po przerwaniu bariery, co umożliwia dostęp do obszarów mózgu lub ich upośledzenie. To znacznie pogarsza rokowania, szczególnie ze względu na ograniczone możliwości leczenia dostępne na poziomie mózgu. W związku z tym pojawiające się badania mają na celu zbadanie potencjalnych środków terapeutycznych, które mogą zapobiec interakcji tych szkodliwych czynników we krwi z komórkami śródbłonka mózgu.

Dostępne na rynku instrumenty ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) oraz cellZscope mierzą impedancję monowarstw komórkowych, takich jak śródbłonek BBB, aby określić ich siłę bariery. W tym miejscu szczegółowo opisujemy zastosowanie obu biosensorów w ocenie integralności bariery śródbłonka mózgu po dodaniu różnych bodźców. Co najważniejsze, podkreślamy znaczenie ich wysokiej przepustowości dla jednoczesnego badania wielu zmiennych i leczenia biologicznego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł omawia aktualne trendy w ocenie komórek mikronaczyniowych. W szczególności szczegółowo opisujemy wykorzystanie dwóch dostępnych na rynku platform do pomiaru właściwości barierowych komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Komórki śródbłonka to komórki skierowane do krwi, które wyściełają ścianę naczynia. Jednak mikronaczynia mózgowe są wyjątkowe, ponieważ pomagają tworzyć ochronną barierę krew-mózg (BBB)1,2,3. Bariera krew-mózg reguluje transport cząsteczek z krwi do mózgu. Choroby obwodowe, które wpływają na ośrodkowy układ nerwowy (OUN), są często związane z niewydolnością funkcjonalną BBB4,5. Struktury anatomiczne, które tworzą barierę krew-krew, nie są obecne na granicy krwi i tkanki w innym miejscu ciała6. Te struktury anatomiczne obejmują perycyty, które znajdują się w pobliżu komórek śródbłonka mózgu i regulują ich proliferację i przepuszczalność; procesy stopy astrocytowej, które biorą udział w tasowaniu składników odżywczych i wsparciu anatomicznym7,8; Mikroglej, który jest makrofagami rezydującymi w mózgu, często bierze udział w zapaleniu nerwów i niedokrwieniu9,10,11,12, oraz śródbłonek mózgu, który tworzy monowarstwę ściśle przylegających komórek bez okien13,14. Śródbłonek mózgu jest zwykle znany jako "bariera śródbłonka mózgu" i tworzy barierę strukturalną i funkcjonalną na pięć różnych sposobów. Po pierwsze, składnik bariery parakomórkowej powstaje w wyniku adhezji na bocznych połączeniach komórka-komórka. Po drugie, składnik bariery transkomórkowej jest podtrzymywany przez regulację endocytozy. Po trzecie, wyspecjalizowana błona podstawna zakotwicza i wspiera śródbłonek poprzez bogatą macierz zewnątrzkomórkową składającą się głównie z kolagenu15,16. Dwa ostatnie mechanizmy są oparte na enzymach i transporterach, które pomagają regulować metabolizm leków i wychwyt dużych cząsteczek, odpowiednio17.

Interakcje parakomórkowe stanowią główny składnik bariery śródbłonka mózgu, ułatwiany przez połączenia ścisłe (TJ), składające się z białek błonowych klaudyn, okludyny i cząsteczek adhezyjnych (JAMs)18. Silne homotypowe wiązanie białek błonowych tworzy pierwszą barierę strukturalną, chociaż JAM łączą się również z białkami pomocniczymi zonula occludens, łącząc w ten sposób TJ z cytoszkieletem aktyny19,20. Połączenia aktynowe umieszczają TJ w obszarze wierzchołkowym śródbłonka21, który funkcjonalnie polaryzuje komórki śródbłonka, tworząc barierę strukturalną po tej wierzchołkowej lub "skierowanej do krwi" stronie. W obszarze podstawno-bocznym śródbłonka wysoce wyspecjalizowane połączenia adherens (AJ) odgrywają rolę regulacyjną w utrzymaniu morfologii komórki. AJ zawierają zależne od wapnia kadheryny, które łączą cytoszkielet sąsiednich komórek śródbłonka poprzez kompleks rodziny katenin20,22. Kadheryna śródbłonka naczyniowego (VE-Cadherin) jest jedną z takich kadheryny, która reguluje ekspresję białek TJ i ogólną funkcję bariery śródbłonkowej w celu utrzymania integralności monowarstwy śródbłonka23,24,25,26,27. Modulatory stanu zapalnego, takie jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), sygnalizują internalizację VE-kadheryny z dala od połączeń komórkowych, prowadząc do destabilizacji bariery śródbłonkowej28,29,30. Cząsteczka adhezji komórek śródbłonka płytek krwi (PECAM)31 to kolejna kadheryna AJ, która stabilizuje i przebudowuje połączenia śródbłonka32,33. Gęstość tych białek połączeniowych ogranicza przepływ elektronów przez przestrzeń parakomórkową między komórkami śródbłonka. Ten atrybut jest wykorzystywany do pomiaru siły bariery śródbłonka lub przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TER) w monowarstwach zlewających się komórek, takich jak śródbłonek mózgu.

Badania terapeutyczne koncentrują się na śródbłonku mózgu ze względu na jego istotną rolę na styku krew-mózg. Kilka chorób negatywnie wpływa na śródbłonek mózgu, w tym stany neurozapalne, takie jak stwardnienie rozsiane, udar, choroby neurodegeneracyjne i rak34,35,36,37. Gdy bariera śródbłonka mózgu zostanie przerwana, postęp choroby znacznie się pogarsza, ponieważ mózg jest skutecznie narażony na szkodliwe bodźce we krwi38. Wcześniej wykazaliśmy, że mediatory stanu zapalnego i komórki czerniaka z przerzutami zaburzają barierę śródbłonka mózgu za pomocą dwóch technologii, które mierzą siłę bariery śródbłonkowej39,40,41.

Wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego (ECIS) to biosensor oparty na impedancji, który pozwala na ocenę integralności bariery komórkowej śródbłonka w czasie rzeczywistym i bez znaczników. W tym przypadku studnie testowe są wyłożone pozłacanymi elektrodami, które wprowadzają prąd przemienny (AC) do systemu testowego. Komórki śródbłonka mózgu są umieszczane w tych studzienkach, co oznacza, że prąd przemienny może być podawany przez komórki. (Rysunek 1A-studnia; widok z boku). W ten sposób ustala się obwód elektryczny, który jest używany do obliczania impedancji (Rysunek 1A - schemat obwodu). Impedancja wzrasta, gdy komórki śródbłonka mózgu przylegają do płytki i zaczynają tworzyć swoje połączenia parakomórkowe. Impedancja stabilizuje się, gdy komórki śródbłonka zlewają się, tworząc monowarstwę i ograniczając przepływ prądu. Zastosowanie prądu przemiennego o różnych częstotliwościach wpływa na przebieg przepływu prądu przez komórki śródbłonka. Prąd przepływa przez korpus komórki śródbłonka, gdy jest podawany z wyższą częstotliwością (>104 Hz). Dostarcza to informacji na temat pojemności monowarstwy komórki, używanej do oceny przyłączania i rozprzestrzeniania się komórek. Przy niskich częstotliwościach (102-10 4 Hz) impedancja membrany jest wysoka, co ogranicza przepływ prądu przez ogniwa. W takim przypadku większość prądu przepływa między komórkami. Przy około 4 000 Hz opór przepływu prądu przypisuje się głównie połączeniom komórka-komórka śródbłonka, przez przestrzeń międzykomórkową. Dlatego każda zmiana oporności przy tej częstotliwości dostarcza informacji na temat integralności bariery śródbłonka.

Podczas gdy surowe pomiary impedancji mogą dostarczyć informacji o właściwościach bariery, oprogramowanie ECIS może następnie matematycznie modelować całkowitą rezystancję mierzoną na wielu częstotliwościach AC, a dokładniej, rozdzielić ją na dwa kluczowe parametry integralności bariery. Parametry te to opór parakomórkowy między błonami bocznymi sąsiednich komórek (oporność beta-Rb; bariera parakomórkowa; Rysunek 1A-zielone strzałki), oraz opór podstawno-boczny między warstwą komórki podstawowej a elektrodą (opór alfa-Alfa; bariera podstawno-boczna; Rysunek 1A-niebieskie strzałki). Trzeci modelowany parametr jest również mierzony jako pojemność błony komórkowej (Cm; Rysunek 1A-czerwone strzałki). CM wyświetla pojemnościowy przepływ prądu przez komórki, co wskazuje na skład błony komórkowej. W tym przypadku zmiany w Rb lub barierze parakomórkowej wskazują na zmiany w TJ i AJ, kluczowe dla utrzymania integralności bariery śródbłonkowej. Aby wiarygodnie zinterpretować Rb, przyjmuje się cztery kluczowe założenia, które zostały opracowane przez Giaevera i Keese42 i krytycznie omówione przez Stolwijk et al.43. Chociaż założenia te są ważne dla zapewnienia poprawności modelowania ECIS, są one łatwo spełnione przez zlewającą się monowarstwę śródbłonka.

Podobnie jak ECIS, cellZscope pozwala na pomiar zmian w odporności bariery śródbłonkowej; jednak komórki są hodowane na porowatej wkładce membranowej. W tym systemie obwód elektryczny znajduje się między dwiema elektrodami po obu stronach wkładu membranowego. Monowarstwa śródbłonka jest hodowana na wierzchu tej wkładki membranowej, co pozwala na pomiar przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TER) (Rysunek 1B-studnia; widok z boku). Podobnie jak w przypadku ECIS, w tym systemie całkowitą impedancję można przypisać kilku składowym bariery, w zależności od częstotliwości przyłożonego prądu44. Przy niskich częstotliwościach pojemność elektrody (CEl) dominuje nad całkowitą impedancją systemu. Alternatywnie, przy wysokich częstotliwościach, rezystancja medium (ośrodek R) dominuje nad impedancją całkowitą. W związku z tym najbardziej użyteczne pomiary mieszczą się w zakresie średnich częstotliwości (102-10 4 Hz), który dostarcza informacji na temat dwóch kluczowych elementów bariery śródbłonkowej (Rysunek 1B-schemat obwodu). Po pierwsze, przy 103-10 4 Hz pojemność warstwy ogniwa (CCl) dominuje nad całkowitą impedancją, ponieważ rezystancja membrany (membrana R) jest na tyle wysoka, że można ją pominąć, a prąd przepływa głównie przez kondensator. W związku z tym CCl wskazuje na zmiany oporności przez błonę komórkową. Alternatywnie, TER głównie nadaje całkowitą impedancję przy 102-10 3 Hz, gdzie przepływ prądu jest kierowany przez przestrzenie połączeniowe między sąsiednimi komórkami, utrzymywanymi razem przez białka złączowe. W związku z tym dostarcza to informacji na temat parakomórkowego komponentu bariery śródbłonkowej, jak zaobserwowano wcześniej w przypadku Rb w ECIS.

Rysunek 1C szczegółowo opisuje, w jaki sposób określone obszary śródbłonka mózgu są zakłócane przez leczenie komórkami czerniaka. Zakłócenie to jest wykrywane przez biosensory poprzez zmianę przepływu prądu przez przestrzeń parakomórkową (mierzoną jako Rb lub TER); przestrzeń podstawno-boczna (mierzona jako alfa); i błona komórkowa (mierzona jako Cm lub CCl). Użyliśmy obu biosensorów opisanych w tym wprowadzeniu, aby zmierzyć zmianę bariery śródbłonka mózgu po leczeniu różnymi bodźcami, takimi jak cytokiny lub inwazyjne komórki czerniaka. Zmierzona rezystancja zmniejsza się, jeśli dany bodziec narusza barierę śródbłonka, tworząc ścieżkę o najmniejszym oporze, aby umożliwić przepływ prądu. W związku z tym spadek "odporności na barierę" sugeruje utratę integralności bariery lub przerwanie bariery śródbłonka mózgu. W tych testach badaliśmy to zakłócenie, interpretując oporność i modelowane parametry w czasie rzeczywistym. Zastosowanie ECIS i cellZscope w rozwiązywaniu takich pytań badawczych jest szczegółowo opisane w innym miejscu39,41,45,46.

Badania in vitro pozwalają odkryć kluczowe mechanizmy chorobowe poprzez odkrycie molekuł i szlaków funkcjonalnych, które rozwijają chorobę. Wymaga to jednak wiarygodnej replikacji choroby in vitro, która znacznie różni się od funkcjonującego organizmu. W idealnym scenariuszu badania in vitro powinny być powtarzalne, nieinwazyjne, wolne od znaczników, ilościowe i naśladować wpływy strukturalne występujące in vivo. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodologię wykorzystania tych dwóch rywalizujących ze sobą technologii do pomiaru wywołanych leczeniem zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu. Omawiamy korzyści płynące z połączenia ich wyników w celu uzyskania bardziej kompleksowego obrazu przełamywania barier i dzielenia się ograniczeniami, które nadal należy pokonać.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Korzystanie z ECIS do monitorowania zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu w odpowiedzi na różne terapie

  1. Konfiguracja oprogramowania, stacji macierzowej i urządzenia
    1. Podłącz 96-dołkową stację macierzową do maszyny. Umieść stację matrycową w plastikowej torbie i umieść ją w inkubatorze co najmniej 1 godzinę przed testem, aby umożliwić jej rozgrzanie. Wyjmij plastikową torbę bezpośrednio przed eksperymentem.
    2. Gdy wszystko będzie gotowe, włącz urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie na komputerze. Naciśnij przycisk Setup (Konfiguracja) na karcie Collect Data (Zbieranie danych). Oprogramowanie zakończy test połączenia, który wykryje typ podłączonego adaptera (np. 96-dołkowa stacja macierzowa) i wyświetli czerwone studzienki na przedstawionej mapie płyt. Oznacza to, że oprogramowanie wykrywa adapter, ale nie może wykryć dołączonej płytki. System jest teraz gotowy do pracy na płytce 96-dołkowej.
  2. Przygotowanie 96-dołkowej płytki biosensora
    UWAGA: Stosowany jest układ płytek 96-dołkowych. Podstawa każdej studzienki jest ozdobiona palcami łączącymi się z pozłacanych elektrod. Płytki są dostarczane w sterylnych opakowaniach, które należy otwierać wyłącznie w sterylnym kapturze/komorze bezpieczeństwa biologicznego. Złote elektrody muszą być najpierw stabilizowane chemicznie przez dodanie 10 mM cysteiny w celu utrzymania pojemności elektrody.
    1. Przygotuj 10 mM cysteiny w sterylnym korycie i za pomocą wielokanałowego ostrożnie odpipetuj 100 μl do każdej studzienki. Inkubować cysteinę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie aspirować, pipetując tylko krawędzie studzienki, aby uniknąć zarysowania elektrody. Zmyj cysteinę co najmniej 2x sterylną wodą dejonizowaną (nie PBS) przy użyciu tej samej techniki pipetowania.
      UWAGA: Elektrody płytkowe mogą być również stabilizowane elektrycznie za pomocą ciepłych mediów na aparacie ECIS, zamiast stosowania powłoki cysteinowej, jak opisano w protokole producenta.
    2. Przygotować podłoże ECM, aby działało jak membrana podstawna na dnie studni.
      UWAGA: Substraty ECM, takie jak kolagen lub laminina, można wybrać w zależności od wymagań linii komórkowej śródbłonka mózgu. Tutaj używamy kolagenu do ludzkiej linii komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (hCMVEC).
    3. Przygotuj 1 μg/cm2 kolagen ze szczurzego ogona, rozpuszczony w 0,02 M kwasie octowym w świeżym, sterylnym korycie (100 μl na studzienkę). Pozostaw kolagen na 1 godzinę przy słabym świetle w sterylnym kapturze, a następnie dokładnie umyj 2x wodą dejonizowaną i ostrożnie pipetując.
      UWAGA: Upewnij się, że po ostatnim praniu usunięto jak najwięcej wody dejonizowanej tak ostrożnie, jak to możliwe i pozostaw płytkę do wyschnięcia w okapie. Zaleca się użycie płytki wkrótce po nałożeniu powłoki; można go jednak tymczasowo przechowywać w wodzie o temperaturze 4 °C (poniżej tygodnia). Płyta jest teraz gotowa do użycia.
  3. Przygotowanie komórek śródbłonka mózgu do wysiewu na 96-dołkową płytkę biosensora
    UWAGA: Zaleca się, aby najpierw zoptymalizować fazę wzrostu i gęstość wysiewu używanej linii komórek śródbłonka. W tym protokole wykorzystano linię hCMVEC, która potrzebuje 48 godzin, aby osiągnąć konfluencję po wysianiu 20 000 komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce.
    1. Zbierz komórki śródbłonka mózgu w sterylnym kapturze za pomocą delikatnego odczynnika dysocjacyjnego i przeprowadź dokładne zliczanie komórek. Stosować 20 000 hCMVEC w 100 μl pożywki na studzienkę, aby uzyskać stałą fazę wzrostu przez 48 godzin. Przygotuj nadmiar komórek śródbłonka mózgu, aby zapewnić optymalne pipetowanie wszystkich 96 dołków.
      UWAGA: Dlatego do płytki 96-dołkowej potrzeba około 2 000 000 komórek w 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża.
    2. Przenieś komórki śródbłonka mózgu do świeżego sterylnego koryta i za pomocą wielokanałowej pipety ostrożnie dodaj 100 μl (20 000 komórek) zawiesiny komórek do dołka. Regularnie delikatnie zawieszaj komórki w korycie, aby uniknąć osiadania komórek śródbłonka z czasem. Upewnij się, że 1 studzienka zawiera tylko pożywkę i nie ma komórek, aby umożliwić modelowanie matematyczne (studnia bez komórek) i że cała płytka zostanie wysiana w ciągu 30 sekund.
  4. Rozpoczęcie eksperymentu
    1. Ostrożnie przymocuj płytkę do adaptera w inkubatorze, przesuwając czerwone zaciski po obu stronach adaptera płytki na zewnątrz. Dopasuj wgłębienie A1 płytki do obszaru A1 adaptera. Delikatnie przytrzymaj płytkę na miejscu jedną ręką na górze, a drugą ręką zatrzaśnij czerwone klipsy z powrotem na miejscu.
      UWAGA: Upewnij się, że płyta jest stabilnie osadzona w adapterze.
    2. Zamknij inkubator i ponownie naciśnij przycisk Setup. Poszukaj zielonych studni na mapie płytowej wskazujących prawidłowo wykryte studnie. Wszystkie studzienki wyświetlane na czerwono mają błąd połączenia. Aby to naprawić, szybko ponownie zamocuj płytkę,
      UWAGA: Nadmierny czas spędzony na próbach naprawy studni ze słabymi połączeniami może zagrozić zdrowiu komórek.
    3. Naciśnij Sprawdź, aby ponownie sprawdzić załączniki jako odczyty impedancji bezwzględnej. Zajmie to kilka minut.
    4. Naciśnij strzałkę pod mapą tablic, aby upewnić się, że wybrano prawidłowy katalog tablic. W tym przypadku jest to 96w20idf.
    5. Naciśnij przycisk wieloczęstotliwościowy, aby upewnić się, że impedancja jest mierzona przy wielu częstotliwościach prądu przemiennego, aby umożliwić przyszłe modelowanie matematyczne.
    6. Naciśnij Start, aby rozpocząć eksperyment. Pozwól komórkom rozmnażać się przez ~ 48 godzin i uformować typową monowarstwę o wysokiej rezystancji, mierzonej wzrostem omów.
  5. Leczenie komórek śródbłonka mózgu komórkami rakowymi lub cytokinami na 96-dołkowej płytce
    UWAGA: Ponieważ 96-dołkowa płytka umożliwia jednoczesne testowanie wielu bodźców, przygotuj przejrzystą mapę płytki z pożądanymi opcjami leczenia (rysunek uzupełniający S1 - dół). Każdy zabieg może i musi być przeprowadzony co najmniej w trzech (trzech powtórzonych studzienkach) w celu umożliwienia analiz statystycznych; jednak cztery powtórzenia przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1.
    1. Po 48 godzinach sprawdź wzrost komórek śródbłonka mózgu. Upewnij się, że osiągnięto plateau przed przygotowaniem roztworów do zabiegów.
      UWAGA: Różne linie komórkowe śródbłonka mogą potrzebować różnej długości czasu, aby osiągnąć plateau. W związku z tym ich faza wzrostu i gęstość siewu muszą być zoptymalizowane przed przeprowadzeniem tego eksperymentu. Studnie powinny zazwyczaj ustabilizować się w ciągu tej samej godziny. W przeciwnym razie mogą one zostać naruszone lub niedokładnie odpipetowane i nie wolno ich dołączać.
    2. Do leczenia cytokinami należy przygotować odpowiednie stężenia cytokin we wstępnie podgrzanych kompletnych pożywkach wraz z ich odpowiednimi nośnikami i kontrolami pożywki.
      1. Przygotuj cytokiny w stężeniu 2x wyższym niż końcowe pożądane stężenie, ponieważ zostaną one rozcieńczone w stosunku 1:1 po dodaniu do każdej studzienki zawierającej komórki śródbłonka mózgu.
      2. Aby umożliwić przeprowadzenie każdego zabiegu w trzech egzemplarzach, należy przygotować wszystkie cytokiny o całkowitej objętości ponad 300 μl (tj. co najmniej 350 μl ogółem) do dodania 100 μl na dołek.
    3. W przypadku leczenia komórkami należy pobrać komórki (trzy różne linie komórkowe czerniaka pochodzące od pacjenta użyte w tym protokole) za pomocą delikatnego odczynnika dysocjacyjnego i przeprowadzić dokładne zliczanie komórek. Wykonuj zabiegi komórkowe w najwyższych proporcjach efektor:cel (stosunek E:T) wynoszącym 1:1, gdzie komórki poddawane działaniu są komórkami efektorowymi (np. komórkami czerniaka), a komórki śródbłonka mózgu są komórkami docelowymi, tj. dodaj 20 000 komórek czerniaka do 20 000 komórek śródbłonka mózgu na studzienkę.
      1. W razie potrzeby rozcieńczać seryjnie w celu uzyskania mniejszych proporcji E:T 1:10 lub 1:100. Aby umożliwić poddanie działaniu substancji w trzech studzienkach, należy policzyć komórki i przygotować je w ponad 300 μl całkowitej objętości (tj. co najmniej 350 μl ogółem) w celu dodania 100 μl na studzienkę.
    4. Oznaczyć probówki zbiorcze z polipropylenu o pojemności 1,1 ml, które są dostępne w formacie 8-probówek paskowych (tj. probówek paskowych o pojemności 1 ml), zgodnie z mapą płytek 96-dołkowych (rysunek uzupełniający S1-Góra). Włóż probówki paskowe do płytek z rurkami paskowymi i autoklawuj je przed eksperymentem. Dodać całkowitą objętość badanych cytokin lub komórek (tj. pełne 350 μl roztworu) do sterylnych probówek z paskami i pozostawić je w inkubatorze, aby się ogrzały.
    5. W oprogramowaniu naciśnij przycisk Pauza, aby wstrzymać eksperyment. Może to potrwać kilka sekund. Po zatrzymaniu otwórz inkubator i ostrożnie odepnij oba czerwone klipsy jedną ręką, jednocześnie stabilizując płytkę drugą ręką. Pozostaw eksperyment w przerwie i przynieś płytkę do sterylnego kaptura.
    6. Wyjąć probówki z paskami zabiegowymi z inkubatora. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie ponownie zawiesić zawartość probówek z paskami do zabiegu, a następnie dodać 100 μl roztworu z probówek do odpowiednich dołków na płytce 96-dołkowej, nie dotykając dna studzienki. Ostrożnie dodaj leczenie do wszystkich studzienek i pożywek tylko do studzienki bezkomórkowej i wykonaj ten krok w mniej niż 5 minut, aby uzyskać pełną 96-dołkową płytkę, ponieważ nadmierne chłodzenie wpłynie na opór monowarstwy śródbłonka.
    7. Zwróć obrobioną płytkę do urządzenia, zamocuj ją tak, jak poprzednio, a następnie ponownie sprawdź połączenia elektrod z adapterem, naciskając Setup | Jest.
    8. Upewnij się, że wybrano prawidłowy katalog płyt i ustawienia akwizycji wieloczęstotliwościowej, a następnie naciśnij przycisk Wznów, aby wznowić eksperyment. Poczekaj, aż eksperyment będzie postępował i uruchom go do żądanego punktu końcowego.
    9. Naciśnij przycisk Zakończ, aby zakończyć eksperyment, który automatycznie zapisze nagrany plik abp. Przejdź do punktu menu Plik | Eksportuj dane, aby pobrać ten plik jako xls. lub plik CSV. plik do dalszych analiz.

2. Używanie cellZscope do monitorowania zmian w integralności bariery śródbłonka mózgu w odpowiedzi na różne terapie

  1. Przygotowanie metalowych elementów aparatu, adaptera i porowatej wkładki membranowej
    1. Wyczyść metalowe elementy sekwencyjnie wodą dejonizowaną, następnie 70% etanolem, a następnie ponownie wodą dejonizowaną.
    2. Elektrodę dolną lub "garnki" należy sterylizować w autoklawie i elektrody zanurzeniowe od góry, a wszystkie inne elementy modułu ogniwa wysterylizować 70% etanolem.
    3. W sterylnym kapturze zainstaluj wszystkie 24 dolne elektrody/"garnki", wkręcając je w moduł ogniwa, zwracając uwagę na utrzymanie sterylności przez cały czas.
    4. Dodać 900 μl pożywki bazowej do studzienek.
      UWAGA: Pożywkę bazową dodaje się do dolnej studzienki, która działa jak podstawowy przedział śródbłonka. Zaleca się, aby nie stosować surowicy w tym przedziale, aby bardziej niezawodnie odtworzyć podstawowe środowisko śródbłonka mózgu.
    5. Podłącz elektrody zanurzające magnetycznie do pokrywy modułu ogniwa i zamknij pokrywę nad studzienkami, tak aby elektrody zanurzające wsuwały się w dolne garnki elektrod.
    6. Podłącz moduł komórkowy do adaptera w inkubatorze i pozostaw go na co najmniej 1 godzinę w celu zrównoważenia. Na tym etapie otwórz oprogramowanie, aby załadować eksperymentalną mapę płyt w zakładce Układ, osadzając w ten sposób mapę płyt zabiegowych w plikach, które ostatecznie będą zawierać dane.
    7. Tam, gdzie wymagane jest powlekanie, pokryj wkładki membranowe sterylnym kapturem, używając sterylnej 24-dołkowej płytki hodowlanej do przytrzymania wkładek i dodając substrat ECM (np. kolagen) do wewnętrznej części studzienki, jak opisano w sekcji 1.2.3 Użyj pipety jednokanałowej, aby ostrożnie załadować substrat ECM do każdej studzienki.
  2. Przygotowanie komórek śródbłonka mózgu do wysiewu na wkładkę membranową i rozpoczęcie eksperymentu
    1. Pobrać i policzyć komórki śródbłonka mózgu zgodnie z sekcją 1.3, ale ostateczne wymagane miareczkowanie komórek należy przygotować w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Upewnij się, że zebrane komórki znajdują się w ciepłym, kompletnym pożywce, zawierającej wszystkie wymagane czynniki wzrostu i surowicę.
    2. Za pomocą pipety jednokanałowej ostrożnie umieść komórki śródbłonka mózgu (80 000 w tym protokole) do komory wierzchołkowej wkładu studzienkowego w 350 μl kompletnego podłoża.
    3. Dołącz studzienkę wolną od komórek, pipetując całe media tylko do jednej z wkładek.
    4. Wyjmij moduł komórkowy z inkubatora i umieść go w sterylnym kapturze. Przenieś przygotowane wkładki do dolnych garnków elektrod za pomocą pęsety, aby obsługiwać tylko górne wsporniki wkładki. Unikaj tworzenia się pęcherzyków pod membraną.
    5. Umieść moduł ogniw z powrotem w inkubatorze nad adapterem.
    6. W oprogramowaniu, na karcie eksperymentu, w sekcji Widmo, wybierz Start od 1 Hz i Zatrzymaj się przy 100 kHz, aby uzyskać dane w całym zakresie częstotliwości; wybierz drobne kroki.
    7. W obszarze Czas oczekiwania wybierz 15 minut, aby zezwolić na ciągłe pomiary z najszybszą szybkością przeprowadzaną przez oprogramowanie.
    8. Naciśnij Start, aby rozpocząć eksperyment i pozwolić komórkom śródbłonka mózgu namnażać się i tworzyć monowarstwę o wysokiej odporności. Ten krok trwa około 48 godzin.
  3. Leczenie komórek śródbłonka mózgu komórkami rakowymi i cytokinami na wstawkach błonowych
    1. Po 48 godzinach przygotować badane cytokiny lub komórki (np. komórki czerniaka) zgodnie z sekcją 1.5, w tym w stosownych przypadkach przeprowadzić liczenie komórek, i zebrać w probówkach paskowych o pojemności 1 ml lub równoważnych.
    2. Przygotować zabieg w odpowiednich stężeniach do dodania 70 μl do każdej studzienki (wkładka). Umieść zabiegi w inkubatorze, aby się ogrzać.
    3. Ponieważ przyrząd przeprowadza pomiary co 15 minut, wybierz czas zabiegu, który rozpoczyna się natychmiast po zakończeniu pomiaru. W tym momencie wyjmij moduł komórkowy z inkubatora i delikatnie przetrzyj go 70% etanolem za pomocą niestrzępiących się chusteczek.
    4. W sterylnym kapturze otwórz moduł kuwety i ostrożnie wlej pipetkę 70 μl leku do komory wierzchołkowej odpowiedniej wkładki. Zrób to za pomocą pipety jednokanałowej i dodawaj okrężnymi ruchami, unikając pęcherzyków powietrza. Wykonaj ten krok w mniej niż 10 minut, aby przywrócić moduł ogniwa do adaptera przed rozpoczęciem następnego pomiaru.
    5. Naciśnij przycisk Stop, aby zakończyć eksperyment. Eksportuj dane bezpośrednio do pliku xls. w obszarze Plik | Zakładka Eksport. Nazwij i zapisz ten plik odpowiednio po jego otwarciu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interpretacja danych o impedancji ECIS

Zrozumienie optymalnych warunków eksperymentalnych
W tym przypadku dane można przeglądać bezpośrednio za pomocą oprogramowania (Rysunek 2A) lub eksportować do analizy i wykresu (Rysunek 2B). Rysunek 2A pokazuje przykład danych wyświetlanych na rzeczywistym interfejsie oprogramowania. Wykres po lewej stronie przedstawia przykład przerwania poł...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania terapeutyczne nad chorobami, które wpływają na barierę krew-mózg, muszą uwzględniać znaczenie integralności i regulacji bariery śródbłonka mózgu. Na przykład przerwanie bariery śródbłonka mózgu jest krytycznie badane w przypadku przerzutów raka do mózgu z innych miejsc anatomicznych. Dzieje się tak, ponieważ śródbłonek mózgu tworzy pierwszą barierę przed krążącymi komórkami nowotworowymi. Jak wspomniano wcześniej we wprowadzeniu, badania in vitro dotyczące integralności bariery śródbłonkowej muszą być po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akshata Anchan została ufundowana przez Fundację Neurologiczną Nowej Zelandii na stypendium Gillespie Scholarship (numer grantu: 1628-GS) i First Fellowship (numer grantu: 2021 FFE). Koszt badań został również częściowo sfinansowany przez Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE oraz University of Auckland Faculty Research Development Fund. James Hucklesby został sfinansowany ze stypendium Fundacji Badań Medycznych w Auckland. Podziękowania dla zespołu Baguley i Centrum Badawczego Towarzystwa Onkologicznego w Auckland za linie komórkowe NZM czerniaka nowozelandzkiego pochodzące od pacjentów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Komórka czerniaka podstawa
medialna tablica Zscope nanoAnalyticscellZscope2; oprogramowanie v4.3.1Pomiar TER matryca biosensorów
Kolagen I— ogon szczuraGibcoA1048301Podłoże ECM do powlekania
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Suplement pożywki śródbłonka mózgu
Tablica ECIS  Oprogramowanie do biofizyki stosowanejECIS ZΘ; v1.2.163.0Matryca biosensorów pomiarowych Rb/Alpha
Tablica ECIS  Biofizyka stosowana96W20idf 96-dołkowa płytka biosensora
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Suplement mediów śródbłonka
mózgu hCMVECZastosowane materiały biologiczneT0259Linia komórkowa śródbłonka mózgu
hEGFPeproTechPTAF10015100Suplement pożywki śródbłonka
mózgu HeparynaSigma-AldrichH-3393Mózg suplement pożywki śródbłonkowej
hFGFPeproTechPTAF10018B50Suplement pożywki śródbłonka mózgu
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Suplement pożywki śródbłonka
mózgu IL-1βPeproTech200-01BCytokina
Insulina-Transferyna-Selenin SoduSigma-Aldrich11074547001Pożywka komórkowa czerniaka
M199Gibco11150-067Pożywka bazowa komórek śródbłonka mózgu
WodaWoda dejonizowana
PBS 1xGibco10010-023
TNF&alfa;PeproTech300-01AWkładka Cytokine
TranswellCorningCLS3464Wkładka z porowatą membraną
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Odczynnik dysocjacyjny
MilliQ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857(2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm's length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835(2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208(2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672(2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778(2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193(2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159(2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896(1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5(2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660(2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64(2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O'sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).
  54. Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers" 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26(2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blood Brain BarrierBrain Endothelial CellsImpedance Based BiosensorsBarrier IntegrityCancer Cell InteractionCytokine TreatmentElectric Cell Substrate ImpedanceCellZscope InstrumentTransendothelial Electrical ResistanceEndothelial Monolayer

Related Articles