Artykuł metodologiczny

Optyczne oczyszczanie i znakowanie w mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych w wielkoskalowym obrazowaniu ludzkiego mózgu

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65960

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół zapewnia krok po kroku procedurę szybkiego i jednoczesnego oczyszczania optycznego, wieloetapowego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu poprzez połączenie (SWITCH - H2O2 - Pozyskiwanie antygenu R- 2,2'-tiodieetanol [TDE]) KRÓTKA technika transformacji tkankowej z obrazowaniem mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego w rutynowym protokole wysokoprzepustowym.

Streszczenie

Pomimo licznych technik oczyszczania, które pojawiły się w ostatniej dekadzie, przetwarzanie pośmiertnych ludzkich mózgów pozostaje trudnym zadaniem ze względu na jego wymiary i złożoność, które sprawiają, że obrazowanie z rozdzielczością mikrometrową jest szczególnie trudne. W pracy przedstawiono protokół rekonstrukcji wolumetrycznych części mózgu człowieka poprzez jednoczesne przetwarzanie kilkudziesięciu skrawków za pomocą protokołu transformacji tkankowej SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]), który umożliwia oczyszczanie, znakowanie i sekwencyjne obrazowanie próbek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego (LSFM). SHORT zapewnia szybkie oczyszczanie tkanek i jednorodne wielokrotne znakowanie grubych warstw z kilkoma markerami neuronalnymi, umożliwiając identyfikację różnych subpopulacji neuronów zarówno w istocie białej, jak i szarej. Po oczyszczeniu plastry są obrazowane za pomocą LSFM z rozdzielczością mikrometryczną i w wielu kanałach jednocześnie w celu szybkiej rekonstrukcji 3D. Łącząc analizę SHORT z LSFM w ramach rutynowo wysokoprzepustowego protokołu, możliwe jest uzyskanie rekonstrukcji cytoarchitektury 3D dużych obszarów objętościowych w wysokiej rozdzielczości w krótkim czasie, umożliwiając w ten sposób kompleksową charakterystykę strukturalną ludzkiego mózgu.

Wprowadzenie

Analizowanie trójwymiarowej organizacji molekularnej i cytoarchitektury dużych objętości ludzkiego mózgu wymaga optycznej przezroczystości próbek, osiągniętej dzięki protokołom o długim czasie przetwarzania. Techniki optycznego oczyszczania zostały opracowane w celu zminimalizowania niejednorodności indeksu refrakcji (RI) w tkankach, zmniejszając w ten sposób rozpraszanie światła i zwiększając głębokość penetracji światła dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości1,2,3,4,5. Obecne postępy w metodach oczyszczania i głębokiego znakowania tkanek umożliwiają wolumetryczne obrazowanie nienaruszonych narządów i zarodków gryzoni dzięki wykorzystaniu najnowocześniejszych technik mikroskopowych6,7,8,9,10,11,12.

Jednak wolumetryczna rekonstrukcja 3D dużych obszarów pośmiertnego ludzkiego mózgu nadal stanowi wyzwanie w porównaniu z organizmami modelowymi. Złożony skład biologiczny oraz zmienne warunki utrwalania i przechowywania po uśmierceniu mogą pogorszyć skuteczność oczyszczania tkanek, głębokość penetracji przeciwciał i rozpoznawanie epitopów13,14,15,16,17,18,19. Co więcej, mechaniczne cięcie tkanek, a następnie oczyszczanie i etykietowanie każdego wycinka jest nadal wymagane, aby osiągnąć skuteczne oczyszczanie i jednolite etykietowanie dużych obszarów ludzkiego mózgu, co skutkuje długim czasem przetwarzania i potrzebą wyrafinowanego niestandardowego sprzętu w porównaniu z organizmami modelowymi15,20,21,22.

Technikatransformacji tkankowej S WITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) została opracowana specjalnie do analizy dużych objętości ludzkiego mózgu18,23. Metoda ta wykorzystuje zachowanie struktury tkankowej protokołu SWITCH11 oraz wysokie stężenia wodoru nadtlenkowego w celu zmniejszenia autofluorescencji tkanek w połączeniu z odbudową epitopu. SHORT umożliwia jednolite barwienie wycinków ludzkiego mózgu markerami dla różnych podtypów neuronów, komórek glejowych, układu naczyniowego i włókien mielinowych18,24. Jego wyniki są zgodne z analizą zarówno białek o niskiej, jak i wysokiej gęstości. Wynikające z tego wysokie poziomy przezroczystości i jednolite etykietowanie umożliwiają wolumetryczną rekonstrukcję grubych plastrów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, w szczególności do szybkiego akwizycji można zastosować aparaturę z arkuszami świetlnymi18,24,25,26,27.

W tej pracy opisujemy, jak technika transformacji tkanek SHORT może być wykorzystana do jednoczesnego oczyszczania i wielorundowego znakowania dziesiątek odcinków ludzkiego mózgu utrwalonych formaliną. Cztery różne markery fluorescencyjne mogą być używane razem, co prowadzi do identyfikacji różnych subpopulacji komórkowych. Po oczyszczeniu można wykonać obrazowanie wolumetryczne o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym przypadku użyliśmy specjalnie zaprojektowanej odwróconej klasy LSFM18,24,25,26,27, która umożliwia szybkie optyczne cięcie próbki i szybkie akwizycje wielu kanałów równolegle. Dzięki temu rutynowo wysokoprzepustowemu protokołowi możliwe jest uzyskanie kompleksowej charakterystyki komórkowej i strukturalnej z subkomórkową rozdzielczością dużych obszarów ludzkiego mózgu, jak już wykazano w mapowaniu całego obszaru Broca23.

Protokół

Próbki tkanek ludzkich z utrwalonym formaliną zostały dostarczone przez Dział Neuropatologii w Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Pisemną zgodę uzyskano od zdrowych uczestników przed śmiercią, zgodnie z zatwierdzonymi przez IRB protokołami pobierania tkanek z Partnerskiego Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (PIBC, protokół 2003P001937). Dokumenty autoryzacyjne są przechowywane w MGH Autopsy Services w Bostonie, MA, Stany Zjednoczone i są dostępne na żądanie.

1. Osadzanie agarozy i wycinanie próbek

  1. Przygotować 4% w/v roztwór agarozy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) w zlewce i zanurzyć w niej blok tkankowy. Poczekaj, aż osiągnie temperaturę pokojową (RT), a następnie przechowuj w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  2. Aby uzyskać bardzo precyzyjne przekroje, przyklej próbkę do krążka próbki wibratomu i napełnij tacę zimnym 1x PBS (pH 7,4). Dostosuj parametry wibratomu, takie jak częstotliwość, amplituda i prędkość, w zależności od rodzaju tkanki, która ma być pokrojona (używane wartości: częstotliwość = 5 (50 Hz); amplituda = 0,4; prędkość = 3 (0,15 mm/s).
    UWAGA: W zależności od objętości próbki należy stosować różne wibratory. W przypadku próbek o maksymalnej objętości 70 x 40 x 15 mm można użyć wibratomu (np. Leica VT1000 S); w przypadku większych próbek możliwe jest użycie kompresora (np. VF-900-0Z Microtome18) lub aparatu wykonanego na zamówienie21. Prezentujemy tutaj plastry cięte o grubości 400 μm lub 500 μm.
  3. Po pokrojeniu umieść wszystkie plastry w roztworze konserwującym składającym się z 1x PBS (pH 7,4) z 0,01% w/v azydku sodu (NaN3) i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przed zanurzeniem należy poczekać, aż roztwór agarozy osiągnie temperaturę 37 °C. Wyższa temperatura może uszkodzić próbkę. Zaleca się, aby nie pozostawiać próbek w PFA na dłużej niż 48 godzin, ponieważ długotrwałe utrwalanie może zakłócić procedurę znakowania poprzez uszkodzenie antygenów i zwiększenie autofluorescencji tkanek. Do długotrwałego przechowywania tkanek ludzkich stosuje się PBS z NaN3 w celu zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu. Ze względu na toksyczność NaN3 należy przygotować roztwór konserwujący pod maską chemiczną.

2. Utrwalenie tkanek

UWAGA: Wszystkie roztwory użyte w poniższym protokole są przygotowywane w dużych ilościach, wystarczających do przetworzenia wszystkich wycinków tego samego bloku tkankowego i zminimalizowania zmienności technicznej oraz skrócenia czasu na poszczególne kroki.

  1. Przygotuj roztwór wyłączający z 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M kwasu solnego (HCl), 25% v/v 0,1 M wodoroftalanu potasu (KHP) i świeżym 4% v/v aldehydu glutarowego. Umieścić wszystkie próbki w naczyniach z zakręcanymi pokrywkami (70 x 23 mm) i inkubować je z roztworem wyłączającym, delikatnie wstrząsając w temperaturze 4 °C przez 1 dzień, chroniąc je przed światłem folią aluminiową.
  2. Przygotuj roztwór Switch-on z 1x PBS (pH 7,4) i świeżym 1% v/v glutaraldehydu. Umieścić wszystkie próbki w nowych naczyniach i inkubować je w roztworze włączającym, delikatnie wstrząsając w temperaturze 4 °C przez 1 dzień, chroniąc je przed światłem folią aluminiową.
    UWAGA: Ze względu na wysoką toksyczność i wrażliwość na światło aldehydu glutarowego, zarówno roztwory wyłączające, jak i włączające muszą być zawsze przygotowywane świeże i przechowywane pod maską chemiczną na lodzie. Zawsze napełniaj naczynie 20 ml każdego roztworu i uszczelniaj je parafilmem.

3. Dezaktywacja i czyszczenie

UWAGA: Reaktywny aldehyd glutarowy w próbkach musi być inaktywowany przez inkubację roztworem inaktywacyjnym składającym się z 1x PBS pH 7,4, 4% w/v acetamidu, 4% w/v glicyny, pH 9,0. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Aby usunąć lipidy i uczynić tkankę przezroczystą, używamy roztworu klarującego składającego się z 200 mM dodecylosiarczanu sodu (SDS), 20 mM siarczynu sodu (Na2SO3) i 20 mM kwasu borowego (H3BO3), pH 9,0. Roztwór musi być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT), ponieważ SDS wytrąca się w temperaturze 4 °C. Wszystkie poniższe kroki zostaną wykonane w probówkach wypełnionych roztworem.

  1. Przenieść próbki z naczyń do probówek i myć przez 3 x 2 godziny 1x PBS pH 7,4 przy temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: W kroku 3.1 konieczna jest praca pod maską chemiczną ze względu na toksyczność aldehydu glutarowego. Acetamid, SDS i kwas borowy są również odczynnikami toksycznymi i należy się z nimi obchodzić pod maską chemiczną. Zawsze napełniaj probówkę 50 ml każdego roztworu.
  2. Próbki inkubować w roztworze inaktywacyjnym w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez noc (o/n).
  3. Prać przez 3 x 2 h w 1x PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej w delikatnym wstrząsaniu.
  4. Próbki inkubować w roztworze klarującym w temperaturze 55 °C w łaźni wodnej przez 3-7 dni. Roztwór należy zmieniać co 2 dni (Tabela 1).

4. Znakowanie immunologiczne

UWAGA: Przed etapem etykietowania konieczne jest usunięcie pozostałości SDS, zmniejszenie autofluorescencji i zdemaskowanie epitopów za pomocą roztworu do odzyskiwania antygenu składającego się z 10 mM zasady Tris, 1 mM EDTA i 0,05% v/v Tween 20, pH 9. pH roztworu wynoszące 9 jest zoptymalizowane pod kątem wydajnego procesu pobierania; Baza Tris działa jako środek buforowy w celu utrzymania stabilnego środowiska pH; EDTA, który jest czynnikiem chelatującym, zwiększa dostępność antygenu. Niejonowy detergent Tween 20 pomaga w poprawie przepuszczalności tkanki. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby zauważyć, że nadtlenek wodoru w połączeniu z etapem pobierania antygenu mają synergistyczny wpływ na zmniejszenie sygnału autofluorescencji poprzez rozkład i/lub modyfikację endogennych fluoroforów odpowiedzialnych za niespecyficzny sygnał tła (takich jak lipofuscyna).

  1. Przygotować 1x PBS z 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), podgrzać do 37 °C i myć próbki 3 x 3 godziny w ciągu dnia w delikatnym wstrząsaniu w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Pozostaw ostatnie pranie o/n.
    UWAGA: Przechowywać roztwór podstawowy PBST w temperaturze 4 °C. Bardzo ważne jest usunięcie SDS z tkanki, ponieważ w niskich temperaturach może on tworzyć nierozpuszczalne osady, które mogą zakłócać późniejsze procesy pozyskiwania.
  2. Następnego dnia dodać 10 ml 30% v/v nadtlenku wodoru (H2O2) do każdej próbki i pozostawić ją delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
  3. Myć 3 x 10 min 1x PBS (pH 7,4) z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  4. Podgrzewać roztwór do pobierania antygenu w temperaturze 95 °C w łaźni wodnej; przenieść próbki do podgrzanego roztworu i pozostawić je w temperaturze 95 °C na 10 minut.
  5. Pozwól próbkom ostygnąć do temperatury RT przez 40 minut, delikatnie wstrząsając.
  6. Myć 3 x 5 min wodą dejonizowaną, delikatnie wstrząsając.
  7. Równoważyć próbki w PBS w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  8. Przygotować świeży roztwór przeciwciał wykonany z PBST z 0,01% w/v NaN3 (patrz UWAGA do kroku 1.3) i dodać przeciwciała pierwszorzędowe. Próbki inkubować z roztworem w naczyniach z zakręcanymi pokrywkami w temperaturze 37 °C przez n dni (1-7) w inkubatorze, delikatnie wstrząsając i chroniąc przed światłem (tabela 2).
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od wielkości i grubości (Tabela 1 i Tabela 2).
  9. Po n dniach przenieść próbki do probówek i przemyć 3 x 2 godziny wstępnie podgrzanym PBST w temperaturze 37 °C i delikatnie wstrząsając w inkubatorze.
  10. Dodać przeciwciała drugorzędowe w PBST z 0,01% w/v NaN3 i inkubować próbki w nowych naczyniach z zakręcanymi pokrywkami w temperaturze 37 °C przez n dni (1-6) w inkubatorze, delikatnie wstrząsając i chronić przed światłem (Tabela 1 i Tabela 2).
  11. Po n dniach przenieść próbki do probówek i przemyć 3 x 3 godziny w ciągu dnia wstępnie podgrzanym PBST w temperaturze 37 °C w inkubatorze z delikatnym wstrząsaniem. Pozostaw ostatnie pranie o/n.
    UWAGA: Ponieważ Triton X-100 i Tween 20 są lepkie, pipetuj powoli, aby końcówka mogła się napełnić. Zawsze napełniaj probówkę 50 ml każdego roztworu. Do każdej próbki należy użyć 10 ml roztworów przeciwciał i uszczelnić naczynie parafilmem, aby zapobiec parowaniu roztworu. Ponieważ roztwory przeciwciał zawierają NaN3, można je przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie wykorzystać do znakowania nowych próbek w ciągu 2 tygodni.

5. Dopasowanie współczynnika załamania światła

UWAGA: Aby osiągnąć wysoki poziom przezroczystości, konieczne jest ujednolicenie tkankowego współczynnika załamania światła. Tutaj używamy 2,2'-tiodieetanolu (TDE) rozcieńczonego w 1x PBS. Rozwiązania TDE muszą być przechowywane w RT.

  1. Przenieść próbki do nowych szalek, dodać 30% v/v TDE i pozostawić na 4 godziny z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć roztwór 30% v/v TDE, dodać 68% v/v TDE do próbek i pozostawić je delikatnie wstrząsając w temperaturze RT.
    UWAGA: Ponieważ TDE jest lepki, pipetuj powoli, aby końcówka się napełniła. Wdychanie pary lub mgły TDE może podrażniać układ oddechowy. Dlatego zaleca się pracę w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub używanie dygestoriów w celu zminimalizowania narażenia. Roztwory TDE muszą być przechowywane w RT. Na każdą próbkę należy użyć 10 ml roztworów TDE.

6. Przykładowy montaż

UWAGA: Aby ułatwić montaż próbki i akwizycję obrazu LSFM, używamy specjalnie wykonanego, uszczelnionego uchwytu na próbki (określanego jako "kanapka"), który składa się z trzech części: szkiełka mikroskopowego, przekładki i szkiełka nakrywkowego.

  1. Umieść stalową przekładkę (56 x 56 x 0,5 mm3) na szkiełku mikroskopu (60 x 60 x 1 mm3) i połóż próbkę na szkiełku mikroskopowym.
  2. Ostrożnie nałóż kwarcowe szkiełko nakrywkowe (60 x 60 x 0,5 mm3), zestrzyj wszystko ze sobą i przygotuj dwuskładnikowy klej silikonowy w proporcji 1:1. Użyj kwarcowego szkiełka nakrywkowego, aby dopasować współczynnik załamania światła i zmniejszyć aberrację optyczną podczas procesu akwizycji.
  3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wypełnij przestrzeń między przekładką a szkiełkiem nakrywkowym dwuskładnikowym klejem silikonowym i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut.
  4. Usuń klipsy i za pomocą małej igły powoli napełnij całą kanapkę 68% v/v TDE.
  5. Zrób świeży klej i uszczelnij kanapkę.
    UWAGA: Jeśli TDE przypadkowo dotrze do podkładki dystansowej w kroku 6.1, klej nie utwardzi się. Upewnij się, że w kroku 6.2 nie tworzą się pęcherzyki powietrza.

7. Zdejmowanie

powłok

UWAGA: Zachowanie struktury i zwiększona dostępność epitopów SHORT pozwalają na wielorundowe znakowanie wycinków poprzez usunięcie przeciwciał i ponowne zabarwienie próbek innymi markerami.

  1. Otwórz kanapkę za pomocą ostrza, włóż próbki do nowych naczyń z zakrętkami wypełnionymi 30% v/v TDE i pozostaw je na 3 godziny.
  2. Przenieść próbki do probówek, myć przez 3 x 2 h w 1 PBS (pH 7,4) w temperaturze suchej temperatury z delikatnym wstrząsaniem i pozostawić ostatnie płukanie o/n.
  3. Umieścić próbki w roztworze klarującym w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C na 4 godziny.
  4. Prać przez 3 x 2 h w 1x PBST (pH 7,4) w temperaturze 37 °C delikatnie wstrząsając i pozostawić ostatnie pranie o/n. Teraz próbka jest gotowa do ponownego etykietowania, począwszy od kroku 4.8.
    UWAGA: Zawsze napełniaj probówkę 50 ml każdego roztworu. Na każdą próbkę należy użyć 10 ml roztworu TDE.

Wyniki

Opisany tutaj protokół umożliwia jednoczesne traktowanie wielu skrawków o grubości od 100 µm Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. 500 µm, stosując metodę SHORT. Podejście to znacząco skraca całkowity czas przetwarzania całej procedury. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis całego procesu (Rycina 1) do jednoczesnego przetwarzania wielu grubych przekrojów ludzkiego mózgu pobranych po śmierci, a protokół demonstrujemy na 24 przekrojach jednocześnie (Rysunek 2A). Czas trwania procesu przejaśniania i podwójnego znakowania wynosi od 1 do 30 dni, w zależności od rozmiaru i grubości próbek (Tabela 1), z wyłączeniem obrazowania i przetwarzania obrazów. Po delipidacji i dopasowaniu współczynnika załamania światła w TDE uzyskuje się optymalną i jednorodną przejrzystość wszystkich skrawków tkanki, zarówno w istocie szarej, jak i białej (Rycina 2B).

Pozyskiwanie obrazów można przeprowadzić przy użyciu różnych zaawansowanych mikroskopów fluorescencyjnych, w tym mikroskopii konfokalnej25 oraz mikroskopii dwufotonowej14. W niniejszej pracy zastosowano wykonany na zamówienie odwrócony mikroskop LSFM18,23 wyposażony w cztery linie laserów wzbudzających: 405 nm, 48 nm, 561 nm i 638 nm, umożliwiający obrazowanie czterech różnych cech biologicznych znakowanych przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforami. Rycina 3A przedstawia reprezentatywne obrazy fragmentu o grubości 40 µm z ludzkiego obszaru Broca, poddanego podwójnemu znakowaniu na NeuN (marker panneuronalny), Somatostatynę (SST) i Kalretyninę (CR), które znakują dwie różne subpopulacje interneuronów, oraz marker jądrowy DAPI (Rycina 3A,B). W plastrze o grubości 40 µm zaobserwowano, że globalna fluorescencja wzdłuż osi Z nie ogranicza się do powierzchni, lecz jest niemal jednorodna w całej głębokości tkanki, choć intensywność sygnału nieznacznie spada w środkowej części (Rycina 3C).

Aby uzyskać bardziej kompleksową charakterystykę komórkową tkanki mózgu człowieka, możliwe jest przeprowadzenie wielorundowego znakowania tych samych próbek poprzez usuwanie przeciwciał i ponowne znakowanie próbki, zgodnie z metodą opisaną w oryginalnej pracy dotyczącej SHORT. Rycina 4 (zaadaptowana z Pesce i wsp.18) przedstawia potencjalne zastosowanie siedmiu różnych przeciwciał na plastrze tkanki o grubości 50 µm przetworzonym za pomocą SHORT w trzech kolejnych rundach immunostainingu. Wykorzystane przeciwciała obejmują NeuN, SST, CR, parwalbuminę (PV) oraz peptyd jelitowo-aktywny wazoaktywny (VIP) jako markery neuronów hamujących, kwaśne białko włókieniste glejowe (GFAP) dla komórek glejowych oraz wimentynę (VIM) dla naczyń krwionośnych (Tabela 2). Wyniki wykazują wyjątkową zdolność metody SHORT do zachowania informacji tkankowych podczas różnych procedur usuwania przeciwciał, skutecznego redukowania sygnałów autofluorescencji oraz efektywnego klarowania próbek.

figure-results-1
Rysunek 1: Harmonogram SHORT. Schemat przedstawiający kroki wymagane do procesowania próbek zgodnie z protokołem SHORT. W każdym kroku procesowanych jest jednocześnie kilkanaście plastrów tkanki mózgu człowieka. Po zatopieniu w agarozie i pocięciu, próbki umieszcza się w roztworach Switch-on oraz Switch-off na 1 dzień każdy; etapy inaktywacji przeprowadza się przez noc, natomiast delipidacja poprzez inkubację w roztworze klarującym trwa od 3 do 7 dni. Następnie próbki inkubuje się z roztworami przeciwciał pierwotnych i wtórnych przez maksymalnie odpowiednio 7 i 6 dni. Po dopasowaniu współczynnika załamania światła, próbki montuje się w uchwycie do próbek (kanapka) w celu obrazowania LSFM i przechowywania. W dowolnym momencie po złożeniu kanapki próbki mogą zostać poddane stripingowi i ponownemu znakowaniu w celu wykrycia innych markerów. Skróty: TDE = 2,2'-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o/n = przez noc; RI = współczynnik załamania światła; LSFM = mikroskopia fluorescencyjna z płatą światła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Przetwarzane jednocześnie skrawki ludzkiego mózgu z bloku obszaru Broca. (A) Dwadzieścia cztery kolejne skrawki z obszaru Broca o wymiarach 4 x 4 x 0,04 cm3 w PBS przed przetwarzaniem metodą SHORT. (B) Te same preparaty co w punkcie A po zastosowaniu metody SHORT. Pasek skali = 1 cm. Skróty: TDE = 2,2'-tiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3Reprezentatywne obrazy LSFM oczyszczonego przekroju znakowanego czterema różnymi markerami. (A) obrazy z maksymalną projekcją intensywności (rozdzielczość 3,3 x 3,3 x 3.3 µm3) przedstawiająca rekonstrukcję mezoskopową przekroju obszaru Broca poddanego procesowi SHORT, znakowanego pod kątem NeuN, somatostatyny, kalretininy oraz markera jądrowego DAPI. Po prawej stronie przedstawiono obraz scalony (NeuN-SST-CR-DAPI). Pasek skali = 0,5 cm. (B) Powiększony wstawka obrazu scalonego w APasek skali = 100 µm. (C) Wysoka rozdzielczość (0,5 x 0,5 x 3.3 µmobrazy w płaszczyźnie yz z (B). Pasek skali = 100 µmSkróty: TDE = 2,2'-tiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antygen Rodzyskiwanie -TDE; LSFM = mikroskopia fluorescencyjna z płaszczyzną światła; NeuN = antygen jądrowy neuronów; SST = somatostatyna; CR = kalretynina; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy LSFM wielorundowego barwienia w skrawkach przetworzonych metodą SHORT. (A) Obrazy skrawka ludzkiego mózgu przed oczyszczaniem (w PBS) oraz po wielorundowym znakowaniu z dopasowaniem współczynnika załamania światła (68% TDE). Pasek skali = 1 cm. (B) Nałożenie różnych kanałów pozyskanych podczas trzech kolejnych wielorund. Obraz przedstawia zarówno istotę białą, jak i szarą, znakowane przeciwciałami przeciwko peptydowi jelitowemu działającemu naczyniorurucznie (VIP), somatostatyninie (SST), parwalbuminie (PV), kalretyninie (CR), antygenowi jądrowemu neuronów (NeuN), kwaśnemu białku włókienstwowemu gleju (GFAP) oraz wimentynie (VIM). Wysokorozdzielcze (rozdzielczość 0,55 x 0,5 x 3,3 µm) obrazy z pojedynczych kanałów przedstawiono po prawej stronie i poniżej obrazu. Pasek skali = 100 µm dla wszystkich obrazów, z wyjątkiem GFAP (pasek skali = 10 µm). (C) Obrazy projekcji maksymalnej intensywności skrawka o grubości 50 µm, wykazujące sygnał z siedmiu różnych przeciwciał użytych w trzech sekwencyjnych rundach immunostynowania. Runda 1: PV-SST-VIP; runda 2: CR-SST-NeuN; runda 3: VIM-SST-GFAP. Pasek skali = 1 mm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Pesce i wsp.18. Skróty: TDE = 2,2'-tiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem światła; NeuN = antygen jądrowy neuronów; SST = somatostatynina; CR = kalretynina; PV = parwalbumina; GFAP = kwaśne białko włókienstwowe gleju; VIM = wimentyna; VIP = peptyd jelitowy działający naczyniorurucznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1: Reprezentatywny czas trwania metody SHORT dla próbek o różnej powierzchni i grubości. Próbki o różnych powierzchniach i grubościach wymagają zróżnicowanego czasu inkubacji w roztworach przejrzystiających i przeciwciałach, co skutkuje różną całkowitą długością procesu SHORT. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Przeciwciała kompatybilne z metodą SHORT. W tabeli wymieniono wszystkie przeciwciała, które zostały przetestowane przy użyciu protokołu SHORT i wykazały specyficzne barwienie w preparatach ludzkiego mózgu o grubości 40-50 µm. Kolumna P/M oznacza przeciwciała poliklonalne i monoklonalne. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i rekonstrukcja 3D dużych obszarów ludzkiego mózgu wymagają mechanicznego cięcia tkanek, a następnie optycznego oczyszczania i znakowania immunologicznego pojedynczych wycinków. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób metoda transformacji tkankowej SHORT może być wykorzystana do szybkiego i jednoczesnego przetwarzania wielu grubych odcinków ludzkiego mózgu w celu rekonstrukcji mózgu 3D z rozdzielczością subkomórkową za pomocą LSFM.

W przeciwieństwie do innych podejść, w przypadku metody SHORT etapy rozliczania i wielokrotnego etykietowania nie wymagają wyrafinowanego, dostosowanego sprzętu. Większość próbek może być przetwarzana w całości, co skraca czas przetwarzania dużych bloków ludzkiej tkanki mózgowej i minimalizuje zmienność techniczną.

Zabiegi dekoloryzacji i demaskowania epitopów są kluczowe podczas pracy ze starymi, utrwalonymi formaliną tkankami ludzkimi. Nadtlenek wodoru i alkaliczne roztwory odzyskiwania antygenów mogą być również stosowane w połączeniu z innymi metodami oczyszczania, takimi jak iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH i SHIELD24.

Aby zapewnić zachowanie informacji epitopowej i uzyskać równomierne usunięcie zarówno istoty szarej, jak i białej, konieczne jest przekształcenie próbki w hybrydę żelowo-tkankową, która jest odporna na ciepło i odczynniki chemiczne. Aldehyd glutarowy został wybrany ze względu na jego doskonałą zdolność sieciowania i zdolność do przenikania do płyty tkankowej przy niskim pH (pH = 3). Stężenie aldehydu glutarowego jest kluczowym czynnikiem decydującym o wytrzymałości i klarowności tkanki. Wyższe stężenie prowadzi do lepszego zachowania struktury tkanki, ale także wydłuża czas potrzebny na jej oczyszczenie. Ten wybór umożliwia uzyskanie pożądanych rezultatów w zakresie zachowania epitopów i jednorodnego oczyszczania. W przypadku roztworu wyłączającego (krok protokołu 2.1) stężenie aldehydu glutarowego zostało starannie dobrane i zoptymalizowane, aby osiągnąć równowagę między skutecznym sieciowaniem a szybkim usuwaniem18,25. SHORT jest specjalnie dostosowany do pracy z utrwalonymi formaliną wycinkami ludzkiego mózgu z obszaru Broki, hipokampa i kory korowej 18,23,25. Jednak podczas pracy z innymi modelami biologicznymi lub różnymi regionami mózgu mogą być konieczne pewne modyfikacje ze względu na różnice w składzie istoty szarej i białej.

Jednym z krytycznych zadań tego protokołu jest również optymalizacja czasu inkubacji podczas oczyszczania (krok protokołu 3.4) i roztworów przeciwciał (kroki protokołu 4.8 i 4.10), głównie w odniesieniu do wielkości próbki i składu biologicznego tkanki. Oszacowaliśmy, że 500 μm stanowi granicę grubości tkanki, aby osiągnąć optymalną przezroczystość zarówno w istocie białej, jak i szarej oraz jednolite znakowanie na całej głębokości tkanki dla kilku barwienia przeciwciałami (Tabela 2). Szczegółowy opis tych procesów można znaleźć w Pesce i wsp.18 oraz Scardigli i wsp.24. Różne obszary mózgu mogą mieć różny skład lipidów i białek, a starzejące się mózgi wytwarzają wysoką zawartość pigmentów typu lipofuscyny i neuromelaniny, które wytwarzają silny sygnał autofluorescencyjny i zmieniają dyfuzję sondy w tkance. Na przykład plaster o grubości 400 μm o grubości 16cm2 z obszaru ludzkiej Broki potrzebuje 7 dni leczenia roztworem czyszczącym, aby osiągnąć wysoki poziom delipidacji. Aby zapewnić równomierne barwienie na całej głębokości tkanki, wymaga inkubacji z roztworami przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych odpowiednio przez 7 i 6 dni (ryc. 3). W związku z tym przed zastosowaniem opisanego tutaj protokołu o wysokiej przepustowości konieczna jest dokładna optymalizacja etapów rozliczania i etykietowania.

SHORT umożliwia przechowywanie próbek w specjalnie zaprojektowanym uchwycie do obrazowania, ponieważ wykazano, że sygnał fluorescencyjny jest zachowany przez co najmniej rok. Naukowcy mogą zatem przygotować wszystkie kanapki z wyprzedzeniem i przechowywać je do etapu obrazowania, który można wykonać później. Warto zauważyć, że szkiełko mikroskopowe, przekładka i szkło nakrywkowe używane do przygotowania kanapek można dostosować do wielkości próbki.

Próbki przetworzone za pomocą opisanego tutaj protokołu SHORT analizowano przy użyciu specjalnie wykonanego odwróconego LSFM 18,23. Zestaw ten składa się z dwóch ramion wyposażonych w 12 niestandardowych obiektywów z kołnierzem korygującym indeks refrakcyjny (RI). Każdy obiektyw działa jednocześnie jako ramię oświetleniowe i detekcyjne, umożliwiając jednoczesną akwizycję dwóch kanałów z prędkością objętościową 0,16 cm3/h. Ponieważ uchwyt na próbki może pomieścić dwie kanapki na raz, jesteśmy w stanie zobrazować kolejno cztery kanały w dwóch plasterkach w ciągu 10 godzin. Ze względu na łagodną toksyczność oparów TDE dla układu oddechowego, aby uniknąć aberracji sferycznej, uchwyt próbki jest wypełniony 91% v/v roztworem glicerolu/wody, który odpowiada RI (1,46) zarówno kwarcowego szkiełka nakrywkowego, jak i roztworu TDE. Roztwór glicerolu/wody o stężeniu 91% v/v należy wymieniać co 3 dni, aby uniknąć zanieczyszczenia pyłem. Dlatego nasz LSFM umożliwia szybkie pozyskiwanie próbek o niskim fotowybielaniu w rozdzielczości izotropowej 3,6 μm po obróbce końcowej 18,23,29. Duża ilość wytworzonych danych została przetworzona przy użyciu zdefiniowanego potoku do ponownego krojenia i zszywania stosów obrazów za pomocą samodzielnie opracowanego oprogramowania, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.

Chociaż użyliśmy SHORT w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną za pomocą arkuszy świetlnych, do akwizycji można zastosować różne rodzaje technik obrazowania fluorescencyjnego, w zależności od dostępności laboratorium i konkretnych zastosowań. Na przykład mikroskopia konfokalna25 lub mikroskopia dwufotonowa14 mogą być używane do analizy oczyszczonych próbek. Ten rodzaj analizy jest zalecany w przypadku próbek o stosunkowo małych objętościach, ponieważ są to systemy oparte na skanowaniu, a czas akwizycji w przypadku dużych obszarów tkanek jest bardzo długi30. Osiągając szybsze obrazowanie i oddzielenie rozdzielczości bocznej i osiowej, mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi jest preferowaną metodą obrazowania dużych objętości oczyszczonych próbek 3,4,18,31,32,33.

Podsumowując, opisaliśmy szybki, wysokoprzepustowy protokół do jednoczesnego oczyszczania, jednorodnego wspólnego znakowania i wolumetrycznej rekonstrukcji 3D dziesiątek pośmiertnych odcinków ludzkiego mózgu. Dzięki połączeniu SHORT z obrazowaniem LSFM i analizą obliczeniową, możliwe jest uzyskanie trójwymiarowych danych do kompleksowego spisu komórek i analizy proteomicznej ludzkiego mózgu.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Bruce'owi Fischlowi, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, za dostarczenie próbek ludzkiego mózgu analizowanych w tym badaniu. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z Programu Ramowego Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 654148 (Laserlab-Europe), z Programu Ramowego Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" na podstawie szczegółowej umowy o udzielenie dotacji nr 785907 (Human Brain Project SGA2) i nr 945539 (Human Brain Project SGA3), z General Hospital Corporation Center of the National Institutes of Health pod numerem grantu U01 MH117023, oraz z włoskiego Ministerstwa Edukacji w ramach Euro-Bioimaging Italian Node (infrastruktura badawcza ESFRI). Ostatecznie, badania te zostały przeprowadzone przy udziale "Fondazione CR Firenze". Odpowiedzialność za treść tej pracy spoczywa wyłącznie na autorach i niekoniecznie odzwierciedla ona oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,2'-tiodieetanolMerck Life Science S.R.L.
Acetamid >= 99,0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agaroza Wysoki EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Kwas borowy MerckLife Science S.R.L.B7901
Compresssome VF-900-0Z Mikrotomprecyzyjny/
Szkiełka nakrywkoweLaserOptex/dostosowane
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuhydrat MerckLife Science S.R.L.E5134
Aldehyd glutarowyMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Nadtlenek wodoru 30%Merck Life Science S.R.L.
Inkubator ISS-4075Towarzysz laboratoryjny /
Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi (LSFM)//Wykonane na zamówienie
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Preparaty mikroskopoweLaborchimica/dostosowana
tabletka z solą fizjologiczną buforu fosforanowegoMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002wycofany z produkcji
Wodoroftalan potasuMerck Life Science S.R.L.P1088
Azydek soduMerck Life Science S.R.L.S2002
Dodecylosiarczan sodu MerckLife Science S.R.L.L3771
Siarczyn soduMerck Life Science S.R.L.S0505
PrzekładkiMicrolaser srldostosowane
pojemniki na plwocinę (naczynia z zakręcanymi pokrywkami)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (odczynniki ITW)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
RurySarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Kąpiel wodna MemmertWNB 7-45
Przeciwciała i barwniki
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure bydlęce przeciwciało anty-kozie IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Przeciwciało anty-NeuNMerck Life Science S.R.L.Zastosowano rozcieńczenie ABN91, 1:100
Przeciwciało anty-parwalbuminowe (PV)Abcamab32895Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Przeciwciało anty-wimentynowe [V9] - Marker cytoszkieletu (VIM)Abcamab8069Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Zastosowano przeciwciało poliklonalne kalretyninyProteinTech12278_1_APRozcieńczenie, 1:200
Rozcieńczenie DAPIThermoFisherD3571 używany, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Osioł Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Osioł Anti-Rat IgG H& L (Alexa Fluor 568) wstępnie zaadsorbowanyAbcamab175475Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Koza IgY IgY H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Zastosowano rozcieńczenie, 1:500
Kozioł Anti-Chicken IgY H& L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Zastosowano rozcieńczenie, 1:500
Kozioł Anti-Chicken IgY H& L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Zastosowano rozcieńczenie, 1:500
Kozia IgG Anty-Królicza H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Rekombinowane przeciwciało anty-GFAP Alexa Fluor 488Zastosowano rozcieńczenieAbcamab194324
Przeciwciało somatostatyny YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Zastosowano rozcieńczenie, 1:200
Zastosowano wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP)ProteinTech16233-1-APZastosowano rozcieńczenie, 1:200
166782, 1:200

Bibliografia

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631(2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684(2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066(2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038(2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447(2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170(2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844(2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234(2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160(2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405(2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia arkusza wiat autrudnianie tkankirekonstrukcja wolumetrycznaods anianie antygen wmarkery neuronalneimmunobarwieniedopasowanie wsp czynnika za amania wiat asekcjonowanie w wibratomie

Powiązane artykuły