Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Podsumowanie

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Streszczenie

Opisano protokoły zrobotyzowanej krystalizacji białek za pomocą Zakładu Krystalizacji w Harwell oraz zbierania danych o temperaturze pokojowej in situ z płytek krystalizacyjnych na linii badawczej VMXi Diamond Light Source. Takie podejście umożliwia proste określenie wysokiej jakości struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej na podstawie wielu kryształów i zapewnia bardzo szybką informację zwrotną na temat wyników prób krystalizacji, a także umożliwia krystalografię szeregową. Wartość struktur w temperaturze pokojowej w zrozumieniu struktury białek, wiązania ligandów i dynamiki staje się coraz bardziej doceniana w społeczności biologii strukturalnej. Ten potok jest dostępny dla użytkowników z całego świata z kilkoma dostępnymi trybami dostępu. Eksperymenty krystalizacji, które są skonfigurowane, mogą być obrazowane i przeglądane zdalnie, a kryształy są automatycznie identyfikowane za pomocą narzędzia uczenia maszynowego. Dane są mierzone w systemie kolejkowym z zestawami danych o rotacji do 60° z wybranych przez użytkownika kryształów na płytce. Dane ze wszystkich kryształów w danej studni lub grupie próbek są automatycznie łączone za pomocą xia2.multiplex, a wyniki są bezpośrednio dostępne za pośrednictwem interfejsu przeglądarki internetowej.

Wprowadzenie

Krystalografia rentgenowska pozostaje kluczowym narzędziem do zrozumienia struktury i funkcji białek, dostarczając struktury białek lub ich kompleksów o wysokiej rozdzielczości, na przykład z substratami lub kandydatami na leki. Jednak w wielu przypadkach uzyskanie kryształów o pożądanych właściwościach - wysoce dyfrakcyjnych, krystalicznej formie podatnej na nasiąkanie i bez patologii kryształów, takich jak bliźniacze - pozostaje znaczącym wąskim gardłem¹. Ponieważ na ogół nie można przewidzieć odpowiednich warunków chemicznych do produkcji kryształów białkowych, standardem jest badanie przesiewowe krystalizacji badające tysiące potencjalnych mieszanin chemicznych, często wspomagane przez automatykę/robotykę w ustawianiu ekranów i hoteli kryształowych do monitorowania, często zdalnie, zarejestrowanych obrazów kropli krystalizacji.

Gdy pojawiają się kryształy, zazwyczaj muszą być zebrane ze środowiska krystalizacji za pomocą pętli nylonowej lub kaptonowej, a następnie przeniesione do kropli zawierającej środek krioprotekcyjny (którego poszukiwanie jest dodatkową zmienną) przed zanurzeniem w ciekłym azocie. Te dodatkowe etapy między krystalizacją a zbieraniem danych rentgenowskich mogą obejmować między innymi odwodnienie kropli krystalizacji, gdy jej uszczelnione środowisko zostanie przerwane, naprężenia mechaniczne kryształu podczas obchodzenia się z nim oraz uszkodzenia sieci krystalicznej przez środki kriopekcyjne (zwykle powodujące zwiększone rozprzestrzenianie się mozaiki)². Ponadto zbieranie kryształów jest czasochłonne i pracochłonne i może prowadzić do niejednorodności między próbkami, zwłaszcza gdy podczas procesu zbioru tworzy się skórka na kroplach. Linia badawcza VMXi zapewnia dostęp do użytecznych danych z kryształów, które są przyklejone do płytki, a które w przeciwnym razie zostałyby odrzucone w celu zbierania danych.

Zdecydowana większość struktur krystalicznych promieniowania rentgenowskiego jest określana w temperaturze 100K przy użyciu powyższego podejścia, co umożliwia prosty transport i obsługę kryształów oraz zwiększa czas życia kryształów w wiązce rentgenowskiej o rzędy wielkości. Rośnie jednak zainteresowanie wyznaczaniem struktur w warunkach niekriogenicznych, czyli znacznie bliższych warunkom fizjologicznym istotnym dla funkcji białek^2,3,4. Umożliwia to znacznie lepsze zrozumienie dynamicznej struktury białek, pozwala uniknąć konformacji aminokwasów lub zamrożenia pętli w funkcjonalnie nieistotnych stanach⁵, a także umożliwia badanie wiązania ligandów w warunkach znacznie bliższych warunkom występującym w naturalnym środowisku białka w komórce i organizmie⁶.

Alternatywne podejście, wdrożone na linii badawczej Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) w synchrotronie Diamond Light Source, UK, polega na pomiarze danych dyfrakcyjnych bezpośrednio z kryształów w środowisku, w którym rosły (tj. w obrębie płyty krystalizacyjnej), w warunkach otoczenia i bez zakłóceń7^,8. Umożliwia to bardzo szybkie informacje zwrotne z ekranów krystalizacji i optymalizacje, aby poprowadzić użytkownika do optymalnej formy kryształu dla jego wymagań. Umożliwia również zautomatyzowane wytwarzanie wysokiej jakości struktur o temperaturze pokojowej⁹.

Ten protokół zakłada, że użytkownik ma próbkę białka o wysokiej czystości gotową do krystalizacji. Opisujemy doświadczenia użytkownika korzystającego z dostępu do zakładu krystalizacji w Harwell w celu wytworzenia kryształów białka, a następnie wykorzystania linii badawczej VMXi do zbierania danych (rysunek 1).

Zakład krystalizacji w Harwell

Ośrodek Krystalizacji w Harwell (CF) znajduje się w Kompleksie Badawczym w Harwell (RCaH) przylegającym do Diamentowego Źródła Światła. Zakład oferuje użytkownikom zautomatyzowane laboratorium o wysokiej przepustowości do krystalizacji makromolekularnej, wykorzystujące robotykę do badań przesiewowych krystalizacji, optymalizacji kryształów, obrazowania kryształów i charakteryzacji. Dzięki ścisłej integracji z wysoce zautomatyzowaną linią badawczą VMXi, tempo określania struktur temperatury pokojowej znacznie przyspieszyło i umożliwia charakteryzację nowych struktur białkowych, kompleksów białko-ligand i DNA-ligand, a także automatyczne badania przesiewowe fragmentów (Rysunek 1), a wszystko to w warunkach niekriogenicznych.

Rurociąg CF to zestaw oprzyrządowania obejmujący nanolitrowe roboty krystalizacyjne⁹ do krystalizacji białek rozpuszczalnych i błonowych, roboty do obsługi cieczy do przygotowania komercyjnych ekranów krystalizacji i złożonych niestandardowych ekranów optymalizacyjnych oraz cztery instrumenty do obrazowania (jeden w temperaturze 4 °C i trzy w temperaturze 20 °C do obrazowania płytek krystalizacyjnych (zobacz Tabelę Materiałów). Jeden imager jest w stanie obrazować szklane płytki lipidowe w fazie sześciennej (LCP), a jeden imager jest wyposażony w optykę multifluorescencyjną (obie w temperaturze 20 °C).

Obiekt jest obecnie szeroko wykorzystywany przez szerokie spektrum użytkowników akademickich i przemysłowych, w tym przez Laboratorium Białek Błonowych (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), ośrodek przesiewowy fragmentów XChem ¹⁰, linie badawcze MX, XFEL-hub, a także Rosalind Franklin Institute (RFI). Ten dobrze ugruntowany i zoptymalizowany proces produkcyjny umożliwił przeprowadzanie eksperymentów krystalizacji w szerokim spektrum projektów z zakresu biologii strukturalnej. W tym artykule opisano potok dla kryształów przeznaczonych do zbierania danych w VMXi, chociaż kryształy mogą być również zbierane i kriochłodzone lub kierowane do rurociągu XChem.

Dostęp użytkowników jest przydzielany przez system propozycji Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), a użytkownicy przemysłowi są wspierani przez grupę Diamond Industry Liaison. Wszyscy użytkownicy mogą przyjść na stronę ze swoimi próbkami lub tabliczkami, które można transportować ręcznie. Nie zaleca się wysyłania płytek kurierem, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że krople mogą oddalić się od miejsca, w którym zostały dozowane, lub krople mogą zostać uszkodzone przez zbiornik krystalizacji. Alternatywnie, po uzgodnieniu, użytkownicy mogą wysłać swoje próbki białek do CF, gdzie pracownicy przeprowadzają eksperymenty krystalizacji w ich imieniu. Eksperymenty mogą być monitorowane zdalnie przez użytkownika, logując się do Rock Maker Web w przypadku CF lub przez ISPyB w przypadku VMXi. Dostęp do mukowiscydozy może odbywać się w sposób iteracyjny w oparciu o wyniki dyfrakcji rentgenowskiej zebrane w Diamond.

Linia badawcza VMXi przy diamentowym źródle światła

Linia badawcza VMXi (zwana dalej "linią") to unikalny i niedawno opracowany instrument w pełni dedykowany do wysoce zautomatyzowanej krystalografii rentgenowskiej w temperaturze pokojowej, z naciskiem na pomiar danych z kryształów w odpowiednich płytkach krystalizacyjnych. Linia oferuje mikroogniskową (10 x 10 μm), różową wiązkę (pasmo przepustowe <5 × ^10-2ΔE/E) o wysokim strumieniu ~2 × 10¹³ fotonów/s (przy 16 KeV)⁷. Ta wiązka o wysokim strumieniu, w połączeniu z szybkim detektorem, umożliwia bardzo wysoką przepustowość próbek i zbieranie danych z próbek o wielkości do 10 μm.

Płytki krystalizacji wchodzą na linię badawczą poprzez przechowywanie w systemie przechowywania próbek i obrazowanie na podstawie harmonogramu dostarczonego przez użytkownika podczas rejestracji płytek za pomocą ISPyB¹¹ interfejs SynchWeb¹². Zazwyczaj zaleca się użytkownikom wybór ciągu Fibonacciego punktów czasowych do obrazowania (0, 12, 24, 36, 60...7,320 h od płytki wprowadzanej do systemu). Użytkownik jest informowany e-mailem o zobrazowaniu tablicy. Zarówno obrazowanie w świetle widzialnym, jak i w świetle UV jest dostępne dla użytkowników na żądanie. Obrazy wykonane przez system przechowywania próbek są analizowane przez algorytm uczenia maszynowego; Automatycznie lokalizuje i definiuje punkty zainteresowania obiektów, które przypominają kryształy i rejestruje interesujące miejsca gotowe do dodania przez użytkownika do kolejki zbierania danych. Użytkownicy mogą również ręcznie kliknąć obrazy w świetle widzialnym, aby zarejestrować interesujące miejsca, lub mogą kliknąć i przeciągnąć region, który ma być analizowany za pomocą skanowania rastrowego. Punkty te są dostępne dla użytkowników, którzy mogą dodać je do kolejki wraz z automatycznie zlokalizowanymi punktami.

Gdy wszystkie próbki mają odpowiednie parametry do zbierania danych, płyta trafia do kolejki. Gdy płytka dotrze na szczyt kolejki, jest automatycznie dozowana do linii badawczej. Płytki krystalizacyjne są automatycznie ładowane z hoteli kryształowych do linii badawczej przez ramię robota, a po dopasowaniu obrazu, z każdego wybranego kryształu mierzone są zestawy danych krystalograficznych o rotacji do 60° zgodnie z instrukcjami zdefiniowanymi przez użytkownika. Wszystkie krople znajdujące się na płytce mogą być użyte do tych eksperymentów na linii badawczej. Dane są łączone z wielu kryształów w celu wytworzenia izomorficznych, optymalnie połączonych zestawów danych w sposób zautomatyzowany^7,9. Po zebraniu wszystkich zestawów danych w kolejce użytkownik otrzymuje wiadomość e-mail z linkiem, który należy kliknąć, aby wyświetlić zestawy danych w ISPyB¹¹, podobnie jak w innych liniach badawczych Diamond MX. Użytkownicy są również przekierowywani na stronę internetową linii badawczej (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protokół

1. Wytwarzanie kryształów w płytkach in situ za pomocą Zakładu Krystalizacji w Harwell

UWAGA: Dostęp do CF jest obsługiwany przez wiele różnych ścieżek i zależy od zastosowania projektu i typu użytkownika (akademicki lub branżowy). Projekty XChem i MPL mają swój własny system składania wniosków za pośrednictwem Systemu Zarządzania Użytkownikami (UAS) i mogą być składane zarówno za pośrednictwem standardowej ścieżki dostępu (w tym iNEXT Discovery i EUbOPEN), jak i BAG Access. Poniższy protokół jest specyficzny dla użytkowników VMXi.

1. Złożenie wniosku i przygotowanie do wizyty
   1. Podaj informacje o projekcie do wniosku o propozycję BAG lub dodaj go do aktywnej propozycji BAG. Zazwyczaj jest koordynator BAG, który organizuje formalności. Alternatywnie, należy złożyć propozycję szybkiego dostępu w celu uzyskania dostępu do linii badawczej.
   2. Upewnij się, że próbka została zarejestrowana, a bezpieczeństwo potwierdzone w UAS na wniosek przed przybyciem na miejsce za pośrednictwem kuriera lub osobiście.
   3. Upewnij się, że użytkownik jest zarejestrowany (przy użyciu identyfikatora FedID i hasła).
   4. Upewnij się, że użytkownik został dodany do propozycji MX jako współpracownik w UAS przez koordynatora BAG.
   5. Wypełnij formularz szczegółów próbki krystalizacji linii badawczej i wyślij go do VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Komunikuj się z personelem linii badawczej na temat wymagań eksperymentu i dostępności linii badawczej.
   7. Jeśli próbki białka są wysyłane, należy je przesyłać wyłącznie po wcześniejszym uzgodnieniu. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji 1.2.
   8. Jeśli użytkownik ma przybyć na teren zakładu w celu ustawienia płytek krystalizacyjnych w CF, należy skontaktować się z personelem placówki w sprawie dostępności przedziału czasowego na korzystanie z oprzyrządowania obiektu i postępować zgodnie z sekcją 1.2.1.
   9. Jeśli użytkownik przynosi płytki na miejsce, upewnij się, że próbka została dozowana do odpowiedniego typu płytki i umieść krople krystalizacji we właściwym miejscu i we właściwej ilości. Postępuj zgodnie z sekcją 1.2.2. Linia badawcza akceptuje tylko specyficzne płytki do krystalizacji in situ (Greiner CrystalQuickX i MiTeGen In Situ-1); upewnij się, że krople nie są większe niż 200 nL.
2. Eksperyment krystalizacji przeprowadzony w CF
   UWAGA: Zakład oferuje szereg wysokoprzepustowych metod krystalizacji makromolekularnej, takich jak dyfuzja parowa, a także krystalizacja okresowa w oleju i LCP. Zaleca się rozpoczęcie od 70-100 μl czystego białka i przeprowadzenie eksperymentów dyfuzji parowej dla rozpuszczalnych białek za pomocą trzech ekranów przy użyciu proporcji 100 nL roztworu białkowego i 100 nL roztworu zbiornika krystalizacyjnego i inkubacji płytek w temperaturze 20 °C. Na terenie obiektu dostępnych jest wiele ekranów komercyjnych. Regulacja wilgotności i temperatury jest dostępna w najczęściej stosowanych 4 °C i 20 °C. Użytkownicy, którzy odwiedzają CF, otrzymują ustandaryzowane szkolenie i wsparcie w zakresie obsługi oprzyrządowania do krystalizacji i będą korzystać z ustawień opisanych w niniejszym dokumencie.
   1. Wysyłka próbek do konfiguracji w CF
      UWAGA: Przed przybyciem na miejsce próbka białka musi zostać zatwierdzona na wniosek w systemie UAS. Gdy próbka białka dotrze na miejsce, pracownicy przeprowadzą eksperymenty krystalizacji zgodnie z instrukcjami zawartymi w poprzedniej komunikacji z użytkownikiem. Potwierdzenie zostanie wysłane e-mailem z informacjami o kodzie kreskowym dla eksperymentalnych płytek krystalizacyjnych. Użytkownik zostanie poproszony o dodanie płytek krystalizacyjnych jako pojemników do odpowiedniej propozycji. Po wykonaniu tej czynności płytki mogą być przechowywane w automatycznych imagerach w zakładzie krystalizacji lub na linii badawczej. ISPyB będzie interfejsem wykorzystywanym do interakcji na linii badawczej.
      1. Dostarczyć roztwór próbki białka o stężeniu do krystalizacji w wielokrotnościach 25 μl podwielokrotności. Wyraźnie oznaczyć probówki z próbkami zawierające próbkę białka.
      2. W razie potrzeby należy podać białkowy roztwór buforowy, roztwór liganda lub roztwór rezerwuarowy.
      3. Poinformuj personel placówki, jakie sita i współczynniki upuszczenia powinny być używane.
   2. Ustawienia płytki krystalizacyjnej
      UWAGA: Wymagamy, aby krople krystalizacji w płytce Greiner CrystalQuickX i MiTeGen In Situ-1 znajdowały się w określonym miejscu; Tablice ustawione w innym miejscu powinny używać następujących ustawień Mosquito¹³ opisanych tutaj.
      1. Aby dostosować definicję płytki dla MiTeGen In Situ-1, otwórz oprogramowanie Mosquito SPT i kliknij stronę standardowej definicji płytki MiTeGen In Situ-1, klikając Ustawienia | 96 Studnia | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 krople) (Rysunek 2A). Kliknij przycisk edycji i zmień wartości dla lokalizacji dołka podrzędnego 2: Przesunięcie X do - 1,2 i Przesunięcie Y do 1,8 oraz dla lokalizacji dołka podrzędnego 3: Przesunięcie X do 1,3 i Przesunięcie Y do 1,8 (Rysunek 2B,C).
      2. Aby dostosować definicję płyty dla Greiner CrystalQuickX, otwórz oprogramowanie Mosquito SPT i kliknij standardową stronę definicji płyty Greiner CrystalQuickX, klikając Ustawienia | 96 Studnia | Greiner CrystalQuickX (Rysunek 2D). Kliknij przycisk edycji i zmień wartości dla lokalizacji dołka podrzędnego 1: Przesunięcie X do - 1,95 i Przesunięcie Y do 1,45 oraz dla położenia dołka poniżej 2: Przesunięcie X do 1,95 i Przesunięcie Y do 1,45 (Rysunek 2E,F).

2. Korzystanie z linii badawczej w Diamentowym Źródle Światła

UWAGA: Cała interakcja użytkowników z linią badawczą odbywa się zdalnie za pomocą interfejsu ISPyB¹¹. Nie jest wymagana fizyczna obecność na linii badawczej, a dane są zbierane za pomocą systemu opartego na kolejkach, a nie są zaplanowane w określonym czasie. Użytkownicy będą mieli propozycję powiązaną z dostępem do Diamond Light Source. Na linii badawczej każda płytka krystalizacyjna ma przypisaną unikalną wizytę i jest zdefiniowana jako "pojemnik" w ISPyB¹¹ analogicznie do krążka zawierającego próbki w temperaturze 100 K. Ekrany optymalizacyjne nie mogą być tworzone za pomocą interfejsu SynchWeb i w związku z tym informacje są zwykle dodawane do sekcji komentarzy (patrz krok 2.1.4.). Osoba rejestrująca tabliczkę będzie musiała sprawdzić adres e-mail, ponieważ właściciel tablicy będzie otrzymywał wiadomości e-mail dotyczące obrazowania, a także powiadomienia o wypełnieniu tablicy.

1. Tablice rejestracyjne
   1. Zaloguj się do ISPyB za pomocą odpowiedniego identyfikatora FedID Diamond i wybierz opcję Propozycje. Wyszukaj interesującą Cię propozycję, przewijając lub wpisując numer oferty w pasku wyszukiwania. Wybierz Przesyłka z menu rozwijanego pod numerem oferty (Rysunek 3A), co otworzy okno Przesyłki z przesyłkami w tej ofercie. Kliknij +Dodaj przesyłkę w prawym górnym rogu (Rysunek 3B), aby otworzyć okno Dodaj nową przesyłkę, nadaj przesyłce nazwę, kliknij Automated/Imager, a następnie kliknij przycisk Dodaj przesyłkę w lewym dolnym rogu (Rysunek 3C).
   2. W oknie wysyłki (Rysunek 3D) kliknij +Dodaj kontener, co spowoduje wyświetlenie widoku strony Dodaj kontener (Rysunek 3E). Z menu rozwijanego Typ kontenera wybierz jeden z odpowiednich typów płyt. Strona zmieni się, aby odzwierciedlić wybrany typ kontenera. Wprowadź kod kreskowy i nazwę kontenera zgodnie z instrukcjami e-mail od personelu linii badawczej właściwymi dla płytek eksperymentalnych. Pamiętaj, że rozróżniana jest wielkość liter.
   3. Wybierz imager VMXi 20 °C z menu rozwijanego Requested Imager, harmonogram obrazowania Fibonacciego z menu rozwijanego Harmonogram obrazowania, ekran krystalizacji z menu rozwijanego Crystallization Screen oraz nazwę użytkownika z menu rozwijanego Owner, kliknij przycisk View i wprowadź poprawny kontaktowy adres e-mail w polu Email box (Rysunek 3F).
   4. Wprowadź więcej szczegółów na temat tabliczki w polu Komentarze. Wybierz odpowiednią próbkę z menu rozwijanego Białko i użyj akronimu zarejestrowanego w UAS i zatwierdzonego przez Diamond w ramach propozycji eksperymentalnej. Wprowadź tę samą nazwę w polu Przykładowa nazwa; Pozostałe pola pozostaw puste.
   5. Kliknij ikonę +Płytka, aby powtórzyć próbkę na całej płytce i wypełnić cały pojemnik zielonymi kwadratami. Kliknij przycisk +Dodaj kontener u dołu strony, aby zarejestrować tabliczkę. Poproś pracownika linii badawczej o przeniesienie płytki do odpowiedniego imagera, gdzie będzie ona przechowywana i obrazowana. Wizyta zostanie wygenerowana, gdy kontener zostanie zapisany w imagerach, a użytkownik otrzyma wiadomość e-mail z linkiem do płyty i jej obrazów.
2. Wyświetlanie wyników obrazowania
   1. Przejdź do interesującej Cię oferty proponowanej (kroki 2.1.1), wybierz opcję Kontenery z menu rozwijanego pod numerem oferty i obserwuj listę dostępnych kontenerów dla oferty. Wybierz płytki filtra, jeśli dostępne są inne typy uchwytów na próbki. Aby jeszcze bardziej zawęzić wyszukiwanie, zaznacz pole Moje kontenery, aby wyświetlić tylko najbardziej odpowiednie kontenery skojarzone z bieżącym identyfikatorem zalogowanego użytkownika. Kliknij odpowiedni kontener, przesuwając kursor nad pojedynczy wiersz i klikając lewym przyciskiem myszy.
   2. Po wybraniu kontenera zostanie wyświetlony nowy widok, pokazujący przegląd płyty (Rysunek 4A). Kliknij kroplę w reprezentacji płyty po lewej stronie ekranu, aby wyświetlić najnowszy obraz z tego odpowiedniego upuszczania. Użyj strzałek, aby nawigować między kroplami lub wybierz pojedyncze krople za pomocą myszy/kursora.
   3. Aby wyświetlić historyczne obrazy kropli, kliknij przycisk H i poczekaj, aż pojawi się wyskakująca galeria obrazów nad bieżącym obrazem kropli studni. Najedź kursorem na poszczególne obrazy, aby zaktualizować główny obraz upuszczania.
   4. Oceniaj obrazy, aby wskazać stan każdej kropli, naciskając przyciski od 0 do 9. Aby wyświetlić poszczególne kategorie, otwórz menu rozwijane Wynik w lewym górnym rogu upuszczanego obrazu. Szukaj niebieskich krzyżyków na każdym z obrazów upuszczania, które są wynikiem algorytmu (CHiMP) wyszkolonego do szukania "kryształów" na obrazach.
   5. Kliknij trzeci przycisk ikony o nazwie Zmierz w prawym górnym rogu upuszczanego obrazu, aby uzyskać dostęp do narzędzia pomiarowego. Aby użyć tego narzędzia, kliknij i przeciągnij linię, a linijka wydłuży się i poda odległość w μm.
   6. Aby poprosić o dodatkową sesję obrazowania, kliknij opcję Widoczne lub UV w polu rozwijanym obok nagłówka Działania u dołu strony. Następnie kliknij przycisk Request Plate Imaging (Poproś o obrazowanie płyty).
3. Wybór kryształów/CHiMP
   1. Aby ręcznie dodać punkty do zbierania danych, naciśnij przycisk +Zaznacz punkt. Najedź kursorem na żądany punkt zainteresowania i wybierz. Poczekaj, aż pojawi się czerwony krzyżyk.
      UWAGA: Na jeden drop można utworzyć do 100 obiektów.
   2. Gdy wszystkie punkty zostaną zaznaczone, kliknij przycisk +Zakończ. Pamiętaj również, aby kliknąć przycisk +Zakończ przed próbą zmierzenia obiektów. Aby dodać regiony do zbierania danych za pomocą skanowania siatki, kliknij przycisk +Oznacz region. Kliknij w lewy górny punkt i przeciągnij w dół i w prawo, aby utworzyć obszar, który zostanie zeskanowany raster na linii badawczej. Podobnie jak w przypadku punktów, kliknij przycisk +Zakończ, gdy zostaną utworzone wszystkie żądane regiony.
      UWAGA: Lepiej jest utworzyć jeden większy region niż wiele małych regionów.
   3. Obserwuj niebieskie krzyżyki już na obrazach kropli, które są wynikiem algorytmu zaprojektowanego do automatycznego lokalizowania obiektów krystalicznych (CHiMP). Aby zobrazować ocenę CHiMP dotyczącą spadków krystalizacji, kliknij pole wyboru Pokaż automatyczne wyniki, a następnie zmień menu rozwijane dla klasy. Zazwyczaj najbardziej użytecznym ustawieniem jest tutaj opcja kryształu (Rysunek 4B).
      UWAGA: Jest to nowa funkcja i nie ma gwarancji, że znajdziesz wszystkie kryształy, a także inne obiekty, które nie są kryształami.
   4. Gdy wszystkie punkty i regiony zostaną zaznaczone w odpowiednich dropach, kliknij przycisk Przygotuj do zbierania danych u dołu strony.
4. Przygotowanie próbek do zbierania danych
   1. Obserwuj listę próbek zawierających punkty lub obszary wybrane w poprzednim kroku lub zlokalizowane automatycznie (Rysunek 4C). Dodaj pojedyncze punkty lub regiony, naciskając przycisk + lub dodaj wszystkie wyświetlane próbki, klikając przycisk Dodaj bieżącą stronę do kolejki.
   2. Filtry są dostępne w celu wyświetlenia tylko punktów, regionów, punktów automatycznych lub punktów ręcznych. Aby wyświetlić tylko te próbki, które nie zostały sfotografowane (tj. wystawione na działanie promieni rentgenowskich), kliknij opcje Bez danych i Nieukończone nad przyciskami filtrów.
   3. Wybierz poszczególne próbki, klikając odpowiednią linię i zaktualizuj obraz po prawej stronie ekranu, aby pokazać właściwy spadek i indywidualny punkt. Jeśli na liście znajduje się wiele próbek, zwiększ liczbę próbek wyświetlanych na stronie, wybierając menu rozwijane z wartością 10 jako wartością domyślną i do 100 jako maksymalną liczbą wyświetlanych próbek.
   4. Po dodaniu wszystkich punktów i regionów do kolejki upewnij się, że wszystkie parametry zbierania danych eksperymentalnych są skojarzone z każdym eksperymentem.
      1. Użyj filtrów dla Punktu, Regionu, Ręcznie i Auto. Kliknij filtr punktowy i kliknij pole wyboru Zaznacz wszystko poniżej przycisków filtrów, aby jednocześnie zastosować parametry do wszystkich próbek widocznych na bieżącej liście próbek w kolejce.
      2. Wybierz parametry eksperymentalne z menu rozwijanego po prawej stronie ekranu pod zdjęciem upuszczenia (Rysunek 4D). W przypadku regionów wybierz opcję Skanowanie siatki DMM co 10 mikronów, 100 procent transmisji. W przypadku wszystkich innych eksperymentów punktowych wybierz odpowiednie inne opcje z menu rozwijanego.
      3. Aby zbierać dane dotyczące oscylacji, kliknij opcję Omega Scan DMM 60 stopni 5 procent transmisji, aby zebrać maksymalną ilość danych z pojedynczej próbki. Zastosuj małe rotacje dla bardzo małych kryształów lub próbek wrażliwych na promieniowanie i zmieniaj transmisję w oparciu o wcześniejsze doświadczenia z określoną formą kryształu. Gdy wszystkie próbki będą miały poprawnie zastosowane parametry eksperymentalne, kliknij przycisk Kontener kolejki u dołu strony.
   5. Gdy tabliczka dotrze na szczyt kolejki, zostanie przedstawiona na linii badawczej, zostaną zebrane zestawy danych, a następnie ponownie wróci do magazynu próbek w obrębie linii badawczej. Po zakończeniu zbierania danych z płyty poszukaj wiadomości e-mail z linkiem, który należy kliknąć, aby uzyskać dostęp do odpowiednich danych.
5. Tworzenie przykładowych grup
   UWAGA: Grupy próbek mogą być tworzone w celu grupowania podobnych próbek w wielu kroplach lub płytkach. Wszystkie zestawy danych w tych przykładowych grupach zostaną przetworzone przy użyciu potoku xia2.multiplex¹⁴ po przetworzeniu przez DIALS. Może to być przydatne podczas zbierania wielu bardzo małych klinów danych, a także może być przydatne do zwiększenia stosunku sygnału do szumu w eksperymentach z wiązaniem ligandów.
   1. Wybierz opcję Zarządzanie przykładowymi grupami z menu rozwijanego pod numerem propozycji. Poszukaj listy grup, jeśli zostały już utworzone przez innych użytkowników. Aby wygenerować nową grupę, kliknij przycisk +Utwórz przykładową grupę. Kliknij przesyłkę z menu rozwijanego na stronie Utwórz przykładową grupę, aby wyświetlić przeglądarkę próbek (Rysunek 5A). Kliknij kontener zawierający odpowiednie przykłady z listy, która zostanie wypełniona.
   2. Po kliknięciu kontenera poszukaj grafiki przedstawiającej przegląd tablicy.
   3. Kliknij krople pojedynczo, klikając pojedynczą kroplę (Rysunek 5B) lub kliknij krople w wierszach lub kolumnach, klikając odpowiednią literę wiersza lub numer kolumny. Po wybraniu wszystkich studni skojarzonych z pojedynczą grupą wprowadź nazwę grupy w polu Nazwa grupy próbki i kliknij przycisk Zapisz grupę próbek. Kliknij przycisk Wyświetl przykładowe grupy na tej stronie, aby powrócić do listy już wygenerowanych przykładowych grup powiązanych z propozycją (Rysunek 5C).
6. Edytowanie grup próbek
   1. Kliknij przykładową grupę na liście grup na stronie Zarządzanie przykładowymi grupami.
   2. Kliknij przycisk +Edytuj przykładową grupę obok kontenerów, które pojawiają się poniżej informacji o grupie (Rysunek 5C).
   3. Obserwuj krople, już powiązane z grupą próbek, podświetlone na przeglądzie płytki.
   4. Dodaj więcej kropli do grupy próbek, klikając krople, studnie lub kolumny, tak jak poprzednio.
      UWAGA: Dropów nie można usunąć z grupy próbki.
   5. Po dodaniu kolejnych kropli edytuj nazwę grupy próbnej, a następnie zapisz ją lub po prostu zapisz, klikając przycisk Zapisz grupę próbek.
7. Wizualizacja i analiza wyników grup próbek
   1. Kliknij pojedynczą grupę na liście grup próbek, aby wyświetlić przegląd blach kontenera lub kontenerów skojarzonych z grupą. Krople wchodzące w skład grupy zostaną podświetlone na tym wyświetlaczu (Rysunek 5D).
   2. Poszukaj listy zawierającej chronologicznie ostatnie trzy zadania multipleksu, jeśli dane zostały zebrane w tej grupie.
   3. Kliknij wiersz przebiegu multipleksu, aby zaktualizować poniższe wyniki przetwarzania.
   4. Zwróć uwagę na przycisk szybkiego łącza, który pokazuje liczbę zestawów danych skojarzonych z grupą. Kliknij ten przycisk, aby otworzyć nową stronę Kolekcje danych z wyświetlonymi poszczególnymi kolekcjami zestawów danych.

3. Dostęp do automatycznego przetwarzania danych

UWAGA: Po zebraniu danych, są one przekazywane przez kilka automatycznych potoków przetwarzania danych. Cztery standardowe rurociągi używane na liniach badawczych MX w Diamond są również uruchamiane na danych zebranych na linii badawczej. Są to 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' i 'autoPROC'¹⁵. "fast_dp" zapewni szybką redukcję danych w celu szybkiej oceny jakości. Pozostałe trzy potoki będą wymagały więcej czasu na obliczenia i będą uruchamiać wiele różnych pakietów oprogramowania do redukcji danych dla porównania. W związku z tym wydruk jest zwykle wyższej jakości niż wydruk "fast_dp". Zestawy danych zebrane na linii badawczej będą również przepuszczane przez oprogramowanie do automatycznego łączenia wielu kryształów 'xia2.multiplex'¹⁴, które połączy wszystkie zestawy danych w zdefiniowaną grupę. Należy pamiętać, że chociaż skanowanie siatki nie jest obecnie przetwarzane automatycznie, dane można przetwarzać ręcznie za pomocą potoku "xia2.ssx". Wyniki automatycznego przetwarzania potoków można znaleźć w ISPyB¹¹ przy użyciu następującego protokołu.

1. Lokalizowanie zestawów danych
   1. Zaloguj się do ISPyB zgodnie z powyższym opisem i wybierz opcję Propozycje.
   2. Wyszukaj interesującą Cię propozycję, przewijając lub wpisując numer oferty w pasku wyszukiwania.
   3. Kliknij żądaną wizytę z listy, która pojawi się na ekranie, aby uzyskać dostęp do okna Zbiory danych dla tej wizyty.
   4. Zastosuj dowolne filtry.
      UWAGA: Popularnym filtrem jest filtr "Automatycznie zintegrowany", który wyświetla tylko zestawy danych, które zostały pomyślnie uruchomione przez co najmniej jeden potok przetwarzania. Spowoduje to wykluczenie skanowania siatki, ponieważ nie są one obecnie automatycznie przetwarzane przez ISPyB.
   5. Przewiń stronę w dół, aby znaleźć interesujący Cię zestaw danych.
      UWAGA: Każdy zestaw danych będzie wyświetlał identyfikator próbki, użyte parametry eksperymentalne, przeglądarkę obrazów dyfrakcyjnych, przeglądarkę obrazów kryształkowych oraz wykres analizy dla każdego obrazu w celu szybkiej obserwacji jakości danych.
2. Aby uzyskać dostęp do wyników automatycznego przetwarzania
   1. Kliknij kartę Automatyczne przetwarzanie pod podsumowaniem danych określonego eksperymentu, aby sprawdzić wyniki automatycznego zmniejszania danych (Rysunek 6A).
   2. Kliknij różne zakładki odpowiadające różnym potokom, aby wyświetlić szczegółowe podsumowanie każdego wyniku.
      UWAGA: Jeśli zdefiniowano grupy próbek, będą dwie zakładki odpowiadające zadaniom multipleksu. Jeden z nich będzie odpowiadał scaleniu wszystkich zestawów danych w grupie do tego momentu, podczas gdy drugi będzie odpowiadał scaleniu zestawów danych tylko w tym upuszczeniu.
   3. Kliknij przycisk Logs & Files, aby pobrać wynikowe pliki .mtz, jeśli przetwarzanie zakończyło się pomyślnie, oraz wszelkie powiązane pliki dziennika. Kliknij kartę Downstream Processing (Przetwarzanie końcowe) pod sekcją Auto Processing, aby wyświetlić dane wyjściowe z DIMPLE.
      UWAGA: DIMPLE będzie działać tylko wtedy, gdy plik PDB został dostarczony podczas przesyłania próbki.
   4. Kliknij przycisk Logs & Files, aby pobrać dowolne wynikowe dane wyjściowe z DIMPLE.
3. Aby uzyskać dostęp do wyników multipleksu grupowego, otwórz menu rozwijane u góry ekranu z zapisanym numerem propozycji i kliknij opcję Zarządzanie grupami próbnymi. Kliknij wiersz odpowiadający żądanej grupie w odpowiednim kontenerze. Przewiń w dół, aby znaleźć listę wyjść multipleksowych odpowiadających grupie, przedstawioną wizualnie na schemacie płyty.
   1. Kliknij żądane wyjście multipleksu z podanej listy. Kliknij przycisk xxx Data Sets (Zestawy danych) , gdzie xxx to liczba scalonych zestawów danych (Figure 6B).
      UWAGA: Spowoduje to otwarcie ekranu Kolekcje danych, ale zostaną wyświetlone tylko zestawy danych z wybranego zadania multipleksu.
   2. Kliknij kartę Automatyczne przetwarzanie w górnym eksperymencie.
   3. Kliknij kartę Przetwarzanie multipleksowe, która odpowiada odpowiedniej liczbie scalonych zestawów danych.
   4. Kliknij przycisk Logs & Files (Dzienniki i pliki), aby pobrać plik .mtz i odpowiednie pliki dziennika (jak w kroku 3.2.3).
4. Aby uzyskać dostęp do wyników skanowania siatki
   1. Przejdź do ekranu Zbiory danych dla żądanej wizyty. Wyniki danych skanowania siatki zostaną wyświetlone wraz z wszelkimi zebranymi danymi obrotu.
      UWAGA: Nie będzie żadnych wyników automatycznego przetwarzania.
   2. Na obraz kropli kryształu zostanie nałożona siatka z mapą cieplną reprezentującą obecność dyfrakcji. Kliknij kwadrat, aby wyświetlić obraz dyfrakcyjny dla tej pozycji w siatce. Kliknij menu rozwijane u góry obrazu studni kryształowej, aby zmienić to, co przedstawia mapa cieplna. Wartość domyślna to całkowita intensywność dyfrakcji, ale można ją zmienić na całkowitą liczbę punktów, szacowaną rozdzielczość lub klatki bez lodu.

4. Przetwarzanie danych

UWAGA: Wybrane zestawy danych mogą być ponownie przetwarzane przez interfejs ISPyB¹¹ przy użyciu tych samych potoków przetwarzania, które są uruchamiane automatycznie ze zmienionymi ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika. Można zastosować punkt odcięcia rozdzielczości; Jeśli znana jest symetria/komórka kryształu, można ją również zdefiniować, aby zapewnić, że rurociągi przetwarzania działają we właściwym ustawieniu. Wybrane zakresy obrazów w określonych zestawach danych można również scalić przy użyciu dostępnych potoków wielokrystalicznych. Może się to okazać korzystne, jeśli systematyczne uszkodzenia popromienne spowodują, że druga część obrazów dyfrakcyjnych będzie słabej jakości. Jest to również opcja dla użytkownika, aby pobrać swoje zestawy danych przy użyciu protokołu opisanego powyżej i uruchomić lokalnie żądane oprogramowanie do ponownego przetwarzania, dla którego samouczki są bezpłatnie dostępne gdzie indziej (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Aby ponownie przetworzyć wiele pojedynczych zestawów danych
   1. Zaloguj się do ISPyB i przejdź do interesujących Cię zestawów danych (krok 3.1).
   2. Kliknij zestaw danych, a następnie kliknij ikonę koła zębatego na pasku tytułu zestawu danych (Rysunek 6), aby otworzyć okno ponownego przetwarzania.
   3. Skonfiguruj dowolne żądane ustawienia i wybierz, które klatki zostaną uwzględnione w ponownym przetwarzaniu.
      UWAGA: Zakres obrazu można zdefiniować, wpisując zakres w oznaczonych polach lub klikając i przeciągając żądany obszar na wykresie analizy dla każdego obrazu (Rysunek 7A).
   4. OPCJONALNIE: Aby dodać kolejny zestaw danych do indywidualnego ponownego przetwarzania, kliknij jego ikonę koła zębatego, a pojawi się on w oknie ponownego przetwarzania pod pierwszym zestawem danych. Zaznacz pole Przetwarzaj indywidualnie.
   5. Kliknij przycisk Integruj.
2. Aby ponownie przetworzyć dane wielokrystaliczne
   1. Otwórz okno ponownego przetwarzania z dowolnego zestawu danych.
   2. Kliknij przycisk Multi-Crystal, aby otworzyć nowy ekran.
   3. Przewiń w dół, aby znaleźć serię wykresów analizy poszczególnych obrazów z eksperymentów przeprowadzonych podczas wizyty.
   4. Wybierz potok przetwarzania z menu rozwijanego.
   5. OPCJONALNIE: Zdefiniuj dowolne limity rozdzielczości lub znane parametry komórki elementarnej.
   6. Kliknij i przeciągnij, aby zdefiniować zakresy obrazów, które mają zostać uwzględnione w przetwarzaniu wielu kryształów (Rysunek 7).
      UWAGA: Należy to zrobić na wielu różnych wykresach, tak aby zestawy danych z wielu różnych kryształów zostały połączone.
   7. Kliknij przycisk Integruj (Rysunek 7B).
3. Aby uzyskać dostęp do ponownie przetworzonych danych
   1. Przejdź do strony Zbiory danych dla konkretnej wizyty (kroki 3.1.1–3.1.3).
   2. Kliknij przycisk Ponowne przetwarzanie u góry ekranu.
   3. Przewiń w dół, aby zlokalizować żądane zadanie.
   4. Kliknij ścieżkę pliku w kolumnie po prawej stronie, aby otworzyć ekran Kolekcje danych dla ponownie przetworzonych danych.
   5. Otwórz kartę Automatyczne przetwarzanie i pobierz dane zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 3.2).
      UWAGA: Wszystkie ponownie przetworzone zadania można zidentyfikować za pomocą symbolu okrągłych strzałek obok nazwy potoku.

Wyniki

Zaplecze do krystalizacji oraz linia wiązki VMXi były wykorzystywane w szerokiej gamie typów projektów i przypadków użycia. Poniżej przedstawiono kilka przykładów ilustrujących cele, jakie mogą stawiać przed sobą użytkownicy.

Studium przypadku 1: Standardowe gromadzenie danych

Linia wiązki umożliwia szybkie wyznaczanie struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej z niewielkiej liczby kryształów znajdujących się na płytce do krystalizacji. Minimalna liczba kryształów zależy od grupy przestrzennej i orientacji kryształów, lecz zazwyczaj wynosi od 1 do 4, choć lepszą jakość danych można uzyskać poprzez scalenie danych z kilkudziesięciu kryształów. Niedawnym przykładem jest jeden ze standardów linii wiązki, taumatyna. Wiele kryształów, przedstawionych na Ryc. 8A, zostało ręcznie zaznaczonych do zbiórki danych zgodnie z opisem w sekcji 2.3 protokołu. Kryształy te dodano do kolejki zgodnie z opisem w sekcji 2.4 protokołu, a parametry eksperymentalne wybrano z listy rozwijanej. Po zastosowaniu parametrów eksperymentalnych płytka została wprowadzona do kolejki zbiórki danych. Zbiory danych zostały zebrane, automatycznie przeskalowane i scalone przy użyciu potoku xia2.multiplex, zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu. Przykład wyniku z SynchWeb pokazano w środkowej części Ryc. 8A. Pięć scalonych zbiorów danych pozwoliło na uzyskanie zbioru o rozdzielczości 1,66 Å. W przypadku standardowej zbiórki danych z około pięciu kryształów w jednej studzience, zbiory danych były gromadzone w ciągu 2,5 min.

Studium przypadku 2: Wiązanie ligandu – eksperyment fragmentowy z wykorzystaniem białka Mac1

Uzyskanie struktur kompleksów białko-ligand w temperaturze pokojowej może być w prosty sposób zrealizowane przy użyciu linii wiązki. Ligandy można dodawać do kropel na płytkach krystalizacyjnych (ręcznie lub za pomocą akustycznego dozowania kropel), a dane pomierzyć po odpowiednim czasie inkubacji. W opisanym tutaj przykładzie szereg fragmentów naniesiono do dołków zawierających kryształy pierwszej makrodomeny białka nsp3 (Mac-1) wirusa SARS-CoV-2 na płytce krystalizacyjnej. Dwa dołki zawierające ten sam fragment przypisano do jednej grupy, zgodnie z opisem w kroku 2.5 protokołu. Kilka kryształów (42) oznaczono do zbierania danych, jak opisano w krokach 2.3 i 2.4 protokołu, a zestawy danych zebrano przy użyciu standardowych parametrów (obrót 60°, krok 0,1°, czas ekspozycji 0,00178 s, transmisja 5%, 16 KeV – na kryształ) (Rycina 8B). Zestawy danych z dwóch dołków przetworzono automatycznie za pomocą potoku xia2.dials, a następnie uruchomiono potok xia2.multiplex w celu automatycznego scalenia 22 z tych zestawów danych. Następnie na wynikach tych potoków uruchomiono program DIMPLE, co pozwoliło uzyskać mapy wyraźnie wykazujące obecność związanego fragmentu. Model fragmentu zbudowano w nieobsadzonej gęstości i dalej go dopracowano (Rycina 8B po prawej). Struktury z ligandem w temperaturze pokojowej można łatwo wyznaczyć, stosując tę serię kroków, co dostarcza bezcennych informacji i informacji zwrotnych dla procesu projektowania leków opartego na strukturze. W przypadku tego zbierania danych z 42 kryształów w wielu dołkach, zestawy danych zebrano w ciągu 10 min.

Studium przypadku 3: Rozwiązanie struktury z grupą przestrzenną o niskiej symetrii i orientacjami preferencyjnymi W wyniku eksperymentów krystalizacyjnych z cytochromem wiążącym gazy typu c otrzymano stos wielu kryształów o morfologii płytkowej (Rysunek 8C). Poprzez wybór kilku pozycji na krawędzi stosu, w których w wiązce promieni rentgenowskich znajdował się tylko pojedynczy kryształ, możliwe było uzyskanie wysokiej jakości zbioru danych o rozdzielczości 1,75 Å poprzez połączenie fragmentów danych z czterech kryształów, pomimo monoklinicznej grupy przestrzennej (C2). Pozwoliło to na szybki postęp projektu bez konieczności dalszej optymalizacji warunków krystalizacji. Wynik ten został opisany wcześniej⁹. W przypadku tej kolekcji danych z czterech kryształów w studzience, zbiory danych zebrano w ciągu 2 min.

Studium przypadku 4: Pozyskiwanie informacji i struktury w temperaturze pokojowej z mikrokryształów na płytce przy użyciu krystalografii seryjnej

Często, gdy w kropli pojawiają się mikrokryształy lub gdy użytkownicy dążą do optymalizacji protokołów mikrokrystalizacji w trybie wsadowym (batch) jako etapu wstępnego do eksperymentów z krystalografii seryjnej w synchrotronach lub źródłach XFEL, bardzo pomocne jest uzyskanie szybkiej informacji zwrotnej na temat właściwości dyfrakcyjnych i wymiarów komórki elementarnej różnych prób przy użyciu minimalnej ilości materiału. W tym przypadku mikrokryształy lizozymu hodowane w trybie wsadowym zostały przeniesione pipetą na płytkę do krystalizacji (objętość 200 nL na kroplę), a dane z ośmiu kropli zebrano za pomocą skanowania siatkowego (grid scan) z krokiem 10 µm (Rycina 9). Powstałe 25 906 obrazów statycznych przetworzono za pomocą oprogramowania do krystalografii seryjnej, co pozwoliło na zaindeksowanie i scalenie 9 891 obrazów dyfrakcyjnych; w efekcie uzyskano zestaw danych o rozdzielczości 2,0 Å, który dobrze udoskonalono w odniesieniu do opublikowanej struktury w temperaturze pokojowej (R_work = 19,6%, R_free = 23,6% z użyciem PDB 8A9D) (Tabela 1). Umożliwiło to szczegółową analizę rozkładu komórek elementarnych oraz wyznaczenie struktury mikrokryształów w temperaturze pokojowej, co może służyć jako podstawa do złożonych eksperymentów z krystalografii seryjnej, w tym badań z rozdzielczością czasową. Całkowita wymagana objętość zawiesiny mikrokryształów wyniosła 1,6 µL. W przypadku tej kolekcji danych z mikrokryształów w ośmiu dołkach przy użyciu skanowania siatkowego, zestawy danych zebrano w ciągu 40 min.

Rycina 1: Schemat procesu prowadzącego od białka do struktury, integrujący przesiewanie krystalizacji, optymalizację w placówce krystalizacji, zautomatyzowane gromadzenie i przetwarzanie danych w temperaturze pokojowej bez konieczności wycinania kryształów w VMXi, przesiewanie fragmentów XChem oraz gromadzenie danych na innych liniach wiązek MX. Użytkownicy mogą rozpocząć proces, dostarczając próbkę lub przynosząc płytki do linii wiązki VMXi. Skrót: Versatile Macromolecular Crystallography in situ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Interfejs Mosquito SPT Labtech do konfiguracji płytek krystalizacyjnych. (A) (1) Widok konfiguracji MiTeGen In Situ-1. Wybierz standardową płytkę MiTeGen 2 drop, przechodząc do (2) typu płytki 96-dołkowej i wybierając (3) płytkę MiTeGen plate 2 drop. Aby zmienić parametry definicji dla kropli 1 i kropli 2, co jest wymagane dla VMXi, kliknij ikonę (4) edytuj. Otwiera to nowe okno (B), w którym (5) przesunięcia X i Y muszą zostać zmienione zgodnie z rysunkiem. Wybierz (B) sub well 2 oraz (C) sub well 3 i odpowiednio zmień wartości. (D) Widok konfiguracji CrystalQuickX. Wybierz standardową płytkę CrystalQuickX 2 drop, przechodząc do typu płytki 96-dołkowej i wybierając płytkę MiTeGen plate 2 drop. Aby zmienić parametry definicji dla kropli 1 i kropli 2, co jest wymagane dla VMXi, kliknij ikonę edytuj w ten sam sposób jak powyżej. Otwiera to nowe okno, w którym (E,F) przesunięcia X i Y muszą zostać zmienione zgodnie z rysunkiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Interfejs SynchWeb pokazujący sposób tworzenia przesyłki VMXi, rejestracji płytki oraz sprawdzania danych kontaktowych. Przedstawiono zrzuty ekranu z poszczególnych etapów wprowadzania informacji do interfejsu SynchWeb: (A) menu rozwijane, (B,C) rejestracja nowej przesyłki, (D) rejestracja nowego pojemnika, (E) wprowadzanie informacji o płytce, (F) sprawdzanie danych kontaktowych oraz (G) lista zarejestrowanych pojemników w ramach wniosku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Wybór i przygotowanie próbek do gromadzenia danych przy użyciu SynchWeb. Przedstawiono serię zrzutów ekranu pokazujących poszczególne etapy przygotowania próbek do gromadzenia danych za pomocą interfejsu SynchWeb. (A) Wybór punktów i obszarów zainteresowania z przeglądu kropli. W dolnej sekcji tego panelu znajduje się chronologiczna seria zdjęć jednej kropli. (B) Przykład wyniku z programu CHiMP dla jednej płytki, wyróżniający wyniki dla kategorii „crystal”. (C) Dodawanie próbek do kolejki z listy wybranych punktów i obszarów oraz (D) przypisywanie parametrów gromadzenia danych do próbek w kolejce z rozwijanej listy ustawień eksperymentów utworzonych dla linii wiązki. Należy zwrócić uwagę na różnicę między próbkami bez parametrów eksperymentalnych (na czerwono) a tymi, którym prawidłowo przypisano parametry (góra i dół). Na dole tego panelu znajduje się przycisk Queue Container, który dodaje płytkę do kolejki pomiarów na linii wiązki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Tworzenie grup próbek w programie SynchWeb. Seria zrzutów ekranu pokazująca poszczególne etapy tworzenia grup próbek. (A) Płytka(i) zawierające próbki są wybierane z odpowiedniej partii dostawy, a (B) wybierane są krople na płytce. Mogą to być pojedyncze krople lub wybór dokonany według wierszy i/lub kolumn. (C) Lista grup próbek, które zostały już utworzone. (D) Wyświetlona jest lista wyników z trzech ostatnich zadań przetwarzania multipleksowego, które można wybrać, aby zobaczyć statystyki z potoku przetwarzania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Przetwarzanie i redukcja danych. (A) Zrzut ekranu przetworzonego zestawu danych w ISPyB¹¹. Podświetlono przycisk umożliwiający dostęp do funkcji ponownego przetwarzania. Identyfikator próbki i parametry eksperymentalne są wyświetlane w lewym górnym rogu, a przeglądarka obrazów dyfrakcyjnych w centrum. Kliknięcie tego obrazu otworzy interaktywne okno do badania różnych obrazów. Po prawej stronie znajduje się przeglądarka obrazów kryształów; kliknięcie tego obrazu również otworzy interaktywne okno w celu porównania obrazów z linii wiązki i magazynu Formulatrix. Wykres analizy dla każdego obrazu jest wyświetlany po prawej stronie, a kliknięcie go otworzy powiększoną wersję tego wyniku. Kliknięcie karty Auto Processing sprawi, że autoprocesowanie stanie się widoczne, co ułatwi porównanie wyników z różnych potoków przetwarzania. Kliknij karty, aby przełączać się między różnymi potokami przetwarzania i przeglądać szczegółowe wyniki z wybranego potoku. Podświetlono przycisk Logs & Files służący do pobierania danych. Kliknięcie karty Downstream Processing rozwinie i dostarczy wyniki dla wszelkich zestawów danych przepuszczonych przez potoki post-redukcji danych, gdzie jest to właściwe. (B) Zrzut ekranu z ekranu Sample Group Management. Zdefiniowana przez użytkownika nazwa grupy znajduje się na górze, a poniżej widoczny jest opis wizualny zawartych dołków. Zielony dołek oznacza, że wszystkie kryształy zmierzone z tej kropli zostaną włączone do grupy. Widoczne jest podsumowanie różnych zadań multipleksowych wykonanych dla tej grupy, a pod nim znajduje się szczegółowy wynik z procesu multipleksowania. Podświetlono przycisk Data Sets służący do badania włączonych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 7: Okna reprocesowania danych. (A) Indywidualne i (B) wielokrystaliczne zbiory danych. Przedstawiono dwa indywidualne zbiory danych, w których wybrano obszary danych. Przy zaznaczonym polu wyboru Process individually, wybrane obrazy dyfrakcyjne zostaną przetworzone indywidualnie po naciśnięciu przycisku Integrate. Kliknięcie przycisku Multi-crystal otworzy podgląd indywidualnych zbiorów danych. Aby reprocesować obrazy dyfrakcyjne z wielu zbiorów danych, należy wybrać obszary obrazów zgodnie z przedstawionym widokiem, a następnie rozpocząć reprocesowanie, klikając podświetlony przycisk Integrate. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8: Reprezentatywne wyniki z potoku VMXi. (A) Zaznaczone kryształy białka taumatyny wewnątrz kropli krystalizacyjnej (panel lewy), wyniki przetwarzania danych (panel środkowy) oraz gęstość elektronowa (panel prawy). (B) Pomiary na wielu kryształach w celu określenia wiązania fragmentu z domeną Macro SARS-CoV-2. Zbiory danych zostały zebrane z wielu kryształów w obecności fragmentu z przesiewu fragmentów EU-OPENSCREEN przy użyciu standardowych ustawień eksperymentalnych. Przykłady tych pomiarów danych są pokazane w tym wycinku z SynchWeb. Fragment został wbudowany w odpowiadającą mu gęstość i dalej doprecyzowany, co pokazano na obrazie po prawej stronie. (C). Zaznaczone kryształy monokliniczne w stosie z trudnego wyniku krystalizacji wykorzystanego do pomiaru danych. Zielone krzyżyki i czerwone liczby wskazują miejsca, w których dane zostały zmierzone przy użyciu wiązki 10 µm i rotacji 60°. Cztery z wynikowych klinów zostały połączone w celu uzyskania zbioru danych o rozdzielczości 1.75 Å. Gęstość elektronowa wokół grupy Hemu jest wyświetlana po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Krystalografia seryjna w płytce do krystalizacji. (A) Obraz optyczny kropli krystalizacyjnej, gdzie biała ramka reprezentuje obszar zainteresowania. (B) Definicja punktów skanowania siatki. (C) Mapa ciepła wskazująca dyfrakcję. (D) Mapa gęstości elektronowej powstała z zestawu danych krystalografii seryjnej pochodzącego z ponad 9 000 statycznych obrazów dyfrakcyjnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rozdzielczość (Å)	Kompletność (%)	Krotność	I/σ(I)	Rpodział	CC1/2	Wyjątkowe obserwacje
Ogólnie	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
Niski (55,55 - 5,43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
Wysoki (2,03 - 2,00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

Tabela 1: Statystyki danych dla seryjnego zbioru danych VMXi RT. Skróty: I = średnia intensywność przeskalowanych obserwacji; R_split = miara rozbieżności zmierzonych intensywności; CC 1/2 = współczynnik korelacji między dwiema losowymi połowami zbioru danych.

Dyskusja

Opisaliśmy pełną procedurę od momentu przybycia próbki białka do CF do pobrania przez użytkownika danych końcowych do dalszych zastosowań. Krytycznymi etapami są produkcja wysokiej jakości próbki białka i odpowiednich ekranów krystalicznych, przy użyciu komercyjnych rzadkich ekranów matrycowych lub ekranów optymalizacyjnych opartych na ustalonych warunkach. Proces ten może odbywać się w CF, lub użytkownicy mogą przeprowadzić procedury krystalizacji w domowych laboratoriach i przynieść na linię badawcze odpowiednie płytki krystalizacyjne. Określenie odpowiednich parametrów gromadzenia danych może być ważne w przypadku niektórych próbek, szczególnie tam, gdzie problemem jest uszkodzenie przez promieniowanie. W większości przypadków zautomatyzowane przetwarzanie danych jest w pełni wystarczające, aby odpowiedzieć na pytanie naukowe, chociaż użytkownicy zachowują możliwość ponownego przetwarzania za pomocą narzędzi linii badawczej, na przykład gdy grupa kosmiczna jest niejednoznaczna lub wykorzystuje się tylko początkową część zebranych danych w celu zminimalizowania skutków uszkodzeń radiacyjnych.

Jeśli odpowiednie kryształy nie zostaną wytworzone w początkowych próbach krystalizacji, wówczas można zbadać zmiany w stężeniu białka, czystości lub ekranizacji krystalizacji, podobnie jak zastosowanie zasiewania kryształów. Jeśli kryształy nie ulegają dyfrakcji do użytecznej rozdzielczości na linii badawczej, wówczas skany siatkowe mogą być używane z wiązką nietłumioną do oceny nieodłącznej granicy dyfrakcji i komórki elementarnej kryształów w celu kierowania działaniami optymalizacyjnymi. Kryształy, które są zbyt małe, aby można je było zebrać na płytkach (np. <10 μm), mogą zamiast tego nadawać się do krystalografii szeregowej lub eksperymentów nanofokusowych (np. na linii badawczej Diamond VMXm). Rozwiązywanie struktur przy użyciu danych VMXi jest na ogół proste dzięki zastąpieniu molekularnemu, szczególnie od czasu pojawienia się Alphafold¹⁶ , który zapewnia skuteczne modele wyszukiwania. Jeśli to się nie powiedzie, kryształy mogą być zbierane i kriochłodzone z płytek, aby umożliwić konwencjonalne eksperymenty z dyfrakcją anomalną na jednej długości fali, dyfrakcją anomalną na wielu długościach fal lub fazami na długich długościach fal.

Do zalet tej metody należy możliwość uzyskania szybkich, wysokiej jakości zbiorów danych i informacji zwrotnych bezpośrednio z płytek krystalizacyjnych bez konieczności zakłócania kryształów ze środowisk, w których rosły. Tak zwany "renesans temperatury pokojowej" w biologii strukturalnej kładzie nacisk na struktury uzyskane w warunkach niekriogenicznych, aby umożliwić zbadanie większego znaczenia fizjologicznego i dynamiki białek². Zwykle osiąga się nieco niższą rozdzielczość niż w przypadku zoptymalizowanego kryształu chłodzonego kriogenicznie, ale tylko wtedy, gdy ustalono odpowiednie warunki kriogeniczne i jeśli kryształy są odporne na mechaniczne przenoszenie i otwieranie kropli krystalizacji³. Nadchodzącym zastosowaniem, do którego ta linia produkcyjna jest bardzo dobrze dopasowana, jest badanie przesiewowe na dużą skalę kompleksów białko-ligand lub kampanii fragmentów w temperaturze pokojowej w procesie odkrywania leków. Ligandy lub fragmenty mogą być kokrystalizowane lub dodawane za pomocą pipety lub akustycznego wyrzutu kropli przed zebraniem danych w temperaturze pokojowej. Innym zastosowaniem jest szybki pomiar danych z wielu setek lub tysięcy kryształów w bardzo wydajny sposób, a następnie użycie oprogramowania DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ do ekstrakcji izomorficznych klastrów, które mogą reprezentować różne jednostki biologiczne lub do ustalenia statystycznie istotnych różnic między populacjami kryształów, które zostały potraktowane w inny sposób lub wystawione na działanie różnych ligandów lub sygnału.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Formulator	Formulatrix	na zamówienie	Robot do obsługi cieczy
Imager Formulatrix	na	zamówienie	Imager do płytek krystalizacyjnych
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Płytka krystalizacyjna
Gryphon	Instrumenty Art Robbins	620-1000-10	Robot krystalizacyjny
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Płytka krystalizacyjna
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	na żądanie	Robot krystalizacyjny
Rock Imager & Maker	Formualtrix	na życzenie	Oprogramowanie do Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Robot do obsługi cieczy https://www.artrobbins.com/scorpion