Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Summary

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Abstract

Opisano protokoły zrobotyzowanej krystalizacji białek za pomocą Zakładu Krystalizacji w Harwell oraz zbierania danych o temperaturze pokojowej in situ z płytek krystalizacyjnych na linii badawczej VMXi Diamond Light Source. Takie podejście umożliwia proste określenie wysokiej jakości struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej na podstawie wielu kryształów i zapewnia bardzo szybką informację zwrotną na temat wyników prób krystalizacji, a także umożliwia krystalografię szeregową. Wartość struktur w temperaturze pokojowej w zrozumieniu struktury białek, wiązania ligandów i dynamiki staje się coraz bardziej doceniana w społeczności biologii strukturalnej. Ten potok jest dostępny dla użytkowników z całego świata z kilkoma dostępnymi trybami dostępu. Eksperymenty krystalizacji, które są skonfigurowane, mogą być obrazowane i przeglądane zdalnie, a kryształy są automatycznie identyfikowane za pomocą narzędzia uczenia maszynowego. Dane są mierzone w systemie kolejkowym z zestawami danych o rotacji do 60° z wybranych przez użytkownika kryształów na płytce. Dane ze wszystkich kryształów w danej studni lub grupie próbek są automatycznie łączone za pomocą xia2.multiplex, a wyniki są bezpośrednio dostępne za pośrednictwem interfejsu przeglądarki internetowej.

Introduction

Krystalografia rentgenowska pozostaje kluczowym narzędziem do zrozumienia struktury i funkcji białek, dostarczając struktury białek lub ich kompleksów o wysokiej rozdzielczości, na przykład z substratami lub kandydatami na leki. Jednak w wielu przypadkach uzyskanie kryształów o pożądanych właściwościach - wysoce dyfrakcyjnych, krystalicznej formie podatnej na nasiąkanie i bez patologii kryształów, takich jak bliźniacze - pozostaje znaczącym wąskim gardłem¹. Ponieważ na ogół nie można przewidzieć odpowiednich warunków chemicznych do produkcji kryształów białkowych, standardem jest badanie przesiewowe krystalizacji badające tysiące potencjalnych mieszanin chemicznych, często wspomagane przez automatykę/robotykę w ustawianiu ekranów i hoteli kryształowych do monitorowania, często zdalnie, zarejestrowanych obrazów kropli krystalizacji.

Gdy pojawiają się kryształy, zazwyczaj muszą być zebrane ze środowiska krystalizacji za pomocą pętli nylonowej lub kaptonowej, a następnie przeniesione do kropli zawierającej środek krioprotekcyjny (którego poszukiwanie jest dodatkową zmienną) przed zanurzeniem w ciekłym azocie. Te dodatkowe etapy między krystalizacją a zbieraniem danych rentgenowskich mogą obejmować między innymi odwodnienie kropli krystalizacji, gdy jej uszczelnione środowisko zostanie przerwane, naprężenia mechaniczne kryształu podczas obchodzenia się z nim oraz uszkodzenia sieci krystalicznej przez środki kriopekcyjne (zwykle powodujące zwiększone rozprzestrzenianie się mozaiki)². Ponadto zbieranie kryształów jest czasochłonne i pracochłonne i może prowadzić do niejednorodności między próbkami, zwłaszcza gdy podczas procesu zbioru tworzy się skórka na kroplach. Linia badawcza VMXi zapewnia dostęp do użytecznych danych z kryształów, które są przyklejone do płytki, a które w przeciwnym razie zostałyby odrzucone w celu zbierania danych.

Zdecydowana większość struktur krystalicznych promieniowania rentgenowskiego jest określana w temperaturze 100K przy użyciu powyższego podejścia, co umożliwia prosty transport i obsługę kryształów oraz zwiększa czas życia kryształów w wiązce rentgenowskiej o rzędy wielkości. Rośnie jednak zainteresowanie wyznaczaniem struktur w warunkach niekriogenicznych, czyli znacznie bliższych warunkom fizjologicznym istotnym dla funkcji białek^2,3,4. Umożliwia to znacznie lepsze zrozumienie dynamicznej struktury białek, pozwala uniknąć konformacji aminokwasów lub zamrożenia pętli w funkcjonalnie nieistotnych stanach⁵, a także umożliwia badanie wiązania ligandów w warunkach znacznie bliższych warunkom występującym w naturalnym środowisku białka w komórce i organizmie⁶.

Alternatywne podejście, wdrożone na linii badawczej Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) w synchrotronie Diamond Light Source, UK, polega na pomiarze danych dyfrakcyjnych bezpośrednio z kryształów w środowisku, w którym rosły (tj. w obrębie płyty krystalizacyjnej), w warunkach otoczenia i bez zakłóceń7^,8. Umożliwia to bardzo szybkie informacje zwrotne z ekranów krystalizacji i optymalizacje, aby poprowadzić użytkownika do optymalnej formy kryształu dla jego wymagań. Umożliwia również zautomatyzowane wytwarzanie wysokiej jakości struktur o temperaturze pokojowej⁹.

Ten protokół zakłada, że użytkownik ma próbkę białka o wysokiej czystości gotową do krystalizacji. Opisujemy doświadczenia użytkownika korzystającego z dostępu do zakładu krystalizacji w Harwell w celu wytworzenia kryształów białka, a następnie wykorzystania linii badawczej VMXi do zbierania danych (rysunek 1).

Zakład krystalizacji w Harwell

Ośrodek Krystalizacji w Harwell (CF) znajduje się w Kompleksie Badawczym w Harwell (RCaH) przylegającym do Diamentowego Źródła Światła. Zakład oferuje użytkownikom zautomatyzowane laboratorium o wysokiej przepustowości do krystalizacji makromolekularnej, wykorzystujące robotykę do badań przesiewowych krystalizacji, optymalizacji kryształów, obrazowania kryształów i charakteryzacji. Dzięki ścisłej integracji z wysoce zautomatyzowaną linią badawczą VMXi, tempo określania struktur temperatury pokojowej znacznie przyspieszyło i umożliwia charakteryzację nowych struktur białkowych, kompleksów białko-ligand i DNA-ligand, a także automatyczne badania przesiewowe fragmentów (Rysunek 1), a wszystko to w warunkach niekriogenicznych.

Rurociąg CF to zestaw oprzyrządowania obejmujący nanolitrowe roboty krystalizacyjne⁹ do krystalizacji białek rozpuszczalnych i błonowych, roboty do obsługi cieczy do przygotowania komercyjnych ekranów krystalizacji i złożonych niestandardowych ekranów optymalizacyjnych oraz cztery instrumenty do obrazowania (jeden w temperaturze 4 °C i trzy w temperaturze 20 °C do obrazowania płytek krystalizacyjnych (zobacz Tabelę Materiałów). Jeden imager jest w stanie obrazować szklane płytki lipidowe w fazie sześciennej (LCP), a jeden imager jest wyposażony w optykę multifluorescencyjną (obie w temperaturze 20 °C).

Obiekt jest obecnie szeroko wykorzystywany przez szerokie spektrum użytkowników akademickich i przemysłowych, w tym przez Laboratorium Białek Błonowych (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), ośrodek przesiewowy fragmentów XChem ¹⁰, linie badawcze MX, XFEL-hub, a także Rosalind Franklin Institute (RFI). Ten dobrze ugruntowany i zoptymalizowany proces produkcyjny umożliwił przeprowadzanie eksperymentów krystalizacji w szerokim spektrum projektów z zakresu biologii strukturalnej. W tym artykule opisano potok dla kryształów przeznaczonych do zbierania danych w VMXi, chociaż kryształy mogą być również zbierane i kriochłodzone lub kierowane do rurociągu XChem.

Dostęp użytkowników jest przydzielany przez system propozycji Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), a użytkownicy przemysłowi są wspierani przez grupę Diamond Industry Liaison. Wszyscy użytkownicy mogą przyjść na stronę ze swoimi próbkami lub tabliczkami, które można transportować ręcznie. Nie zaleca się wysyłania płytek kurierem, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że krople mogą oddalić się od miejsca, w którym zostały dozowane, lub krople mogą zostać uszkodzone przez zbiornik krystalizacji. Alternatywnie, po uzgodnieniu, użytkownicy mogą wysłać swoje próbki białek do CF, gdzie pracownicy przeprowadzają eksperymenty krystalizacji w ich imieniu. Eksperymenty mogą być monitorowane zdalnie przez użytkownika, logując się do Rock Maker Web w przypadku CF lub przez ISPyB w przypadku VMXi. Dostęp do mukowiscydozy może odbywać się w sposób iteracyjny w oparciu o wyniki dyfrakcji rentgenowskiej zebrane w Diamond.

Linia badawcza VMXi przy diamentowym źródle światła

Linia badawcza VMXi (zwana dalej "linią") to unikalny i niedawno opracowany instrument w pełni dedykowany do wysoce zautomatyzowanej krystalografii rentgenowskiej w temperaturze pokojowej, z naciskiem na pomiar danych z kryształów w odpowiednich płytkach krystalizacyjnych. Linia oferuje mikroogniskową (10 x 10 μm), różową wiązkę (pasmo przepustowe <5 × ^10-2ΔE/E) o wysokim strumieniu ~2 × 10¹³ fotonów/s (przy 16 KeV)⁷. Ta wiązka o wysokim strumieniu, w połączeniu z szybkim detektorem, umożliwia bardzo wysoką przepustowość próbek i zbieranie danych z próbek o wielkości do 10 μm.

Płytki krystalizacji wchodzą na linię badawczą poprzez przechowywanie w systemie przechowywania próbek i obrazowanie na podstawie harmonogramu dostarczonego przez użytkownika podczas rejestracji płytek za pomocą ISPyB¹¹ interfejs SynchWeb¹². Zazwyczaj zaleca się użytkownikom wybór ciągu Fibonacciego punktów czasowych do obrazowania (0, 12, 24, 36, 60...7,320 h od płytki wprowadzanej do systemu). Użytkownik jest informowany e-mailem o zobrazowaniu tablicy. Zarówno obrazowanie w świetle widzialnym, jak i w świetle UV jest dostępne dla użytkowników na żądanie. Obrazy wykonane przez system przechowywania próbek są analizowane przez algorytm uczenia maszynowego; Automatycznie lokalizuje i definiuje punkty zainteresowania obiektów, które przypominają kryształy i rejestruje interesujące miejsca gotowe do dodania przez użytkownika do kolejki zbierania danych. Użytkownicy mogą również ręcznie kliknąć obrazy w świetle widzialnym, aby zarejestrować interesujące miejsca, lub mogą kliknąć i przeciągnąć region, który ma być analizowany za pomocą skanowania rastrowego. Punkty te są dostępne dla użytkowników, którzy mogą dodać je do kolejki wraz z automatycznie zlokalizowanymi punktami.

Gdy wszystkie próbki mają odpowiednie parametry do zbierania danych, płyta trafia do kolejki. Gdy płytka dotrze na szczyt kolejki, jest automatycznie dozowana do linii badawczej. Płytki krystalizacyjne są automatycznie ładowane z hoteli kryształowych do linii badawczej przez ramię robota, a po dopasowaniu obrazu, z każdego wybranego kryształu mierzone są zestawy danych krystalograficznych o rotacji do 60° zgodnie z instrukcjami zdefiniowanymi przez użytkownika. Wszystkie krople znajdujące się na płytce mogą być użyte do tych eksperymentów na linii badawczej. Dane są łączone z wielu kryształów w celu wytworzenia izomorficznych, optymalnie połączonych zestawów danych w sposób zautomatyzowany^7,9. Po zebraniu wszystkich zestawów danych w kolejce użytkownik otrzymuje wiadomość e-mail z linkiem, który należy kliknąć, aby wyświetlić zestawy danych w ISPyB¹¹, podobnie jak w innych liniach badawczych Diamond MX. Użytkownicy są również przekierowywani na stronę internetową linii badawczej (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Wytwarzanie kryształów w płytkach in situ za pomocą Zakładu Krystalizacji w Harwell

UWAGA: Dostęp do CF jest obsługiwany przez wiele różnych ścieżek i zależy od zastosowania projektu i typu użytkownika (akademicki lub branżowy). Projekty XChem i MPL mają swój własny system składania wniosków za pośrednictwem Systemu Zarządzania Użytkownikami (UAS) i mogą być składane zarówno za pośrednictwem standardowej ścieżki dostępu (w tym iNEXT Discovery i EUbOPEN), jak i BAG Access. Poniższy protokół jest specyficzny dla użytkowników VMXi.

1. Złożenie wniosku i przygotowanie do wizyty
   1. Podaj informacje o projekcie do wniosku o propozycję BAG lub dodaj go do aktywnej propozycji BAG. Zazwyczaj jest koordynator BAG, który organizuje formalności. Alternatywnie, należy złożyć propozycję szybkiego dostępu w celu uzyskania dostępu do linii badawczej.
   2. Upewnij się, że próbka została zarejestrowana, a bezpieczeństwo potwierdzone w UAS na wniosek przed przybyciem na miejsce za pośrednictwem kuriera lub osobiście.
   3. Upewnij się, że użytkownik jest zarejestrowany (przy użyciu identyfikatora FedID i hasła).
   4. Upewnij się, że użytkownik został dodany do propozycji MX jako współpracownik w UAS przez koordynatora BAG.
   5. Wypełnij formularz szczegółów próbki krystalizacji linii badawczej i wyślij go do VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Komunikuj się z personelem linii badawczej na temat wymagań eksperymentu i dostępności linii badawczej.
   7. Jeśli próbki białka są wysyłane, należy je przesyłać wyłącznie po wcześniejszym uzgodnieniu. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji 1.2.
   8. Jeśli użytkownik ma przybyć na teren zakładu w celu ustawienia płytek krystalizacyjnych w CF, należy skontaktować się z personelem placówki w sprawie dostępności przedziału czasowego na korzystanie z oprzyrządowania obiektu i postępować zgodnie z sekcją 1.2.1.
   9. Jeśli użytkownik przynosi płytki na miejsce, upewnij się, że próbka została dozowana do odpowiedniego typu płytki i umieść krople krystalizacji we właściwym miejscu i we właściwej ilości. Postępuj zgodnie z sekcją 1.2.2. Linia badawcza akceptuje tylko specyficzne płytki do krystalizacji in situ (Greiner CrystalQuickX i MiTeGen In Situ-1); upewnij się, że krople nie są większe niż 200 nL.
2. Eksperyment krystalizacji przeprowadzony w CF
   UWAGA: Zakład oferuje szereg wysokoprzepustowych metod krystalizacji makromolekularnej, takich jak dyfuzja parowa, a także krystalizacja okresowa w oleju i LCP. Zaleca się rozpoczęcie od 70-100 μl czystego białka i przeprowadzenie eksperymentów dyfuzji parowej dla rozpuszczalnych białek za pomocą trzech ekranów przy użyciu proporcji 100 nL roztworu białkowego i 100 nL roztworu zbiornika krystalizacyjnego i inkubacji płytek w temperaturze 20 °C. Na terenie obiektu dostępnych jest wiele ekranów komercyjnych. Regulacja wilgotności i temperatury jest dostępna w najczęściej stosowanych 4 °C i 20 °C. Użytkownicy, którzy odwiedzają CF, otrzymują ustandaryzowane szkolenie i wsparcie w zakresie obsługi oprzyrządowania do krystalizacji i będą korzystać z ustawień opisanych w niniejszym dokumencie.
   1. Wysyłka próbek do konfiguracji w CF
      UWAGA: Przed przybyciem na miejsce próbka białka musi zostać zatwierdzona na wniosek w systemie UAS. Gdy próbka białka dotrze na miejsce, pracownicy przeprowadzą eksperymenty krystalizacji zgodnie z instrukcjami zawartymi w poprzedniej komunikacji z użytkownikiem. Potwierdzenie zostanie wysłane e-mailem z informacjami o kodzie kreskowym dla eksperymentalnych płytek krystalizacyjnych. Użytkownik zostanie poproszony o dodanie płytek krystalizacyjnych jako pojemników do odpowiedniej propozycji. Po wykonaniu tej czynności płytki mogą być przechowywane w automatycznych imagerach w zakładzie krystalizacji lub na linii badawczej. ISPyB będzie interfejsem wykorzystywanym do interakcji na linii badawczej.
      1. Dostarczyć roztwór próbki białka o stężeniu do krystalizacji w wielokrotnościach 25 μl podwielokrotności. Wyraźnie oznaczyć probówki z próbkami zawierające próbkę białka.
      2. W razie potrzeby należy podać białkowy roztwór buforowy, roztwór liganda lub roztwór rezerwuarowy.
      3. Poinformuj personel placówki, jakie sita i współczynniki upuszczenia powinny być używane.
   2. Ustawienia płytki krystalizacyjnej
      UWAGA: Wymagamy, aby krople krystalizacji w płytce Greiner CrystalQuickX i MiTeGen In Situ-1 znajdowały się w określonym miejscu; Tablice ustawione w innym miejscu powinny używać następujących ustawień Mosquito¹³ opisanych tutaj.
      1. Aby dostosować definicję płytki dla MiTeGen In Situ-1, otwórz oprogramowanie Mosquito SPT i kliknij stronę standardowej definicji płytki MiTeGen In Situ-1, klikając Ustawienia | 96 Studnia | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 krople) (Rysunek 2A). Kliknij przycisk edycji i zmień wartości dla lokalizacji dołka podrzędnego 2: Przesunięcie X do - 1,2 i Przesunięcie Y do 1,8 oraz dla lokalizacji dołka podrzędnego 3: Przesunięcie X do 1,3 i Przesunięcie Y do 1,8 (Rysunek 2B,C).
      2. Aby dostosować definicję płyty dla Greiner CrystalQuickX, otwórz oprogramowanie Mosquito SPT i kliknij standardową stronę definicji płyty Greiner CrystalQuickX, klikając Ustawienia | 96 Studnia | Greiner CrystalQuickX (Rysunek 2D). Kliknij przycisk edycji i zmień wartości dla lokalizacji dołka podrzędnego 1: Przesunięcie X do - 1,95 i Przesunięcie Y do 1,45 oraz dla położenia dołka poniżej 2: Przesunięcie X do 1,95 i Przesunięcie Y do 1,45 (Rysunek 2E,F).

2. Korzystanie z linii badawczej w Diamentowym Źródle Światła

UWAGA: Cała interakcja użytkowników z linią badawczą odbywa się zdalnie za pomocą interfejsu ISPyB¹¹. Nie jest wymagana fizyczna obecność na linii badawczej, a dane są zbierane za pomocą systemu opartego na kolejkach, a nie są zaplanowane w określonym czasie. Użytkownicy będą mieli propozycję powiązaną z dostępem do Diamond Light Source. Na linii badawczej każda płytka krystalizacyjna ma przypisaną unikalną wizytę i jest zdefiniowana jako "pojemnik" w ISPyB¹¹ analogicznie do krążka zawierającego próbki w temperaturze 100 K. Ekrany optymalizacyjne nie mogą być tworzone za pomocą interfejsu SynchWeb i w związku z tym informacje są zwykle dodawane do sekcji komentarzy (patrz krok 2.1.4.). Osoba rejestrująca tabliczkę będzie musiała sprawdzić adres e-mail, ponieważ właściciel tablicy będzie otrzymywał wiadomości e-mail dotyczące obrazowania, a także powiadomienia o wypełnieniu tablicy.

1. Tablice rejestracyjne
   1. Zaloguj się do ISPyB za pomocą odpowiedniego identyfikatora FedID Diamond i wybierz opcję Propozycje. Wyszukaj interesującą Cię propozycję, przewijając lub wpisując numer oferty w pasku wyszukiwania. Wybierz Przesyłka z menu rozwijanego pod numerem oferty (Rysunek 3A), co otworzy okno Przesyłki z przesyłkami w tej ofercie. Kliknij +Dodaj przesyłkę w prawym górnym rogu (Rysunek 3B), aby otworzyć okno Dodaj nową przesyłkę, nadaj przesyłce nazwę, kliknij Automated/Imager, a następnie kliknij przycisk Dodaj przesyłkę w lewym dolnym rogu (Rysunek 3C).
   2. W oknie wysyłki (Rysunek 3D) kliknij +Dodaj kontener, co spowoduje wyświetlenie widoku strony Dodaj kontener (Rysunek 3E). Z menu rozwijanego Typ kontenera wybierz jeden z odpowiednich typów płyt. Strona zmieni się, aby odzwierciedlić wybrany typ kontenera. Wprowadź kod kreskowy i nazwę kontenera zgodnie z instrukcjami e-mail od personelu linii badawczej właściwymi dla płytek eksperymentalnych. Pamiętaj, że rozróżniana jest wielkość liter.
   3. Wybierz imager VMXi 20 °C z menu rozwijanego Requested Imager, harmonogram obrazowania Fibonacciego z menu rozwijanego Harmonogram obrazowania, ekran krystalizacji z menu rozwijanego Crystallization Screen oraz nazwę użytkownika z menu rozwijanego Owner, kliknij przycisk View i wprowadź poprawny kontaktowy adres e-mail w polu Email box (Rysunek 3F).
   4. Wprowadź więcej szczegółów na temat tabliczki w polu Komentarze. Wybierz odpowiednią próbkę z menu rozwijanego Białko i użyj akronimu zarejestrowanego w UAS i zatwierdzonego przez Diamond w ramach propozycji eksperymentalnej. Wprowadź tę samą nazwę w polu Przykładowa nazwa; Pozostałe pola pozostaw puste.
   5. Kliknij ikonę +Płytka, aby powtórzyć próbkę na całej płytce i wypełnić cały pojemnik zielonymi kwadratami. Kliknij przycisk +Dodaj kontener u dołu strony, aby zarejestrować tabliczkę. Poproś pracownika linii badawczej o przeniesienie płytki do odpowiedniego imagera, gdzie będzie ona przechowywana i obrazowana. Wizyta zostanie wygenerowana, gdy kontener zostanie zapisany w imagerach, a użytkownik otrzyma wiadomość e-mail z linkiem do płyty i jej obrazów.
2. Wyświetlanie wyników obrazowania
   1. Przejdź do interesującej Cię oferty proponowanej (kroki 2.1.1), wybierz opcję Kontenery z menu rozwijanego pod numerem oferty i obserwuj listę dostępnych kontenerów dla oferty. Wybierz płytki filtra, jeśli dostępne są inne typy uchwytów na próbki. Aby jeszcze bardziej zawęzić wyszukiwanie, zaznacz pole Moje kontenery, aby wyświetlić tylko najbardziej odpowiednie kontenery skojarzone z bieżącym identyfikatorem zalogowanego użytkownika. Kliknij odpowiedni kontener, przesuwając kursor nad pojedynczy wiersz i klikając lewym przyciskiem myszy.
   2. Po wybraniu kontenera zostanie wyświetlony nowy widok, pokazujący przegląd płyty (Rysunek 4A). Kliknij kroplę w reprezentacji płyty po lewej stronie ekranu, aby wyświetlić najnowszy obraz z tego odpowiedniego upuszczania. Użyj strzałek, aby nawigować między kroplami lub wybierz pojedyncze krople za pomocą myszy/kursora.
   3. Aby wyświetlić historyczne obrazy kropli, kliknij przycisk H i poczekaj, aż pojawi się wyskakująca galeria obrazów nad bieżącym obrazem kropli studni. Najedź kursorem na poszczególne obrazy, aby zaktualizować główny obraz upuszczania.
   4. Oceniaj obrazy, aby wskazać stan każdej kropli, naciskając przyciski od 0 do 9. Aby wyświetlić poszczególne kategorie, otwórz menu rozwijane Wynik w lewym górnym rogu upuszczanego obrazu. Szukaj niebieskich krzyżyków na każdym z obrazów upuszczania, które są wynikiem algorytmu (CHiMP) wyszkolonego do szukania "kryształów" na obrazach.
   5. Kliknij trzeci przycisk ikony o nazwie Zmierz w prawym górnym rogu upuszczanego obrazu, aby uzyskać dostęp do narzędzia pomiarowego. Aby użyć tego narzędzia, kliknij i przeciągnij linię, a linijka wydłuży się i poda odległość w μm.
   6. Aby poprosić o dodatkową sesję obrazowania, kliknij opcję Widoczne lub UV w polu rozwijanym obok nagłówka Działania u dołu strony. Następnie kliknij przycisk Request Plate Imaging (Poproś o obrazowanie płyty).
3. Wybór kryształów/CHiMP
   1. Aby ręcznie dodać punkty do zbierania danych, naciśnij przycisk +Zaznacz punkt. Najedź kursorem na żądany punkt zainteresowania i wybierz. Poczekaj, aż pojawi się czerwony krzyżyk.
      UWAGA: Na jeden drop można utworzyć do 100 obiektów.
   2. Gdy wszystkie punkty zostaną zaznaczone, kliknij przycisk +Zakończ. Pamiętaj również, aby kliknąć przycisk +Zakończ przed próbą zmierzenia obiektów. Aby dodać regiony do zbierania danych za pomocą skanowania siatki, kliknij przycisk +Oznacz region. Kliknij w lewy górny punkt i przeciągnij w dół i w prawo, aby utworzyć obszar, który zostanie zeskanowany raster na linii badawczej. Podobnie jak w przypadku punktów, kliknij przycisk +Zakończ, gdy zostaną utworzone wszystkie żądane regiony.
      UWAGA: Lepiej jest utworzyć jeden większy region niż wiele małych regionów.
   3. Obserwuj niebieskie krzyżyki już na obrazach kropli, które są wynikiem algorytmu zaprojektowanego do automatycznego lokalizowania obiektów krystalicznych (CHiMP). Aby zobrazować ocenę CHiMP dotyczącą spadków krystalizacji, kliknij pole wyboru Pokaż automatyczne wyniki, a następnie zmień menu rozwijane dla klasy. Zazwyczaj najbardziej użytecznym ustawieniem jest tutaj opcja kryształu (Rysunek 4B).
      UWAGA: Jest to nowa funkcja i nie ma gwarancji, że znajdziesz wszystkie kryształy, a także inne obiekty, które nie są kryształami.
   4. Gdy wszystkie punkty i regiony zostaną zaznaczone w odpowiednich dropach, kliknij przycisk Przygotuj do zbierania danych u dołu strony.
4. Przygotowanie próbek do zbierania danych
   1. Obserwuj listę próbek zawierających punkty lub obszary wybrane w poprzednim kroku lub zlokalizowane automatycznie (Rysunek 4C). Dodaj pojedyncze punkty lub regiony, naciskając przycisk + lub dodaj wszystkie wyświetlane próbki, klikając przycisk Dodaj bieżącą stronę do kolejki.
   2. Filtry są dostępne w celu wyświetlenia tylko punktów, regionów, punktów automatycznych lub punktów ręcznych. Aby wyświetlić tylko te próbki, które nie zostały sfotografowane (tj. wystawione na działanie promieni rentgenowskich), kliknij opcje Bez danych i Nieukończone nad przyciskami filtrów.
   3. Wybierz poszczególne próbki, klikając odpowiednią linię i zaktualizuj obraz po prawej stronie ekranu, aby pokazać właściwy spadek i indywidualny punkt. Jeśli na liście znajduje się wiele próbek, zwiększ liczbę próbek wyświetlanych na stronie, wybierając menu rozwijane z wartością 10 jako wartością domyślną i do 100 jako maksymalną liczbą wyświetlanych próbek.
   4. Po dodaniu wszystkich punktów i regionów do kolejki upewnij się, że wszystkie parametry zbierania danych eksperymentalnych są skojarzone z każdym eksperymentem.
      1. Użyj filtrów dla Punktu, Regionu, Ręcznie i Auto. Kliknij filtr punktowy i kliknij pole wyboru Zaznacz wszystko poniżej przycisków filtrów, aby jednocześnie zastosować parametry do wszystkich próbek widocznych na bieżącej liście próbek w kolejce.
      2. Wybierz parametry eksperymentalne z menu rozwijanego po prawej stronie ekranu pod zdjęciem upuszczenia (Rysunek 4D). W przypadku regionów wybierz opcję Skanowanie siatki DMM co 10 mikronów, 100 procent transmisji. W przypadku wszystkich innych eksperymentów punktowych wybierz odpowiednie inne opcje z menu rozwijanego.
      3. Aby zbierać dane dotyczące oscylacji, kliknij opcję Omega Scan DMM 60 stopni 5 procent transmisji, aby zebrać maksymalną ilość danych z pojedynczej próbki. Zastosuj małe rotacje dla bardzo małych kryształów lub próbek wrażliwych na promieniowanie i zmieniaj transmisję w oparciu o wcześniejsze doświadczenia z określoną formą kryształu. Gdy wszystkie próbki będą miały poprawnie zastosowane parametry eksperymentalne, kliknij przycisk Kontener kolejki u dołu strony.
   5. Gdy tabliczka dotrze na szczyt kolejki, zostanie przedstawiona na linii badawczej, zostaną zebrane zestawy danych, a następnie ponownie wróci do magazynu próbek w obrębie linii badawczej. Po zakończeniu zbierania danych z płyty poszukaj wiadomości e-mail z linkiem, który należy kliknąć, aby uzyskać dostęp do odpowiednich danych.
5. Tworzenie przykładowych grup
   UWAGA: Grupy próbek mogą być tworzone w celu grupowania podobnych próbek w wielu kroplach lub płytkach. Wszystkie zestawy danych w tych przykładowych grupach zostaną przetworzone przy użyciu potoku xia2.multiplex¹⁴ po przetworzeniu przez DIALS. Może to być przydatne podczas zbierania wielu bardzo małych klinów danych, a także może być przydatne do zwiększenia stosunku sygnału do szumu w eksperymentach z wiązaniem ligandów.
   1. Wybierz opcję Zarządzanie przykładowymi grupami z menu rozwijanego pod numerem propozycji. Poszukaj listy grup, jeśli zostały już utworzone przez innych użytkowników. Aby wygenerować nową grupę, kliknij przycisk +Utwórz przykładową grupę. Kliknij przesyłkę z menu rozwijanego na stronie Utwórz przykładową grupę, aby wyświetlić przeglądarkę próbek (Rysunek 5A). Kliknij kontener zawierający odpowiednie przykłady z listy, która zostanie wypełniona.
   2. Po kliknięciu kontenera poszukaj grafiki przedstawiającej przegląd tablicy.
   3. Kliknij krople pojedynczo, klikając pojedynczą kroplę (Rysunek 5B) lub kliknij krople w wierszach lub kolumnach, klikając odpowiednią literę wiersza lub numer kolumny. Po wybraniu wszystkich studni skojarzonych z pojedynczą grupą wprowadź nazwę grupy w polu Nazwa grupy próbki i kliknij przycisk Zapisz grupę próbek. Kliknij przycisk Wyświetl przykładowe grupy na tej stronie, aby powrócić do listy już wygenerowanych przykładowych grup powiązanych z propozycją (Rysunek 5C).
6. Edytowanie grup próbek
   1. Kliknij przykładową grupę na liście grup na stronie Zarządzanie przykładowymi grupami.
   2. Kliknij przycisk +Edytuj przykładową grupę obok kontenerów, które pojawiają się poniżej informacji o grupie (Rysunek 5C).
   3. Obserwuj krople, już powiązane z grupą próbek, podświetlone na przeglądzie płytki.
   4. Dodaj więcej kropli do grupy próbek, klikając krople, studnie lub kolumny, tak jak poprzednio.
      UWAGA: Dropów nie można usunąć z grupy próbki.
   5. Po dodaniu kolejnych kropli edytuj nazwę grupy próbnej, a następnie zapisz ją lub po prostu zapisz, klikając przycisk Zapisz grupę próbek.
7. Wizualizacja i analiza wyników grup próbek
   1. Kliknij pojedynczą grupę na liście grup próbek, aby wyświetlić przegląd blach kontenera lub kontenerów skojarzonych z grupą. Krople wchodzące w skład grupy zostaną podświetlone na tym wyświetlaczu (Rysunek 5D).
   2. Poszukaj listy zawierającej chronologicznie ostatnie trzy zadania multipleksu, jeśli dane zostały zebrane w tej grupie.
   3. Kliknij wiersz przebiegu multipleksu, aby zaktualizować poniższe wyniki przetwarzania.
   4. Zwróć uwagę na przycisk szybkiego łącza, który pokazuje liczbę zestawów danych skojarzonych z grupą. Kliknij ten przycisk, aby otworzyć nową stronę Kolekcje danych z wyświetlonymi poszczególnymi kolekcjami zestawów danych.

3. Dostęp do automatycznego przetwarzania danych

UWAGA: Po zebraniu danych, są one przekazywane przez kilka automatycznych potoków przetwarzania danych. Cztery standardowe rurociągi używane na liniach badawczych MX w Diamond są również uruchamiane na danych zebranych na linii badawczej. Są to 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' i 'autoPROC'¹⁵. "fast_dp" zapewni szybką redukcję danych w celu szybkiej oceny jakości. Pozostałe trzy potoki będą wymagały więcej czasu na obliczenia i będą uruchamiać wiele różnych pakietów oprogramowania do redukcji danych dla porównania. W związku z tym wydruk jest zwykle wyższej jakości niż wydruk "fast_dp". Zestawy danych zebrane na linii badawczej będą również przepuszczane przez oprogramowanie do automatycznego łączenia wielu kryształów 'xia2.multiplex'¹⁴, które połączy wszystkie zestawy danych w zdefiniowaną grupę. Należy pamiętać, że chociaż skanowanie siatki nie jest obecnie przetwarzane automatycznie, dane można przetwarzać ręcznie za pomocą potoku "xia2.ssx". Wyniki automatycznego przetwarzania potoków można znaleźć w ISPyB¹¹ przy użyciu następującego protokołu.

1. Lokalizowanie zestawów danych
   1. Zaloguj się do ISPyB zgodnie z powyższym opisem i wybierz opcję Propozycje.
   2. Wyszukaj interesującą Cię propozycję, przewijając lub wpisując numer oferty w pasku wyszukiwania.
   3. Kliknij żądaną wizytę z listy, która pojawi się na ekranie, aby uzyskać dostęp do okna Zbiory danych dla tej wizyty.
   4. Zastosuj dowolne filtry.
      UWAGA: Popularnym filtrem jest filtr "Automatycznie zintegrowany", który wyświetla tylko zestawy danych, które zostały pomyślnie uruchomione przez co najmniej jeden potok przetwarzania. Spowoduje to wykluczenie skanowania siatki, ponieważ nie są one obecnie automatycznie przetwarzane przez ISPyB.
   5. Przewiń stronę w dół, aby znaleźć interesujący Cię zestaw danych.
      UWAGA: Każdy zestaw danych będzie wyświetlał identyfikator próbki, użyte parametry eksperymentalne, przeglądarkę obrazów dyfrakcyjnych, przeglądarkę obrazów kryształkowych oraz wykres analizy dla każdego obrazu w celu szybkiej obserwacji jakości danych.
2. Aby uzyskać dostęp do wyników automatycznego przetwarzania
   1. Kliknij kartę Automatyczne przetwarzanie pod podsumowaniem danych określonego eksperymentu, aby sprawdzić wyniki automatycznego zmniejszania danych (Rysunek 6A).
   2. Kliknij różne zakładki odpowiadające różnym potokom, aby wyświetlić szczegółowe podsumowanie każdego wyniku.
      UWAGA: Jeśli zdefiniowano grupy próbek, będą dwie zakładki odpowiadające zadaniom multipleksu. Jeden z nich będzie odpowiadał scaleniu wszystkich zestawów danych w grupie do tego momentu, podczas gdy drugi będzie odpowiadał scaleniu zestawów danych tylko w tym upuszczeniu.
   3. Kliknij przycisk Logs & Files, aby pobrać wynikowe pliki .mtz, jeśli przetwarzanie zakończyło się pomyślnie, oraz wszelkie powiązane pliki dziennika. Kliknij kartę Downstream Processing (Przetwarzanie końcowe) pod sekcją Auto Processing, aby wyświetlić dane wyjściowe z DIMPLE.
      UWAGA: DIMPLE będzie działać tylko wtedy, gdy plik PDB został dostarczony podczas przesyłania próbki.
   4. Kliknij przycisk Logs & Files, aby pobrać dowolne wynikowe dane wyjściowe z DIMPLE.
3. Aby uzyskać dostęp do wyników multipleksu grupowego, otwórz menu rozwijane u góry ekranu z zapisanym numerem propozycji i kliknij opcję Zarządzanie grupami próbnymi. Kliknij wiersz odpowiadający żądanej grupie w odpowiednim kontenerze. Przewiń w dół, aby znaleźć listę wyjść multipleksowych odpowiadających grupie, przedstawioną wizualnie na schemacie płyty.
   1. Kliknij żądane wyjście multipleksu z podanej listy. Kliknij przycisk xxx Data Sets (Zestawy danych) , gdzie xxx to liczba scalonych zestawów danych (Figure 6B).
      UWAGA: Spowoduje to otwarcie ekranu Kolekcje danych, ale zostaną wyświetlone tylko zestawy danych z wybranego zadania multipleksu.
   2. Kliknij kartę Automatyczne przetwarzanie w górnym eksperymencie.
   3. Kliknij kartę Przetwarzanie multipleksowe, która odpowiada odpowiedniej liczbie scalonych zestawów danych.
   4. Kliknij przycisk Logs & Files (Dzienniki i pliki), aby pobrać plik .mtz i odpowiednie pliki dziennika (jak w kroku 3.2.3).
4. Aby uzyskać dostęp do wyników skanowania siatki
   1. Przejdź do ekranu Zbiory danych dla żądanej wizyty. Wyniki danych skanowania siatki zostaną wyświetlone wraz z wszelkimi zebranymi danymi obrotu.
      UWAGA: Nie będzie żadnych wyników automatycznego przetwarzania.
   2. Na obraz kropli kryształu zostanie nałożona siatka z mapą cieplną reprezentującą obecność dyfrakcji. Kliknij kwadrat, aby wyświetlić obraz dyfrakcyjny dla tej pozycji w siatce. Kliknij menu rozwijane u góry obrazu studni kryształowej, aby zmienić to, co przedstawia mapa cieplna. Wartość domyślna to całkowita intensywność dyfrakcji, ale można ją zmienić na całkowitą liczbę punktów, szacowaną rozdzielczość lub klatki bez lodu.

4. Przetwarzanie danych

UWAGA: Wybrane zestawy danych mogą być ponownie przetwarzane przez interfejs ISPyB¹¹ przy użyciu tych samych potoków przetwarzania, które są uruchamiane automatycznie ze zmienionymi ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika. Można zastosować punkt odcięcia rozdzielczości; Jeśli znana jest symetria/komórka kryształu, można ją również zdefiniować, aby zapewnić, że rurociągi przetwarzania działają we właściwym ustawieniu. Wybrane zakresy obrazów w określonych zestawach danych można również scalić przy użyciu dostępnych potoków wielokrystalicznych. Może się to okazać korzystne, jeśli systematyczne uszkodzenia popromienne spowodują, że druga część obrazów dyfrakcyjnych będzie słabej jakości. Jest to również opcja dla użytkownika, aby pobrać swoje zestawy danych przy użyciu protokołu opisanego powyżej i uruchomić lokalnie żądane oprogramowanie do ponownego przetwarzania, dla którego samouczki są bezpłatnie dostępne gdzie indziej (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Aby ponownie przetworzyć wiele pojedynczych zestawów danych
   1. Zaloguj się do ISPyB i przejdź do interesujących Cię zestawów danych (krok 3.1).
   2. Kliknij zestaw danych, a następnie kliknij ikonę koła zębatego na pasku tytułu zestawu danych (Rysunek 6), aby otworzyć okno ponownego przetwarzania.
   3. Skonfiguruj dowolne żądane ustawienia i wybierz, które klatki zostaną uwzględnione w ponownym przetwarzaniu.
      UWAGA: Zakres obrazu można zdefiniować, wpisując zakres w oznaczonych polach lub klikając i przeciągając żądany obszar na wykresie analizy dla każdego obrazu (Rysunek 7A).
   4. OPCJONALNIE: Aby dodać kolejny zestaw danych do indywidualnego ponownego przetwarzania, kliknij jego ikonę koła zębatego, a pojawi się on w oknie ponownego przetwarzania pod pierwszym zestawem danych. Zaznacz pole Przetwarzaj indywidualnie.
   5. Kliknij przycisk Integruj.
2. Aby ponownie przetworzyć dane wielokrystaliczne
   1. Otwórz okno ponownego przetwarzania z dowolnego zestawu danych.
   2. Kliknij przycisk Multi-Crystal, aby otworzyć nowy ekran.
   3. Przewiń w dół, aby znaleźć serię wykresów analizy poszczególnych obrazów z eksperymentów przeprowadzonych podczas wizyty.
   4. Wybierz potok przetwarzania z menu rozwijanego.
   5. OPCJONALNIE: Zdefiniuj dowolne limity rozdzielczości lub znane parametry komórki elementarnej.
   6. Kliknij i przeciągnij, aby zdefiniować zakresy obrazów, które mają zostać uwzględnione w przetwarzaniu wielu kryształów (Rysunek 7).
      UWAGA: Należy to zrobić na wielu różnych wykresach, tak aby zestawy danych z wielu różnych kryształów zostały połączone.
   7. Kliknij przycisk Integruj (Rysunek 7B).
3. Aby uzyskać dostęp do ponownie przetworzonych danych
   1. Przejdź do strony Zbiory danych dla konkretnej wizyty (kroki 3.1.1–3.1.3).
   2. Kliknij przycisk Ponowne przetwarzanie u góry ekranu.
   3. Przewiń w dół, aby zlokalizować żądane zadanie.
   4. Kliknij ścieżkę pliku w kolumnie po prawej stronie, aby otworzyć ekran Kolekcje danych dla ponownie przetworzonych danych.
   5. Otwórz kartę Automatyczne przetwarzanie i pobierz dane zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 3.2).
      UWAGA: Wszystkie ponownie przetworzone zadania można zidentyfikować za pomocą symbolu okrągłych strzałek obok nazwy potoku.

Results

Urządzenie do krystalizacji i linia badawcza VMXi były wykorzystywane w wielu różnych typach projektów i przypadkach użycia. Oto niewielka liczba przykładów ilustrujących to, co użytkownicy mogą chcieć realizować.

Studium przypadku 1: Standardowe zbieranie danych

Linia badawcza umożliwia szybkie określenie struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej z niewielkiej liczby kryształów na płytce krystalizacyjnej. Minimalna liczba kryształów zależy od grupy kosmicznej i orientacji kryształów, ale często wynosi 1-4, chociaż lepszą jakość danych można osiągnąć poprzez połączenie danych z kilkudziesięciu kryształów. Niedawnym przykładem jest jeden ze standardów linii badawczych, taumatyna. Wiele kryształów, pokazanych w Rysunek 8A, zostało oznaczonych do ręcznego zbierania danych, jak opisano w sekcji 2.3 protokołu. Kryształy te zostały dodane do kolejki zgodnie z opisem w sekcji 2.4 protokołu, a parametry eksperymentalne zostały wybrane z listy rozwijanej. Po zastosowaniu parametrów eksperymentalnych płytkę umieszczono w kolejce do zebrania danych. Zestawy danych zostały zebrane, automatycznie przeskalowane i scalone przy użyciu potoku xia2.multiplex zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu. Przykładowe dane wyjściowe z SynchWeb są pokazane w Rysunek 8A w środku. Pięć połączonych zbiorów danych dało w wyniku zbiór danych o rozdzielczości 1,66 A. W przypadku standardowego zbierania danych z około pięciu kryształów w studni, zestawy danych zebrano w ciągu 2,5 minuty.

Studium przypadku 2: Wiązanie ligandów – Eksperyment z fragmentami z wykorzystaniem białka Mac1

Wytwarzanie struktur kompleksów białko-ligand w temperaturze pokojowej może być łatwo osiągnięte za pomocą linii badawczej. Ligandy mogą być dodawane do kropli na płytkach krystalizacyjnych (ręcznie lub przez akustyczne wstrzykiwanie kropli), a dane mierzone po odpowiednim czasie inkubacji. W opisanym przykładzie serię fragmentów dozowano do studzienek zawierających kryształy pierwszej makrodomeny białka SARS-CoV-2 (Mac-1) na płytce krystalizacyjnej. Dwa studnie zawierające ten sam fragment zostały przydzielone jako grupa, jak opisano w kroku 2.5 protokołu. Wiele kryształów (42) oznaczono do zbierania danych zgodnie z opisem w krokach protokołu 2.3 i 2.4, a zestawy danych zebrano przy użyciu standardowych parametrów (obrót o 60°, krok 0,1°, ekspozycja 0,00178 s, transmisja 5%, 16 KeV - na kryształ) (Rysunek 8B). Zestawy danych z dwóch odwiertów zostały automatycznie przetworzone przy użyciu potoku xia2.dials, a następnie zainicjowano potok xia2.multiplex w celu automatycznego scalenia 22 z tych zestawów danych. Następnie uruchomiono DIMPLE na wyjściu tych rurociągów i uzyskano mapy, które wyraźnie pokazały dowody na istnienie związanego fragmentu. Model fragmentu został wbudowany w niezamieszkałą gęstość i dalej udoskonalony (Rysunek 8B po prawej). Struktury związane z ligandami w temperaturze pokojowej można łatwo określić za pomocą tej serii kroków, aby dostarczyć bezcennych informacji i informacji zwrotnych w procesie projektowania leków opartym na strukturze. W przypadku tego zbioru danych obejmującego 42 kryształy w wielu dołkach, zestawy danych zostały zebrane w ciągu 10 minut.

Studium przypadku 3: Rozwiązanie struktury z grupą przestrzeni o niskiej symetrii i preferowanymi orientacjami Stos wielu kryształów o morfologii przypominającej płytkę został wytworzony w wyniku eksperymentów krystalizacji z cytochromem wiążącym gaz typu c (Rysunek 8C). Wybierając kilka pozycji wokół krawędzi stosu, w których w wiązce promieniowania rentgenowskiego znajdował się tylko pojedynczy kryształ, możliwe było uzyskanie dobrej jakości zestawu danych o rozdzielczości 1,75 A poprzez połączenie klinów z czterech kryształów, pomimo jednoskośnej (C2) grupy przestrzennej. Pozwoliło to na szybki postęp projektu bez konieczności dalszej optymalizacji warunków krystalizacji. Ten wynik został opisany wcześniej⁹. W przypadku tego zbioru danych z czterech kryształów w studni zestawy danych zebrano w ciągu 2 minut.

Studium przypadku 4: Uzyskiwanie informacji i struktury temperatury pokojowej z mikrokryształów na płytce za pomocą krystalografii szeregowej

Często, gdy mikrokryształy pojawiają się w kropli lub gdy użytkownicy starają się zoptymalizować protokoły mikrokrystalizacji w partii jako prekursor do eksperymentów z krystalografią szeregową w źródłach synchrotronowych lub XFEL, bardzo pomocne jest uzyskanie szybkiej informacji zwrotnej na temat właściwości dyfrakcyjnych i wymiarów komórek elementarnych różnych prób przy użyciu minimalnej ilości materiału. W tym przypadku użycia mikrokryształy lizozymu rosnące w partii zostały odpipetowane na płytkę krystalizacyjną (objętość 200 nL na kroplę), a dane zebrano z ośmiu kropli za pomocą skanowania siatki z krokiem o rozmiarze 10 μm (Rysunek 9). Uzyskane w ten sposób 25 906 nieruchomych obrazów przetworzono za pomocą oprogramowania do krystalografii szeregowej, w wyniku czego powstał zestaw danych, w którym 9 891 wzorów dyfrakcyjnych zostało zindeksowanych i połączonych, tworząc zestaw danych o rozdzielczości 2,0 A, który dobrze pasował do opublikowanej struktury temperatury pokojowej (_praca R = 19,6%,_wolność R = 23,6% przy użyciu PDB 8A9D) (Tabela 1). Umożliwiło to szczegółową analizę rozmieszczenia komórek elementarnych i określenie struktury mikrokryształów w temperaturze pokojowej, co mogło zostać wykorzystane w złożonych eksperymentach krystalografii seryjnej, w tym badaniach czasowo-rozdzielczych. Całkowita wymagana objętość zawiesiny mikrokrystalicznej wynosiła 1,6 μl. W celu zebrania danych o mikrokryształach z ośmiu odwiertów za pomocą skanów siatkowych, zestawy danych zebrano w ciągu 40 minut.

Rysunek 1: Schemat procesu białko-struktura integrującego badanie przesiewowe krystalizacji, optymalizację w obiekcie krystalizacji, automatyczne zbieranie i przetwarzanie danych w temperaturze pokojowej bez pobierania próbek w VMXi, badanie przesiewowe fragmentów XChem oraz zbieranie danych na innych liniach badawczych MX. Użytkownicy mogą rozpocząć proces od dostarczenia próbki lub przyniesienia płytek do linii badawczej VMXi. Skrót: Wszechstronna krystalografia makromolekularna in situ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Interfejs Mosquito SPT Labtech do ustawiania płytek krystalizacyjnych. (A) (1) Widok konfiguracji MiTeGen In Situ-1. Wybierz standardową płytkę kroplową MiTeGen 2, przechodząc do (2) typu płytki 96-dołkowej i wybierając (3) płytkę kroplową MiTeGen 2. Aby zmienić parametry definicji dla dropu 1 i drop 2, który jest wymagany dla VMXi, kliknij ikonę edycji (4). Spowoduje to otwarcie nowego okna (B), w którym (5) należy zmienić przesunięcia X i Y, jak pokazano. Wybierz (B) dołek pomocniczy 2 i (C) dołek pomocniczy 3 i odpowiednio zmień wartości. (D) Widok konfiguracji programu CrystalQuickX. Wybierz standardową płytkę kroplową CrystalQuickX 2, przechodząc do typu płytki 96-dołkowej i wybierając płytkę kroplową MiTeGen Plate 2. Aby zmienić parametry definicji dla dropu 1 i drop 2, który jest wymagany dla VMXi, kliknij ikonę edycji tak samo jak powyżej. Spowoduje to otwarcie nowego okna, w którym (E,F) przesunięcia X i Y muszą zostać zmienione, jak pokazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Interfejs SynchWeb pokazujący, jak utworzyć przesyłkę VMXi, zarejestrować tabliczkę i sprawdzić dane kontaktowe. Zrzuty ekranu przedstawiające różne etapy przesyłania informacji do interfejsu SynchWeb są wyświetlane z (A) menu rozwijanego, (B,C) rejestracji nowej przesyłki, (D) rejestracji nowego kontenera, (E) wprowadzania informacji o tablicy rejestracyjnej, (F) sprawdzania danych kontaktowych i (G) listy zarejestrowanych kontenerów w ramach oferty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wybór i przygotowanie próbek do zbierania danych za pomocą SynchWeb. Wyświetlana jest seria zrzutów ekranu przedstawiających poszczególne etapy przygotowania próbek do pobrania danych za pomocą interfejsu SynchWeb. (A) Punkty i obszary zainteresowania są wybierane z rozwijanego przeglądu. W dolnej części tego panelu znajduje się chronologiczna seria fotografii jednej kropli. (B) Przykład wyjścia CHiMP dla jednej płytki z wyszczególnieniem wyników dla kategorii "kryształu". (C) Dodawanie próbek do kolejki z listy wybranych punktów i regionów oraz (D) zastosowanie parametrów do zbierania danych do próbek kolejkowanych z listy rozwijanej ustawień eksperymentów utworzonych na linii badawczej. Zwróć uwagę na różnicę między próbkami bez parametrów eksperymentalnych (na czerwono) a tymi, które mają prawidłowo zastosowane parametry (na górze i na dole). U dołu tego panelu znajduje się przycisk Queue Container, który ustawia w kolejce płytę do pobrania na linii badawczej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykładowe tworzenie grup w SynchWeb. Seria zrzutów ekranu przedstawiających poszczególne etapy tworzenia przykładowych grup. (A) Tabliczka(-i) zawierająca(-e) próbki jest wybierana z odpowiedniej przesyłki oraz (B) wybiera się krople znajdujące się na płytce. Mogą to być pojedyncze krople lub mogą być wybierane według wierszy i/lub kolumn. (C) Wykaz grup próbnych, które zostały już utworzone. (D) Dane wyjściowe ostatnich trzech zadań przetwarzania multipleksu są wymienione i można je wybrać w celu pokazania statystyk z potoku przetwarzania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przetwarzanie danych i redukcja danych. (A) Zrzut ekranu przetworzonego zestawu danych w ISPyB¹¹. Przycisk umożliwiający dostęp do funkcji ponownego przetwarzania jest podświetlony. Identyfikator próbki i parametry eksperymentalne są pokazane w lewym górnym rogu, a przeglądarka obrazów dyfrakcyjnych pośrodku. Kliknięcie tego obrazu otworzy interaktywne okno do obejrzenia różnych obrazów. Przeglądarka obrazów kryształowych jest pokazana po prawej stronie, a kliknięcie na ten obraz otworzy również interaktywne okno do porównania obrazów z linii badawczej i pamięci Formulatrix. Wykres analizy poszczególnych obrazów jest pokazany po prawej stronie, a kliknięcie tego obrazu otworzy powiększoną wersję tego wyniku. Kliknięcie zakładki Automatyczne przetwarzanie sprawi, że automatyczne przetwarzanie będzie widoczne i ułatwi porównanie wyników różnych potoków. Kliknij karty, aby przełączać się między różnymi potokami przetwarzania i wyświetlić szczegółowe dane wyjściowe z wybranego potoku. Przycisk Dzienniki i pliki do pobierania danych jest podświetlony. Kliknięcie karty Przetwarzanie podrzędne spowoduje rozwinięcie i wyświetlenie wyników dla wszystkich zestawów danych uruchamianych przez potoki po redukcji danych, jeśli jest to konieczne. (B) Zrzut ekranu z ekranu zarządzania grupą próbek. Zdefiniowana przez użytkownika nazwa grupy znajduje się na górze, a wizualny opis dołączonych studni można zobaczyć poniżej. Zielona studzienka oznacza, że wszystkie kryształy mierzone od tej kropli zostaną włączone do grupy. Można zobaczyć podsumowanie różnych zadań multipleksu wykonanych w tej grupie, a poniżej znajduje się szczegółowe dane wyjściowe z multipleksu. Przycisk Zestawy danych służący do sprawdzania uwzględnionych eksperymentów jest podświetlony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Okna przetwarzania danych. (A) Indywidualne i (B) zestawy danych wielokryształowych. Wyświetlane są dwa indywidualne zestawy danych, w których wybrano regiony danych. Po zaznaczeniu pola wyboru Przetwarzaj pojedynczo wybrane obrazy dyfrakcyjne zostaną indywidualnie przetworzone po naciśnięciu przycisku Integruj. Kliknięcie przycisku Multi-crystal otworzy ekran poszczególnych zestawów danych. Aby ponownie przetworzyć obrazy dyfrakcyjne z wielu zestawów danych, obszary obrazów są wybierane w takiej postaci, w jakiej są wyświetlane, a ponowne przetwarzanie jest inicjowane przez kliknięcie przycisku Integruj, jak pokazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Reprezentatywne wyniki z potoku VMXi. (A) Oznaczone kryształy dla białka taumatyny w kropli krystalizacji (lewy panel), wyniki przetwarzania danych (środkowy panel) i gęstość elektronów (prawy panel). (B) Zbieranie na wielu kryształach w celu określenia wiązania fragmentu z domeną makro SARS-CoV-2. Zestawy danych zebrano na wielu kryształach w obecności fragmentu z ekranu fragmentów EU-OPENSCREEN przy użyciu standardowych ustawień eksperymentalnych. Przykłady tych zbiorów danych przedstawiono w tym fragmencie z SynchWeb. Fragment został wbudowany w odpowiednią gęstość i dodatkowo uszlachetniony, jak pokazano w najdalszym po prawej stronie. (C) Oznaczone kryształy jednoskośne w stosie z trudnego uderzenia krystalizacyjnego używane do zbierania danych. Zielone krzyżyki i czerwone cyfry wskazują miejsca, w których dane zostały zmierzone za pomocą wiązki 10 μm i obrotu o 60°. Cztery z powstałych klinów zostały połączone w celu utworzenia zestawu danych o rozdzielczości 1,75 A. Gęstość elektronów wokół grupy hemowej jest wyświetlana po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Krystalografia szeregowa na płytce krystalizacyjnej. (A) Obraz optyczny kropli krystalizacji, z białą ramką reprezentującą obszar zainteresowania. (B) Definicja punktów skanowania siatki. (C) Mapa cieplna wskazująca dyfrakcję. (D) Mapa gęstości elektronów wynikająca z zestawu danych krystalografii szeregowej z ponad 9 000 wzorów dyfrakcyjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. jezdnego pkt.

Rozdzielczość (Å)	Kompletność (%)	Liczebność	I/σ(I)	Podział R	CC1/2	Unikalne obserwacje
kombinezon	100	95,5	20,8	0,063	0,998	Numer katalogowy: 8422
Niski (55.55 - 5.43)	100	147,1	81,7	0,028	0,999	Z numerem 488
Wysoki (2.03 -2.00)	100	75,3	Rozdział 1.2	1,092	0,410	Z numerem 411

Tabela 1: Statystyki danych dla zestawu danych szeregowych VMXi RT. Skróty: I = średnia intensywność skalowanych obserwacji; _Podział R = miara rozbieżności zmierzonych intensywności; CC 1/2 = współczynnik korelacji między dwiema losowymi połowami zbioru danych.

Discussion

Opisaliśmy pełną procedurę od momentu przybycia próbki białka do CF do pobrania przez użytkownika danych końcowych do dalszych zastosowań. Krytycznymi etapami są produkcja wysokiej jakości próbki białka i odpowiednich ekranów krystalicznych, przy użyciu komercyjnych rzadkich ekranów matrycowych lub ekranów optymalizacyjnych opartych na ustalonych warunkach. Proces ten może odbywać się w CF, lub użytkownicy mogą przeprowadzić procedury krystalizacji w domowych laboratoriach i przynieść na linię badawcze odpowiednie płytki krystalizacyjne. Określenie odpowiednich parametrów gromadzenia danych może być ważne w przypadku niektórych próbek, szczególnie tam, gdzie problemem jest uszkodzenie przez promieniowanie. W większości przypadków zautomatyzowane przetwarzanie danych jest w pełni wystarczające, aby odpowiedzieć na pytanie naukowe, chociaż użytkownicy zachowują możliwość ponownego przetwarzania za pomocą narzędzi linii badawczej, na przykład gdy grupa kosmiczna jest niejednoznaczna lub wykorzystuje się tylko początkową część zebranych danych w celu zminimalizowania skutków uszkodzeń radiacyjnych.

Jeśli odpowiednie kryształy nie zostaną wytworzone w początkowych próbach krystalizacji, wówczas można zbadać zmiany w stężeniu białka, czystości lub ekranizacji krystalizacji, podobnie jak zastosowanie zasiewania kryształów. Jeśli kryształy nie ulegają dyfrakcji do użytecznej rozdzielczości na linii badawczej, wówczas skany siatkowe mogą być używane z wiązką nietłumioną do oceny nieodłącznej granicy dyfrakcji i komórki elementarnej kryształów w celu kierowania działaniami optymalizacyjnymi. Kryształy, które są zbyt małe, aby można je było zebrać na płytkach (np. <10 μm), mogą zamiast tego nadawać się do krystalografii szeregowej lub eksperymentów nanofokusowych (np. na linii badawczej Diamond VMXm). Rozwiązywanie struktur przy użyciu danych VMXi jest na ogół proste dzięki zastąpieniu molekularnemu, szczególnie od czasu pojawienia się Alphafold¹⁶ , który zapewnia skuteczne modele wyszukiwania. Jeśli to się nie powiedzie, kryształy mogą być zbierane i kriochłodzone z płytek, aby umożliwić konwencjonalne eksperymenty z dyfrakcją anomalną na jednej długości fali, dyfrakcją anomalną na wielu długościach fal lub fazami na długich długościach fal.

Do zalet tej metody należy możliwość uzyskania szybkich, wysokiej jakości zbiorów danych i informacji zwrotnych bezpośrednio z płytek krystalizacyjnych bez konieczności zakłócania kryształów ze środowisk, w których rosły. Tak zwany "renesans temperatury pokojowej" w biologii strukturalnej kładzie nacisk na struktury uzyskane w warunkach niekriogenicznych, aby umożliwić zbadanie większego znaczenia fizjologicznego i dynamiki białek². Zwykle osiąga się nieco niższą rozdzielczość niż w przypadku zoptymalizowanego kryształu chłodzonego kriogenicznie, ale tylko wtedy, gdy ustalono odpowiednie warunki kriogeniczne i jeśli kryształy są odporne na mechaniczne przenoszenie i otwieranie kropli krystalizacji³. Nadchodzącym zastosowaniem, do którego ta linia produkcyjna jest bardzo dobrze dopasowana, jest badanie przesiewowe na dużą skalę kompleksów białko-ligand lub kampanii fragmentów w temperaturze pokojowej w procesie odkrywania leków. Ligandy lub fragmenty mogą być kokrystalizowane lub dodawane za pomocą pipety lub akustycznego wyrzutu kropli przed zebraniem danych w temperaturze pokojowej. Innym zastosowaniem jest szybki pomiar danych z wielu setek lub tysięcy kryształów w bardzo wydajny sposób, a następnie użycie oprogramowania DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ do ekstrakcji izomorficznych klastrów, które mogą reprezentować różne jednostki biologiczne lub do ustalenia statystycznie istotnych różnic między populacjami kryształów, które zostały potraktowane w inny sposób lub wystawione na działanie różnych ligandów lub sygnału.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	na zamówienie	Robot do obsługi cieczy
Imager Formulatrix	na	zamówienie	Imager do płytek krystalizacyjnych
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Płytka krystalizacyjna
Gryphon	Instrumenty Art Robbins	620-1000-10	Robot krystalizacyjny
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Płytka krystalizacyjna
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	na żądanie	Robot krystalizacyjny
Rock Imager & Maker	Formualtrix	na życzenie	Oprogramowanie do Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Robot do obsługi cieczy https://www.artrobbins.com/scorpion