Niemal ciągła ewolucja wspomagana fagami i robotyką (PRANCE) to technika szybkiej i solidnej ewolucji białek. Robotyka umożliwia równoległość eksperymentów, monitorowanie w czasie rzeczywistym i kontrolę sprzężenia zwrotnego.
Artykuł metodologiczny
Praktyczny przewodnik po niemal ciągłej ewolucji wspomaganej przez fagi i robotykę
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie
PRANCE to połączenie dwóch potężnych technik ukierunkowanej ewolucji. Pierwszą z nich jest PACE1, technika molekularna, która łączy rundy dywersyfikacji i selekcji genów z szybkim cyklem życia bakteriofaga M13, umożliwiając szybkie rundy ewolucji w sposób ciągły w hodowli płynnych fagów. Selekcja ta jest napędzana przez zastosowanie obwodu genu kodowanego plazmidem, który sprzęga funkcję ewoluującego białka z ekspresją pIII, białka płaszcza ogonowego M13, które jest potrzebne do propagacji fagów, co zilustrowano w Rysunek 1. Na poziomie eksperymentalnym ciągłe rozcieńczanie ciekłej kultury fagowej pozwala na ciągłą selekcję. Rygorystyczność selekcji może być zatem modulowana zarówno na poziomie obwodu genowego, jak i na poziomie eksperymentalnym, poprzez kontrolowanie szybkości rozcieńczania kultur fagowych. PACE można zatem zastosować do każdego wyzwania inżynierii biomolekuł, dla którego istnieje czujnik molekularny, który może wykryć pożądaną aktywność bakterii E. coli w celu wywołania ekspresji pIII. Zastosowania obejmują ewolucję wiązania białko-białko2,3,4, wiązanie białko-DNA5, rozpuszczalność białek6, oraz liczne specyficzne funkcje enzymatyczne7. Drugi to przyspieszona przez robotykę Evolution8,9, która wykorzystuje kontroler sprzężenia zwrotnego do wyeliminowania dwóch typowych trybów niepowodzenia ewolucji kierowanej: wyginięcia, które występuje, gdy środowisko jest zbyt rygorystyczne, i braku ewolucji, które występuje, gdy środowisko jest zbyt łagodne. W przeciwieństwie do seryjnego pasażowania fagów, jak to ma miejsce w PANCE (Fagowa ewolucja nieciągła)7,10, przyspieszona przez robotykę "prawie ciągła" ewolucja obejmuje szybkie pipetowanie, które utrzymuje kultury w połowie fazy logarytmicznej, umożliwiając populacjom doświadczanie ciągłych cykli infekcji i rozmnażania. Gdy te dwie technologie są używane razem, określa się je mianem PRANCE, od Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution8, co umożliwia solidną, multipleksowaną i szybką ciągłą ewolucję. PRANCE został wykorzystany do ewolucji polimeraz, tRNA i syntetaz amino-acylowych tRNA oraz do przeprowadzenia kontroli sprzężenia zwrotnego podczas tych ewolucji w celu poprawy ich szybkości i niezawodności8.
Istnieje kilka szczegółów dotyczących konfiguracji sprzętu i oprogramowania dla PRANCE, które umożliwiają użycie bakteriofaga w robocie obsługującym ciecze. Zamiast korzystać z domyślnego oprogramowania dostarczonego przez producenta robota, używamy pakietu oprogramowania open source opartego na Pythonie11, który umożliwia szybkie, równoczesne wykonywanie, a tym samym możliwość utrzymania półciągłych bioreaktorów w połowie fazy logarytmicznej. Czas wolny od pracy badacza można wydłużyć do kilku dni poprzez rutynową samosterylizację kilku komponentów na pokładzie, a osiąga się to dzięki automatycznemu sterowaniu pompami, które mogą wybielać i płukać te elementy. Zanieczyszczenie krzyżowe fagów można wyeliminować za pomocą robota do obsługi cieczy, który nie używa końcówek dopasowanych na siłę i starannego dostosowania ustawień obsługi cieczy.
Protokół
1. Konfiguracja sprzętu
UWAGA: Zobacz Rysunek 2 dla przeglądu komponentów sprzętowych systemu PRANCE i Rysunek 3 dla zdjęć tych komponentów fizycznie złożonych.
- Zaopatrz się w podstawowy osprzęt do systemu PRANCE, w tym przyrząd do obsługi cieczy, czytnik tabliczek i pompy pomocnicze.
UWAGA: Wszystkie dotychczasowe systemy PRANCE zostały wdrożone w średnich i dużych urządzeniach do obsługi cieczy, wyposażonych w 8-kanałowe, indywidualnie adresowane ramiona pipetujące, jednotłokowe ramię pipetujące z 96 końcówkami, zrobotyzowany chwytak do ruchomych płytek, zintegrowaną stację mycia do sterylizacji końcówek oraz zintegrowany czytnik płytek umożliwiający pomiary absorbancji i luminescencji. - Skonfiguruj strategie ogrzewania w zależności od modelu i funkcji robota do obsługi cieczy. Stosować podgrzewany plate carrier lub klimatyzację robota sterowanego nagrzewnicą.
- Ustanów stację mycia końcówek, aby umożliwić ponowne użycie końcówki.
UWAGA: Do tej pory systemy PRANCE korzystały z gotowych stacji mycia, chociaż w zasadzie ten komponent można było łatwo zbudować z tanich komponentów. - Stworzenie źródła kultury bakteryjnej utrzymywanej w fazie logarytmicznej poprzez ustawienie bioreaktora działającego w czasie rzeczywistym w temperaturze 37 °C jako chemostat/turbidostat. Alternatywnie, zatrzymać hodowlę bakterii w fazie logarytmicznej o objętości co najmniej 1 l, wstępnie wyhodowaną w temperaturze 37 °C w fazie logarytmicznej (OD600 między 0,25 a 0,45) w temperaturze 4 °C w pobliskiej lodówce. Upewnij się, że kultura, schłodzona lub ciepła, jest regularnie mieszana za pomocą płytki do wytrząsania lub mieszadła, aby zapobiec sedymentacji.
- Skonfiguruj preferowane pompy do integracji z robotami z niezbędnym oprogramowaniem i sterownikami. Wdrożenie oprogramowania umożliwiającego pompom dostarczanie określonych ilości cieczy rzędu 10-100 ml.
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów dla pomp używanych w tej realizacji oraz na stronie producenta, aby zapoznać się z oprogramowaniem używanym do obsługi tych pomp oraz dokumentacją dotyczącą ich konfiguracji. Takie oprogramowanie dla pomp używanych w konfiguracji PRANCE zilustrowanej w tym manuskrypcie jest dostarczane jako open source w następującym repozytorium GitHub https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE wymaga co najmniej kolektora z trzema pompami zdolnego do pompowania trzech oddzielnych kanałów (dostarczanie bakterii do zbiornika bakteryjnego, dostarczanie wybielacza do zbiornika bakteryjnego i opróżnianie zbiornika bakteryjnego do odpadów), z prędkością każdego kalibrowaną i kontrolowaną niezależnie. W przeszłości ludzie używali pomp do akwarium i układów pomp hydroponicznych, chociaż w zasadzie można użyć dowolnej pompy perystaltycznej sterowanej przez pytona. Podstawowe funkcje obejmują możliwość użycia chwytaka robota do przenoszenia płytek do lub z czytnika, inicjowania pomiaru czytnika płytek oraz uzyskiwania dostępu do pomiarów. - Wydrukuj w 3D wymagane niestandardowe komponenty pokładu dla systemu PRANCE, w tym co najmniej zbiornik bakteryjny/kolektor dystrybucyjny ("wafel"), jak znajduje się w pliku uzupełniającym 1 (https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link). Przymocuj te pojemniki do pokładu i skalibruj ich pozycje za pomocą standardowego oprogramowania robota do obsługi cieczy. Podłącz zbiornik do zestawu pomp.
UWAGA: Zapoznaj się z dokumentacją producenta robota, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat sposobu przeprowadzenia kalibracji, ponieważ będzie ona zależna od robota. Najbardziej odpowiednie są drukarki 3D na bazie żywicy; przykład używanego typu drukarki podany jest w Tabeli materiałów; Przy domyślnych ustawieniach drukarki użyto standardowej żywicy przezroczystej. - Wyposaż system w odpływ zgodny z lokalnymi zaleceniami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
- Umieść sprzęt laboratoryjny na pokładzie robota do obsługi cieczy, jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
- Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami bezpieczeństwa, w tym stosuj standardowe laboratoryjne środki ochrony osobistej (tj. fartuch laboratoryjny, rękawice i ochronę oczu).
2. Przygotowanie oprogramowania
- Zainstaluj oprogramowanie typu open source używane do sterowania robotami do obsługi cieczy za pomocą python11, dostępne w repozytorium PyHamilton o otwartym kodzie źródłowym. https://github.com/dgretton/pyhamilton
- Zmodyfikuj i skalibruj plik układu pokładu dla oprogramowania robota do obsługi cieczy, aby dokładnie odzwierciedlić pozycje sprzętu laboratoryjnego na pokładzie robota, jak pokazano na Rysunek 4.
UWAGA: Zastosowana tutaj konfiguracja wykorzystuje oprogramowanie dostarczone przez producenta robota do obsługi cieczy, zgodnie z dostarczoną dokumentacją. - Uruchom program metody robota PRANCE w trybie symulacji.
- Otwórz wiersz poleceń za pomocą następujących poleceń (w systemie operacyjnym Windows), jak pokazano w Rysunek 5.
Windows + R
Wpisz: cmd - Zmień katalog nadrzędny na katalog programu metody robota. Wprowadź poniższe polecenie z poprawną ścieżką, jak pokazano w Rysunek 5.
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Wywołaj program metody robota w Pythonie z flagą trybu symulacji, jak pokazano w Rysunek 5.
py robot_method.py --symulować - Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, które otworzy się po uruchomieniu programu (Rysunek 5).
UWAGA: Przed przejściem do dalszych czynności należy upewnić się, że metoda PRANCE może działać bez błędów w symulacji. Staje się oczywiste, czy skrypt jest w stanie działać w trybie symulacji bez błędów, ponieważ zakończy wiele pętli głównego programu bez wywoływania systemowej obsługi błędów, co kończy główną pętlę programu.
- Otwórz wiersz poleceń za pomocą następujących poleceń (w systemie operacyjnym Windows), jak pokazano w Rysunek 5.
- Uruchom program metody robota PRANCE z wyłączonym trybem symulacji.
- Otwórz wiersz poleceń w odpowiednim katalogu (Rysunek 5).
Windows + R
Wpisz: cmd
CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE - Wywołaj program metody robota w Pythonie bez flag:
py robot_method.py - Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, które otworzy się po uruchomieniu programu.
- Upewnij się, że PyHamilton może sterować instrumentem i spowodować jego inicjalizację.
- Otwórz wiersz poleceń w odpowiednim katalogu (Rysunek 5).
- Nawiąż synchronizację danych w czasie rzeczywistym.
UWAGA: Do tej pory systemy PRANCE korzystały z komputerów połączonych w sieć, które umożliwiają użytkownikom monitorowanie plików dziennika i wykresów pomiarowych czytnika płyt w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do zdalnego udostępniania plików lub za pośrednictwem zdalnego pulpitu. - Wyłącz aktualizacje automatyczne.
3. Przygotowanie do biegu
- Upewnij się, że źródła kultur bakteryjnych w fazie logarytmicznej są dostępne dla wszystkich kultur wymaganych dla planowanego cyklu i że są one aktywnie mieszane, aby zapobiec sedymentacji. Użyj aktywnego chemostatu/turbidostatu lub schłodzonej kultury wstępnie wyhodowanej z zatrzymanym wzrostem.
- Zaktualizować plik manifestu sterownika o szczegółowe informacje o objętości (zakres 0-500 μl), której kultura bakteryjna ma być pompowana do każdej studzienki 96-dołkowej laguny na cykl programu. Pozwala to na precyzyjną kontrolę efektywnego stopnia rozcieńczenia laguny. Można to zobaczyć w Rysunek 6.
- Oblicz stopień rozcieńczenia laguny, korzystając z arkusza kalkulacyjnego DilutionCalculator.xlsx (dostarczonego jako plik uzupełniający 2), jak pokazano na Rysunek 7.
- Zaktualizuj plik robot_method.py o zamierzoną wysokość laguny. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj 14 (w jednostkach milimetrowych) jako wartości domyślnej dla zmiennej fixed_lagoon_height w programie. Odpowiada to objętości laguny wynoszącej 550 μl w systemie, ale może się różnić w zależności od konkretnej użytej płytki z 96 studniami.
- Umieść czyste, filtrowane końcówki do pipet na pokładzie robota w wyznaczonych miejscach i przyklej stojaki na końcówki taśmą do uchwytów końcówek, aby zapewnić stabilność podczas pracy.
- Umieść czyste płytki z 96 głębokościami na pokładzie robota w wyznaczonych miejscach.
- Umieść czyste 96-dołkowe płytki czytnika na pokładzie robota w wyznaczonych miejscach.
- Upewnij się, że taca czytnika płytek nie jest zajęta przez istniejącą płytę.
- Upewnij się, że pompy są podłączone do komputera i są przypisane do właściwego adresu.
- Oczyść przewody pompy, aktywując pompy w celu pompowania wybielacza, a następnie wody.
- Podłącz przewody pomp do odpowiednich źródeł i wyjść, zwracając szczególną uwagę na to, aby właściwe przewody były podłączone do odpowiednich kultur bakteryjnych.
- Napełnij zbiorniki/wiadra zawierające wybielacz/wodę do zbiornika bakteryjnego i mycia końcówki pipety.
- Upewnij się, że wszystkie elementy pokładowe, w szczególności elementy ruchome, są ustabilizowane w wyznaczonych pozycjach.
- Aktywuj grzałki zgodnie z lokalną implementacją na temperaturę docelową (np. 37 °C; Rysunek 8).
- Uruchom plik Protokół sterylizacji UV na 10 minut, aby uruchomić wbudowaną lampę sterylizacyjną UV w robotach obsługujących ciecze, zgodnie z dostawą producenta (Rysunek 9).
- Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, które otworzy się po uruchomieniu programu.
- Uruchom plik z opcją parametryzowaną przez 600 s.
- Upewnij się, że oprogramowanie Robot Run Control jest zamknięte.
UWAGA: Program metody robota ulegnie awarii, jeśli istnieją jakiekolwiek istniejące wystąpienia uruchomionego oprogramowania Run Control.
4. Integracja sprzętu i oprogramowania
- Przeprowadź "bieg wodny", w którym program metody robota PRANCE jest uruchamiany przez noc, w którym woda zastępuje wszystkie kultury i mokre odczynniki.
UWAGA: Ten test można przeprowadzić w temperaturze pokojowej.- Zakończ przygotowanie przed uruchomieniem, jak opisano powyżej, z controller_manifest i robot_method ustawionymi na efektywną szybkość rozcieńczania laguny 1 objętość/h, jak pokazano na Rysunek 5 i Rysunek 6.
- Podłącz linię "bakterie w" do pojemnika z wodą, aby zastąpić bakterie w fazie logarytmicznej w przepływie wody.
UWAGA: Barwniki spożywcze można dodać do źródeł wody, aby śledzić ruch cieczy podczas eksperymentu. - Otwórz wiersz poleceń w odpowiednim katalogu.
- Wywołaj program metody robota w Pythonie z nową flagą uruchamiania (py robot_method.py --new) i wprowadź żądane argumenty, w tym nazwę pliku dziennika (TestRun), liczbę studni lagunowych (16), czas trwania cyklu (30), liczbę cykli na pomiar płytki czytnika (4) i objętość induktora (objętość induktora wynosi 0 μL dla tej serii testowej, podczas ewolucji, w której mutageneza jest indukowana arabinozą, wartość ta może wynosić 10 μL), jak pokazano na Rysunek 5.
- Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, który otworzy się po uruchomieniu programu po podaniu argumentów.
UWAGA: Metodę PRANCE można rozpocząć od pustej płyty laguny, a objętość cieczy w lagunach zrównoważy się do końcowej objętości w ciągu pierwszych sześciu cykli.
- Należy przeprowadzić "przebieg oparty wyłącznie na bakteriach", w którym protokół PRANCE jest uruchamiany tylko z hodowlą bakterii w temperaturze docelowej, ale bez bakteriofagów.
- Zakończ przygotowanie przed uruchomieniem, jak opisano powyżej, z controller_manifest i robot_method ustawionymi na efektywną szybkość rozcieńczania laguny wynoszącą 1 objętość/h, jak pokazano na Rysunek 5 i Rysunek 6. Upewnij się, że grzejniki są włączone dla temperatury docelowej 37 °C.
- Podłącz linię "bakterie w" do wybranego źródła bakterii w fazie logarytmicznej.
- Otwórz wiersz poleceń w odpowiednim katalogu.
- Wywołaj program metody robota w Pythonie z nową flagą uruchamiania (py robot_method.py --new) i wprowadź żądane argumenty, jak opisano wcześniej w sekcji 4.1.4.
- Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, które otworzy się po uruchomieniu programu po podaniu argumentów.
- Przeprowadź "test infekcji", w którym fagi zawierające wyewoluowane białko są prowokowane do namnażania się na bakteriach wymagających tego białka.
UWAGA: Zdecyduj z wyprzedzeniem, które laguny zostaną zaszczepione fagami, a które nie zostaną zaszczepione, a tym samym posłużą jako laguny kontrolne bez fagów do wykrywania zanieczyszczenia krzyżowego.- Zakończ przygotowanie przed uruchomieniem, jak opisano powyżej, z controller_manifest i robot_method ustawionymi na efektywną szybkość rozcieńczania 1 objętość/h, jak pokazano na Rysunek 5 i Rysunek 6. Upewnij się, że grzejniki są włączone dla temperatury docelowej 37 °C.
- Podłącz linię "bakterie w" do wybranego źródła bakterii w fazie logarytmicznej.
- Otwórz wiersz poleceń w odpowiednim katalogu.
- Wywołaj program metody robota w Pythonie z nową flagą uruchamiania (py robot_method.py --new) i wprowadź żądane argumenty, jak opisano wcześniej w sekcji 4.1.4.
- Wybierz przycisk PLAY w lewym górnym rogu okna Robot Run Control, który otworzy się po uruchomieniu programu po podaniu argumentów.
- Przed dodaniem bakteriofaga uruchom metodę na 2-3 godziny, aby zrównoważyć objętość i OD bakterii w płytach laguny.
- Zaszczepić laguny z fagami 106 pfu/ml bakteriofaga pod koniec cyklu pracy, gdy program jest uśpiony (np. 5,5 μl podwielokrotności faga przy 10-8 pfu/ml, zgodnie z oznaczeniem płytki lub qPCR), do laguny o pojemności 550 μl.
- Uruchom program przez noc, a następnie sprawdź miano faga w studniach laguny za pomocą testu płytkiowego lub qPCR.
Wyniki
Wyniki testu infekcji
Test ten pozwoli wykryć problemy z kulturą bakteryjną, klonowaniem i mianem faga, stabilnością temperaturową sprzętu, ustawieniami dozowania cieczy oraz integracją czytnika płytek. Pomyślny test infekcji fagowej wykaże wyraźną i szybką infekcję fagową w lagunach inokulowanych fagiem oraz brak sygnału w lagunach bez faga. Rysunek 10 przedstawia reprezentatywne wyniki testu infekcji fagowej. Wyniki eksperymentalne można również porównać z rysunkami 1d i 1c w publikacji dotyczącej PRANCE8, w zależności od tego, czy wdrażana jest konfiguracja „gorącego PRANCE” (zasilanego przez żywy turbidostat bakteryjny), czy „zimnego PRANCE” (zasilanego schłodzoną kulturą w średniej fazie logarytmicznej). Test ten może ujawnić kilka powszechnych problemów. Problemy z przygotowaniem kultury bakteryjnej często skutkują słabą lub brakiem infekcji. Bakterie mogą być optymalnie zainfekowane fagiem M13 tylko wtedy, gdy znajdują się w średniej fazie logarytmicznej i w temperaturze 37 °C. W innych temperaturach i stadiach wzrostu wykazują one słabszą ekspresję pili, a tym samym są mniej podatne na infekcję fagową12. Inokulacja fagiem o niskim mianie lub fagiem z mutacjami w szkielecie może prowadzić do opóźnionego wystąpienia sygnału lub jego braku. Test ten pozwoli również wykryć problemy z ustawieniami wzmocnienia (gain) czytnika płytek dla fluorescencji lub luminescencji.
Rysunek 1: Schemat obwodu genetycznego działającego podczas testowego przebiegu infekcji w aparaturze PRANCE. Gdy polimeraza RNA T7, kodowana w genomie faga, infekuje gospodarza Escherichia coli, zostaje ona przetranskrybowana i wiąże się z AP w obrębie promotora T7, co prowadzi do transkrypcji białka fagowego pIII oraz białka luxAB, co z kolei umożliwia propagację faga i emisję luminescencji. Skróty: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; AP = plazmid pomocniczy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Schemat komponentów fizycznych systemu PRANCE. Lodówka przechowuje mieszane kultury, które są następnie przenoszone na pokład robota za pomocą zestawu pomp do zbiornika bakteryjnego, tzw. „waffle”. Robot do obsługi cieczy jest wykorzystywany do przenoszenia kultur bakteryjnych z „waffle” za pomocą głowicy pipetującej do studni oczekujących w celu ogrzania ich do temperatury inkubacji, a następnie do lagun, gdzie odbywa się główna inkubacja. Zarówno studnie oczekujące, jak i laguny są standardowymi płytkami głębokostudzienkowymi o pojemności 2 mL. Robot pobiera próbki do jednorazowych płytek do odczytu, które są następnie przenoszone do czytnika płytek w celu dokonania pomiaru. Skrót: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Aparatura robotyczna PRANCE. (A) Układ PRANCE. (I) Filtr HEPA i zewnętrzny podgrzewacz. (II) Lodówka do hodowli. (III) Główna obudowa robota. (IV) Czytnik płytek. (V) Pompy i zbiorniki. (B) Obudowa robota. (VI) Główne pompy do hodowli. (VII) Zbiorniki na wodę, odpady i wybielacz. (VIII) Pompy myjące. (C) Obudowa robota. (IX) Robotyczne ramię pipetujące i chwytak. (X) Końcówki do pipet. (XI) Komponent wydrukowany w technologii 3D umożliwiający rozdzielanie hodowli wewnątrz robota („opłatek”). (XII) Płytki do pobierania próbek w czytniku płytek. (XIII) Pojemniki do mycia końcówek. (XIV) „Laguny”: naczynia hodowlane, w których odbywa się ewolucyjne hodowanie. Skróty: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution; HEPA = high-efficiency particulate air. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Układ platformy. (A) Reprezentacja 3D układu platformy w oprogramowaniu sterującym robotem. (B) Zdjęcie komponentów platformy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Zrzut ekranu wiersza poleceń z przykładowymi parametrami (powyżej) oraz oprogramowaniem do sterowania uruchamianiem (poniżej). Przycisk odtwarzania znajduje się w lewym górnym rogu i można go kliknąć myszą lub aktywować za pomocą ekranu dotykowego, w zależności od lokalnej implementacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Plik manifestu sterownika skonfigurowany dla serii testowych. Laguny zawierające kulturę #0 znajdowałyby się w kolumnach 1 i 3 płytki 96-dołkowej. Pozostałe kolumny pozostałyby puste. Wiersze A, B, D i E płytki 96-dołkowej są oznaczone w prawej kolumnie jako zainfekowane fagiem (1), pozostałe wiersze (0) stanowią kontrole bez faga. Ta instancja manifestu sterownika spowodowałaby rozcieńczanie laguny przez program 210 µL kultury w każdym cyklu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Obliczanie skutecznej szybkości rozcieńczania w lagunie przy użyciu arkusza DilutionCalculator. Patrz Plik uzupełniający 2 w celu uzyskania arkusza DilutionCalculator. Jak pokazano na tej rycinie, laguna o objętości 550 µL rozcieńczana 210 µL świeżej kultury w każdym 30 min cyklu, przy pobieraniu 150 µL próbek do pomiaru na płytce odczytowej co cztery cykle, będzie odpowiadać skutecznej szybkości rozcieńczania wynoszącej 1,0 objętości laguny/h (po każdej 1 h pozostanie 50% pierwotnego płynu w lagunie z początku godziny) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: System grzewczy robota. Grzałka jest aktywowana poprzez podłączenie zasilacza, co zaznaczono czerwonym okręgiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 9: Ustawienia protokołu dekontaminacji UV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 10: Pomiar testu infekcji przeprowadzonego w systemie PRANCE. Próbki są pobierane w trakcie procesu, a następnie wykonuje się pomiary luminescencji i absorbancji. Dla każdej laguny pomiary luminescencji są dzielone przez odpowiadający im pomiar absorbancji i przedstawione jako funkcja czasu. Laguny zainfekowane fagami zaznaczono kolorem zielonym, natomiast niezinfekowane laguny kontrolne zaznaczono kolorem czarnym. Skrót: PRANCE = Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Plik uzupełniający 1: Plik STL do druku 3D wymaganych niestandardowych komponentów platformy dla systemu PRANCE, w tym co najmniej zbiornika bakterii/rozdzielacza ("waffle"). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: Arkusz kalkulacyjny DilutionCalculator. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Pomimo wysiłków zmierzających do standaryzacji sprzętu, praktycznie rzecz biorąc, każda konfiguracja PRANCE będzie inna ze względu na zmiany w dostawach sprzętu, sprzęcie i wersjach oprogramowania. W rezultacie, każda konfiguracja PRANCE wiąże się z unikalnymi wyzwaniami konfiguracyjnymi, wymagającymi kompleksowego zrozumienia przeznaczenia każdego komponentu w celu skutecznego modułowego rozwiązywania problemów.
Metoda ta określa krok po kroku protokół konfiguracji i testowania uznanego systemu PRANCE. Najpierw skupiamy się na krytycznych elementach sprzętu i oprogramowania, a następnie szczegółowo opisujemy niezbędne kroki w celu przygotowania i przeprowadzenia serii testów, które ustalają, że system jest gotowy do pracy z PRANCE.
Istotną cechą sprzętu jest optymalizacja w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego próbki podczas multipleksowanych eksperymentów z użyciem bakteriofagów. Zaleca się stosowanie wyłącznie filtrowanych końcówek z technologią końcówek robota, która jest kompatybilna z ponownym użyciem końcówki i uważa się, że minimalizuje aerozole wytwarzane podczas wyrzucania końcówki poprzez unikanie końcówek dopasowanych na siłę. Solidne mycie końcówek zgodnie z tym protokołem pozwala na ponowne użycie końcówki, chociaż jej adekwatność musi zostać zweryfikowana w ramach testu infekcji w każdym systemie. Samosterylizacja jest również uzależniona od stałego dostarczania wody i wybielacza do systemu. Są one przechowywane w zbiornikach/wiadrach, a ich wyczerpanie spowoduje upośledzoną autosterylizację i szybkie zanieczyszczenie krzyżowe. Można zrobić zdjęcia zbiorników/wiader zrobione przed i po uruchomieniu programu, aby porównać szybkość, z jaką sprzęt myjący zużywa wodę i wybielacz przy określonej konfiguracji pompy.
Kolejnym kluczowym elementem systemu jest utrzymanie fazy wzrostu i temperatury bakterii. Eksperymenty PRANCE są prowadzone przy użyciu szczepu bakterii S2060 E. coli (Addgene: #105064). Jest to szczep zawierający plazmid F pochodzący z K12, zoptymalizowany pod kątem redukcji biofilmów7. Ponadto plazmid F w tym szczepie został zmodyfikowany przez dodanie kasety oporności na tetracykliny do konserwacji plazmidu, luxCDE i luxR w celu uzupełnienia monitorowania luminescencji za pośrednictwem luxAB, a także lacZ pod promotorem wstrząsu fagowego, aby umożliwić kolorymetryczną wizualizację blaszek. Kodowany plazmidem F pilus F-pilus jest niezbędny do infekcji fagiem M13. Bakterie stosowane w PACE muszą być zatem hodowane w temperaturze 37 °C i w środkowej fazie logarytmicznej, kiedy dochodzi do ekspresji F-pilus12 i możliwe jest zakażenie, rozmnażanie i ewolucja faga M13. Do statycznej regulacji temperatury można zastosować gotowy do użycia podgrzewany plate carrier. Alternatywą jest po prostu podgrzanie powietrza wchodzącego do filtra HEPA za pomocą niedrogich grzejników, chociaż nie jest to zalecane, ponieważ może to prowadzić do przyspieszonego zużycia sprzętu. Ponadto przyspiesza to parowanie pomocniczych płynów na pokładzie, takich jak wiadra z wybielaczem/wodą i induktor, gdy są używane.
Kalibracja pakietów oprogramowania jest również niezbędna do prawidłowego funkcjonowania systemu. Rozbieżności między układem pokładu oprogramowania a rzeczywistym pokładem robota są najczęstszą przyczyną awarii systemu podczas pracy. Regularna kalibracja pomp pomocniczych, które dostarczają hodowlę bakterii, wybielacz i drenują system, jest niezbędna, ponieważ stosowanie pompy perystaltycznej może prowadzić do zużycia przewodów i zmian objętości płynu.
Test przepływu wody szybko ujawni szereg typowych problemów z konfiguracją, w tym nieprawidłowe ustawienia obsługi cieczy, wycieki płynów/wadliwe połączenia i niestabilność oprogramowania. Udany przepływ wody nie wykaże żadnych nieoczekiwanych wycieków płynu i będzie działał stabilnie bez błędów przez noc. Istnieje wiele typowych problemów, które mogą wystąpić podczas przepływu wody, takich jak niewykonanie pewnych kroków związanych z cieczą, kapanie z pipet i zatrzymanie protokołu w trakcie cyklu. W przypadku niewykonania pewnych czynności związanych z cieczą należy upewnić się, że zainstalowano wszystkie klasy cieczy. Zawierają one informacje o odpowiedniej lepkości i prędkościach pipetowania, które są dostosowywane w oprogramowaniu sterującym robotem dostarczonym przez producenta. Jeśli z pipet kapie woda, ważne jest, aby ustawienia ramienia pipetującego robota były prawidłowe, aby umożliwić czyste pipetowanie i wyeliminować zanieczyszczenie krzyżowe fagów. Skuteczne pipetowanie zrobotyzowane wymaga, oprócz odpowiednich klas cieczy, prawidłowych wysokości układu pokładu wszystkich urządzeń laboratoryjnych oraz odpowiednich przesunięć wysokości pipetowania określonych w programie metody robota PRANCE. Te przesunięcia wysokości mogą wymagać bezpośredniej regulacji. Jeśli protokół zatrzyma się w trakcie, często będzie to generowane przez szeroki wachlarz błędów, które wskazują, że plik układu talii może nie pasować do rzeczywistej konfiguracji talii.
Test oparty wyłącznie na bakteriach ujawni problemy z ustawieniami czytnika płytek i wizualizacją danych w czasie rzeczywistym, problemy z nadmiernym stężeniem wybielacza lub niewystarczającym płukaniem oraz stabilnością temperatury. Udany przebieg oparty wyłącznie na bakteriach będzie wykazywał równowagę absorbancji laguny w ciągu pierwszych trzech cykli, a następnie stabilną absorbancję przez cały czas trwania biegu. Ponadto może ujawnić kilka typowych problemów. Jest to pierwszy krok, w którym wykreślane są dane wygenerowane przez czytnik płytek. Dane w bazie danych czytnika płyt mogą nie być poprawnie zapisane lub prawidłowo wydrukowane. Jeśli bakterie nie zrównoważą swojej absorbancji, może to oznaczać, że stężenie wybielacza jest zbyt wysokie. Nadmierny wybielacz lub niewystarczające mycie może wysterylizować cały eksperyment, a nie tylko przybory laboratoryjne. Jeśli istnieje podejrzenie, do przetestowania laguny można użyć pasków wykrywających wybielanie. Stabilność temperatury kultury można sprawdzić za pomocą pistoletu termometrycznego.
Pomyślny wynik testu infekcji wskazuje, że system jest gotowy do uruchomienia PRANCE. Test infekcji można przeprowadzić, zaszczepiając podzbiór lagun zawierających kulturę bakteryjną. Bakterie te będą wyrażać pIII po zakażeniu odpowiednim fagiem, który nie ma genu pIII (ΔgIII), umożliwiając rozmnażanie faga. Jedną z możliwych kombinacji do testowania jest użycie bakterii S2060 przekształconych plazmidem eksprymującym pIII pod promotorem wstrząsu fagowego z dowolnym fagiem ΔgIII. Zalecamy stosowanie faga ΔgIII zawierającego polimerazę RNA T7 typu dzikiego z bakteriami S2060 transformowanymi za pomocą dodatkowego plazmidu, w którym pIII i luxAB są sterowane przez promotor T7 (plazmid pJC173b13), jak pokazano na rysunku 1. Pozwala to również na monitorowanie infekcji za pośrednictwem czytnika płytek podczas przebiegu testowego. Ostateczny dowód na powodzenie testu na infekcję i brak zanieczyszczenia krzyżowego będzie pochodził z mianowania fagów w lagunach testowych i kontrolnych. Tam, gdzie stosuje się reporter lucyferazy, wzrost luminescencji tylko w studzienkach testowych, jak widać na rysunku 3, jest również wskaźnikiem udanej infekcji fagowej i propagacji. Złotym standardem w ilościowym oznaczaniu miana faga jest test płytkinazębnej 7. Istnieje również protokół oznaczania ilościowego M13 metodą qPCR7 , który może być szybszy, chociaż nie rozróżnia zakaźnych i niezakaźnych cząstek fagowych, a zatem może zawyżać miana.
Główny program odwołuje się do pliku manifestu, jest to zwykły tekstowy plik bazy danych, który dyktuje objętość rozcieńczenia na cykl każdej rozmnażającej się kultury, a także wybór dowolnej liczby potencjalnych surowców do hodowli bakteryjnych, które mogą różnić się rygorystycznością wyboru. W ten sposób plik manifestu definiuje wiele parametrów przebiegu PRANCE. Należy zauważyć, że plik ten może być edytowany podczas pracy zarówno przez operatora, jak i system, co oznacza, że można przeprowadzić ręczną lub automatyczną kontrolę sprzężenia zwrotnego.
Użyteczność w pełni funkcjonalnej konfiguracji PRANCE polega na jej zdolności do szybkiej ewolucji dużych populacji w starannie monitorowanym i kontrolowanym środowisku. Format oparty na płytkach odróżnia PRANCE od innych technik, takich jak stosowanie mniejszych, gotowych do użycia systemów opartych na turbidostacie14,15. Konfiguracja oparta na płytkach nie tylko ułatwia integrację z dodatkowymi etapami obróbki zrobotyzowanej, ale także zapewnia kompatybilność z innymi przyrządami laboratoryjnymi, takimi jak wirówki. Co więcej, możliwość przeprowadzenia przyspieszonej ewolucji jednocześnie w wielu instancjach wprowadza dodatkowy wymiar eksperymentu, zwiększając perspektywę osiągnięcia zróżnicowanych i solidnych wyników. Szczegółowy system kontroli i sprzężenia zwrotnego zintegrowany z PRANCE dodatkowo zwiększa przewidywalność i niezawodność eksperymentu, co oznacza znaczący postęp w dziedzinie technik ukierunkowanej ewolucji. Jednak ta technika jest ograniczona pod względem liczby równoległych eksperymentów, które może przeprowadzić. W zależności od konfiguracji, konfiguracje PRANCE są zwykle ograniczone albo prędkością pipetowania przez robota, albo dostępną przestrzenią na pokładzie.
Ten sam sprzęt i oprogramowanie, które są używane w PRANCE, można również zastosować do metod ewolucji, które nie obejmują bakteriofagów. Jak wykazano w metodzie11 z wieloma turbidostami, ten sam instrument może być stosowany wyłącznie w przypadku bakterii, umożliwiając eksperymenty z ewolucją adaptacyjną całego genomu. Ta zdolność adaptacji poszerza zakres tego instrumentu, torując drogę dla nowych form ewolucji przyspieszonej przez robotykę.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Emmie Chory i Kevinowi Esveltowi za pomoc i porady dotyczące konfiguracji sprzętu i oprogramowania. Samir Aoudjane, Osaid Ather i Erika DeBenedictis są wspierani przez Steel Perlot Early Investigator Grant. Praca ta była wspierana przez Francis Crick Institute, który otrzymuje podstawowe fundusze od Cancer Research UK (CC2239), UK Medical Research Council (CC2239) i Wellcome Trust (CC2239).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wydrukowany w 3D zbiornik bakteryjny "wafel" | - | - | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; Do |
| drukarki 3D | Robot deck FormLabs | Form 3B + | elementy drukarki 3D |
| żywica drukarki 3D (przezroczysta) | Materiał eksploatacyjny FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | do drukarki 3D |
| 8-1,000 i mikro; L głowica | Hamilton | 10140943 | Do robota do obsługi cieczy |
| 96-1,000 µ L głowica pipetująca | Hamilton | 10120001 | Do robota do obsługi cieczy |
| Czytnik płytek z czarnego polistyrenu | mikropłytki Millipore Sigma | CLS3603 | Do pokładu robota |
| BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | Do robota do obsługi cieczy |
| Roztwór czyszczący | Fluorochem Limited | F545154-1L | służy do czyszczenia części robota do obsługi cieczy |
| Płytki Deep Well | Appleton Woods | ACP006 | służą do zatrzymywania rozwijających się bakterii na pokładzie robota |
| podgrzewacz do podgrzewania | Stego | 13060.0-01 | nagrzewa się wewnątrz obudowy robota |
| Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | Do robota do obsługi cieczy |
| Grzałka | Erbauer | BGP2108-25 | Do robota do obsługi cieczy |
| HIG Bionex wirówka | Hamilton | 10086700 | Do robota do obsługi cieczy |
| Chwytak płytowy iSWAP | Hamilton | 190220 | Do robota do obsługi cieczy |
| rurki laboratoryjne | Merck | Z280356 | do budowy kolektora do obsługi cieczy |
| złącze luer do zadzioru | AIEX | B13193 / B13246 | do łączenia rurek |
| Magnetyczna płytka mieszająca | Camlab | SKU - 1189930 | Do lodówki pomocniczej |
| Ruchome ramię pipetujące | Hamilton | 173051 | Do robota do obsługi cieczy |
| Omega | BMG Oprogramowanie | sterujące czytnikiem płytek | 5.7 |
| Jednokierunkowe zawory zwrotne | Masterflex | MFLX30505-91 | do jednokierunkowych sekcji kolektora do obsługi cieczy |
| pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | oprogramowanie do sterowania robotami python o otwartym kodzie źródłowym |
| pymodbus | opensource 3.5.2 | interfejs oprogramowania pompy python | |
| Chłodnica | Tefcold | FSC175H | umożliwia stosowanie schłodzonych bakterii zamiast turbidostat |
| Szczep bakteryjny S2060 | Addgene Addgene: #105064 | E. coli | |
| temperature kontroler | Digiten | DTC102UK | Służy do termostatycznego sterowania grzejnikami |
| Sterownik przełącznika termostatu | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Regulator temperatury 110 V Cyfrowy przełącznik termostatu Kontroler sous vide Czujnik NTC 10K Ulepszona wersja; dla Robot do obsługi cieczy |
| Venus | Hamilton | 4.6 | zastrzeżone oprogramowanie sterujące robotem |
| Stacja mycia dla MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | Do robota do obsługi cieczy |
| Sugerowani producenci pomp | |||
| Firma | Numer katalogowy | Uwagi | Dokumentacja |
| Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
| Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
| Cole-Parmer | EW-07522-3 | Napęd cyfrowy Masterflex L/S, 100 obr./min, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
| Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Ekonomiczny napęd o zmiennej prędkości, od 7 do 200 obr./min, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
Bibliografia
- Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472, 499-503 (2011).
- Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
- Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
- Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. Methods for the directed evolution of biomolecular interactions. Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).
- Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions. ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).
- Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression. Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).
- Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. Phage-assisted continuous and non-continuous evolution. Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).
- DeBenedictis, E. A., et al. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).
- Zhong, Z., et al. Automated continuous evolution of proteins in vivo. ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).
- Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).
- Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation. Mol Syst Biol. 17 (3), 9942(2021).
- Novotny, C. P., Lavin, K. Some effects of temperature on the growth of F pili. J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).
- Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution. Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).
- Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLOS Biology. 18 (7), e3000794(2020).
- Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).
Przedruki i uprawnienia
