Prosta technika mankietu do przeszczepu mysiego lewego płuca

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje technikę mankietową dla modelu przeszczepu lewego płuca myszy. Technika ta była rozwijana przez kilka lat i dobrze się sprawdza, skutecznie służąc w badaniach immunologicznych.

Streszczenie

W ciągu ostatniej dekady, nasze laboratorium poczyniło znaczne postępy w rozwoju i udoskonalaniu unaczynionych modeli przeszczepów płuc myszy przy użyciu wydajnej i wysoce niezawodnej techniki transplantacji "mankietowej". W artykule opisano zaawansowaną i kompleksową metodę ortotopowego przeszczepu płuc w unaczynionym ortotopowym modelu płuc, reprezentującym najbardziej fizjologiczny i klinicznie istotny model przeszczepu płuc u myszy. Proces przeszczepu składa się z dwóch odrębnych etapów: pobrania od dawcy i późniejszego wszczepienia implantu biorcy. Metoda została pomyślnie opanowana, a po kilku miesiącach wystarczającego szkolenia, wykwalifikowany praktyk może wykonać zabieg w około 90 minut od skóry do skóry. Co zaskakujące, gdy osoby pokonają początkową krzywą uczenia się, wskaźnik przeżycia w okresie okołooperacyjnym zbliża się do prawie 100%. Model mysi pozwala na wykorzystanie wielu dostępnych na rynku transgenicznych i zmutowanych szczepów myszy, umożliwiając badanie tolerancji i odrzucenia. Ponadto unikalne cechy tego modelu sprawiają, że jest on cennym narzędziem do badania biologii i immunologii nowotworów.

Wprowadzenie

Podczas gdy terapie zastępcze, takie jak dializa i urządzenia wspomagające pracę komór, istnieją dla osób z niewydolnością nerek i serca, przeszczep płuc pozostaje główną opcją leczenia dla pacjentów cierpiących na schyłkową niewydolność płuc. Ta procedura służy jako jedyny wybór ratujący życie dla osób, u których zdiagnozowano zwłóknienie płuc¹. Dodatkowo stosuje się go w celu przedłużenia życia osób borykających się ze schyłkową obturacyjną chorobą płuc, taką jak rozedma płuc, a także osób ze stanami ropnymi, takimi jak mukowiscydoza¹.

Podczas gdy wskaźniki krótkoterminowego przeżycia poprawiły się dzięki udoskonaleniom technicznym, ulepszeniom opieki okołooperacyjnej i postępom w immunosupresji, długoterminowe wyniki po przeszczepie płuc są znacznie gorsze niż w przypadku innych organów stałych. Ogólny pięcioletni wskaźnik przeżycia wynoszący zaledwie 50% dla biorców przeszczepu płuc jest znacznie niższy niż dla tych, którzy otrzymują alloprzeszczepy serca, nerek lub wątroby¹. Nasz zespół i inni podejrzewali, że powodem takiej rozbieżności jest brak klinicznie istotnych modeli biologicznych, aby w pełni zrozumieć szlaki prowadzące do odrzucenia i/lub tolerancji alloprzeszczepu płuc, ponieważ eksperymentalna manipulacja fizjologicznie istotnymi modelami myszy znacząco przyczyniła się do długoterminowego przeżycia innych alloprzeszczepów litych lub komórkowych².

Przed opracowaniem modelu mysiego ortotopowego przeszczepu płuc, badacze polegali w swoich badaniach na większych modelach zwierzęcych. Jednak te większe modele miały ograniczenia, w tym brak transgenicznych mutantów wymaganych do badania pytań mechanistycznych³. Dodatkowo, badania na szczurach napotkały podobne ograniczenia⁴, a nieunaczynione heterotopowe modele przeszczepu tchawicy u myszy były również ograniczone do ich użyteczności⁵. Badania wykazały, jak ważne jest stosowanie unaczynionych modeli przeszczepów zamiast nieunaczynionych w różnych układach narządów. Na przykład nieunaczynione przeszczepy tkanki serca noworodka wprowadzone do małżowiny usznej myszy biorcy nie mają bezpośredniej interakcji ze śródbłonkiem naczyniowym i krwiobiegiem biorcy. W związku z tym ich znaczenie jest ograniczone w porównaniu z unaczynionymi przeszczepami ludzkiego serca⁶. W podobny sposób heterotopowy model przeszczepu tchawicy, który nie posiada unaczynienia i napowietrzenia, różni się znacznie od przeszczepów płuc u ludzi, szczególnie w obserwowanych zmianach w drogach oddechowych w małych drogach oddechowych po przeszczepie. Co więcej, szybki początek zwłóknienia w heterotopowych alloprzeszczepach tchawicy nie odzwierciedla obserwacji w ludzkich płucach ani w unaczynionych przeszczepach płuc u większych zwierząt lub szczurów⁷.

W naszym laboratorium badawczym stworzenie ortotopowego modelu przeszczepu płuc myszy było inspirowane ortotopowym modelem przeszczepu pojedynczego płuca ustalonym u szczurów^8,9. W przeciwieństwie do ludzi, myszy i szczury mają tylko jeden płat w lewym płucu, co stanowi zaledwie dwadzieścia pięć procent całkowitej masy płuc. Ta funkcja umożliwia pomyślne przeprowadzenie przeszczepu lewego płuca w modelach mysich bez konieczności wspomagania krążenia^10,11. Z biegiem czasu wprowadziliśmy modyfikacje techniczne do modelu i w tym kontekście wyjaśnione zostały kluczowe kroki, które zwiększają łatwość wykonania zabiegu.

Poza jego implikacjami w badaniach immunobiologicznych transplantacji, ortotopowy model przeszczepu płuc myszy oferuje solidne narzędzie do badania roli niehematopoetycznych komórek zrębowych płuc w różnych procesach chorobowych. Dzieje się tak, ponieważ zmutowany syngeniczny przeszczep pojedynczego płuca prowadzi do prawie całkowitej wymiany komórek krwiotwórczych na komórki pochodzące od biorcy, podczas gdy niehematopoetyczne komórki zrębu nadal pochodzą od dawcy. W związku z tym "narząd chimeryczny" może zostać stworzony bez napromieniowania gospodarza lub specyficznej dla płuc ekspresji transgene¹². Co więcej, natywne płuco po przeciwnej stronie może funkcjonować jako wewnętrzna kontrola w tym samym zwierzęciu, nie powodując rozległych zmian w układzie odpornościowym gospodarza. Model ten jest bardzo obiecujący dla postępów w badaniach nad przeszczepem płuc i innymi szlakami chorobowymi obejmującymi komórki zrębu płucnego.

Protokół

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Maryland w Baltimore i otrzymały od niego zgodę. Zaleca się stosowanie samców myszy w wieku 8-12 tygodni (20-25 g) BALB/c jako dawcy i myszy C57BL/6 jako biorcy. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie mankietów oskrzelowych i naczyniowych

Czas: 10 min (dla trzech mankietów)

1. Przygotować mankiet oskrzelowy za pomocą angiocewnika 18 G, a mankiet żylny płuc za pomocą cewnika naczyniowego 20 G o długości 1 mm (bez uchwytu przedłużającego) (patrz tabela materiałów). Użyj skalpela #11 i metalowej igły angiocewnika służącego jako powierzchnia tnąca (Rysunek 1).
2. Przygotować mankiet tętnicy płucnej za pomocą angiocewnika 24 G o długości 0,6 mm (patrz Tabela materiałów) w podobny sposób.
   UWAGA: Ogólne podstawowe zasady techniki mankietowej do tworzenia zespoleń mikronaczyniowych są następujące: podczas tworzenia zespoleń mikronaczyniowych do przeszczepu płuc myszy stosuje się specjalne techniki mankietowe ze względu na mały rozmiar naczyń. W przeciwieństwie do większych naczyń, które można zszyć bezpośrednio, mikroskopijne połączenia oskrzelowe i naczyniowe wymagają odrębnej metody. Podstawowa zasada polega na przepuszczeniu naczynia dawczego przez sztywny okrągły mankiet, który jest nieco większy niż samo naczynie.

2. Procedura dawcy

Czas: 10-15 min

1. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny (patrz Tabela materiałów) w celu znieczulenia myszy dawcy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
2. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, ogolić mysz dawcy i umieścić ją w pozycji leżącej pod mikroskopem operacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu.
3. Wstrzyknąć 50 μl heparyny (patrz tabela materiałów) przez żyłę prącia (Rysunek 2A).
4. Wytnij tchawicę i włóż angiocewnik o pojemności 20 G, a następnie owiń go jedwabnym szwem 6-0 (patrz tabela materiałów). Podłączyć cewnik do respiratora (Rysunek 2B).
5. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej (laparotomia) i wykonaj nacięcie obwodowe w przeponie (Ryc. 2C).
6. Przeprowadź sternotomię w linii środkowej¹² i umieść dwa kleszcze po obu stronach mostka do hemostazy i retrakcji od krawędzi kości (Rysunek 2D).
7. Usunąć grasicę i wyciąć przydatki prawego i lewego przedsionka, aby ułatwić odprowadzanie drenażu z płuc.
8. Wstrzyknąć 3 ml zimnego, dostępnego w handlu roztworu konserwującego o temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów) bezpośrednio do prawej komory lub korzenia tętnicy płucnej, używając igły 27 G na strzykawce o pojemności 3 ml w celu wypłukania całej krwi z płuc.
   UWAGA: Wstrzyknięcie dokomorowe lub do tętnicy płucnej może spowodować uszkodzenie płuca dawcy. Kluczowe jest utrzymanie odpowiedniej wentylacji w czasie spłukiwania, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu konserwującego.
9. Zacisnąć tchawicę proksymalnie, a następnie podzielić tchawicę dystalnie. Następnie należy rozciąć tchawicę doogonowo i tylnie¹².
10. Wyjąć blok płuco-serce i przenieść go na małą szalkę Petriego, sterylną i wyłożoną gazą zwilżoną zimnym roztworem konserwującym. Potem włóż tę szalkę Petriego do większej wypełnionej lodem (Rysunek 2E).
11. Aby odsłonić lewą wnękę, umieść małą gazę zarówno na lewej, jak i prawej tkance płucnej w celu wycofania (Rysunek 2F).
12. Delikatnie i precyzyjnie oddziel struktury wnękowe od siebie za pomocą zakrzywionych kleszczy. Wyciąć lewą tętnicę płucną (PA) z oskrzeli (Rysunek 2G). Następnie należy w podobny sposób wypreparować żyłę płucną (PV), znajdującą się w najbardziej ogonowej części wnęki od oskrzela (Ryc. 2H).
    1. Przytnij PA i PV na jak najdłuższej długości, aby zapewnić prawidłowe mankiety. Staraj się unikać wycinania nadmiaru tkanki tłuszczowej lub limfatycznej, ponieważ może to utrudnić wykonanie kroku mankietowego.
13. Umieść mankiet PV około 2 mm powyżej tętnicy płucnej za pomocą zacisku stabilizującego, a następnie włóż PV do wnętrza mankietu. Złóż PV na mankiecie, odsłaniając w ten sposób powierzchnię śródbłonka (Rysunek 2I). Zabezpiecz go wokół mankietu za pomocą szwu 10-0 (2 węzły) (Rysunek 2J).
14. Oddziel PA od wnęki i umieść mankiet na PA w identyczny sposób.
    UWAGA: Na tym etapie powstrzymaj się od przecinania oskrzeli. Zamiast tego należy upewnić się, że oskrzela zostały założone w kajdankach tuż przed implantacją, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu konserwującego do dróg oddechowych w czasie przechowywania. Zanurzyć blok płuc w roztworze konserwującym o temperaturze 4 °C.

3. Procedura odbiorcy

Czas: 50-60 min

1. Znieczulić mysz biorcę mieszaniną ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) (dootrzewnowo) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Następnie ogol lewą klatkę piersiową i zaintubuj¹².
2. Intubację należy przeprowadzić pod bezpośrednim wzrokiem, delikatnie wysuwając język z ust i odsłaniając w ten sposób struny głosowe. Zrób to pod lunetą sekcyjną z 10-krotnym powiększeniem. Zaintubuj zwierzę, wprowadzając cewnik naczyniowy o wymiarach 20 G x 1,25 cala bezpośrednio między struny głosowe.
3. Ułóż zwierzę w prawej bocznej pozycji odleżynowej i oczyść ścianę klatki piersiowej 70% etanolem. (Rysunek 3A).
4. Za pomocą nożyczek naciąć skórę i wykonać torakotomię lewą w całości za pomocą elektromagnesu (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Aby zminimalizować utratę krwi ze ściany klatki piersiowej na tym etapie, należy zastosować elektrokoagulację we wszystkich częściach tej sekcji. Skórę należy osuszyć po przetarciu etanolem, ponieważ elektrokoagulacja niesie ze sobą ryzyko poparzenia w połączeniu z etanolem.
Wejdź do klatki piersiowej z 3 lub 4 ^przestrzeni międzyżebrowej i umieść dwa zwijacze klatki piersiowej (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 3B).
6. Po torakotomii ustaw mysz w pozycji leżącej. Lekko zegnij korpus myszy odbiorcy, aby zbliżyć lewą klatkę piersiową do operatora, poprawiając widoczność wnęki i poprawiając dostępność.
7. Umieść kleszczyki tętnicze pod kątem prostym (6 cali) na lewym płucu biorcy i delikatnie cofnij płuco. Pozwala na odsłonięcie przedniej wnęki, ułatwiając dalszy dostęp chirurgiczny i manipulację (Ryc. 3C).
8. Wyciąć tętnicę płucną (PA) z oskrzeli za pomocą zakrzywionych kleszczy preparacyjnych, uważając, aby nie rozerwać naczynia. Optymalnym miejscem rozwarstwienia jest środkowa część, a odległość 2 mm jest wystarczająca (Rysunek 3D).
9. Rozwiń PV z oskrzeli w podobny sposób (Rysunek 3E).
10. Aby utrudnić przepływ powietrza w lewym płucu biorcy i przepływ krwi, umieść mikroklips tętniaka (patrz Tabela materiałów) u podstawy wnęki (Ryc. 3F).
11. Wykonaj małe nacięcie w kształcie litery V w tętnicy płucnej (PA) i żyle płucnej biorcy (PV) za pomocą mikronożyczek. Delikatnie rozszerz otwory oskrzelowe i naczyniowe za pomocą prostych lub zakrzywionych kleszczy, aby wygenerować odpowiedni otwór do umieszczenia mankietów dawczych.
12. Delikatnie przepłukać rozcieńczoną heparyną (heparyna: sól fizjologiczna = 1:9) w celu usunięcia krwi.
13. Umieść nylon 10-0 wokół PA i pozostaw go luźno (w celu zabezpieczenia mankietów na późniejszym etapie).
14. Następnie przeciąć oskrzela dawcy i założyć je w mankiet w podobny sposób jak PA i PV. Wyrzuć blok prawego płuca dawcy i serca.
15. Trzymając lewe płuco biorcy, umieść płuco dawcy na kleszczach retrakcyjnych i przykryj je małą wilgotną gazą.
    UWAGA: Lewe płuco biorcy powinno być utrzymywane w takiej pozycji, aby wywierać napięcie na wnękę biorcy, ułatwiając w ten sposób proces zespolenia.
16. Z przodu należy odsłonić struktury wnękowe z mankietem i rozpocząć zespolenia, umieszczając dawcę w tętnicy płucnej biorcy (PA), trzymając go niżej za mankiet. W tym momencie PA dawcy doświadczy pewnego rozciągnięcia (Rysunek 3G).
17. Po umieszczeniu tętnicy płucnej dawcy (PA) w PA biorcy, zabezpiecz struktury, umieszczając mikroklips w poprzek przedłużenia mankietu. Następnie zabezpiecz wcześniej założony nylonowy szew 10-0 wokół tętnicy płucnej biorcy (PA) i mankiet dwoma węzłami (patrz Rysunek 3H). Na koniec odczep mikroklips od mankietu przedłużającego.
18. Włóż PV dawcy do PV biorcy w podobny sposób (Rysunek 3I).
19. Włóż oskrzela dawcy do oskrzela biorcy, upewniając się, że oskrzela dawcy jest w pewnym stopniu rozciągnięte (Ryc. 3J). Zwolnij mikroklips na wnęce, aby przywrócić perfuzję i wentylację (Rysunek 3K).
20. W jamie klatki piersiowej włóż płuco dawcy i wytnij lewe płuco biorcy, przecinając pozostałe kawałki tętnicy płucnej biorcy (PA), żyły płucnej (PV) i oskrzeli z przodu (Ryc. 3L). Usunąć lewe płuco biorcy.
21. Zamknij klatkę piersiową za pomocą szwu 6-0 PDS (patrz Tabela materiałów), zabezpieczając w ten sposób jedno żebro poniżej i jedno żebro powyżej nacięcia torakotomii. Tuż przed zamknięciem klatki piersiowej zapewnij zwierzęciu jeden duży oddech, aby usunąć resztki powietrza z klatki piersiowej.
    UWAGA: W przeciwieństwie do modelu szczurzego, nie ma potrzeby wkładania rurek do klatki piersiowej myszom.
22. Zszyć skórę i znajdującą się pod nią tkankę podskórną za pomocą ciągłego podskórnego szwu jedwabnego 6-0 (patrz tabela materiałów).

4. Odzyskiwanie zwierząt

Czas trwania: 12 h

1. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przy nieograniczonym dostępie do jedzenia i wody na OIOM-ie dla małych zwierząt (przenośny oddział intensywnej terapii dla zwierząt, patrz tabela materiałów) przez noc.
2. Buprenorfinę należy podawać podkroplowo (0,5-1 mg/kg) co 12 godzin, aby zminimalizować ból pooperacyjny.

Wyniki

Na podstawie doświadczeń z tym modelem w ciągu ostatnich 10 lat, osoby z podstawowymi umiejętnościami mikrochirurgicznymi zazwyczaj wymagają nauki około 50 zwierząt. Po osiągnięciu biegłości procedury dawstwa trwają zwykle 15-30 minut, podczas gdy procedury biorcy trwają około 60 minut. Po początkowej krzywej uczenia się, śmiertelność okołooperacyjna jest zwykle bardzo niska.

W Rysunek 4A,B, morfologia płuc siedem dni po wszczepieniu płuc dawcy Balb/cJ do...

Dyskusja

Technika mankietowa do przeszczepu mysiego lewego płuca stanowi znaczący postęp w badaniach transplantacyjnych^10,11. Krytyczne kroki obejmują precyzyjne i skrupulatne rozwarstwienie struktury wnęki i bezpieczne zespolenia. Modyfikacje mogą być wprowadzane w celu zaspokojenia potrzeb eksperymentalnych, ale wymaga to krzywej uczenia się. Nasza grupa zmodyfikowała pozycję myszy odbiorcy z tylnej na przednią, uzyskując lepszy widok wnęki poprzez zgięcie myszy odbiorc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10-0 Nylonowy szew	Surgical Specialties Corporation, Reading PA	AK-0106
2 kleszcze Dumont #5	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	11251-20
2 Zakrzywiona końcówka zacisku Halsted-Mosquito	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91309-12
6-0 pleciony jedwabny szew	Henry Schein Inc., Melville, NY,	100-5597
6-0 Szew z polidioksanonu PDS II i	Ethicon Inc., Somerville, NJ.	Z117H
70% etanolu	Pharmco Products Inc., Brookfield, CT	111000140
Kleszcze Adson	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91127-12
Myszy Balb/c	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000651	8– 12 tygodni; Mężczyzna
Koagulator bipolarny	Valleylab Inc., Boulder, CO	SurgII-20, E6008/E6008B
C57BL/6 myszy	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA	000664	8– 12 tygodni; Mężczyzna
Bezbarwne soczewki Hibiclens z chlorheksydyną	, Mö lnlycke Health Care US, LLC, Norcross, GA	57591
Elektrokoagulacja	Bovie
Drobne nożyczki sprężynowe w stylu vannas	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15000-03
Uchwyt na igłę Halsey	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	91201-13
Aparat Harvard Wentylator dla myszy VentElite	Harvard Apparatus, Holliston, MA	55-7040	ustawienia 3L O2/min, częstość oddechów 130 uderzeń na minutę, objętość oddechowa 0,4 cm³
Roztwór heparyny	Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL	504031	100 U/ml
sól fizjologiczna do wstrzykiwań	Hospira Inc., Lake Forest, IL	NDC 0409-4888-20
Ketamina	VetOne, Boise, ID	501072	50 mg/kg
Mikro kleszczyki pediatryczne König Mixter Szczęki kątowe	Medline, Northfield, IL,MDS1247714		Extra Fine, Długość całkowita 5 1/2" (14cm)
Wysokotemperaturowa kauteryzacja Medline, z cienką końcówką	Leica Microsystems, Inc., Allendale, NJ	10 450 290
Mikroskop Leica M80 F12 Statyw podłogowy	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	15396-00
Bardzo cienkie nożyczki sprężynowe Moria	Parkland Scientific, Coral Springs, FL	V3000i
Ohio Waporyzator izofluranowy	Vitrolife Inc., Englewood, CO,	19001
Perfadex  roztwór glukozy o niskiej zawartości dekstranu potasu	Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ	353025	Roztwór do konserwacji elektrolitów
polistyrenowe Petrrydzy	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	00632-11 i 00649-11	150 &razy; 25 mm i 60 &-razy; 25 mm
S& T Kleszcze SuperGrip prosta i kątowa końcówka	Fine Science Tools Inc., Foster City, CA	18200-20
System chowania małych zwierząt	Puritan Medical Company LLC, Guilford, Maine	823-WC	stożkowe mini bawełniane końcówki 3-calowe aplikatory
sterylne Q-tips	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD&	nbsp;
Cewnik dożylny SROX2419Z Surflo etfe, żółty, 24 G x 0,75"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX1851Z
Cewnik dożylny Surflo etfe; Zielony, 18 G x 2"	Terumo Medical Corporation, Elkton, MD	SROX2032Z
Cewnik dożylny Surflo etfe; Różowy, 20 G x 1,25"	Thermocare, Inc., Incline Village, NV
System OIOM dla małych zwierząt ThermoCare,	A do Z Vet Supply, Drezno, TN	008679	10 mg/kg
ksylazyny	Aesculap, Inc., Dolina Środkowa, PA,	FT480T
Yasargil Clip Applier	Aesculap, Inc., Center Valley, PA,	FT264T
Yasargil Tymczasowe klipsy do tętniaka	Medline, Northfield, IL,

od ESCT001