Tutaj opisujemy niezbędne kroki do ustanowienia modelu EVLP u szczurów oraz pokazujemy profil zapalny związany z przekroczonymi płucami. Celem jest propagowanie wiedzy i doświadczeń na temat modelu EVLP szczurów, umożliwiając integralne zrozumienie biologicznych odpowiedzi związanych z tą rewolucyjną techniką.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie modelu szczura perfuzyjnego płuc ex vivo dla wglądów translacyjnych w transplantację płuc
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od czasu ustanowienia przeszczepu płuc jako strategii terapeutycznej zaawansowanych chorób płuc, środowisko naukowe stoi przed problemem niskiej liczby płuc uznawanych za nadające się do procesu dawstwa. W ostatnich dekadach jednak sytuacja ta uległa pozytywnej zmianie, biorąc pod uwagę rozwój perfuzji płuc ex vivo (EVLP) jako strategii oceny i rekondycjonowania płuc marginalnych. Utworzenie EVLP w dużych ośrodkach transplantacyjnych sprzyjało zwiększeniu liczby przeszczepów płuc, zarówno poprzez zwiększenie dokładności diagnostycznej funkcji płuc, jak i poprzez stworzenie skutecznej platformy do rekondicjonowania przeszczepów płuc. W tym kontekście, w obliczu kwestii etycznych i logistycznych, a także w badaniu czynników immunologicznych związanych z przeszczepami płuc, rozwój modeli EVLP u gryzoni stał się istotny, ze względu na ich wiarygodność, możliwość manipulacji genetycznej oraz niższe koszty. Niniejszy artykuł opisuje protokół ustanawiania modelu EVLP u szczurów oraz pokazuje profil zapalny związany z przebitym płucem. To pomoże rozpowszechnić wiedzę o modelu EVLP szczurów, promując naszą wiedzę o biologicznych reakcjach związanych z tą rewolucyjną techniką.
Wprowadzenie
Przeszczep płuc został uznany za strategię terapeutyczną w przypadku chorób w końcowym stadium, z ulepszeniem metod chirurgicznych i immunosupresji w ostatnich dekadach. Pomimo wysokiego zapotrzebowania, liczba akceptowalnych zmarłych dawców płuc jest niższa niż w przypadku innych narządów stałych, a liczba przeprowadzonych przeszczepów płuc jest niższa: 1,2,3. Aby sprostać niedoborowi dawców, środowisko medyczne rozszerzyło kryteria dawstwa płuc, zamieniając narządy wcześniej uznawane za niezdolne do przeszczepu w potencjalne narządy do przeszczepu. Jednak rozszerzone kryteria wymagają różnych działań dla lepszego zrozumienia i interwencji, biorąc pod uwagę możliwe systemowe konsekwencje wynikające z oddanego organu. Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) pojawiła się jako technika zapewniająca normotermiczną konserwację płuc, ocenę funkcji płuc oraz rekondicjonowanie płuc, które wcześniej uważano za niewykonalne w procesie dawstwa 4,5,6.
Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę przeszczepów płuc od czasu wprowadzenia EVLP w dużych ośrodkach transplantacyjnych, coraz częściej badane są strategie zachowania i naprawy płuc. W tym sensie, w obliczu kwestii etycznych i logistycznych, a także w badaniu czynników immunologicznych związanych z transplantacją płuc, rozwój modeli EVLP dla gryzoni stał się istotny, ze względu na ich wiarygodność, możliwość manipulacji genetycznej oraz niższe koszty 7,8,9. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do ustanowienia modelu EVLP szczura oraz pokazujemy profil zapalny związany z przekroczonymi płucami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z Protokołem Użytkowania Zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia. Samce szczurów Lewisa (255-330 g) miały ad libitum dostęp do jedzenia i wody. Następnie były utrzymywane w kontrolowanym środowisku (18-22 °C) z cyklem dnia i nocy trwającym 12 godzin. Zobacz Tabelę Materiałów , aby poznać szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, rozwiązań i instrumentów używanych w tym protokole.
1. Inicjalizacja systemu perfuzji płuc ex vivo
- Upewnij się, że wszystkie przetworniki są podłączone do izolowanego sprzętu do perfuzji oraz systemu akwizycji danych (Rysunek 1). Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji danych.
- Przed przelewem napełnij obwód EVLP 150 mL roztworu Steena, uzupełnionego o 1000 jednostek USP heparyny sodu, 50 mg cefazoliny i 50 mg metyloprednizolonu.
- Ustaw ciepłą kąpiel na 20 °C. Zacznij cyrkulować ciepłą wodę, aby ogrzać cały system EVLP.
2. Procedura pobierania płuc dawcy
- Znieczulaj szczura za pomocą intraotrzewnejowego zastrzyku ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg), lub zgodnie z lokalną praktyką, a następnie potwierdzić odpowiednią znieczulenie poprzez ocenę odruchu uszczypania palców u stóp. Przez cały zabieg stosuj nawilżenie oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia, używając poduszki grzewczej lub podobnego systemu aż do pobrania organów.
- Wykonaj intubację tchawicową (14 G dożylnie cewnik). Po intubacji podłącz rurkę tchawicową do systemu wentylacji dla małych zwierząt. Wentyluj szczura objętością pływową 10 mL/kg, szybkością 60 oddechów/min, udziałem tlenu wdechowego (FiO2) 0,5 oraz dodatnim ciśnieniem końcowym wydechowym (PEEP) 2 cmH2O.
- Połóż szczura w pozycji leżącej.
- Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy wejdź do jamy otrzewnej i przenieś nacięcie w czaszce, wykonując laparotomię środkową i wstrzykując heparynę sodu (400 jednostek USP) do żyły wrotnej.
- Następnie wejdź do jamy piersiowej przez wyrostek ksyloidalny. Sternotomia wykonana jest z resekcją czaszki mostka i ostrożnym promieniowym otwarciem przepony, aby nie uszkodzić płuc.
- Aby usunąć blokadę serca i płuc, wykonaj nacięcie w dolnej żyłze głowej (dożylnej kości dożylnej) oraz wzdłuż wierzchołka lewego serca.
- Za pomocą mikronożyczek wykonaj przednie nacięcie w prawym odpływie komorowym. Następnie należy wprowadzić dożylny cewnik o pojemności 18 G do pnia płucnego i przepłukać płuca 20 mL roztworu dekstranu o niskiej zawartości potasu (LPD) zawierającego 10 μg/mL prostaglandyny E1.
- Zaraz po płukaniu zaciskaj dolną trzecią część tchawicy na końcu wdechu, aby zachować płuca w stanie nadmuchania.
- Pobierz blok serca i płuc i umieść go w roztworze LPD do przechowywania.
UWAGA: Przeszczep płuc można przechowywać w temperaturach i różnych odstępach czasowych w zależności od celów badawczych. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki płuc, które przeszły różne długości zimnego czasu niedokrwiennego (CIT) na lodzie.
3. Procedura perfuzji płuc ex vivo
- Pod główną tętnicą płucną (PA) i wokół komór należy założyć jedwabną ligaturę 0, którą przygotuj w celu ułatwienia kaniulacji.
- Podłącz kaniulę PA do linii dopływu systemu EVLP i uruchom pompę perystaltyczną z 10% przepływu utrzymania, co pozwala usunąć powietrze z kaniuli PA.
- Umieść i zabezpiecz kaniulę dolotową do głównego pna (średnica przelotowa: 2,0 mm/średnica głowy: 2,5 mm), a następnie kanyulę drenażową od wierzchołka serca do lewego przedsionka (średnica LA-Head: 4,0 mm) przez zastawkę mitralną w celu dalszej perfuzji. Użyj kleszczy do rozszerzenia zastawki mitralnej, ułatwiając kanilowość.
- Zrób mały otwór w tchawicy i włóż kaniulę tchawicową (oddalony: 2,0 mm/L: 14 mm). Następnie podłącz go do przewodu wentylacyjnego systemu.
- Podłącz kaniulę LA do linii odpływowej systemu.
- UWAGA: Ustawiamy 10% przepływu utrzymania jako inicjację perfuzji. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do płuc, upewnij się, że pułapka jest wypełniona.
- Stopniowo zwiększać przepływ perfuzji do 20% wydajności serca (CO).
UWAGA: Do perfuzji obu płuc użyliśmy szacowanego stężenia CO na poziomie 75 mL/min dla szczurów10,11 g o wadze 250 g. Przepływ perfuzji stopniowo zwiększano do 1 godziny, aby osiągnąć docelową prędkość przepływu zgodnie z naszym klinicznym protokołem EVLP12. Parametry perfuzji są podsumowane w Tabeli 113. - Usuń zacisk tchawicowy 20 minut po rozpoczęciu perfuzji i rozpocznij wentylację płuc, a następnie rozpocznij przepływ gazu EVLP (8% CO2, 6%O2, 86% N2), aby utrzymać napływ perfuzacji PCO2 w zakresie od 35 do 45 mmHg.
UWAGA: Parametry wentylacji są podsumowane w Tabeli 113.
4. Parametry i zarządzanie próbkami
- Co godzinę podczas EVLP zapisuj w czasie rzeczywistym dynamiczną zgodność płuc oraz opór naczyniowy płuc (PVR).
UWAGA: Na 5 minut przed badaniami fizjologicznymi płuca powinny zostać rozszerzone do ciśnienia inflacyjnego. - Pobieraj próbki perfuzacji z portu próbki co godzinę i zamrażaj je w ciekłym azocie do dalszych analiz.
UWAGA: Dodatkowo wykonujemy manewr rekrutacyjny (do 20 cmH2O) 5 minut przed oceną, po czym pobieramy perfuzatory do badań gazów we krwi w celu pomiaru pH, PCO2, PO2, elektrolitów, glukozy i mleczanu. - Zatrzymaj perfuzję i zaciskaj tchawicę, aby utrzymać płuca w stanie napompowania. Następnie izolować próbki płuc i szybko je zamrażać w ciekłym azocie lub umieścić w roztworach utrwalających do dalszych badań.
UWAGA: Tutaj płuca były perfuzowane przez 4 godziny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wszystkie płuca z CT trwającym od 20 do 18 godzin mogły być perfuzowane przez 4 godziny (rysunek 2)13. Zgodność była stabilna w większości grup, z wyjątkiem 18-godzinnego CIT, który stopniowo spadał w ciągu 4 godzin perfuzji (rysunek 2A). Mimo to nie zaobserwowano istotnych różnic w oporności naczyniowej, natlenieniu przeszczepów płuc oraz poziomach glukozy w obu grupach (Rysunek 2B-D...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to opisywało niezbędne kroki do ustanowienia protokołu EVLP dla szczurów. Tutaj pokazujemy, że płuca dawcy mogą być perfuzowane przez 4 godziny po chłodnym, statycznym zachowaniu do 18 godzin w temperaturze 4 °C. Wykazano to poprzez ocenę zgodności płuc, oporności naczyń płucnych, stężenia glukozy do mleczanu perfuzowanego oraz stosunku P/F.
Wzrost platformy EVLP jako ważnego narzędzia do oceny funkcji płuc oraz do rekondicjonowania przeszczepów zmotywował kilka grup do opracowania mod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
MC jest udziałowcem Traferox Technologies Inc oraz konsultantem dla Lung Bioengineering Inc. MC otrzymuje wsparcie badawcze od Beyond Air Inc. oraz Synklino. Autorzy twierdzą, że nie istniały konkurencyjne interesy, które mogłyby wpłynąć na wyniki przedstawione w tym artykule.
Podziękowania
Rysunek 1 został stworzony na podstawie BioRender.com (potwierdzenie praw do publikacji i licencji [Umowa: BT25KGSKWF]).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14 g cewnika dożylnego | BD | 381167 | Intubacja orotchawicowa |
| 16 G dożylnie cewnik | BD | 381157 | Cewnik do przepłukania płuc |
| 2-0 Szawy Sofsilk | Covidien | S-305 | Utrwalenie rurki tchawicowej |
| 3-0 Szew Sofsilk | Covidien | S303 | Utrwalenie kniąli tętniczej i przedsionkowej |
| Rdzeniowy IPL-2 izolowany perfuzowany system płuc dla szczurów | Aparat Harvarda | 734276 | System perfuzji płuc Ex Vivo (EVLP) |
| Ketamina (narketan) | Wetochinol | 440894 | Sedacja/znieczulenie |
| Duża tętnica płucna (kaniula tętnicy płucnej ); | Aparat Harvarda | 73-0711 | |
| Lewa kaniula przedsionkowa | Aparat Harvarda | 73-0712 | |
| Roztwór glukozy z dekstranem o niskiej zawartości potasu (Perfadex) | XVIVO | 19811 | Rozwiązanie konserwatorskie |
| Metyloprednizolon sodu sukcynian (SOLU-MEDROL) | Pfizer | 14705 | Przeciwzapalne |
| Prostaglandyna E1 (Prostin VR) | Pfizer | RX297945 | |
| Respirator dla małych zwierząt (Model 683) | Aparat Harvarda | 55-0000 | |
| Heparyna sodu | Leo Pharma | 453811 | |
| Rozwiązanie Steena | XVIVO | 19004 | Buforowany roztwór zewnątrzkomórkowy do perfuzji płuc podczas EVLP |
| Sugita Aneur clip curv | Mizuho | 07-940-86 | Zacisk tchawicowy |
| Kaniula tchawicowa i nbsp; | Aparat Harvarda | 73-3384 | |
| Ksylazyna (Rompun) | Bayer Healthcare | 2169592 | Sedacja/znieczulenie |
Bibliografia
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
- Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
- Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
- Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
- Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
- Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
- Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
- Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
- Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
