Method Article

Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

DOI:

10.3791/65985

⸱

December 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1KYOTO Drosophila Stock Center, Kyoto Institute of Technology, 2Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 3Research Center of Genetic Resources, National Agriculture and Food Research Organization, 4Shizuoka Prefectural Ogasa High School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoce pożądana jest długoterminowa metoda konserwacji szczepów Drosophila jako alternatywa dla częstego przenoszenia dorosłych much do fiolek ze świeżą żywnością. Protokół ten opisuje kriokonserwację pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i odrodzenie szczepu poprzez ich przeszczepienie do agametycznych zarodków gospodarza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepy Drosophila muszą być utrzymywane poprzez częste przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek. Niesie to ze sobą niebezpieczeństwo pogorszenia mutacji i zmian fenotypowych. W związku z tym konieczne jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego przechowywania bez takich zmian. Pomimo wcześniejszych udanych prób, kriokonserwacja zarodków Drosophila nadal nie ma praktycznego zastosowania ze względu na niską odtwarzalność. W tym miejscu opisujemy protokół kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) i odrodzenia szczepu poprzez przeszczepienie kriokonserwowanych PGC do agametycznych zarodków gospodarza Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGC są wysoce przepuszczalne dla środków krioprotekcyjnych (CPA), a zmienność rozwojowa i morfologiczna między szczepami jest mniej problematyczna niż w przypadku krioprezerwacji zarodków. W tej metodzie PGC są pobierane z około 30 zarodków dawcy, ładowane do igły po leczeniu CPA, a następnie kriokonserwowane w ciekłym azocie. Aby wytworzyć gamety pochodzące od dawcy, kriokonserwowane PGC w igle są rozmrażane, a następnie umieszczane w około 15 agametycznych zarodkach gospodarza. Dzięki temu protokołowi osiągnięto częstość co najmniej 15% płodnych much, a liczba potomstwa na płodną parę była zawsze więcej niż wystarczająca, aby ożywić oryginalny szczep (średnia liczba potomstwa wynosiła 77,2 ± 7,1), co wskazuje na zdolność kriokonserwowanych PGC do przekształcania się w komórki macierzyste linii zarodkowej. Średnia liczba płodnych much na igłę wynosiła 1,1 ± 0,2, a 9 z 26 igieł dało dwa lub więcej płodnego potomstwa. Stwierdzono, że 11 igieł wystarcza do wyprodukowania 6 lub więcej potomstwa, w którym prawdopodobnie znajduje się co najmniej jedna samica i jeden samiec. Żywiciel agametyczny umożliwia szybkie ożywienie szczepu, po prostu krzyżując nowo pojawiające się samice i samce much. Ponadto PGC mogą być wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrzymanie szczepów Drosophila poprzez przenoszenie dorosłych much do nowych fiolek z jedzeniem nieuchronnie prowadzi do akumulacji mutacji i zmian epigenetycznych w czasie. Konieczne jest opracowanie alternatywnej metody długoterminowego utrzymania szczepów Drosophila bez takich zmian, zwłaszcza w przypadku szczepów referencyjnych, w których musi zostać zachowany cały genom. Opisano kilka udanych prób kriokonserwacji zarodków lub jajników Drosophila1,2,3. Niestety, nadal nie mają one praktycznego zastosowania ze względu na niską odtwarzalność. Rzeczywiście, zarodki we wczesnym stadium mają niski wskaźnik przeżywalności po kriokonserwacji ze względu na wysoką zawartość żółtka, co utrudnia przenikanie i dyfuzję czynnika krioprotekcyjnego (CPA)2,3. Przepuszczalność CPA jest również poważnie ograniczona przez woskowate warstwy zarodków w późnym stadium rozwoju. Znalezienie specyficznego dla szczepu okresu czasu, w którym zarodki mają wysoki wskaźnik przeżywalności i cieńszą warstwę wosku, jest trudne i czasochłonne. Ostatnio Zhan et al.4 ulepszyli metody przenikania zarodków, ładowania CPA i witryfikacji oraz z powodzeniem krioprezerwowali zarodki wielu szczepów. Metody te nie są jednak łatwe do zastosowania, ponieważ żywotność zarodków po przepuszczalności jest zwykle słaba. W związku z tym nadal potrzebna jest dalsza poprawa i rozwój alternatywnych podejść. Metody polegające na kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) są alternatywnym podejściem do długoterminowego utrzymania szczepów Drosophila.

Przeszczep PGC (zwany również komórką biegunową) został wykorzystany do generowania chimer linii zarodkowej, zwłaszcza u kobiet, do badania procesów takich jak matczyne skutki śmiertelnych mutacji zygotycznych i determinacja płci komórek rozrodczych5,6,7,8,9,10,11,12. PGC są znacznie mniejsze niż zarodki i prawdopodobnie są wysoce przepuszczalne dla większości krioprotektantów. Co więcej, zmienność rozwojowa i morfologiczna między szczepami jest mniej problematyczna, a gospodarz agametyczny umożliwia szybkie odtworzenie całych genomów. Niedawno opracowaliśmy nową metodę krioprezerwacji PGC13, która zapobiega nieuniknionym zmianom genetycznym i epigenetycznym w szczepach Drosophila. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół.

Ta metoda kriokonserwacji wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie obsługi PGC i oprzyrządowania. Chociaż podejście krok po kroku może być skutecznym rozwiązaniem dla tych, którzy go nie znają, może być nieodpowiednie dla małych laboratoriów ze względu na wymagania dotyczące oprzyrządowania. Ten protokół kriokonserwacji PGC można łatwiej dostosować do stosowania z różnymi gatunkami Drosophila i różnymi gatunkami owadów niż protokoły kriokonserwacji zarodków ze względu na mniejsze różnice rozwojowe i morfologiczne. PGC mogą być również potencjalnie wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu14,15,16. Podsumowując, metoda ta może być stosowana w centrach magazynowych i innych laboratoriach w celu utrzymania szczepów much i innych owadów przez dłuższy czas bez zmian.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

  1. System mikromanipulatora: Zmontuj system mikromanipulatora do zbierania i przeszczepiania komórek (Rysunek 1A).
  2. Szkiełka szklane z kolekcji PGC (Rysunek 2A)
    1. Aby przygotować klej heptanowy, odetnij dwustronną taśmę o długości około 30 cm i namocz ją przez noc w 7 ml technicznego (zwykłego) roztworu heptanu.
    2. Narysuj dwie równoległe linie odniesienia do wyrównania zarodków na odwrocie szklanego szkiełka.
    3. Rozprowadź krople powyższego kleju heptanowego na szkiełku podstawowym (po stronie bez linii) za pomocą pipety Pasteura. Wysusz powierzchnię szkiełka na powietrzu, aż stanie się biała.
    4. Powtórz dodawanie i rozprowadzanie kropli kleju heptanowego i ponownie wysusz szkiełko.
      UWAGA: Klej zapobiega rozlewaniu się płynnych roztworów po płaskiej powierzchni i ułatwia ładowanie roztworów wodnych do igły.
    5. Aby wykonać ramki do puli zarodków, przyklej trzy warstwy standardowej taśmy winylowej o grubości 0,2 mm, takiej jak taśma izolacyjna, na desce do krojenia. Pokrój taśmę na prostokąty o szerokości 1,5 cm. Następnie odetnij wszystkie trzy warstwy taśmy, pozostawiając ramkę o grubości od 2 do 3 mm.
      UWAGA: Ramka puli zarodków jest mocowana po wyrównaniu zarodków, aby utworzyć pulę dla zarodków.
  3. Igły do przeszczepów
    UWAGA: Wszystkie dostępne na rynku igły w czasie tego badania były zbyt wąskie lub zbyt szerokie do kriokonserwacji PGC.
    1. Zrób igłę za pomocą szklanej kapilary i ściągacza. Używamy ściągacza NARISHIGE PN-31 z poziomem grzałki na poziomie 85,0-98,4, poziomem głównym magnesu na 57,8 i poziomem podrzędnym magnesu na 45,0.
    2. Aby wykonać igłę o przybliżonej grubości ścianki 1 μm i końcówce o długości około 200 μm i średnicy wewnętrznej 10-12 μm, wypoleruj końcówkę igły w następującym trzyetapowym procesie (Rysunek 3). Najpierw zetrzyj końcówkę igły pod kątem 30° z prędkością 780 obr./min, aż końcówka będzie miała średnicę wewnętrzną 10-12 μm. Ten pierwszy etap mielenia trwa około 1 godz.
      UWAGA: Aby uniknąć złamania końcówki igły, najpierw obróć kamień szlifierski, a następnie delikatnie przesuń igłę w dół na kamień szlifierski.
    3. Narysuj linię na górze igły, aby śledzić żądany kąt. Obróć igłę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 90° i ponownie wypoleruj ją z prędkością 180 obr./min. Trwa to około 5 minut.
    4. Obróć igłę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 45° i poleruj ją z prędkością 180 obr./min przez jedną sekundę.
    5. Umieść szkiełko zbiorcze z kroplą mieszaniny kwasu chromowego (UWAGA: toksyczny) na stoliku mikroskopu. Przymocuj igłę do uchwytu kapilarnego (Rysunek 1D) pod kątem 10°-13° w stosunku do powierzchni szkiełka, ostrożnie przesuń igłę w dół i zanurz końcówkę w mieszaninie kwasu chromowego.
    6. Pociągając i popychając tłok (Rysunek 1B), kilkakrotnie mechanicznie załaduj i opróżnij roztwór z igły, aby usunąć szklane zanieczyszczenia z igły. Pamiętaj, aby wyczyścić również ścianę zewnętrzną.
    7. Umyć igłę dwa razy wewnątrz i na zewnątrz wodą destylowaną, aby całkowicie usunąć kwas chromowy.

2. Zbieranie i kriokonserwacja PGC

  1. Pobieranie zarodków
    1. Przenieść odpowiednią liczbę muszek ze szczepu dawcy będącego przedmiotem zainteresowania (około 450 dla każdej płci dla kubka do pobierania zarodków) do kubka do pobierania zarodków z płytką do pobierania zarodków (Rysunek 1E) i inkubować je w temperaturze 25 °C. Zwykle używamy 3- do 5-dniowych much rodzicielskich, które są hodowane w mniej zatłoczonych warunkach w temperaturze pokojowej (23-25 °C).
    2. Wykonaj dwie 30-minutowe zbiórki wstępne i wyrzuć wszystkie złożone jaja. Ponieważ samice mogą zachować zapłodnione jaja, które rozwijają się w jajowodzie, ten krok jest wymagany do synchronizacji składania jaj w kroku 2.1.3 (Rysunek 4).
    3. Po dwóch wstępnych pobraniach należy pobierać zarodki przez 50 minut, a następnie inkubować pobrane zarodki w wilgotnej komorze w temperaturze 25 °C, aby umożliwić zarodkom rozwinięcie się do stadium blastodermy (wczesne stadium 517). Czas inkubacji wynosi zwykle 100 minut, ale może być wydłużony do 120 minut, w zależności od szczepu (Rysunek 4).
      UWAGA: Nawilżaną komorę tworzy się poprzez umieszczenie wilgotnego ręcznika papierowego na dnie plastikowego pudełka i spryskanie go mgiełką wody przed użyciem. We wczesnym stadium 5 zarodki tworzenie PGC jest zakończone, ale cellaryzacja somatyczna nie. Dokładny etap rozwoju zarodka określa się pod mikroskopem złożonym w kroku 2.4.
  2. Zarodki dechorionujące
    1. Umieść kroplę wody destylowanej na sitku ze stali nierdzewnej (oczka 150, otwór 109 μm, średnica drutu 60 μm; Rysunek 1F). Za pomocą kleszczy zbierz zarodki z płytki do pobierania zarodków i umieść je w kropli wody.
    2. Dociśnij bibułę do sitka od spodu, aby wchłonąć wodę. Dodaj kropelki świeżego 5% (jako Cl) roztworu podchlorynu sodu do zarodków i ciągle stukaj w sitko przez 10 sekund.
    3. Umyj zarodki, spryskując je bezpośrednio wodą destylowaną i dociśnij bibułkę do sitka od spodu, aby wchłonąć wodę. Powtórz ten krok 3 razy.
  3. Wyrównywanie zarodków z odkorzą
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy do transferu zarodków. Ustaw zdekorionowane zarodki w dwóch rzędach na szkiełku podstawowym do pobierania PGC wzdłuż dwóch linii odniesienia (Rysunek 2A). Zarodki są zorientowane przodem do prawej strony (strona, która ma być manipulowana), a brzuszną stroną do góry.
      UWAGA: Ten etap powinien zostać zakończony w ciągu 20 minut, podczas których zwykle wyrównujemy około 40 zarodków.
    2. Umieścić ramkę puli zarodków wokół zarodków na szkiełku podstawowym do pobierania PGC. Upuść 1 μl roztworu CPA (1x roztwór Ringera Ephrussi-Beadle'a, EBR, zawierający 20% glikolu etylenowego i 1 M sacharozy; 1x EBR: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 i 10 mM Hepes przy pH 6,9) w dwóch oddzielnych miejscach w obszarze zamkniętym przez ramę i napełnij basen olejem silikonowym, aby zapobiec wysychaniu zarodków (Rysunek 2A).
      UWAGA: Aby przygotować roztwór CPA, całkowicie rozpuść 10,26 g sacharozy w około 20 ml destylowanegoH2Ozawierającego 3 ml 10 x roztworu EBR. Dodać 6 ml glikolu etylenowego, a następnie dodać destylowanyH2Odo 30 ml. Po dokładnym wymieszaniu przefiltruj roztwór przez jednorazową membranę o średnicy 0,22 mm.
  4. Zbieranie PGC
    1. Umieścić szkiełko podstawowe z tworzywa sztucznego do pobierania próbek PGC, o którym mowa w kroku 2.3.2, na stoliku mikroskopu wyposażonym w system mikromanipulatora. Przymocuj igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie, a końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Załaduj olej silikonowy do igły na 2-3 s.
    2. Rozpocznij pobieranie PGC od zarodków w lewym rzędzie. Używając soczewki obiektywowej 20x, delikatnie przesuń końcówkę igły do powierzchni przedniego końca zarodka i wbij zarodek w kierunku tylnego końca, nie przesuwając igły, ale przesuwając stolik mikroskopu.
    3. Gdy końcówka igły dotrze do tylnego końca, lekko cofnij igłę i całkowicie rozładuj żółtko z igły tuż wewnątrz warstwy komórek somatycznych.
    4. Utrzymując stałe ciśnienie w igle, przesuń końcówkę igły do PGC tuż wewnątrz tylnego bieguna i delikatnie, ale nie zajmując dużo czasu, załaduj PGC.
    5. Szybko wyciągnij igłę z zarodka i wypuść żółtko i inne zanieczyszczenia z igły do basenu oleju silikonowego, utrzymując PGC w igle. Następnie załaduj czysty olej silikonowy z basenu.
    6. Powtórzyć kroki od 2.4.2 do 2.4.5 dla pozostałych zarodków w lewym rzędzie. Przed pobraniem PGC od nowego zarodka należy zdeponować jak najwięcej oleju silikonowego załadowanego w kroku 2.4.5 wewnątrz warstwy komórek somatycznych, trzymając jednocześnie załadowane PGC w igle. Gwarantuje to, że nowo załadowane PGC sąsiadują z poprzednio zebranymi PGC bez żadnego materiału pośredniego między nimi.
    7. Po zakończeniu pobierania PGC z zarodków w lewym rzędzie, należy w miarę możliwości oddzielić PGC od żółtka i innych zanieczyszczeń. Aby to osiągnąć, umieść wszystkie PGC w igle na powierzchni zarodka i usuń wszelkie żółtka lub inne zanieczyszczenia z innego sąsiedniego zarodka.
    8. Następnie zbierz PGC z zarodków w prawym rzędzie. Połącz PGC zebrane z prawego i lewego rzędu.
  5. Stosowanie środka krioprotekcyjnego (CPA) do PGC
    1. Po umyciu igły z CPA w jednej kropli, załaduj świeży CPA w innej kropli do igły i dodaj CPA do PGC osadzonych na zarodku. Wielkość CPA powinna być równoważna wielkości CPC.
    2. Usuń jak najwięcej CPA z klastra PGC 1-2 s po dodaniu CPA. PGC nieznacznie się kurczą i stają się kwadratowe natychmiast po dodaniu CPA.
    3. Opróżnij igłę, a następnie załaduj olej silikonowy na 5 s lub dłużej. Załaduj wszystkie zebrane PGC, a następnie ponownie załaduj olej silikonowy na 5 s lub dłużej. PGC są teraz umieszczone pomiędzy dwiema warstwami oleju silikonowego (Rysunek 2B).
      UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej żółtka, CPA i innych zanieczyszczeń.
  6. Kriokonserwacja PGC
    1. Otwórz trójdrożny kran (Rysunek 1C), a następnie odłącz igłę od mikromanipulatora. Zetrzyj olej z powierzchni igły miękką bibułą. Nie dotykać bezpośrednio końcówki igły tkanką.
    2. Przymocuj igłę do uchwytu na igłę i zablokuj ją u podstawy za pomocą taśmy winylowej ( Rysunek 1H). Przymocuj etykietę do rurki uchwytu.
    3. Błyskawicznie zamroź uchwyt z igłą skierowaną w dół, zanurzając go w ciekłym azocie. Nie zwalniaj uchwytu, dopóki płyn nie przestanie musować z rusztu.
    4. Przechowuj uchwyt w zbiorniku ciekłego azotu w obszarze fazy ciekłej, a nie w obszarze fazy gazowej.

3. Rozmrażanie i przesadzanie PGC

  1. Zbieranie, dechorionacja i wyrównywanie zarodków z agametycznych muszek żywiciela
    1. Zbierz i zdechorionuj zarodki od agametycznych much gospodarza, postępując zgodnie z krokiem 2.
    2. Wyrównaj zarodki gospodarza w stadium 5 agametycznym na szkiełku do przeszczepu. Jednak tym razem zorientuj tylną stronę po prawej stronie (strona, która ma być manipulowana), a brzuszną do góry (Rysunek 5). Ustaw około 30 zarodków w dwóch rzędach w ciągu 20 minut.
    3. Podczas wyrównywania zarodków używaj nawilżacza przez 2-10 minut, jeśli wymaga tego wilgotność w pomieszczeniu (Tabela 1). Idealna wilgotność wynosi od 30% do 40%, ale może się ona różnić w zależności od warunków termicznych.
  2. Rozmrażanie i przesadzanie PGC w zarodkach gospodarza
    1. Aby szybko rozmrozić kriokonserwowane PGC, wsuń uchwyt zawierający igłę do temperatury pokojowej 1x roztwór EBR z igłą skierowaną w dół i trzymaj ją zanurzoną przez 10 sekund.
    2. Umieść szkiełko do przeszczepu na stoliku mikroskopu. Przymocuj rozmrożoną igłę do uchwytu kapilary i umieść pierwszy zarodek w lewym rzędzie i końcówkę igły w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
    3. Używając soczewki obiektywowej 20x, delikatnie przesuń końcówkę igły na powierzchnię tylnego końca zarodka.
    4. Delikatnie szturchaj zewnętrzną stronę każdego zarodka i upewnij się, że powoli wracają do swojego pierwotnego kształtu. Szturchanie potwierdzi, że ciśnienie wewnętrzne zarodka nie jest ani za wysokie, ani za niskie.
    5. Delikatnie przesuń igłę i wbij zarodek od tylnego bieguna.
    6. Delikatnie umieść około 10-20 PGC tuż wewnątrz tylnego bieguna, dokładnie między błoną witelinową a warstwą komórek somatycznych zarodka. Unikaj odkładania ich w warstwie komórek somatycznych. Jeśli płyn perivitelinowy wycieknie z zarodka, należy go zassać do igły i usunąć.
    7. Wycofać igłę z zarodka. Powtórzyć kroki 3.2.5 i 3.2.6 dla kolejnych zarodków.

4. Inkubacja zarodków i odtwarzanie szczepów dawców

  1. Usuń wszystkie zarodki, które nie otrzymały przeszczepionych PGC i inkubuj pozostałe zarodki w wilgotnej komorze (Rysunek 1G) w temperaturze 25 °C.
  2. Po upływie 24 godzin lub więcej od przeszczepienia i jak najszybciej po wykluciu należy użyć kleszczy do pobrania i przeniesienia wyklutych larw do standardowych fiolek z pokarmem Drosophila i inkubować w temperaturze 25 °C.
  3. Aby ożywić szczep, skrzyżuj nowo powstałe samice i samce (Ryc. 6).
    UWAGA: Gospodarze agametyczni umożliwiają odtworzenie całego genomu za jednym razem bez krzyżowania się ze szczepami chromosomów równoważących. Współistnienie agametycznych samców w fiolce nie będzie miało znaczenia, ponieważ samice, nawet jeśli są z nimi kojarzone, nie wykazują długotrwałych reakcji po kryciu, w tym zmniejszonej podatności na remating18,19.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność kriokonserwowanego przeszczepu PGC została opisana przez Asaoka et al.13 i jest podana w Tabeli 2 dla kriokonserwacji PGC przez 1 dzień lub dłużej w ciekłym azocie. Wskaźnik wylęgu wynosił 168/208 przeszczepionych zarodków (80,8%), a żywotność zarodka do dorosłego osobnika wyniosła 87/208 (41,8%). Częstość płodnych much wynosiła 28/87 (32,2%). Częstość ta nie różniła się między kriokonserwowanymi PGC przez 8 do 30 dni i kriokonserwowanymi przez 31-150 dni (20/57 vs. 8/30, G' = 0,63, p >0,1, d.f. = 1). Średnia liczba potomstwa na parę wynosiła 77,2 ± 7,1 (n = 18, 28-122), co wskazuje na zdolność kriokonserwowanych PGC do przekształcania się w komórki macierzyste linii rozrodczej. Z 26 igieł, 10 nie dało płodnego potomstwa, 7 igieł dało 1 płodne potomstwo, 7 igieł wydało 2 płodne potomstwo, a 2 igły dały 3 lub 4 płodne potomstwo. Średnia liczba płodnych much na igłę wynosiła 1,1 ± 0,2. Na podstawie tych danych, z 95% pewnością, 11 igieł wystarcza do wyprodukowania 6 lub więcej potomstwa, w którym prawdopodobnie znajduje się co najmniej jedna samica i jeden samiec.

W powyższych eksperymentach użyliśmy embrionów wyrażających mRNA >ovo-A w PGC (nanos>ovo-A, OvoA_OE zarodkach) jako gospodarza agametycznego. Spośród 669 samic F1 i 720 samców F1 wyprodukowanych z przeszczepionych par nanos>ovo-A, nie było uciekiniera, który pochodziłby od PGC gospodarza. Kilka mutantów oskar (osk) jest również wrażliwych na temperaturę agametic20,21. Ponieważ mutant osk o wysokiej homozygotycznej żywotności i fenotypie agametycznym nie jest już dostępny, odtworzyliśmy mutanta missense osk[8] klasy 20 poprzez edycję genomu wspomaganą CRISPR/Cas9. Muchy te były całkowicie agametyczne (0 uciekinierów z 230 samic i 192 samców) w temperaturze 25 °C, ale kilka uciekinierów pojawiło się w temperaturze 23 °C (1 z 248 samic i 1 z 290 samców). Nanos>ovo-A są zatem zalecane jako zarodki gospodarza agametycznego. Zarówno akcje UASp-ovo-A, jak i nanos-Gal413 będą wkrótce dostępne w Centrum Magazynowym KYOTO Drosophila.

figure-results-1
Rysunek 1: Wymagany sprzęt. (A) System mikromanipulacyjny do pobierania i przeszczepiania komórek. i) mikroskop odwrócony, ii) mikromanipulator mechaniczny, iii) strzykawka, iv) uchwyt kapilarny, v) kran trójdrożny, vi) nawilżacz i vii) mikroskop stereoskopowy. (B) Strzykawka. (C) Trójdrogowy kran i silikonowe rurki łączą strzykawkę i uchwyt kapilarny. (D) Igła i uchwyt kapilarny są przymocowane do mikromanipulatora. (E) Kubek do pobierania zarodków z płytką do pobierania zarodków (średnica 6 cm, wysokość 7,7 cm). (F) Sitko siatkowe ze stali nierdzewnej. (G) Pojemnik używany jako wilgotna komora ze szkiełkiem szkiełkowym. Aby utrzymać wilgotność, połóż mokry papier na dnie i zamknij pokrywę. (H) Uchwyt na igłę z igłą do krioprezerwacji. (I) Stojak do przechowywania kriokonserwacji i pudełko z igłami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Szkiełko podstawowe z kolekcji PGC i igła do kriokonserwacji. (A) Szkiełko podstawowe z komórek rozrodczych (PGC) pokryte klejem. Zarodki z odkorówką są ustawione w dwóch rzędach i zorientowane przodem do prawej strony (strona, która ma być manipulowana), a brzuszną stroną do góry. Zakłada się ramę puli zarodków, osadza się dwie krople roztworu środków krioprotekcyjnych (CPA), a basen napełnia się olejem silikonowym. (B) Igła powinna zawierać jak najmniejszą ilość żółtka i innych zanieczyszczeń. PGC są umieszczane między dwiema warstwami oleju silikonowego podczas kriokonserwacji w ciekłym azocie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Tworzenie igły. Trzyetapowa metoda polerowania końcówki w celu wykonania igły o odpowiednim rozmiarze otworu i ostrej końcówce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schemat pobierania zarodków. Po dwóch zbiórkach wstępnych zbieramy zwykle trzy lub cztery razy dziennie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wyrównanie zarodka gospodarza. Wyrównanie zarodków gospodarza na szkiełku podstawowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przegląd metody kriokonserwacji PGC. Przegląd wszystkich kroków wykonanych w celu przeprowadzenia kriokonserwacji pierwotnych komórek rozrodczych (PGC). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powietrza
Wilgotność w pomieszczeniu
< 30%~ 30%> 30%
Wyrównaj zarodki gospodarza
(~20 min)		Używaj nawilżacza przez 2 - 10 minutUżywaj nawilżacza z przerwami przez 1 minutęNie używaj nawilżacza
Odwilż dawcy PGCNie dotyczyNie dotyczyNie dotyczy
Suszenie na powietrzu PGCPomiń ten krokPomiń ten krokCzas trwania: 5 min
Zastosuj olej silikonowyNie dotyczyNie dotyczyNie dotyczy
Przeszczepy PGCNie dotyczyNie dotyczyNie dotyczy
Wszystkie te kroki powinny być zakończone w ciągu 50 minut.

Tabela 1: Suszenie zarodków podczas wyrównywania zarodków i rozmrażania PGC.

Rozdział
Szczep dawcyOkres kriokonserwacjiLiczba przeszczepionych zarodków (A)Liczba wyklutych larw (B)
(wylęgowość, B/A)		Liczba zamkniętych dorosłych (C)
(żywotność od jaja do dorosłego osobnika, C/A)		Liczba płodnych dorosłych (D)
(częstotliwość płodnych much, D/C)
Zobacz materiał M178 - 30 dni134108
(80,6 proc.)		57
(42,5 proc.)		20
(35,1 proc.)
Zobacz materiał M1731 - 150 dni74 Rozdział 7460
(81,1 proc.)		30
(40,5 proc.)		8
(26,7 proc.)
M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1]

Tabela 2: Skuteczność kriokonserwowanego przeszczepu PGC. Ta tabela została zmodyfikowana z13. Wszystkie dane pochodzą z hostów agametic.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym czynnikiem sukcesu w kriokonserwacji i reanimacji PGC jest wykorzystanie dobrych zarodków. Młode samice (np. w wieku od 3 do 5 dni) powinny być wykorzystywane do pobierania zarodków. Zarówno zarodki dawcy, jak i gospodarza są oceniane za pomocą badania mikroskopowego i wykorzystuje się tylko te w stadium blastodermy (stadium 5)12. W przypadku pobrania PGC zwykle wyrównujemy około 40 zarodków dawcy w ciągu 20 minut i pobieramy PGC z około 30 zarodków we wczesnym stadium 5; Nie wykorzystuje się zarodków starszych i wadliwych. Po kriokonserwacji i rozmrożeniu PGC powinny zachować swój kształt; PGC pękają w nieudanej konserwacji. Zarodki gospodarza powinny również znajdować się w stadium 5 i mieć umiarkowane ciśnienie wewnętrzne; Zarodki powinny powoli wracać do swojego pierwotnego kształtu po delikatnym szturchnięciu. Nadmiernie i niedostatecznie wysuszone zarodki nie będą się normalnie rozwijać po przeszczepie. Ponieważ heteroseksualne przeszczepienie PGC nie wytwarza gamet u Drosophila 5,10, przeszczepienie PGC z zarodków wielu dawców do zarodków gospodarza ma większe szanse na uzyskanie płodnych dorosłych. W tym celu zwykle pobieramy PGC z około 30 zarodków na igłę.

Jako krioprotektanty wypróbowaliśmy glikol etylenowy, dimetylosulfotlenek i glicerol wraz z sacharozą w różnych stężeniach. Ustaliliśmy, że EBR zawierający 20% glikolu etylenowego i 1 M sacharozy jest najlepszy13; jednak stosowanie różnych krioprotektantów może poprawić konserwację PGC22.

Ta metoda kriokonserwacji wymaga specjalistycznych umiejętności w zakresie obchodzenia się z PGC, a do wygodnego pobierania i przeszczepiania PGC potrzeba około 6 tygodni szkolenia. Aby ocenić i poprawić biegłość umiejętności, można to podzielić na sześć etapów treningowych: 1) wyrównywanie zarodków na szkiełku podstawowym, 2) sterowanie manipulatorem, 3) przeszczepianie PGC z zarodka do innego zarodka bez krioprezerwacji, 4) przesadzanie PGC z 10 lub więcej zarodków do 5 do 10 zarodków, 5) przesadzanie PGC po zastosowaniu CPA i 6) przesadzanie PGC po zamrożeniu i rozmrożeniu. Każdy krok może zająć 1 tydzień. Cele krótkoterminowe na etapie 3 to wskaźnik wylęgu na poziomie 40%, żywotność od zarodka do dorosłego osobnika na poziomie 10%-20% oraz częstotliwość płodnych much na poziomie 20%.

Kriokonserwacja PGC wymaga kosztownego oprzyrządowania i wysoko wykwalifikowanego personelu. Dlatego ta metoda może nie być stosowana przez wiele laboratoriów. Obecna metoda PGC ma jednak kilka ważnych aspektów. Po pierwsze, PGC są znacznie mniejsze niż zarodki i są bardzo przepuszczalne dla krioprotektantów. Natomiast przepuszczalność krioprotektantu jest poważnie ograniczona przez woskowate warstwy zarodków Drosophila, co stanowi najpoważniejszy problem w kriokonserwacji zarodków. Rzeczywiście, wcześniejsze badania dołożyły wszelkich starań, aby znaleźć okno czasowe, w którym zarodki mają wysoki wskaźnik przeżywalności i cieńszą warstwę woskowiny. Drugi dotyczy zmienności rozwojowej i morfologicznej między szczepami. PGC pobiera się z zarodków we wczesnym stadium 5 (2 h 30 min-3 h 20 min po złożeniu jaj), natomiast kriokonserwację zarodków przeprowadza się na zarodkach w stadium 16 (14-22 h po złożeniu jaj). Zarodki są zatem znacznie starsze i wykazują znacznie większą zmienność szczepu w optymalnym oknie czasowym dla kriokonserwacji w porównaniu z krioprezerwacją PGC. Rzeczywiście, częstotliwość wytwarzania przez gospodarzy potomstwa pochodzącego od dawcy nie różniła się między pięcioma szczepami badanymi przez Asaokę i wsp.13, chociaż gospodarze nie byli agametyczni. Co więcej, PGC mają potencjał do wykorzystania w zastosowaniach inżynierii genetycznej, takich jak edycja genomu 14,15,16.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Hodowli KYOTO Drosophila za szczepy much. Dziękujemy również Pani Wandzie Miyacie za angielskojęzyczną redakcję manuskryptu oraz dr Jeremy'emu Allenowi z Edanz (https://jp.edanz.com/ac) za redakcję szkicu tego rękopisu. Prace te były wspierane przez granty (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) dla T.T.-S.-K., granty (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) od AMED dla S.K., grant (JP20km0210172) od AMED dla T.T.-S.-K. oraz S.K., dotację na badania naukowe (C) (JP19K06780) od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) na rzecz T.T.-S.-K. oraz dotację na badania naukowe w obszarach innowacyjnych (JP18H05552) od JSPS na rzecz S.K.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation017-00256Do pobierania zarodków
Agar w proszkuFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-08725Do pobierania zarodków
Chlorek wapniaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985Do roztworu EBR
Kapilarnyinstrument SutterB100-75-10-PTSZKŁO BOROKRZEMIANOWE; OD: 1.0mm, ID: 0.75mm , długość: 10cm, 225szt
Uchwyt kapilarnyEppendorf5196 081.005Uchwyt kapilarny 4; do mikromanipulacji
Mieszanina kwasu chromowegoFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation037-05415Do mycia igieł
roztwór1x EBR zawierający 20% glikolu etylenowego i 1M sacharozy
Taśma dwustronna3MScotch w-12Do ekstrakcji kleju
Ephrussi– Beadle Ringer roztwór (EBR)130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 i 10 mM Hepes przy pH 6,9
Etanol (99,5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation057-00451Do pobierania zarodków
Glikol etylenowyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation054-00983Do roztworu CPA
Falcon 50 mm x 9 mm bakteriologiczna szalka PetriegoCorning Inc.351006Do pobierania zarodków
KleszczeVigorType5 TitanDo obsługi zarodków
Sok winogronowyAsahi Soft Drinks Co., LTD.Welch's Grape 100Do zbierania zarodków
agarowy z sokiem winogronowym50% sok winogronowy, 2% agar, 1% etanol, 1% kwas octowy
HeptanFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation084-08105Do ekstrakcji kleju
Nawilżaczpowietrza APIX INTERNATIONAL CO., LTD.FSWD2201-WHDo preparacji zarodków
Mikroskop odwróconyLeica Microsystems GmbHLeica  DM IL LEDDo mikromanipulacji
Szklana strzykawka Luer-lockTokyo Garasu Kikai Co., Ltd.0550 14 71 08Pokryj tłok olejem silikonowym (FL-100-450CS); do mikromanipulacji
Mikromanipulator mechanicznyLeica Microsystems GmbHDo mikromanipulacji
Szkło do mikroszkiełekMatsunami Glass Ind., Ltd.S-2441Do wyrównywania zarodków
MikromłynekNARISHIGE GroupNa zamówienieEG-401-S w połączeniu z EG-401 i MF2 (z soczewką okularową MF2-LE15 ); do przygotowania igły
Kamera mikroskopowaLeica Microsystems GmbHLeica MC170 HDDo mikromanipulacji
Uchwyt igłyMerck KGaAEppendorf TransferTip (ES)Do kriokonserwacji
Chlorek potasuNacalai Tesque, Inc.28514-75Do roztworu EBR
ŚciągaczNARISHIGE GroupPN-31Do przygotowania igły; poziom grzałki jest ustawiony na 85,0-98,4, główny poziom magnesu na 57,8, a poziom podrzędny magnesu na 45,0.
Taśma klejąca PVC do izolacji elektrycznejNitto Denko Corporation  J2515Do ramy puli zarodków
Olej silikonowyShin-Etsu Chemical, Co, Ltd.FL-100-450CSDo obsługi zarodków
Chlorek soduNacalai Tesque, Inc.31320-05Do roztworu EBR
Roztwór podchlorynu soduFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation197-02206Nierozcieńczony i świeżo przygotowany; do naruszania zarodków
SacharozaNacalai Tesque, Inc.30404-45Dla rozwiązania CPA
CPA Talerz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).">Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
  2. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).">Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
  3. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).">Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
  4. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412(2021).">Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412(2021).
  5. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).">Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
  6. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).">Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
  7. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).">Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
  8. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).">Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
  9. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).">Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
  10. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).">Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
  11. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).">Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
  12. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).">Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
  13. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159(2021).">Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159(2021).
  14. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).">Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  15. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).">Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
  16. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).">Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
  17. The Embryonic Development of Drosophila. , Second Edition, Springer, Berlin, Heidelberg. (1997).">Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , Second Edition, Springer, Berlin, Heidelberg. (1997).
  18. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).">Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
  19. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).">Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
  20. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).">Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
  21. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).">Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Genetics. 153 (2), 799-812 (1999).
  22. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).">Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primordial Germ CellsDrosophila CryopreservationPGC TransplantationGerm Cell RevivalAgametic Host EmbryosGenome EditingCryoprotective AgentsLiquid Nitrogen StorageMicromanipulator SystemXenotransplantation

Related Articles