Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.
Artykuł metodologiczny
Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technika rejestrowania lokalnych potencjałów pola (LFP) jest metodą elektrofizjologiczną używaną do pomiaru aktywności elektrycznej zlokalizowanych populacji neuronów. Służy jako kluczowe narzędzie w badaniach poznawczych, szczególnie w obszarach mózgu, takich jak hipokamp i kora przedczołowa. Podwójne nagrania LFP między tymi obszarami są szczególnie interesujące, ponieważ pozwalają na eksplorację międzyregionalnej komunikacji sygnałowej. Jednak metody wykonywania tych nagrań są rzadko opisywane, a większość komercyjnych urządzeń nagrywających jest albo droga, albo brakuje im możliwości dostosowania do konkretnych projektów eksperymentalnych. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół wykonywania dwuelektrodowych zapisów LFP w hipokampie myszy i korze przedczołowej w celu zbadania wpływu leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanału potasowego na właściwości LFP w tych obszarach. Technika ta umożliwia pomiar właściwości LFP, w tym widm mocy w każdym regionie mózgu i spójności między nimi. Dodatkowo, na potrzeby tych eksperymentów opracowano niedrogie, specjalnie zaprojektowane urządzenie rejestrujące. Podsumowując, protokół ten zapewnia środki do rejestrowania sygnałów o wysokim stosunku sygnału do szumu w różnych regionach mózgu, ułatwiając badanie międzyregionalnej komunikacji informacyjnej w mózgu.
Wprowadzenie
Lokalne potencjały pola (LFP) odnoszą się do aktywności elektrycznej rejestrowanej z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, odzwierciedlającej zbiorową aktywność zlokalizowanej grupy neuronów. Wykazują one zróżnicowany zakres częstotliwości, od wolnych fal o częstotliwości 1 Hz do szybkich oscylacji przy 100 Hz lub 200 Hz. Określone pasma częstotliwości zostały powiązane z funkcjami poznawczymi, takimi jak uczenie się, pamięć i podejmowanie decyzji1,2. Zmiany właściwości LFP zostały wykorzystane jako biomarkery różnych zaburzeń neurologicznych, w tym demencji i schizofrenii3,4. Analiza zapisów LFP może dostarczyć cennych informacji na temat podstawowych mechanizmów patologicznych związanych z tymi stanami i potencjalnych strategii terapeutycznych.
Podwójny zapis LFP to technika używana do pomiaru zlokalizowanej aktywności elektrycznej w obrębie i pomiędzy dwoma określonymi obszarami mózgu. Technika ta stanowi cenną okazję do zbadania skomplikowanej dynamiki neuronalnej i komunikacji sygnałów zachodzących w różnych obszarach mózgu i między nimi. Wcześniejsze badania wykazały, że wykrywanie zmian we właściwościach neuronalnych poszczególnych regionów mózgu może być złożone, ale można zaobserwować zmiany w międzyregionalnej komunikacji korowej5,6. Dlatego wykorzystanie podwójnego nagrywania LFP stanowi skuteczny sposób na rozwiązanie tego problemu.
Łączność hipokampowo-przedczołowa odgrywa kluczową rolę w modulowaniu funkcji poznawczych, a dysfunkcja została powiązana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi7,8. Zapisy tych obszarów z podwójnymi elektrodami mogą dostarczyć informacji o tych interakcjach. Niestety, dostępne są ograniczone informacje na temat metod wykonywania dwuelektrodowych nagrań LFP między tymi obszarami. Co więcej, dostępne na rynku urządzenia rejestrujące są na ogół drogie i nie można ich dostosować do konkretnych projektów eksperymentalnych. Konwencjonalna metoda rejestrowania LFP polega na użyciu ekranowanego do połączenia urządzenia rejestrującego z elektrodami wszczepionymi w mózg zwierzęcia. Takie podejście jest jednak podatne na artefakty ruchu i szumy otoczenia, co wpływa na jakość i niezawodność rejestrowanych sygnałów.
Ten protokół opisuje kompleksową procedurę wykonywania dwuelektrodowych nagrań LFP w hipokampie myszy i korze przedczołowej, przy użyciu taniego specjalnie zaprojektowanego stopnia głowy, który można umieścić na głowie zwierzęcia. Metody te umożliwiają naukowcom badanie specyficznych dla regionu wzorców oscylacyjnych w obrębie dwóch odrębnych regionów mózgowych oraz badanie międzyregionalnej wymiany informacji i połączeń między tymi obszarami.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Florey (Uniwersytet w Melbourne, nr 22-025UM) zgodnie z australijskim kodeksem opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL/6 (8 tygodni), uzyskane z Centrum Zasobów Zwierzęcych (Australia).
1. Projekt i wykonanie sceny głównej
UWAGA: Płytka PCB sceny głównej to kompaktowa, czterowarstwowa płytka o wymiarach 14 mm x 12 mm, przeznaczona do umieszczenia bezpośrednio na głowie zwierzęcia. Wykorzystuje komercyjny układ wzmacniacza (patrz tabela materiałów), a wszystkie pliki projektowe i Gerber są dostępne online (link do GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
- Podaj producentowi następujące specyfikacje: Grubość płyty: 0,6 mm; Minimalne śledzenie/odstępy: 4 mils; Minimalny rozmiar otworu: 0,2 mm.
- Podczas procesu montażu PCB postępuj zgodnie z następującą kolejnością:
- układ wzmacniacza do płytki za pomocą pistoletu na gorące powietrze ustawionego na 350 °C.
- elementy pasywne.
- złącze SPI i złącze elektrody (patrz tabela materiałów).
- Sprawdź pod mikroskopem w celu zapewnienia jakości. Zamocuj złącze SPI na miejscu za pomocą żywicy epoksydowej, aby zwiększyć stabilność.
- Do akwizycji sygnału należy używać oprogramowania do nagrywania innych firm i tablicy sterowniczej (patrz tabela materiałów). Zapoznaj się z instrukcją obsługi oprogramowania, aby uzyskać szczegółowe instrukcje.
- Zaprojektowana scena czołowa obsługuje 8 kanałów. W oprogramowaniu włącz kanały 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 i 23 do nagrywania.
2. Produkcja elektrod
- Przytnij druty wolframowe pokryte PFA (patrz tabela materiałów) na określone długości dla różnych typów elektrod: elektroda kory przedczołowej (12 mm), elektroda hipokampa (10 mm) i elektroda uziemiająca (6 mm).
- Pokrój mosiężną rurkę (patrz tabela materiałów) na segmenty 3 mm.
- Usuń 2 mm powłoki na końcu każdego drutu za pomocą zapalniczki, a następnie bezpiecznie drut elektrody do mosiężnej rurki. Rurka mosiężna ma średnicę wewnętrzną 0,45 mm i średnicę zewnętrzną 0,60 mm.
- W przypadku elektrody uziemiającej ze stali nierdzewnej M1.2 (patrz Tabela materiałów) do elektrody. Nałóż topnik na bazie kwasu fosforowego na, aby poprawić. Po przylutowaniu wyczyść za pomocą alkoholu.
UWAGA: Nosić rękawice dla ochrony podczas procesu.
3. Zabieg chirurgiczny
- Znieczulij mysz w komorze anestezjologicznej z 3% izofluranem i przepływem tlenu 1 l/min.
- Umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej i zabezpiecz ją w ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów).
- Dostosuj szybkość utrzymywania izofluranu do 2,5-3% i zmniejsz przepływ tlenu do 500 ml/min. Za pomocą uszczypnięcia palca u nogi sprawdź, czy zwierzę jest nadal pod głęboką narkozą.
- Podskórnie wstrzyknąć karprofen w dawce 0,5 mg/kg mc. i nałożyć maść do oczu w celu ochrony oczu.
- Ogol i wysterylizuj głowę myszy za pomocą jodu powidonu i 80% etanolu.
- Wykonaj nacięcie o średnicy 8 mm wzdłuż linii środkowej skóry głowy, usuwając tkankę łączną w obszarze nacięcia.
- Nałóż nadtlenek wodoru, aby oczyścić powierzchnię czaszki, uważając, aby nie dotknąć otaczającej skóry.
- Wyrównaj punkty orientacyjne bregma i lambda na tym samym poziomie, aby uzyskać dokładne umieszczenie elektrod (bregma i lambda to miejsca, w których szew strzałkowy przecina szwy koronalne i lambdoidalne).
- Wywierć otwory na elektrodę referencyjną/uziemiającą, kotwiące (zadzior wiertarski 0,9 mm) i elektrody aktywne (zadziory wiertarskie 0,3 mm) w określonych współrzędnych.
- Przymocuj specjalnie wykonaną elektrodę (krok 2) do ramienia ramy stereotaktycznej i upewnij się, że jest prostopadła do mózgu.
- Wszczepić elektrodę w obszar CA1 hipokampa (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm).
UWAGA: AP, przednio-tylny; ML, środkowo-boczny; DV, grzbietowo-brzuszny. - Powtórzyć wszczepienie elektrody w korze przedczołowej (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).
- Zabezpiecz elektrody dostępnym na rynku mocnym klejem i cementem dentystycznym (patrz Tabela materiałów).
- Wszczep dwie kotwiące 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm), aby zapobiec przesuwaniu się.
- Ustawić elektrodę referencyjną/masową w bezpośrednim kontakcie z oponą twardą, 2 mm z tyłu i 2 mm jednostronnie do punktu orientacyjnego lambda.
- Podłącz mosiężną rurkę po stronie elektrod do wielokanałowego złącza gniazda (patrz tabela materiałów) z elektrodą uziemiającą pośrodku.
- Użyj rurki termokurczliwej 0.8 mm na zewnątrz środkowego kołka do izolacji.
- Zabezpiecz elektrody, kotwiące i łącznik za pomocą kleju i cementu dentystycznego.
4. Opieka pooperacyjna
- Aby złagodzić ból pooperacyjny, należy wstrzykiwać karprofen w dawce 5-10 mg/kg podskórnie co 12-24 godziny na podstawie oceny bólu przez okres trzech dni.
- Należy zapewnić zwierzęciu tygodniowy okres rekonwalescencji przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur rejestracyjnych lub doświadczalnych.
5. Procedura nagrywania
- Ze zwierzęciem należy obchodzić się przez 15 minut, dwa razy dziennie, przez trzy kolejne dni.
- Podnieś myszy, delikatnie zaciskając wokół nich dłoń, nie wywierając nadmiernego nacisku.
- Umieść deskę do sceny, na głowie zwierzęcia na 30 minut raz dziennie przez trzy kolejne dni.
- W dniu nagrania należy zaaklimatyzować zwierzę w pomieszczeniu do nagrywania na 30 minut.
- Umieść zwierzę w małej komorze nagrywającej w klatce Faradaya, aby zmniejszyć zewnętrzne zakłócenia elektryczne. Dołącz niestandardową scenę główną do nagrywania.
- Otwórz oprogramowanie do nagrywania i wybierz częstotliwość próbkowania 2.00 kHz. Wyłącz wszystkie kanały z wyjątkiem 13 i 20, wybierając każdy kanał i naciskając spację.
- W oknie przepustowości sprzętowej ustaw dolną przepustowość na 2 Hz, a górną przepustowość na 100 Hz.
- W oknie filtrowania programowego ustaw filtr dolnoprzepustowy na 100 Hz, a filtr górnoprzepustowy na 2 Hz.
- Wybierz ścieżkę przechowywania, klikając Wybierz nazwę pliku, a następnie kliknij Nagraj.
- Rozpocznij każdą sesję nagraniową od 10-minutowego okresu przyzwyczajenia, po którym następuje 15-minutowy podstawowy zapis EEG.
- Po zapisie wyjściowym należy podać lek we wstrzyknięciu dootrzewnowym i kontynuować zapis przez dodatkowe 30 minut bez opóźnień.
UWAGA: Zapoznaj się z sekcją Wyniki, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stosowanych leków.
Wyniki
Przedstawione tutaj wyniki demonstrują wpływ kilku leków na właściwości lokalnych potencjałów polowych (LFPs) badanych w czterech kohortach samców myszy C57BL/6 (n = 8 dla każdej kohorty; wiek: 8 tygodni; masa ciała: 24,0 ± 0,42 g). Przebadane leki obejmowały lek przeciwpsychotyczny klozapinę, modulatory kanałów potasowych 4-aminopirydynę (4-AP) i retigabinę, a także sól fizjologiczną jako nośnik kontrolny.
Jak pokazano na Rysunku 1, mysz umieszczono w małej komorze rejestracyjnej, a potencjały polowe (LFP) zbierano z hipokampa (HIP) i kory przedczołowej (PFC) za pomocą specjalnie zaprojektowanej głowicy rejestrującej. Ponieważ badanie to koncentrowało się przede wszystkim na analizie pasm częstotliwości theta i gamma, zarejestrowany sygnał poddano najpierw wstępnemu filtrowaniu pasmowoprzepustowemu w zakresie częstotliwości 2-100 Hz, a następnie próbkowaniu z częstotliwością 2000 Hz. Sygnał podzielono następnie na kilka 2 s epok. Epoki wykazujące wyraźne artefakty ruchowe zostały zidentyfikowane i w konsekwencji wykluczone z dalszych procesów analizy. Widma mocy LFP zarówno w HIP, jak i PFC, a także koherencję HIP-PFC zmierzono przy użyciu metody analizy opartej na wielofunkcyjnym oknie (multi-taper)9. W analizie zastosowano pięć okien Slepiana, a iloczyn czasu i szerokości pasma ustawiono na trzy, aby uzyskać optymalną koncentrację widmową. Do wygenerowania spektrogramów czasowo-częstotliwościowych oraz przebiegu czasowego koherencji HIP-PFC zastosowano przesuwne okno o szerokości 1 s i kroku 100 ms.
Jak pokazano na Rysunku 2 i Rysunku 3, podanie soli fizjologicznej nie wywołało żadnych dostrzegalnych efektów w widmach mocy LFP w HIP i PFC ani w koherencji HIP-PFC. Zarówno retigabina, jak i klozapina spowodowały wyraźne zmniejszenie mocy w pasmie gamma (30-100 Hz) w HIP i PFC, a także zmniejszenie koherencji HIP-PFC w pasmie gamma. W przeciwieństwie do nich, 4-AP wywołało efekty przeciwstawne, charakteryzujące się zwiększoną mocą pasma gamma w HIP i PFC oraz zwiększoną koherencją w pasmie gamma pomiędzy HIP a PFC.
Rycina 1: Schemat układu eksperymentalnego. Elektrody zostały zaimplantowane w hipokampie (HIP) oraz korze przedczołowej (PFC) w celu rejestracji lokalnych potencjałów polowych. Zwierzę umieszczono w małej komorze rejestracyjnej, a do złącza elektrod przymocowano specjalnie zaprojektowany headstage. Każda sesja rejestracji rozpoczynała się od 10 min sesji bazowej, po której następowała 30 min sesja z podaniem leku. Przebadano działanie soli fizjologicznej, klozapiny, 4-AP oraz retygabiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2Wpływ leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanałów potasowych na aktualną aktywność elektrofizjologiczną w hipokampie (HIP) i korze przedczołowej (PFC). Znormalizowany spektrogram potencjałów polowych w HIP i PFC, wraz z koherencją HIP-PFC, wykazał efekty zależne od czasu dla wszystkich badanych leków. Leki podawano poprzez iniekcja doszpikowa w czasie t = 15 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wpływ leków przeciwpsychotycznych i modulatorów kanałów potasowych na gęstość widmową mocy w HIP i PFC. 4-AP znacząco zwiększył moc w paśmie gamma w obu obszarach mózgu, podczas gdy klozapina i retygabina stłumiły moc w paśmie gamma w obu obszarach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół przedstawia procedurę konstruowania niestandardowego stopnia czołowego zaprojektowanego specjalnie do jednoczesnego rejestrowania podwójnych potencjałów pola lokalnego (LFP) w hipokampie (HIP) i korze przedczołowej (PFC). Szczegółowe kroki przedstawione w tym protokole dostarczają wystarczających informacji dla badaczy, aby dokładnie zbadać komunikację sygnałową zarówno w każdym regionie, jak i między HIP i PFC.
Specjalnie zaprojektowana scena główna wykorzystuje komercyjny układ wzmacniacza. Podczas gdy obecna konfiguracja obsługuje nagrywanie 8 kanałów, stację czołową można łatwo dostosować do pełnej pojemności 32 kanałów, zapewniając w ten sposób potencjał do zwiększenia pojemności kanału odpowiedniego do nagrywania w układzie elektrod. Biorąc pod uwagę niski koszt sceny, jedną z opcji jest trwałe przymocowanie deski do głowy zwierzęcia. Takie podejście ma tę zaletę, że minimalizuje artefakty ruchu i zmniejsza ogólny poziom zakłóceń spowodowanych ruchem.
Wykonana na zamówienie elektroda wykazuje stabilny, długotrwały zapis LFP, utrzymując dobrą jakość sygnału przez okres 3-5 miesięcy. Innym realnym podejściem jest zastosowanie elastycznych płytek drukowanych na bazie poliimidu jako układów elektrod10,11. Te elastyczne płytki drukowane można zintegrować ze sceną czołową nagrywającą, aby umożliwić nagrywanie wielokanałowe. Zaletą tej metody jest uproszczenie przygotowania elektrod i zabiegów chirurgicznych. Waga implantu z głowicą i bez niej jest bardzo lekka, wynosi odpowiednio 0,198 g i 0,812 g, dzięki czemu jest odpowiedni dla bardzo młodych myszy.
Jednym z ograniczeń obecnej techniki nagrywania są potencjalne zakłócenia powodowane przez wiszący kabel, które mogą zakłócać naturalne zachowanie zwierzęcia podczas eksperymentów. Aby rozwiązać ten problem, można rozważyć alternatywne rozwiązania, takie jak wykorzystanie karty SD do przechowywania danych lub wdrożenie modułu nadajnika sygnału bezprzewodowego.
Istotnym i krytycznym etapem protokołu jest dokładne ustawienie elektrody. Kluczowe znaczenie ma zapewnienie precyzyjnego i spójnego rozmieszczenia elektrod, aby umożliwić porównywalność między eksperymentami. Aby zweryfikować położenie elektrody, należy przeprowadzić badanie histologiczne12. Przydatną techniką poprawiającą prawidłowe ustawienie elektrod w HPC jest nagrywanie, gdy elektroda jest włożona pionowo, ponieważ silne rytmy theta i odpalanie neuronów wskażą prawidłowe umieszczenie. Zaleca się wykorzystanie dorosłych myszy w wieku powyżej 8 tygodni, ponieważ jakość sygnału może z czasem ulec pogorszeniu lub spowodować nieprawidłowe umieszczenie wraz z wiekiem myszy. Uwzględnienie tych rozważań pomoże utrzymać wiarygodność i ważność wyników eksperymentalnych.
Podsumowując, protokół przedstawiony w tym artykule zapewnia ramy do badania komunikacji sygnałowej między różnymi obszarami mózgu. Umożliwia to naukowcom zbadanie dynamiki neuronalnej i interakcji w obrębie tych regionów i między nimi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rura mosiężna | Albion Alloys, USA | Średnica wewnętrzna 0,45 mm | |
| Carprofen | Rimadyl, Pfizer Zdrowie zwierząt | ||
| Komercyjny układ wzmacniacza | Intantech | RHD 2132 | |
| Tablica sterownicza | Intantech | RHD | |
| Cement dentystyczny | Paladur | ||
| Koszulki termokurczliwe | Panduit | M1,2 o średnicy | |
| Narzędzia do zegarków | Śruba | ||
| Złącze gniazda wielokanałowego | Harwin, | raster AU 1,27 mm, gniazdo | |
| przewody wolframowe powlekane PFA | A-M SYSTEMS, USA | Średnica wewnętrzna 150 &mikro; m | |
| Topnik na bazie kwasu fosforowego | Chip Quik | CQ4LF-0.5 | |
| Oprogramowanie do nagrywania | nagrywania | Intantech | |
| Rama stereotaktyczna | Świat Instrumenty precyzyjne | Mysz Instrument | |
| Super klej | UHU | Ultra szybki |
Bibliografia
- Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Witton, J., et al. Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia. J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).
- Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings. Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).
- Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. Functional network disruption in the degenerative dementias. Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).
- Sigurdsson, T., Duvarci, S. Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease. Front Syst Neurosci. 9, 190(2015).
- Sun, D., et al. Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex. Neuropharmacology. 191, 108572(2021).
- Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. Chronux: A platform for analyzing neural signals. J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).
- Bozkurt, A., Lal, A. Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system. Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).
- Du, P., et al. High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation. Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).
- JoVE Science Education Database. Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue. JoVE. , (2023).
Przedruki i uprawnienia
