Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66020

⸱

27 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Streszczenie

Ciągle rosnący siekacz myszy wyłania się jako wysoce elastyczny system modelowy do badania regulacji dorosłych nabłonkowych i mezenchymalnych komórek macierzystych oraz regeneracji zębów. Te populacje progenitorowe aktywnie dzielą się, przemieszczają i różnicują, aby utrzymać homeostazę tkanek i regenerować utracone komórki w sposób responsywny. Jednak tradycyjne analizy z wykorzystaniem nieruchomych skrawków tkanek nie były w stanie uchwycić dynamicznych procesów ruchów i interakcji komórkowych, co ograniczało naszą zdolność do badania ich regulacji. W artykule opisano protokół utrzymywania całych siekaczy myszy w systemie hodowli eksplantatów i śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów za pomocą wielofotonowej mikroskopii poklatkowej. Technika ta uzupełnia nasz istniejący zestaw narzędzi do badań stomatologicznych i pozwala badaczom na uzyskanie informacji czasoprzestrzennych na temat zachowań i organizacji komórek w żywej tkance. Przewidujemy, że ta metodologia pomoże naukowcom w dalszym badaniu mechanizmów kontrolujących dynamiczne procesy komórkowe zachodzące zarówno podczas odnawiania, jak i regeneracji zębów.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad siekacz myszy stał się nieocenioną platformą do badania zasad regulacji dorosłych komórek macierzystych i regeneracji zębów1,2. Siekacz myszy rośnie w sposób ciągły i odnawia się przez całe życie zwierzęcia. Jest to możliwe dzięki utrzymaniu zarówno nabłonkowych, jak i mezenchymalnych komórek macierzystych, które mogą samoodnawiać się i różnicować w różne typy komórek zęba1,2. Podczas gdy komórki macierzyste nabłonka zębów powodują powstawanie ameloblastów, które wydzielają macierz szkliwa, mezenchymalne komórki macierzyste zębów powodują powstawanie odontoblastów, cementoblastów i fibroblastów, które tworzą odpowiednio zębinę, cement i więzadło przyzębia3,4,5,6. Ten ciągły dopływ nowych komórek utrzymuje homeostazę tkanek i umożliwia wymianę starych komórek, które zostały utracone w wyniku zużycia lub urazów narządu żucia7,8. Wyjaśnienie mechanizmów komórkowych i molekularnych, które regulują utrzymanie i różnicowanie komórek macierzystych zęba, ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia regeneracji zębów, obszaru rosnącego zainteresowania.

Anatomicznie, duża część siekacza dorosłej myszy jest zamknięta w kości szczęki. Podczas gdy krawędź sieczna zęba jest odsłonięta, wierzchołkowy koniec siekacza mieści się w zębodole i jest mocno przymocowany do otaczającej kości poprzez więzadła przyzębia i tkanki łączne (Rysunek 1A,B). Wierzchołkowy koniec siekacza jest również obszarem wzrostu zęba i utrzymuje komórki pnia i progenitora zęba zarówno w warstwie nabłonkowej, jak i w miazdze mezenchymalnej9,10,11,12,13. W szczególności komórki macierzyste nabłonka zębów są utrzymywane na bulwiastym końcu nabłonka, znanym jako pączek wierzchołkowy, określany również jako wargowa pętla szyjna (Rysunek 1C). Podobnie jak w przypadku nabłonka jelitowego i naskórka, odnowa nabłonka w siekaczu jest przede wszystkim wspierana przez aktywnie cykliczne komórki macierzyste i ich wysoce proliferacyjne pośrednie potomstwo, zwane komórkami wzmacniającymi tranzyt14,15,16,17, oba znajdujące się w wewnętrznej części pętli szyjnej. Nie wiadomo jednak, czy nabłonek siekacza zawiera i wykorzystuje komórki macierzyste w stanie spoczynku podczas regeneracji. W przeciwieństwie do tego, zarówno aktywne, jak i spokojne mezenchymalne komórki macierzyste zębów zostały zidentyfikowane w miazdze wierzchołkowej, a spoczynkowe komórki macierzyste funkcjonują jako populacja rezerwowa, która aktywuje się podczas naprawy urazu13,18.

Wiele odkryć dotyczących biologii odnawiania i regeneracji siekaczy myszy wynikało z badań histologicznych, w których próbki są uzyskiwane w różnych punktach czasowych, ustalane, przetwarzane, a następnie dzielone na cienkie mikrony plastry wzdłuż określonej płaszczyzny. Dzięki szczegółowej analizie skrawków histologicznych z różnych modeli mysich, które umożliwiają śledzenie linii lub zaburzeń genetycznych, naukowcy zidentyfikowali linie komórkowe różnych populacji przodków, a także szlaki genetyczne i sygnałowe, które kontrolują homeostazę siekaczy i naprawę urazów19,20,21. Jednak statyczne dwuwymiarowe (2D) obrazy nieistotnych komórek w sekcjach nie mogą uchwycić pełnego spektrum zachowań komórkowych i organizacji przestrzennych w żywej tkance, takich jak zmiany kształtu komórki, ruchy i kinetyka komórkowa. Wykrywanie i mierzenie tych szybkich zmian komórkowych, które zachodzą w skali czasowej, która jest nierozwiązywalna przez sekcjonowanie tkanek, wymaga innej strategii. Co więcej, uzyskanie takich informacji ma również kluczowe znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób komórki zębowe oddziałują ze sobą, reagują na różne bodźce sygnałowe i samoorganizują się w celu utrzymania struktur i funkcji tkanek.

Pojawienie się czterowymiarowego (4D) głębokiego obrazowania tkanek za pomocą mikroskopii dwufotonowej 22, technologia integrująca trzy wymiary przestrzenne z rozdzielczością czasową, pokonuje nieodłączne ograniczenia analizy histologicznej, umożliwiając czasoprzestrzenne badanie hodowanych eksplantatów tkanek, organoidów, a nawet tkanek in situ23,24,25,26. Na przykład obrazowanie na żywo 4D rozwijającego się nabłonka zębów ujawniło czasoprzestrzenne wzorce podziałów i migracji komórek, które koordynują wzrost tkanek, tworzenie centrum sygnalizacyjnego i morfogenezę nabłonka zębów27,28,29,30,31,32. W siekaczu dorosłej myszy obrazowanie 4D zostało niedawno przystosowane do badania zachowań komórkowych podczas naprawy uszkodzeń nabłonka zębów. Obrazowanie na żywo ujawniło, że komórki warstwy międzyśrodkowej w warstwie nadpodstawnej mogą być bezpośrednio przekształcane w ameloblasty w warstwie podstawnej w celu regeneracji uszkodzonego nabłonka, kwestionując tradycyjny paradygmat naprawy uszkodzeń nabłonka15.

Tutaj opisujemy preparację, hodowlę i obrazowanie siekacza dorosłej myszy, skupiając się na komórkach nabłonka w wargowej pętli szyjki macicy (Rysunek 1). Technika ta zachowuje witalność komórek zęba przez ponad 12 godzin i umożliwia śledzenie na żywo komórek znakowanych fluorescencyjnie w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podejście to pozwala na badanie ruchu i migracji komórek, a także dynamicznych zmian w kształcie komórki i orientacji podziału w normalnych warunkach hodowli lub w odpowiedzi na zaburzenia genetyczne, fizyczne i chemiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były utrzymywane w obiektach wolnych od patogenów na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA) lub Uniwersytecie Hebrajskim w Jerozolimie (HUJI). Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z przepisami i protokołami zatwierdzonymi przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) lub (MD-23-17184-3; HUJI). Ogólny przebieg kroków eksperymentalnych jest pokazany w Rysunek 2A. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich instrumentów, odczynników i materiałów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów i żeli

  1. Pożywka preparacyjna: Przygotować świeży DMEM/F12 z 0,5% glukozy i utrzymywać w cieple w temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebna w kroku 2.4.
    UWAGA: Używamy DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia autofluorescencji podczas obrazowania na żywo.
  2. 1x Pożywka hodowlana: Przygotuj świeżą pożywkę, używając 50% DMEM/F12, 50% surowicy szczurzej, 1x substytut glutaminy, 1x aminokwasy endogenne MEM, 1% glukozy, 0,1 mg/ml kwasu L-askorbinowego i 0,5% penicyliny-streptomycyny. Utrzymuj go w cieple w temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebny w kroku 5.5. Pożywka ta służy do hodowli eksplantatów siekaczy podczas obrazowania na żywo.
    UWAGA: Surowica szczura powinna być wysokiej jakości i specjalnie przygotowana do hodowli całych tkanek przez badaczy lub ze źródła komercyjnego. W szczególności krew musi być odwirowana (przez 5 minut w temperaturze 1 200 × g w temperaturze pokojowej), zanim zacznie tworzyć się krzepnięcie. Po odwirowaniu powstały skrzep fibryny należy wycisnąć i wyrzucić33.
  3. Żel hodowlany: Żel ma na celu unieruchomienie próbek podczas obrazowania i jest przygotowywany na świeżo.
    1. Zrobić 2% żel w DMEM/F12, rozpuszczając 200 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 10 ml DMEM/F12 za pomocą kuchenki mikrofalowej. Przechowywać 2% żel w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj 2x pożywkę hodowlaną (bez DMEM/F12) mieszając 50% surowicy szczurzej, 1x substytut glutaminy, 1x aminokwasy endogenne MEM, 1% glukozy, 0,1 mg/ml kwasu L-askorbinowego i 0,5% penicyliny-streptomycyny. Podgrzać 2x pożywkę hodowlaną (bez DMEM/F12) do 37 °C.
    3. Przygotować 1% żel hodowlany, mieszając równe objętości 2% żelu i 2x pożywki hodowlanej (bez DMEM/F12). Przechowywać 1% żel hodowlany w temperaturze 37 °C do czasu, gdy będzie potrzebny w kroku 5.1.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie roztwory są ciepłe przed zmieszaniem, aby uniknąć żelowania. Stwierdziliśmy, że 1% żel nadaje się do hodowli siekaczy dorosłych myszy. Zawartość procentową żelu należy określić empirycznie, jeśli mają być hodowane inne tkanki.

2. Ekstrakcja żuchwy dorosłej myszy

  1. Eutanazja myszy w pożądanym wieku przy użyciu standardowych procedur zatwierdzonych przez IACUC.
    UWAGA: Tutaj używamy uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Przepisy dotyczące eutanazji zwierząt mogą się różnić w różnych regionach. Badacze powinni uzyskać niezbędne zgoda instytucjonalne przed przeprowadzeniem eksperymentów i zapewnić zgodność z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
  2. Zdezynfekuj mysz za pomocą 70% etanolu.
  3. Odetnij głowę myszy i wyciągnij lewą i prawą żuchwę.
    1. Połóż mysz na brzuchu, a następnie użyj przemysłowej żyletki #9 z pojedynczym ostrzem, aby przeciąć obszar szyi i oddzielić głowę myszy od reszty ciała.
      UWAGA: Jeśli mają zostać pobrane również tkanki z gardła lub szyi, nie należy wykonywać dekapitacji i można bezpośrednio przejść do kroku 2.3.2.
    2. Odwróć mysz tak, aby jej brzuszna strona była skierowana do góry, a żuchwy były łatwo dostępne.
    3. Zabezpiecz głowę zwierzęcia, trzymając ją delikatnie między kciukiem a palcem wskazującym.
    4. Użyj żyletki, aby wykonać nacięcie w połowie odległości strzałkowej, które przecina skórę dolnej szczęki od dolnej wargi w kierunku dekoltu.
      UWAGA: Ostrze chirurgiczne #15 może być również użyte do wykonania nacięcia i późniejszych rozwarstwień (kroki 2.3.6-2.3.9).
    5. Podczas wykonywania nacięcia rozłóż przeciętą skórę za pomocą kciuka i palca wskazującego, aby odsłonić mięśnie i kość szczęki pod spodem.
    6. Użyj żyletki, aby przeciąć mięśnie żwaczy po stronie policzkowej dolnej szczęki, tak aby zewnętrzna strona lewej i prawej półkrwi była teraz wolna od przyczepów mięśniowych.
    7. Przeciąć mięśnie błonowo-gnykowe wzdłuż wewnętrznej strony żuchwy, aby usunąć znajdujące się tam przyczepy mięśniowe.
    8. Wykonaj kolejne nacięcie w spojeniu żuchwy, które łączy dwie półkrwiożercze. Po przecięciu żuchwa zostanie podzielona na lewą i prawą połowę.
    9. Wciśnij żyletkę między kłykieć żuchwy a staw skroniowo-żuchwowy i ostrożnie odetnij półkość od reszty głowy.
      UWAGA: Stwierdziliśmy, że pomocne jest jednoczesne delikatne pociągnięcie siekacza podczas cięcia. Należy zachować ostrożność, aby nie złamać żuchwy i nie uszkodzić tkanek miękkich w jej wnętrzu.
  4. Natychmiast przenieś wypreparowane żuchwy na szalkę Petriego za pomocą podgrzanego podłoża preparacyjnego (krok 1.1) i usuń pozostałe tkanki mięśniowe za pomocą ostrza chirurgicznego #15.
    UWAGA: Przechowywanie próbek w zimnych pożywkach spowalnia aktywność komórek, co skutkuje opóźnionym lub nawet nieudanym przywróceniem niektórych czynności komórek, takich jak proliferacja lub ruch komórek, podczas obrazowania na żywo.

3. Izolacja całych siekaczy myszy

UWAGA: Dalsza izolacja siekacza odbywa się pod mikroskopem preparacyjnym w jasnym polu.

  1. Wizualnie zidentyfikuj owalny obszar żuchwy, który zakrywa panewkę siekacza i mieści wierzchołkową część siekacza.
  2. Ustaw żuchwę tak, aby wewnętrzna (językowa) powierzchnia była skierowana do góry.
  3. Trzymając żuchwę na miejscu za pomocą pary ząbkowanych kleszczy, wygeneruj okno w okolicy owalnej, goląc leżącą nad nią kość błony za pomocą ostrza chirurgicznego #15, w kierunku od kłykcia w kierunku zębów trzonowych. To odsłania tkankę miękką siekacza wierzchołkowego na wewnętrznej powierzchni.
  4. Odwróć żuchwę tak, aby zewnętrzna (policzkowa) powierzchnia była skierowana do góry.
  5. Wygeneruj okienko w owalnym obszarze zewnętrznej żuchwy, jak opisano w kroku 3.3 i użyj końcówki skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałe fragmenty kości na krawędzi. Upewnij się, że wierzchołkowy koniec zęba jest widoczny z obu stron.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego nacisku podczas golenia kości, aby zapobiec uszkodzeniu leżącej pod spodem tkanki miękkiej.
  6. Systematycznie odcinaj kości otaczające siekacz, aby odizolować cały ząb.
    1. Wykonaj czyste cięcie w płaszczyźnie, która bezpośrednio przylega do siekacza wierzchołkowego, aby najpierw usunąć wyrostek kłykciowy.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć siekacza.
    2. Wykonaj drugie cięcie tuż za 3. zębem trzonowym, ale grzbietowo do siekacza, nie uszkadzając zęba. Spowoduje to usunięcie kości, która obejmuje wyrostek dziobiasty.
    3. Seryjnie cięte od końca wyrostka kątowego w kierunku siekacza, aby stopniowo usuwać brzuszną żuchwę w sposób krokowy.
      UWAGA: Nabłonek zębów i związane z nim tkanki przyzębia są często przyklejone do kości i łatwo je oderwać, jeśli duża część kości brzusznej zostanie przecięta za jednym razem. Aby oddzielić kość od tkanki miękkiej siekacza, można włożyć skalpel (lub parę ostrych, nieząbkowanych kleszczy) między dwie tkanki na wierzchołkowym końcu siekacza i delikatnie przesunąć instrument do przodu.
    4. Odetnij kość wyrostka zębodołowego z zębami trzonowymi i wszelkie pozostałe kości, które są nadal przyczepione do siekacza.
    5. Cały siekacz jest teraz odizolowany. Przenieść całkowicie wypreparowany siekacz do naczynia z czystym, ciepłym podłożem preparacyjnym (krok 1.1).
  7. Powtórz kroki 3.2-3.6, aby w razie potrzeby odizolować dodatkowe siekacze.
    UWAGA: Siekacze szczękowe/górne myszy również utrzymują dorosłe komórki macierzyste i mogą być używane do badania regeneracji zębów34. Badacze dentystyczni zazwyczaj koncentrują się na dolnych siekaczach, ponieważ są one bardziej dostępne i można je łatwiej wypreparować niż górne siekacze. Różnice między komórkami progenitorowymi siekaczy żuchwy i szczęki pozostają do ustalenia.

4. Usunięcie tkanek przyzębia w celu odsłonięcia pętli nabłonkowej szyjki macicy

  1. Gdy cały siekacz leży na stronie językowej i przytrzymując ząb na miejscu za pomocą ząbkowanych kleszczy, użyj pary cienkich kleszczy #5, aby zacząć podwijać tkanki przyzębia pokrywające siekacz wierzchołkowy i obszar pętli szyjnej.
  2. Ostrożnie oderwij tkankę przyzębia od zawiązka wierzchołkowego, tak aby boczna strona pętli szyjnej (lub inne obszary zainteresowania) stała się widoczna pod lunetą.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić nabłonka zębowego lub nie oderwać go od mezenchymy. Jeśli siekacz ma sygnały fluorescencyjne w obszarze zainteresowania i dostępny jest fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, sygnały fluorescencyjne można wykorzystać do rozróżnienia typów tkanek i ułatwienia sekcji. Ważne jest, aby skutecznie przeprowadzić sekcje 2-4, aby próbki można było szybko przenieść do pożywki hodowlanej i odpowiednio konserwować poprzez hodowlę eksplantacyjną (patrz poniżej).

5. Osadzanie tkanek do hodowli eksplantatów

  1. Dodaj 500 μl ciepłego, niezestalonego żelu hodowlanego do studzienki na 24-dołkowej płytce i szybko przenieś wypreparowane całe siekacze do dołka. Zakręć płytką kilka razy, aby wypłukać siekacze.
  2. Dodać 400 μl ciepłego, niezestalonego żelu hodowlanego do szalki hodowlanej i przenieść wypłukane siekacze do naczynia.
    UWAGA: Używamy dostępnego na rynku naczynia hodowlanego, które jest kompatybilne z konfiguracją perfuzyjną. Zobacz krok 6.4, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami.
  3. Ustaw siekacz tak, aby umieścił obszar pętli szyjnej (lub inne obszary zainteresowania) na środku naczynia (Rysunek 2A,B) i dostosuj nachylenie siekacza wierzchołkowego do żądanej płaszczyzny obrazowania.
    UWAGA: Orientację tkanki należy wykonać szybko przed całkowitym żelowaniem.
  4. Po związaniu żelu użyj pary cienkich kleszczyków, aby usunąć żel z obszaru zainteresowania, aby nie był pokryty żelem.
  5. Dodać odpowiednią ilość ciepłej pożywki hodowlanej, powoli pipetując ją do krawędzi naczynia, aby po prostu przykryć próbkę (~150 μl).
  6. Przenieść hodowlę eksplantatów do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, aby umożliwić osiadanie tkanek i dostosowanie ich do warunków hodowli przez 1 godzinę.

6. Mikroskopia poklatkowa eksplantatów siekaczy

UWAGA: W tym eksperymencie użyliśmy pionowego mikroskopu wyposażonego w 25-krotny obiektyw zanurzający w wodzie, który ma aperturę numeryczną 1. Ogólnie rzecz biorąc, soczewka zanurzająca w wodzie z dużą aperturą numeryczną najlepiej nadaje się do obrazowania głębokich tkanek.

  1. Włącz mikroskop i laser dwufotonowy.
  2. Przymocuj naczynie hodowlane do stage adapter i zamontuj pierścień adaptera perfuzji na górze (Rysunek 2C).
  3. Podłącz stage adapter do regulatora temperatury ustawionego na utrzymanie kultury na poziomie 37 °C.
  4. Podłączyć wlot i wylot pierścienia adaptera do pompy mikroperfuzyjnej i rozpocząć perfuzję pożywki hodowlanej, z prędkością perfuzji ustawioną na 20 na pompie. Powoduje to powolny przepływ (~5 ml/h) pożywki hodowlanej nad górną powierzchnią próbek (Rysunek 2C).
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat systemu do utrzymywania tkanki w stabilnie kontrolowanym środowisku. Można również stosować inne systemy. Można również zastosować kombinację płyty grzewczej o temperaturze 37 °C i domowego naczynia do hodowli perfuzyjnej (rysunek uzupełniający S1) z wlotem i wylotem podłączonym do pomp strzykawkowych.
  5. Umieść pierścień bariery kontroli atmosfery (ACBR) na górze pierścienia adaptera i opuść obiektyw przez ACBR, aby po prostu zetknąć się z pożywką hodowlaną (Rysunek 2D).
  6. Dostosuj długość fali lasera do 920 nm, aby uwidocznić zarówno sygnały GFP, jak i czerwonej fluorescencji (np. tdTomato).
  7. Zlokalizuj próbki przez okulary, a następnie w oprogramowaniu mikroskopu.
  8. Skonfiguruj stosy Z, obrazowanie wielopozycyjne i interwały czasowe za pomocą oprogramowania. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć kroku Z o rozmiarze 4 μm i odstępu czasu 5 minut dla 14 h.
    UWAGA: Odkryliśmy, że interwał czasowy dłuższy niż 5 minut jest często niewystarczający do uchwycenia płynnych ruchów i podziałów komórek.
  9. Zainicjuj obrazowanie poklatkowe.
    UWAGA: Sample pozycja może ulec zmianie w ciągu pierwszej godziny i mogą być wymagane dalsze regulacje.
  10. Zapisywanie plików do dalszego przetwarzania i analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obszar apikalny siekacza dorosłej myszy znajduje się wewnątrz żuchwy (Rysunek 1), przez co nie jest bezpośrednio dostępny do wizualizacji i śledzenia na żywo komórek progenitorowych znajdujących się w strefie wzrostu. W związku z tym opracowaliśmy metodę wyodrębniania całego siekacza z kości żuchwy i utrzymywania go w systemie hodowli eksplantatów do dwufotonowej mikroskopii timelapse (Rysunek 2>). Poniżej opisujemy reprezentatywne wyniki obrazujące dynamiczny p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie żywych tkanek jest ważną techniką, która pozwala nam badać dynamiczne procesy i zachowania komórek, gdy są one utrzymywane w swoim niszowym środowisku41. W idealnej sytuacji obrazowanie na żywo jest wykonywane in vivo z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną. Jednak obrazowanie in vivo narządów ssaków może być trudne ze względu na niedostępność tkanek, nieprzezroczystość optyczną i trudności w unieruchomieniu zwierzęcia lub narządu przez dłuższy czas

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Laboratorium Zaawansowanej Mikroskopii Świetlnej/Spektroskopii UCLA oraz Centrum Doskonałości Leica Microsystems w Kalifornijskim Instytucie Nanosystemów (RRID:SCR_022789) za dostarczenie mikroskopii dwufotonowej. AS był wspierany przez ISF 604-21 z Izraelskiej Fundacji Naukowej. JH był wspierany przez R03DE030205 i R01DE030471 z NIH/NIDCR. AS i JH były również wspierane przez 2021007 grantowe z Amerykańsko-Izraelskiej Dwunarodowej Fundacji Naukowej (BSF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa, płaska płytka do hodowli tkankowejOlympus plastics25-107
25x HC IRAPO motCORR cel do zanurzania w wodzieLeica11507704
Kwas askorbinowy (Witamina C)Acros Organics352685000
D-(+)-Glukoza bioxtra System Sigma AldrichG7528
Delta T Bioptechs0420-4W tym kontrola temperatury, naczynia hodowlane i konfiguracja perfuzji
Mikroskop preparacyjny - LEICA S9ELeicaLED300 SLI
DMEM/F12Thermo Scientific11039047Podłoże podstawowe bez czerwieni fenolowej
Ostrze chirurgiczne z piór (#15)Pióro72044-15
Szczypce do drobnych końcówekFST11252-23
Glutamax Thermo Scientific35050-061Substytut glutaminy
Leica SP8-DIVE wyposażony w 25X HC IRAPO motCORR cel zanurzania w wodzie Leican/a niskotopliwa
agarozaNuSieve50080
aminokwasy endogenne (100x)Penicylina Thermo Scientific11140-050
– streptomycynaThermo Scientific 1514012210 000 U/ml 
Szalka PetriegoGen Clone32-107G90 mm 
Surowica szczurzaValley BiomedicalAS3061SCPrzetworzone do obrazowania na żywo
Żyletka #9VWR55411-050
Rękojeść skalpelaFST10003-12
NożyczkiFST37133
kleszcze ząbkowaneFST11000-13
nożyczki sprężynoweFST91500-09

Bibliografia

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494(2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378(2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918(2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818(2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336(2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405(2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685(2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969(2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51(2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816(2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403(2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie ex vivosiekacz myszyregulacja kom rek macierzystychhodowla eksplantat wmikroskopia wielofotonowaledzenie podzia w kom rkowychnab onkowe kom rki progenitoroweregeneracja z b wmikroskopia poklatkowa
Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.