Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przejściowe w transformacji planta to szybka i opłacalna alternatywa dla genetycznej transformacji roślin. Większość protokołów transformacji in planta opiera się na użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium. Jednak obecnie stosowane protokoły są ustandaryzowane dla małych zakładów ze względu na fizyczne i ekonomiczne ograniczenia związane z poddawaniem dużych zakładów obróbce próżniowej. W pracy tej przedstawiono skuteczny protokół miejscowej agroinfiltracji opartej na próżni, dostosowany do dużych roślin. Aby ocenić skuteczność proponowanej metody, przetestowaliśmy jej zastosowanie w roślinach kakaowca, tropikalnym gatunku rośliny opornym na transformacje genetyczne. Nasz protokół pozwolił na zastosowanie próżni do 0,07 MPa, z powtórzeniami, do zlokalizowanej nadziemnej części liści kakaowca, co umożliwiło wymuszenie infiltracji Agrobacterium do przestrzeni międzykomórkowych przyczepionych liści. W rezultacie, uzyskaliśmy transient za pośrednictwem Agrobacterium w transformacji planta przyczepionych liści kakaowca ulegających ekspresji dla systemu reporterowego RUBY. Jest to również pierwsza przejściowa przemiana kakao za pośrednictwem Agrobacterium. Protokół ten pozwoliłby na zastosowanie metody agroinfiltracji opartej na próżni do innych gatunków roślin o podobnych ograniczeniach wielkości i otworzyłby drzwi do charakterystyki genów in planta u opornych gatunków drzewiastych o dużych rozmiarach.
Wprowadzenie
Metody genetycznej transformacji roślin są niezbędne do testowania biologicznych funkcji genów i są szczególnie przydatne dzisiaj, biorąc pod uwagę dużą liczbę niescharakteryzowanych genów przewidywanych w erze postgenomicznej1. Metody te mogą być stosowane do uzyskiwania w pełni przekształconych linii lub do przejściowej ekspresji genów. Stabilna transformacja zachodzi, gdy obce DNA, które przejął gospodarz, zostaje w pełni i nieodwracalnie zintegrowane z genomem gospodarza, a modyfikacje genetyczne są przekazywane kolejnym pokoleniom. Przejściowa ekspresja, znana jako transformacja przejściowa, zachodzi z wielu kopii T-DNA przeniesionych przez Agrobacterium do komórki, które nie zostały zintegrowane z genomem gospodarza, i osiąga szczyt 2-4 dni po zakażeniu2.
Warto zauważyć, że testy ekspresji przejściowej są często wystarczające do funkcjonalnej charakterystyki genów i mogą oferować wiele zalet w porównaniu ze stabilną transformacją. Na przykład transformacja przejściowa nie wymaga procedur regeneracji opartych na kulturach tkankowych. Kolejną zaletą jest to, że jest kompatybilny z funkcjonalną analizą genów in planta, istniejącą kilkoma udanymi przykładami protokołów dobrze ustandaryzowanych dla modelowych gatunków roślin, takich jak Arabidopsis thaliana3 i Nicotiana benthamiana4, ale nadal ograniczony w gatunkach niemodelowych5.
Rozwój testów przejściowych opiera się na dostępności skutecznych metod transferu genów. W tym celu najpopularniejsze podejścia opierają się na infiltracji Agrobacterium, która wykorzystuje unikalną zdolność Agrobacterium do przenoszenia DNA do komórek roślinnych6. Innym przydatnym narzędziem do tych analiz jest wykorzystanie genów reporterowych, takich jak białka zielonej fluorescencji (GFP), β-glukuronidaza (GUS), lucyferazy lub RUBY, z których wszystkie są wykorzystywane do śledzenia zdarzeń transformacji. Spośród tych systemów reporterowych, RUBY jest obecnie najłatwiejszy do wizualizacji i opiera się na przemianie tyrozyny w betalainy w trzech etapowych reakcjach enzymatycznych. W przeciwieństwie do innych systemów reporterowych, powstałe betalainy można łatwo zaobserwować jako jaskrawo zabarwione pigmenty na przekształconej tkance roślinnej bez potrzeby stosowania zaawansowanego sprzętu lub dodatkowych reagentów7.
Podczas infiltracji zawiesiny Agrobacterium do przestrzeni międzykomórkowej mezofilu liści, najważniejszym krokiem dla udanej agroinfekcji jest pokonanie fizycznej bariery nałożonej przez naskórek liści8. Podczas gdy w przypadku niektórych roślin gradient ciśnienia utworzony za pomocą strzykawki bezigłowej (strzykawka Agroinfiltracja) jest wystarczający do skutecznej agroinfiltracji, jak ma to miejsce w przypadku Nicotiana benthamiana9, inne gatunki roślin mogą wymagać większego gradientu ciśnienia, takiego jak ten utworzony za pomocą pomp próżniowych10. W procesach wspomaganych próżnią agroinfiltracja przebiega w dwóch etapach. W pierwszym próżnia służy do poddania materiału roślinnego zmniejszonemu ciśnieniu, wymuszając uwalnianie gazów z przestrzeni powietrznych mezofilu przez aparaty szparkowe i rany. Następnie, podczas fazy represji, zawiesina Agrobacterium infiltruje przestrzenie międzykomórkowe przez aparaty szparkowe i rany11.
W porównaniu do infiltracji strzykawką, infiltracja próżniowa pozwala na większą częstotliwość użytkowania, powtarzalność oraz możliwość kontrolowania ciśnienia i czasu trwania na każdym etapie procesu infiltracji10. W liściach różnych gatunków roślin, takich jak szpinak (Spinacia oleracea)12, piwonia (roślina wieloletnia drzewiasta) (Paeonia ostii)13 i Cowpea (Vigna unguiculata)14, protokoły agroinfiltracji próżniowej osiągnęły głębszy wskaźnik infiltracji niż infiltracja strzykawkowa. Podobnie w przypadku pomidora (Lycopersicon esculentum)15 i gerbery (Gerbera hybrida)16, agroinfiltracja próżniowa powodowała silniejsze i bardziej równomierne wyciszanie genów niż infiltracja strzykawką. Dodatkową zaletą infiltracji próżniowej jest mniejsza zależność od genotypu, w porównaniu z infiltracją strzykawkową, którą zaobserwowano ostatnio w trzech odmianach cytrusów (Fortunella obovata, Citrus limon i C. grandis)17. Jednak przy próbie zastosowania agroinfiltracji próżniowej do roślin, które są zbyt duże, aby zmieścić się w eksykatorach, rozmiar komór próżniowych może być ograniczeniem, jak to zwykle ma miejsce w przypadku tropikalnych roślin drzewiastych.
Poniżej opisujemy protokół, który pokonuje ograniczenia przestrzenne komór próżniowych, testując jego użyteczność dla przejściowej transformacji liści kakaowca in planta. Przedstawiamy pierwszą miejscową metodę infiltracji próżniowej kakao, która nie wymaga dodatkowego wyposażenia, a nawet pozwala na użycie tych samych eksykatorów laboratoryjnych, które służą do infiltracji całej instalacji, ale z prostą adaptacją, która umożliwia dostęp części rośliny do wnętrza komory próżniowej, co pozwala na jej zastosowanie na różnych etapach rozwoju rośliny. Aby przetestować przydatność proponowanej metody miejscowej infiltracji próżniowej, wybraliśmy kakao jako wskaźnik zastępczy dla gatunku rośliny tropikalnej o dużych liściach, który jest trudny do przekształcenia. Korzystając z tej metody miejscowej infiltracji, niedawno opisaliśmy pierwszą przejściową ekspresję w awokado w awokado przez infiltrację próżniową za pośrednictwem Agrobacterium w warunkach wcześniej zoptymalizowanych dla oderwanych liści18, a tutaj zgłaszamy pierwszą przejściową ekspresję w roślinie w kakao.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Agrobacterium tumefaciens hodowla
- Odmrozić komórki elektrokompetentne szczepu Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Do probówki hodowlanej o wymiarach 17 mm x 100 mm dodać 1 mL bulionu Yeast Malt (YM; Tabela 1). Odstawić probówkę i przechowywać ją w temperaturze pokojowej (RT).
- Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mL dodać 30 µL rozmrożonych komórek Agrobacterium oraz 100-250 ng (do 5 µL) DNA zawierającego 35S:RUBY. Delikatnie wymieszać.
UWAGA: 35S:RUBY został otrzymany jako dar od Yunde Zhao. Aby uniknąć przeskoków iskry (arcingu) w próbce, należy maksymalnie ograniczyć obecność związków jonowych. Związki jonowe te mogą być resztkowymi solami z wytrącania DNA etanolem19. - W tym momencie umieścić kuwetę do elektroporacji o szerokości 1 mm na lodzie.
- Przenieść przygotowaną zawiesinę do schłodzonej kuwety do elektroporacji o szerokości 1 mm. Wszystko przechowywać na lodzie. Przetrzeć elektrody metalowe kuwety.
- Ustawić elektroporator na program Agr (2,2 kV, ~5 ms, 1 impuls). Umieścić kuwetę w komorze do elektroporacji.
- Nacisnąć przycisk Pulse . Zapisać parametry impulsu. Jeśli w próbce wystąpił przeskok iskry, proces elektroporacji zakończył się niepowodzeniem.
UWAGA: Kluczowe jest szybkie przeniesienie komórek do bulionu YM bezpośrednio po impulsie. Opóźnienie tego transferu może drastycznie obniżyć wydajność transformacji20. - Natychmiast, używając zarezerwowanego bulionu YM, przenieść komórki z kuwety do probówki 17 mm x 100 mm. Delikatnie resuspendować komórki.
- Inkubować transformowane komórki przez 3 h w temperaturze 28 °C przy 250 rpm w inkubatorze orbitalnym.
UWAGA: Kultura ta nie zawiera antybiotyków; należy ściśle przestrzegać warunków aseptycznych. - Wysiać kulturę metodą smugową na selektywne płytki z agarem YM21. W przypadku transformowanego szczepu LBA4404-RUBY upewnić się, że płytki zawierają ryfampicynę (25 µg/mL), spektynomycynę (50 µg/mL) i streptomycynę (50 µg/mL). Inkubować płytkę przez noc w inkubatorze stacjonarnym w temperaturze 28 °C.
UWAGA: W tym protokole użyto wektora 35S:RUBY, który nadaje bakteriom oporność na spektynomycynę (50 µg/mL) i pełni funkcję wizualnego reportera w infiltrowanej tkance roślinnej. - Zaszczepić kolonie z kultury nocnej w 12,5 mL mieszaniny bulionu YM i bulionu Luria Bertani (LB) (w proporcji odpowiednio 9:1), 10 mM MES, pH 5,722. Upewnić się, że to selektywne medium płynne zawiera te same antybiotyki, które zostały użyte w kroku 1.10. Składniki i stężenia dla tych mediów znajdują się w Tabeli 1.
- Podczas inkubacji Agrobacterium pozostawić wystarczającą przestrzeń napowietrzającą dla kultury, około 4 do 5 razy większą niż objętość cieczy. Dla szczepu Agrobacterium LBA4404 stosować bulion YM, aby uniknąć agregacji komórek23.
- Inkubować kulturę przez 16 h przy 250 rpm w inkubatorze orbitalnym w temperaturze 28 °C.
- Zwiększyć skalę kultury do 10-krotności objętości początkowej, stosując to samo medium, co w kroku 1.11.
- Inkubować kulturę przez 16 h przy 250 rpm w inkubatorze orbitalnym w temperaturze 28 °C.
- Dostosować gęstość optyczną (OD600) kultury nocnej do poziomu 0,4. Dodać 20 µM acetosyringonu (AS).
- Inkubować przy 250 rpm w inkubatorze orbitalnym w temperaturze 28 °C, aż OD600 osiągnie około 1,0.
- Wirować komórki z prędkością 4 500 x g przez 10 min w temperaturze 20 °C.
- Resuspendować osad w roztworze zawiesiny (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7), dostosowując OD600 do 0,6. Dodać 200 µM AS24.
UWAGA: Roztwór zawiesiny należy podgrzać wcześniej do 28 °C. Jeśli roztwór zawiesiny będzie zimny podczas dodawania, komórki ulegną wytrąceniu. - Pozostawić zawiesinę bakteryjną na 2-24 h w ciemności w temperaturze 25 °C. Mieszanie nie jest wymagane22.
2. Wybór roślin
- Wybierz roślinę z gałązką posiadającą liście w optymalnym stadium do agroinfiltracji.
UWAGA: Roślina może być w pełni wyrośnięta lub może to być dojrzałe drzewo. W przypadku kakaowca zalecane są młode liście w stadium C. Liście te mają kolor od brązowego do jasnozielonego; nie są one w pełni rozwinięte ani tak sztywne jak liście w stadium D25(Rycina 1).- W ramach kontroli przeprowadź jednocześnie agroinfiltrację u innych roślin (np. Nicotiana tabacum), dla których zgłoszono wysoką wydajność agroinfiltracji przy użyciu danego szczepu i wektora.
UWAGA: Jeśli w tej kontroli nie uzyskano pozytywnych wyników, możliwe jest, że wyniki negatywne wynikają ze zastosowanego szczepu lub wektora.
- W ramach kontroli przeprowadź jednocześnie agroinfiltrację u innych roślin (np. Nicotiana tabacum), dla których zgłoszono wysoką wydajność agroinfiltracji przy użyciu danego szczepu i wektora.
3. Konfiguracja komory próżniowej
- Jako komorę próżniową należy wykorzystać eksykator wyposażony w manometr do pomiaru ciśnienia próżni wewnątrz.
- Do zawiesiny Agrobacterium z kroku 1.19 dodać 250 µM kwasu jasmonowego (JA)18,26.
- Przenieść kulturę Agrobacterium do zlewki o szerokim wlewie, aby zanurzyć wybraną gałązkę i liście. Następnie umieścić zlewkę z kulturą Agrobacterium wewnątrz eksykatora.
- Umieścić gałązkę pomiędzy eksykatorem a jego pokrywą. Należy upewnić się, że wybrane liście są zanurzone w kulturze Agrobacterium. Następnie użyć pierścienia dystansowego (jump ring), który jest okrągłym pierścieniem z wycięciem umożliwiającym wprowadzenie gałązki rośliny do eksykatora. Pierścień ten pełni również funkcję dystansora pomiędzy dnem a górną częścią eksykatora.
- Należy upewnić się, że uszczelka jest na tyle stabilna konstrukcyjnie, aby nie została zmiażdżona przez pokrywę, wystarczająco elastyczna, aby dopasować się do obwodu eksykatora i nie jest wykonana z materiału porowatego.
UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano splot metalowego drutu składającego się z kilku mniejszych drutów skręconych razem, powleczonych nieporowatym materiałem plastikowym przypominającym uszczelkę (Rysunek 2). - Aby przymocować gałązkę do eksykatora, należy użyć silikonowego materiału do wycisków. Materiał ten musi być lepki, nieporowaty, chemicznie obojętny względem eksykatora i rośliny oraz łatwy w aplikacji, aby wypełnić małe szczeliny między gałązką, uszczelką a eksykatorem.
- Po spolimeryzowaniu silikonowego materiału do wycisków (trwa to około 1 min) i unieruchomieniu gałązki, należy zamknąć eksykator. Należy upewnić się, że nie pozostały żadne szczeliny.
- Podłączyć eksykator do pompy próżniowej (Rysunek 3).
4. Infiltracja próżniowa
- Uruchom pompę próżniową, aż ciśnienie spadnie do -0,07 MPa.
- Po osiągnięciu tego ciśnienia zamknij zawór ciśnieniowy i wyłącz pompę próżniową. Utrzymuj to ciśnienie przez 5 min.
- Otwórz zawór ciśnieniowy, aby przywrócić ciśnienie w komorze.
UWAGA: Jest to krytyczny krok. Przywracaj ciśnienie w komorze stopniowo i równomiernie. Pełne przywrócenie ciśnienia w eksykatorze może potrwać do 3 min. Przedłużony czas wyrównywania ciśnienia zwiększa liczbę bakterii, które przenikają do wnętrza tkanki10. - Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
- Wyjmij gałązkę z zawiesiny komórkowej oraz z eksykatora.
- Oczyść infiltrowane liście wodą destylowaną.
5. Inkubacja infiltrowanych liści
- Pozostaw zinfiltrowane liście w ciemności w temperaturze 25 °C przez 48 h.
- Następnie poddaj zainfiltrowaną tkankę fotoperiodowi 16/8 h światła/ciemności.
- Oceń przejściową transformację liści 3–7 dni po infekcji (DPI).
Rycina 1: Etapy rozwoju liści kakaowca. (A-E) Etapy rozwoju25. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Konfiguracja komory próżniowej i jej elementy. Komora próżniowa to eksykator podłączony do manometru próżniowego. Uszczelka/O-ring jest nacięta tak, aby posiadała otwór, w którym zostanie umieszczona gałązka. (A) Manometr próżniowy, (B) Pokrywa, (C) Uszczelka/O-ring, (D) Zawór ciśnieniowy, (E) Eksykator, (F) Wąż. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: System agroinfiltracji próżniowej in planta. Aby uniknąć strat próżni podczas procesu infiltracji, kluczowe jest zabezpieczenie gałęzi przytwierdzonej do deskykatora oraz uszczelki/oringu za pomocą silikonowego materiału do wycisków. (A) Roślina kakaowca, (B) Komora próżniowa, (C) Silikonowy materiał do wycisków, (D) Liście zanurzone w zawiesinie Agrobacterium, (E) Pompa próżniowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół przedstawia skuteczną metodę agroinfiltracji dla dużych roślin zdrewniałych. Dzięki temu protokołowi udało nam się osiągnąć ciśnienie próżniowe na poziomie -0,07 MPa, co doprowadziło do skutecznej, zlokalizowanej infiltracji liści kakaowca. Na Rysunku 4 przedstawiono proces przygotowania systemu infiltracyjnego, a na Rysunku 5 jego końcową konfigurację.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiliśmy skuteczny, tani protokół agroinfiltracji do przejściowej transformacji roślin drzewiastych in planta , na przykładzie roślin kakaowca. Biorąc pod uwagę dobrze znane ograniczenie, jakie stanowi naskórek liści dla transformacji tkanek roślinnych, skoncentrowaliśmy się na opracowaniu strategii ułatwiającej agroinfiltrację za pomocą próżni u roślin drzewiastych, które zwykle są oporne na tę procedurę.
Osiągnięte podciśnienie wewnątrz komory próżniowej by...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Lic. Jesús Fuentes González i Néstor Iván Robles Olivares za pomoc w nakręceniu materiału wideo. Dziękujemy za hojne dary od dr Antonii Gutierrez Mora z CIATEJ (Theobroma cacao plants). Dziękujemy również CIATEJ i Laboratorio Nacional PlanTECC, México, za wsparcie obiektu. H.E.H.D. (CVU: 1135375) prowadził studia magisterskie dzięki finansowaniu z Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. dziękuje za wsparcie ze strony Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) oraz Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY plazmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| Kuweta elektroporacyjna 1 mm | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Marka rybacka Kuwety do elektroporacji Plus |
| Eksykator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Liofilizator | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | Do podłoża YM dodaj 0,38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F Do | podłoża YM dodaj 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (Dla LB, YM i pożywki do ponownego spożycia) dodaj 1,95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Do podłoża do sporządzania zawiesiny dodaj 0,952 g/L (10 mM) |
| MgSO4· 7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | Do podłoża YM dodaj 0,204 g / L |
| Aparat do elektroporacji MicroPulser | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | Do podłoża LB dodać 5 g/L; Do podłoża YM dodać 0,1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silikon Materiał wyciskowy | COLTENE | 60019938 | |
| Ryfampicyna | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg / mL) |
| Silikonowy pistolet do materiałów wyciskowych | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycyna | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycyna | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Trawienie enzymatyczne tryptonu z kazeiny | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | Do podłoża LB dodaj 10 g/L |
| drożdży ekstrakt | MCD LAB | 9031 | Do podłoża LB dodać 5 g/L; Dla podłoża YM dodać 0,4 g/L |
Bibliografia
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- Wang, X., et al. Identification and functional analysis of in vivo phosphorylation sites of the Arabidopsis BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1 receptor kinase. Plant Cell. 17 (6), 1685-1703 (2005).
- Pan, Z., et al. In vivo assembly of the sorgoleone biosynthetic pathway and its impact on agroinfiltrated leaves of Nicotiana benthamiana. The New Phytologist. 230 (2), 683-697 (2021).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an agrobacterium-mediated method: Applications for gene expression and silencing studies. Nature Protocols. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N., Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances. 37 (1), 259-270 (2019).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152(2020).
- Zheng, L., et al. An improved and efficient method of Agrobacterium syringe infiltration for transient transformation and its application in the elucidation of gene function in poplar. BMC Plant Biology. 21 (1), 54(2021).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 77, 50521(2013).
- Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83(2021).
- Simmons, C. W., Vandergheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102 (3), 965-970 (2009).
- Cao, D. V., et al. Optimization of Agrobacterium -mediated transient expression of heterologous genes in spinach. Plant Biotechnology Reports. 11, 397-405 (2017).
- Xie, L., et al. Virus-induced gene silencing in the perennial woody Paeonia ostii. PeerJ. 7, ee7001(2019).
- Prasad Babu, K., Maligeppagol, M., Asokan, R., Krishna Reddy, M. Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method. Virusdisease. 30 (2), 269-278 (2019).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MARK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (6), 905-917 (2003).
- Deng, X., et al. Virus-induced gene silencing for Asteraceae-a reverse genetics approach for functional genomics in Gerbera hybrida. Plant Biotechnology Journal. 10 (8), 970-978 (2012).
- Wang, F., et al. Use of TRV-mediated VIGS for functional genomics research in citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 139 (3), 609-613 (2019).
- Salazar-González, J. A., et al. In-planta transient transformation of avocado (Persea americana) by vacuum agroinfiltration of aerial plant parts. Plant Cell Tissue Organ Cult. 152, 635-646 (2023).
- Bio-Rad. MicroPulserTM electroporation apparatus operating instructions and applications guide. The Bio-Rad Literature Library, Rev B Bulletin# M4006174 at. , www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf (2010).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- GoldBio. Electrotransformation of Agrobacterium tumefaciens Protocol. , https://goldbio.com/documents/3906/Electrotransformation%20of%20agrobacterium%20tumefaciens.pdf (2018).
- Lindbo, J. A. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiology. 145 (4), 1232-1240 (2007).
- Rajasekaran, K. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation of Cotton. Transgenic Crops of the World. Curtis, I. S. , Springer, Dordrecht. (2004).
- Llave, C., Kasschau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13401-13406 (2000).
- Fister, A. S., et al. Protocol: transient expression system for functional genomics in the tropical tree Theobroma cacao L. Plant Methods. 12, 19(2016).
- Jung, S. -K., et al. Agrobacterium tumefaciens mediated transient expression of plant cell wall-degrading enzymes in detached sunflower leaves. Biotechnology Progress. 30 (1), 905-915 (2014).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (2), 259-273 (2005).
- Keith, C. V., Ramos-Sobrinho, R., Marelli, J. -P., Brown, J. K. Construction of an infectious clone of the Badnavirus Cacao Swollen Shoot Ghana M Virus and infectivity by gene gun- and Agrobacterium-mediated inoculation. Frontiers in Agronomy. 3, 774863(2021).
- Fister, A. S., Landherr, L., Maximova, S. N., Guiltinan, M. J. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobroma cacao. Frontiers in Plant Science. 9, 268(2018).
- Grützner, R., et al. Engineering betalain biosynthesis in tomato for high level betanin production in fruits. Frontiers in Plant Science. 12, 682443(2021).
- Saifi, S. K., Passricha, N., Tuteja, R., Kharb, P., Tuteja, N. In planta transformation: A smart way of crop improvement. Advancement in Crop Improvement Techniques. 21, 351-362 (2020).
- Huda, K. M., et al. OsACA6, a P-type IIB Ca2+ ATPase promotes salinity and drought stress tolerance in tobacco by ROS scavenging and enhancing the expression of stress-responsive genes. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 76 (6), 997-1015 (2013).
- Micheli, F., et al. Functional Genomics of Cacao. Advances in Botanical Research. 55, 119-177 (2010).
- Bailey, B. A., et al. Fungal and plant gene expression during the colonization of cacao seedlings by endophytic isolates of four Trichoderma species. Planta. 224 (6), 1449-1464 (2006).
- Motamayor, J. C., et al. Geographic and genetic population differentiation of the Amazonian chocolate tree (Theobroma cacao L). PLoS ONE. 3 (10), e3311(2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
