Tutaj prezentujemy pierwszy protokół miejscowej infiltracji próżniowej do badań in vivo genetycznej transformacji dużych roślin. Korzystając z tej metodologii, po raz pierwszy uzyskaliśmy przejściową transformację kakao za pośrednictwem Agrobacterium.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Agroinfiltracja wymuszona próżnią w celu transformacji in planta roślin opornych: kakao jako studium przypadku
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przejściowe w transformacji planta to szybka i opłacalna alternatywa dla genetycznej transformacji roślin. Większość protokołów transformacji in planta opiera się na użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium. Jednak obecnie stosowane protokoły są ustandaryzowane dla małych zakładów ze względu na fizyczne i ekonomiczne ograniczenia związane z poddawaniem dużych zakładów obróbce próżniowej. W pracy tej przedstawiono skuteczny protokół miejscowej agroinfiltracji opartej na próżni, dostosowany do dużych roślin. Aby ocenić skuteczność proponowanej metody, przetestowaliśmy jej zastosowanie w roślinach kakaowca, tropikalnym gatunku rośliny opornym na transformacje genetyczne. Nasz protokół pozwolił na zastosowanie próżni do 0,07 MPa, z powtórzeniami, do zlokalizowanej nadziemnej części liści kakaowca, co umożliwiło wymuszenie infiltracji Agrobacterium do przestrzeni międzykomórkowych przyczepionych liści. W rezultacie, uzyskaliśmy transient za pośrednictwem Agrobacterium w transformacji planta przyczepionych liści kakaowca ulegających ekspresji dla systemu reporterowego RUBY. Jest to również pierwsza przejściowa przemiana kakao za pośrednictwem Agrobacterium. Protokół ten pozwoliłby na zastosowanie metody agroinfiltracji opartej na próżni do innych gatunków roślin o podobnych ograniczeniach wielkości i otworzyłby drzwi do charakterystyki genów in planta u opornych gatunków drzewiastych o dużych rozmiarach.
Wprowadzenie
Metody genetycznej transformacji roślin są niezbędne do testowania biologicznych funkcji genów i są szczególnie przydatne dzisiaj, biorąc pod uwagę dużą liczbę niescharakteryzowanych genów przewidywanych w erze postgenomicznej1. Metody te mogą być stosowane do uzyskiwania w pełni przekształconych linii lub do przejściowej ekspresji genów. Stabilna transformacja zachodzi, gdy obce DNA, które przejął gospodarz, zostaje w pełni i nieodwracalnie zintegrowane z genomem gospodarza, a modyfikacje genetyczne są przekazywane kolejnym pokoleniom. Przejściowa ekspresja, znana jako transformacja przejściowa, zachodzi z wielu kopii T-DNA przeniesionych prze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Agrobacterium tumefaciens hodowla
- Odmrozić komórki elektrokompetentne szczepu Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
- Do probówki hodowlanej o wymiarach 17 mm x 100 mm dodać 1 mL bulionu Yeast Malt (YM; Tabela 1). Odstawić probówkę i przechowywać ją w temperaturze pokojowej (RT).
- Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mL dodać 30 µL rozmrożonych komórek Agrobacterium oraz 100-250 ng (do 5 µL) DNA zawierającego 35S:RUBY. Delikatnie wymieszać.
UWAGA: 35S:RUBY został otrzymany jako dar od Yunde Zhao. Aby uniknąć przeskoków iskry (arcing....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół przedstawia skuteczną metodę agroinfiltracji dla dużych roślin zdrewniałych. Dzięki temu protokołowi udało nam się osiągnąć ciśnienie próżniowe na poziomie -0,07 MPa, co doprowadziło do skutecznej, zlokalizowanej infiltracji liści kakaowca. Na Rysunku 4 przedstawiono proces przygotowania systemu infiltracyjnego, a na Rysunku 5 jego końcową konfigurację.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiliśmy skuteczny, tani protokół agroinfiltracji do przejściowej transformacji roślin drzewiastych in planta , na przykładzie roślin kakaowca. Biorąc pod uwagę dobrze znane ograniczenie, jakie stanowi naskórek liści dla transformacji tkanek roślinnych, skoncentrowaliśmy się na opracowaniu strategii ułatwiającej agroinfiltrację za pomocą próżni u roślin drzewiastych, które zwykle są oporne na tę procedurę.
Osiągnięte podciśnienie wewnątrz komory próżniowej by.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Lic. Jesús Fuentes González i Néstor Iván Robles Olivares za pomoc w nakręceniu materiału wideo. Dziękujemy za hojne dary od dr Antonii Gutierrez Mora z CIATEJ (Theobroma cacao plants). Dziękujemy również CIATEJ i Laboratorio Nacional PlanTECC, México, za wsparcie obiektu. H.E.H.D. (CVU: 1135375) prowadził studia magisterskie dzięki finansowaniu z Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México (CONAHCYT). R.U.L. dziękuje za wsparcie ze strony Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) oraz Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, México (Grant 7270-2018).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY plazmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| Kuweta elektroporacyjna 1 mm | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Marka rybacka Kuwety do elektroporacji Plus |
| Eksykator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Liofilizator | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | Do podłoża YM dodaj 0,38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F Do | podłoża YM dodaj 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (Dla LB, YM i pożywki do ponownego spożycia) dodaj 1,95 g/L (10mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Do podłoża do sporządzania zawiesiny dodaj 0,952 g/L (10 mM) |
| MgSO4· 7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | Do podłoża YM dodaj 0,204 g / L |
| Aparat do elektroporacji MicroPulser | Biorad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | Do podłoża LB dodać 5 g/L; Do podłoża YM dodać 0,1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President Silikon Materiał wyciskowy | COLTENE | 60019938 | |
| Ryfampicyna | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg / mL) |
| Silikonowy pistolet do materiałów wyciskowych | Andent | TBT06 | |
| Spectinomycyna | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycyna | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Trawienie enzymatyczne tryptonu z kazeiny | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | Do podłoża LB dodaj 10 g/L |
| drożdży ekstrakt | MCD LAB | 9031 | Do podłoża LB dodać 5 g/L; Dla podłoża YM dodać 0,4 g/L |
Bibliografia
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
