Generowanie widoku regulacji transkrypcji cech transkryptomicznych na potrzeby zadania predykcyjnego i wykrywania ciemnych biomarkerów na małych zestawach danych

Summary

Tutaj wprowadzamy protokół do przekształcania danych transkryptomicznych w widok mqTrans, umożliwiając identyfikację ciemnych biomarkerów. Chociaż biomarkery te nie są wyrażane różnicowo w konwencjonalnych analizach transkryptomicznych, wykazują różnicową ekspresję w ujęciu mqTrans. Podejście to służy jako technika uzupełniająca tradycyjne metody, odsłaniając wcześniej pomijane biomarkery.

Abstract

Transkryptom reprezentuje poziomy ekspresji wielu genów w próbce i jest szeroko stosowany w badaniach biologicznych i praktyce klinicznej. Naukowcy zwykle koncentrowali się na biomarkerach transkryptomicznych z różnicowymi reprezentacjami między grupą fenotypową a grupą kontrolną próbek. W badaniu tym przedstawiono wielozadaniową strukturę uczenia się graf-uwaga (GAT) w celu poznania złożonych interakcji międzygenowych próbek referencyjnych. Na zdrowych próbkach wytrenowano wstępnie demonstracyjny model referencyjny (HealthModel), który można bezpośrednio wykorzystać do wygenerowania opartego na modelu ilościowego obrazu regulacji transkrypcji (mqTrans) niezależnych transkryptomów testowych. Wygenerowany widok transkryptomów mqTrans zademonstrowano za pomocą zadań predykcyjnych i wykrywania ciemnych biomarkerów. Ukuty termin "ciemny biomarker" wywodzi się z jego definicji, zgodnie z którą ciemny biomarker wykazywał różnicową reprezentację w widoku mqTrans, ale nie wykazywał zróżnicowanej ekspresji na pierwotnym poziomie ekspresji. Ciemny biomarker był zawsze pomijany w tradycyjnych badaniach wykrywania biomarkerów ze względu na brak ekspresji różnicowej. Kod źródłowy i instrukcję obsługi potoku HealthModelPipe można pobrać ze strony http://www.healthinformaticslab.org/supp/resources.php.

Introduction

Transkryptom składa się z ekspresji wszystkich genów w próbce i może być profilowany za pomocą technologii o wysokiej przepustowości, takich jak mikromacierz i sekwencja RNA¹. Poziomy ekspresji jednego genu w zbiorze danych nazywane są cechą transkryptomiczną, a różnicowa reprezentacja cechy transkryptomicznej między fenotypem a grupą kontrolną definiuje ten gen jako biomarker tego fenotypu^2,3. Biomarkery transkryptomiczne są szeroko wykorzystywane w badaniach nad diagnostyką chorób ⁴, biological mechanism⁵ i analizie przeżycia^6,7, itd.

Wzorce aktywności genów w zdrowych tkankach niosą ze sobą kluczowe informacje o życiu^8,9. Wzorce te dostarczają bezcennych spostrzeżeń i stanowią idealne punkty odniesienia do zrozumienia złożonych trajektorii rozwojowych łagodnych zaburzeń^10,11 i chorób śmiertelnych¹². Geny oddziałują ze sobą, a transkryptomy reprezentują końcowe poziomy ekspresji po ich skomplikowanych interakcjach. Takie wzorce są formułowane jako sieć regulacji transkrypcji¹³ i sieć metabolizmu¹⁴, itd. Ekspresja informacyjnych RNA (mRNA) może być regulowana transkrypcyjnie przez czynniki transkrypcyjne (TF) i długie międzygenowe niekodujące RNA (lincRNA)^15,16,17. Konwencjonalna analiza ekspresji różnicowej ignorowała takie złożone interakcje genów przy założeniu niezależności między cechami^18,19.

Ostatnie osiągnięcia w grafowych sieciach neuronowych (GNN) wykazują niezwykły potencjał w wydobywaniu ważnych informacji z danych opartych na OMIC do badań nad rakiem²⁰, np. identyfikowanie modułów współekspresji²¹. Wrodzona zdolność GNN-ów sprawia, że idealnie nadają się do modelowania skomplikowanych relacji i zależności między genami^22,23.

Badania biomedyczne często koncentrują się na dokładnym przewidywaniu fenotypu w porównaniu z grupą kontrolną. Takie zadania są często formułowane jako klasyfikacje binarne^24,25,26. W tym przypadku dwie etykiety klas są zwykle kodowane jako 1 i 0, prawda i fałsz, a nawet pozytywna i ujemna²⁷.

To badanie miało na celu dostarczenie łatwego w użyciu protokołu do generowania widoku regulacji transkrypcji (mqTrans) dla zestawu danych transkryptomu w oparciu o wstępnie wytrenowany model referencyjny sieci grafowo-ukierunkowanej (GAT). Wielozadaniowy framework GAT z wcześniej opublikowanego work²⁶ został użyty do przekształcenia cech transkryptomicznych w funkcje mqTrans. Duży zestaw danych zdrowych transkryptomów z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC) Xena platform²⁸ został wykorzystany do wstępnego wytrenowania modelu referencyjnego (HealthModel), który ilościowo zmierzył regulacje transkrypcji od czynników regulacyjnych (TF i lincRNA) do docelowych mRNA. Wygenerowany widok mqTrans może zostać wykorzystany do budowy modeli predykcyjnych i wykrywania ciemnych biomarkerów. Protokół ten wykorzystuje zestaw danych pacjentów z gruczolakorakiem jelita grubego (COAD) z bazy danych The Cancer Genome Atlas (TCGA) ²⁹ jako przykład ilustracyjny. W tym kontekście pacjenci w stadium I lub II są klasyfikowani jako próbki ujemne, podczas gdy ci w stadium III lub IV są uważani za próbki dodatnie. Porównano również rozkład ciemnych i tradycyjnych biomarkerów w 26 typach raka TCGA.

Opis potoku HealthModel
Metodologia zastosowana w tym protokole opiera się na wcześniej opublikowanym frameworku²⁶, jak opisano w Rysunek 1. Aby rozpocząć, użytkownicy muszą przygotować wejściowy zestaw danych, wprowadzić go do proponowanego potoku HealthModel i uzyskać funkcje mqTrans. Szczegółowa instrukcja przygotowania danych znajduje się w sekcji 2 sekcji protokołu. Następnie użytkownicy mają możliwość połączenia funkcji mqTrans z oryginalnymi cechami transkryptomicznymi lub kontynuowania tylko wygenerowanych funkcji mqTrans. Utworzony zestaw danych jest następnie poddawany procesowi wyboru funkcji, przy czym użytkownicy mają możliwość wyboru preferowanej wartości k w k-krotnej walidacji krzyżowej na potrzeby klasyfikacji. Podstawową metryką oceny wykorzystywaną w tym protokole jest dokładność.

HealthModel²⁶ kategoryzuje cechy transkryptomiczne na trzy odrębne grupy: TF (czynnik transkrypcyjny), lincRNA (długie międzygenowe niekodujące RNA) i mRNA (informacyjne RNA). Cechy TF są definiowane na podstawie adnotacji dostępnych w atlasie białek ludzkich ^30,31. W tej pracy wykorzystano adnotacje lincRNA ze zbioru danych GTEx³². Geny należące do szlaków trzeciego poziomu w bazie danych KEGG³³ są uważane za cechy mRNA. Warto zauważyć, że jeśli cecha mRNA wykazuje role regulacyjne dla genu docelowego, zgodnie z dokumentacją w bazie danych TRRUST³⁴, jest ona ponownie klasyfikowana do klasy TF.

Ten protokół również ręcznie generuje dwa przykładowe pliki dla identyfikatorów genów czynników regulatorowych (regulatory_geneIDs.csv) i docelowego mRNA (target_geneIDs.csv). Macierz odległości parami między cechami regulatorowymi (TF i lincRNA) jest obliczana za pomocą współczynników korelacji Pearsona i grupowana za pomocą popularnej analizy sieci koekspresji genów ważonej narzędziem (WGCNA)³⁶ (adjacent_matrix.csv). Użytkownicy mogą bezpośrednio korzystać z potoku HealthModel wraz z tymi przykładowymi plikami konfiguracyjnymi w celu wygenerowania widoku mqTrans zestawu danych transkryptomicznych.

Szczegóły techniczne HealthModel
HealthModel przedstawia skomplikowane relacje między TF i lincRNA w postaci grafu, przy czym cechy wejściowe służą jako wierzchołki oznaczone przez V i macierz krawędzi między wierzchołkami oznaczona jako E. Każda próbka charakteryzuje się cechami regulacyjnymi K, symbolizowanymi jako V^K×1. W szczególności zestaw danych obejmował 425 TF i 375 lincRNA, co dało wymiarowość próbki K = 425 + 375 = 800. Aby ustalić macierz krawędzi E, w tej pracy wykorzystano popularne narzędzie WGCNA³⁵. Waga parami łącząca dwa wierzchołki reprezentowana jako i , jest określana przez współczynnik korelacji Pearsona. Sieć regulacji genów wykazuje topologię bezskalową³⁶, charakteryzującą się obecnością genów piasty o kluczowych rolach funkcjonalnych. Obliczamy korelację między dwoma obiektami lub wierzchołkami, i , używając miary nakładania się topologii (TOM) w następujący sposób:

(1)

(2)

Miękki próg β jest obliczany za pomocą funkcji 'pickSoft Threshold' z pakietu WGCNA. Stosowana jest funkcja wykładnicza potęgi_{a ij}, gdzie reprezentuje gen z wyłączeniem i i j, a reprezentuje łączność wierzchołków. WGCNA grupuje profile ekspresji cech transkryptomicznych w wiele modułów przy użyciu powszechnie stosowanej miary odmienności (³⁷.

Struktura HealthModel została pierwotnie zaprojektowana jako wielozadaniowa architektura uczenia się²⁶. Protokół ten wykorzystuje tylko zadanie wstępnego trenowania modelu do budowy transkryptomicznego widoku mqTrans. Użytkownik może zdecydować się na dalsze udoskonalenie wstępnie wytrenowanego HealthModel w ramach wielozadaniowej sieci uwagi grafu o dodatkowe próbki transkryptomiczne specyficzne dla danego zadania.

Szczegóły techniczne wyboru i klasyfikacji funkcji
Pula wyboru funkcji implementuje jedenaście algorytmów wyboru funkcji (FS). Wśród nich trzy to algorytmy FS oparte na filtrach: wybór K najlepszych cech przy użyciu maksymalnego współczynnika informacyjnego (SK_mic), wybór K cech na podstawie FPR MIC (SK_fpr) oraz wybór K cech o najwyższym współczynniku fałszywych wykryć MIC (SK_fdr). Ponadto trzy algorytmy FS oparte na drzewie oceniają poszczególne cechy za pomocą drzewa decyzyjnego z indeksem Giniego (DT_gini), adaptacyjnymi wzmocnionymi drzewami decyzyjnymi (AdaBoost) i lasem losowym (RF_fs). Pula obejmuje również dwie metody wrappera: rekurencyjną eliminację cech za pomocą liniowego klasyfikatora wektorów nośnych (RFE_SVC) i rekurencyjną eliminację cech za pomocą klasyfikatora regresji logistycznej (RFE_LR). Wreszcie, uwzględniono dwa algorytmy osadzania: liniowy klasyfikator SVC z najwyżej sklasyfikowanymi wartościami ważności cech L1 (lSVC_L1) i klasyfikator regresji logistycznej z najwyżej sklasyfikowanymi wartościami ważności cech L1 (LR_L1).

Pula klasyfikatorów wykorzystuje siedem różnych klasyfikatorów do budowania modeli klasyfikacji. Klasyfikatory te obejmują liniową maszynę wektorów nośnych (SVC), naiwny algorytm Bayesa Gaussa (GNB), klasyfikator regresji logistycznej (LR), k-najbliższego sąsiada, z domyślnie ustawionym k na 5 (KNN), XGBoost, las losowy (RF) i drzewo decyzyjne (DT).

Losowy podział zbioru danych na pociąg: podzbiory testowe można ustawić w wierszu poleceń. W zademonstrowanym przykładzie użyto stosunku pociągu: test = 8: 2.

Protocol

UWAGA: Poniższy protokół opisuje szczegóły procedury analitycznej informatyki i poleceń Pythona głównych modułów. Rysunek 2 ilustruje trzy główne kroki za pomocą przykładowych poleceń używanych w tym protokole i odsyła do wcześniej opublikowanych prac^26,38 po więcej szczegółów technicznych. Wykonaj następujące czynności przy użyciu normalnego konta użytkownika w systemie komputerowym i unikaj korzystania z konta administratora lub konta root. Jest to protokół obliczeniowy i nie zawiera żadnych biomedycznych czynników niebezpiecznych.

1. Przygotowanie środowiska Pythona

1. Utwórz środowisko wirtualne.
   1. W badaniu wykorzystano język programowania Python i środowisko wirtualne Python (VE) z Pythonem 3.7. Wykonaj następujące kroki (Rysunek 3A):
      conda create -n healthmodel python=3.7
      conda create to polecenie służące do tworzenia nowego VE. Parametr -n określa nazwę nowego środowiska, w tym przypadku healthmodel. A python=3.7 określa wersję Pythona do zainstalowania. Wybierz dowolną preferowaną nazwę i wersję języka Python obsługującą powyższe polecenie.
   2. Po uruchomieniu polecenia dane wyjściowe są podobne do Rysunek 3B. Wpisz y i poczekaj na zakończenie procesu.
2. Aktywowanie środowiska wirtualnego
   1. W większości przypadków aktywuj utworzony VE za pomocą następującego polecenia (Rysunek 3C):
      Conda Aktywuj HealthModel
   2. Postępuj zgodnie z instrukcjami specyficznymi dla platformy dla aktywacji VE, jeśli niektóre platformy wymagają od użytkownika przesłania plików konfiguracyjnych specyficznych dla platformy w celu aktywacji.
3. Instalowanie platformy PyTorch 1.13.1
   1. PyTorch to popularny pakiet języka Python dla algorytmów sztucznej inteligencji (AI). Jako przykład użyj platformy PyTorch 1.13.1 opartej na platformie programowania procesora GPU CUDA 11.7. Znajdź inne wersje na https://pytorch.org/get-started/previous-versions/. Użyj następującego polecenia (Rysunek 3D):
      pip3 Zainstaluj latarkę TorchvisionAudio
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się korzystanie z platformy PyTorch w wersji 1.12 lub nowszej. W przeciwnym razie zainstalowanie wymaganego pakietu torch_geometric może być trudne, jak zaznaczono na oficjalnej stronie torch_geometric: https://pytorch-geometric.readthedocs.io/en/latest/install/installation.html.
4. Zainstaluj dodatkowe pakiety dla torch-geometric
   1. Postępując zgodnie ze wskazówkami na https://pytorch-geometric.readthedocs.io/en/latest/install/installation.html, zainstaluj następujące pakiety: torch_scatter, torch_sparse, torch_cluster i torch_spline_conv za pomocą polecenia (Rysunek 3E):
      install pyg_lib torch_scatter torch_sparse torch_cluster torch_spline_conv -f https://data.pyg.org/whl/torch-1.13.0+cu117.html
5. Zainstaluj pakiet torch-geometric.
   1. To badanie wymaga specyficznej wersji, 2.2.0, pakietu torch-geometric. Uruchom polecenie (Rysunek 3F):
      install torch_geometric==2.2.0
6. Zainstaluj inne pakiety.
   1. Pakiety takie jak pandas są zwykle dostępne domyślnie. Jeśli nie, zainstaluj je za pomocą polecenia. Na przykład, aby zainstalować pandas i xgboost, uruchom:
      install pandas
      install xgboost (w języku angielskim
   )

2. Korzystanie z wstępnie wytrenowanego HealthModel do generowania funkcji mqTrans

1. Pobierz kod i wstępnie wytrenowany model.
   1. Pobierz kod i wstępnie wytrenowany model HealthModel ze strony internetowej: http://www.healthinformaticslab.org/supp/resources.php, który nosi nazwę HealthModel-mqTrans-v1-00.tar.gz (Rysunek 4A). Pobrany plik można zdekompresować do ścieżki określonej przez użytkownika. Szczegółową formułę i dane pomocnicze wdrożonego protokołu można znaleźć w²⁶.
2. Wprowadź parametry, aby uruchomić HealthModel.
   1. Najpierw zmień katalog roboczy na folder HealthModel-mqTrans w wierszu poleceń. Użyj następującej składni do uruchamiania kodu:
      python main.py
      Szczegóły dotyczące każdego parametru oraz folderów danych, modelu i danych wyjściowych są następujące:
      Folder danych: Jest to folder danych źródłowych, a każdy plik danych jest w formacie csv. Ten folder danych zawiera dwa pliki (patrz szczegółowe opisy w krokach 2.3 i 2.4). Pliki te należy zastąpić danymi osobowymi.
      data.csv: Plik macierzy transkryptomicznej. Pierwszy wiersz zawiera listę identyfikatorów cech (lub genów), a pierwsza kolumna zawiera identyfikatory próbek. Lista genów obejmuje czynniki regulatorowe (TF i lincRNA) oraz regulowane geny mRNA.
      label.csv: Przykładowy plik etykiety. Pierwsza kolumna zawiera listę identyfikatorów próbek, a kolumna o nazwie "label" zawiera przykładową etykietę.
      folder modelu: Folder do zapisywania informacji o modelu:
      HealthModel.pth: wstępnie wytrenowany HealthModel.
      regulatory_geneIDs.csv: Identyfikatory genów regulatorowych użyte w tym badaniu.
      target_geneIDs.csv: Geny docelowe wykorzystane w tym badaniu.
      adjacent_matrix.csv: Sąsiednia matryca genów regulatorowych.
      folder wyjściowy: Pliki wyjściowe są zapisywane w tym folderze, utworzonym przez code.
      test_target.csv: Wartość ekspresji genów docelowych po normalizacji i imputacji Z.
      pred_target.csv: Przewidywana wartość ekspresji genów docelowych.
      mq_target.csv: Przewidywana wartość ekspresji genów docelowych.
3. Przygotuj plik z macierzą transkryptomiczną w formacie csv.
   1. Każdy wiersz reprezentuje próbkę, a każda kolumna reprezentuje gen (Rysunek 4B). Nazwij plik transkryptomicznej macierzy danych jako data.csv w folderze danych.
      UWAGA: Ten plik może zostać wygenerowany przez ręczne zapisanie macierzy danych w formacie .csv z oprogramowania takiego jak Microsoft Excel. Macierz transkryptomiczna może być również generowana przez programowanie komputerowe.
4. Przygotuj plik etykiety w formacie csv.
   1. Podobnie jak w przypadku pliku macierzy transkryptomicznej, nazwij plik etykiety jako label.csv w folderze danych (Rysunek 4C).
      UWAGA: Pierwsza kolumna zawiera nazwy próbek, a etykieta klasy każdej próbki jest podana w kolumnie zatytułowanej etykieta. Wartość 0 w kolumnie etykiety oznacza, że próbka jest ujemna, a 1 oznacza próbkę dodatnią.
5. Wygeneruj cechy mqTrans.
   1. Uruchom następujące polecenie, aby wygenerować funkcje mqTrans i uzyskać dane wyjściowe pokazane w Rysunek 4D. Cechy mqTrans są generowane jako plik ./output/mq_targets.csv, a plik etykiety jest ponownie zapisywany jako plik ./output/label.csv. Dla wygody dalszej analizy, oryginalne wartości ekspresji genów mRNA są również ekstrahowane jako plik ./output/ test_target.csv.
      python ./Get_mqTrans/code/main.py ./data ./Get_mqTrans/model ./output

3. Wybierz funkcje mqTrans

1. Składnia kodu wyboru elementu
   1. Najpierw zmień katalog roboczy na folder HealthModel-mqTrans. Użyj następującej składni:
      python ./FS_classification/testMain.py
      Szczegóły każdego parametru są następujące:
      in-data-file: Plik danych wejściowych
      in-label-file: etykieta pliku danych wejściowych
      Folder wyjściowy: W tym folderze zapisywane są dwa pliki wyjściowe, w tym Output-score.xlsx (metoda wyboru cech i dokładność odpowiedniego klasyfikatora) oraz Output-SelectedFeatures.xlsx (nazwy wybranych cech dla każdego algorytmu wyboru cech).
      1. select_feature_number: wybierz liczbę obiektów, z zakresu od 1 do liczby obiektów pliku danych.
      2. test_size: Ustaw stosunek próbki testowej do podziału. Na przykład 0,2 oznacza, że wejściowy zestaw danych jest losowo podzielony na podzbiory testowe pociągu: według stosunku 0,8:0,2.
      3. połącz: Jeśli wartość to prawda, połącz ze sobą dwa pliki danych w celu wyboru funkcji, tj. oryginalnych wartości wyrażeń i cech mqTrans. Jeśli wartość jest fałszywa, użyj tylko jednego pliku danych do wyboru funkcji, tj. oryginalnych wartości wyrażeń lub cech mqTrans.
      4. połącz plik: Jeśli wartość combine ma wartość true, podaj tę nazwę pliku, aby zapisać połączoną matrycę danych.
         UWAGA: Ten potok ma na celu zademonstrowanie, jak wygenerowane funkcje mqTrans działają w zadaniach klasyfikacji, i bezpośrednio używa pliku wygenerowanego przez sekcję 2 do następujących operacji.
2. Uruchom algorytm wyboru funkcji dla wyboru funkcji mqTrans.
   1. Włącz opcję połącz =Fałsz, jeśli użytkownik wybierze funkcje mqTrans lub oryginalne funkcje.
   2. Najpierw wybierz 800 oryginalnych funkcji i podziel zestaw danych na pociąg: test=0.8:0.2:
      python ./FS_classification/testMain.py ./output/test_target.csv ./output/label.csv ./result 800 0.2 Fałsz
   3. Włącz opcję połącz =True, jeśli użytkownik chce połączyć cechy mqTrans z oryginalnymi wartościami wyrażeń, aby wybrać obiekty. W tym miejscu przykładem demonstracyjnym jest wybranie 800 funkcji i podzielenie zestawu danych na pociąg: test=0.8:0.2:
      python ./FS_classification/testMain.py ./output/mq_targets.csv ./output/label.csv ./result_combine 800 0.2 True ./output/test_target.csv
      UWAGA: Rysunek 5 pokazuje informacje wyjściowe. Pliki dodatkowe wymagane dla tego protokołu znajdują się w folderze HealthModel-mqTrans-v1-00.tar (Supplementary Coding File 1).

Results

Ocena widoku mqTrans w transkryptomicznej zbiorze danych
Kod testowy wykorzystuje jedenaście algorytmów wyboru funkcji (FS) i siedem klasyfikatorów do oceny, w jaki sposób wygenerowany widok mqTrans zestawu danych transkryptomicznych przyczynia się do zadania klasyfikacyjnego (Rysunek 6). Zestaw danych testowych składa się z 317 gruczolakoraka jelita grubego (COAD) z bazy danych The Cancer Genome Atlas (TCGA)²⁹. Pacjenci z COAD w stadium I lub II są uważani za próbki ujemne, podczas gdy ci w stadium III lub IV są próbkami dodatnimi.

Jedenaście algorytmów FS jest zaimplementowanych w kodzie testowym. Istnieją trzy algorytmy FS oparte na filtrach, w tym: wybierz K najlepszych cech według MIC (SK_mic), wybierz K cech według FPR MIC (SK_fpr) i wybierz K cechy według najwyższego FDR MIC (SK_fpr). Trzy algorytmy FS oparte na drzewie oceniają poszczególne cechy za pomocą drzewa decyzyjnego z indeksem Giniego (DT_gini), adaptacyjnymi wzmocnionymi drzewami decyzyjnymi (AdaBoost) i lasem losowym (RF_fs). Pula FS kodu testowego ocenia również dwa opakowania: rekurencyjną eliminację cech (RFE) z liniowym klasyfikatorem wektorów nośnych (SVC) (RFE_SVC) i RFE z klasyfikatorem regresji logistycznej (RFE_LR) oraz dwa algorytmy osadzania: liniowy klasyfikator SVC z najwyżej ocenianymi wartościami ważności funkcji L1 (lSVC_L1) i klasyfikator regresji logistycznej z najwyżej ocenianymi wartościami ważności funkcji L1 (LR_L1).

Kod testowy buduje modele klasyfikacyjne przy użyciu siedmiu klasyfikatorów, w tym liniowej maszyny wektorów nośnych (SVC), Gaussian Naïve Bayes (GNB), klasyfikatora regresji logistycznej (LR), k-najbliższego sąsiada, domyślnie k-5 (KNN), XGBoost, lasu losowego (RF) i drzewa decyzyjnego (DT).

Rysunek 6 pokazuje maksymalną dokładność testu cech mqTrans, oryginalnych cech mRNA oraz połączonego podzbioru cech mRNA i mqTrans zalecanych przez każdy algorytm FS.

Połączone podzbiory cech (mRNA+mqTrans) osiągnęły najwyższą dokładność 0,7656 w metodzie "SK_fpr" FS, lepszą niż indywidualne typy cech mqTrans (0,7188) i oryginalne mRNA (0,7188). Podobne wzorce można zaobserwować dla innych algorytmów FS. Użytkownik może sprawdzić wybrane cechy w pliku wyjściowym Output-SelectedFeatures.csv.

Wykrywanie ciemnych biomarkerów
Wcześniejsze badania wykazały istnienie genów o niezróżnicowanej ekspresji ze znacznie odmiennie reprezentowanymi wartościami mqTrans między grupą fenotypową i kontrolną^26,38,39. Geny te nazywane są ciemnymi biomarkerami, ponieważ tradycyjne badania wykrywania biomarkerów ignorują je ze względu na ich niezróżnicowane ekspresje. Funkcja analizy statystycznej t.test w programie Microsoft Excel może być użyta do zdefiniowania cechy, która jest wyrażona różnicowo, jeśli jej statystyczna wartość p jest mniejsza niż 0,05.

Spośród 3062 cech z wygenerowanymi wartościami mqTrans wykryto 221 ciemnych biomarkerów (Rysunek 7). Trzeci w kolejności gen ENSG00000163697 (APBB2, Amyloid Beta Precursor Protein Binding Family B Member 2) wykazuje istotnie zróżnicowane wartości mqTrans (mqTrans.P = 2,03 x ^10-4), podczas gdy jego pierwotny poziom ekspresji nie wykazuje ekspresji różnicowej (mRNA.P = 3,80 x ^10-1). Słowo kluczowe APBB2 trafiło do 27 publikacji w bazie danych PubMed⁴⁰, ale nie wykryto żadnych powiązań z okrężnicą lub jelitem.

Inny ENSG00000048052 genu (HDAC9, deacetylaza histonów 9) ma różnie reprezentowane wartości mqTrans (mqTrans.P = 6,09 x ^10-3), zachowując praktycznie ten sam rozkład normalny między grupą fenotypową a kontrolną (mRNA.P = 9,62 x ^10-1). Słowo kluczowe HDAC9 trafiło do 417 publikacji w bazie PubMed. W trzech badaniach wspomniano również o słowach kluczowych "okrężnica" lub "jelito" w abstraktach^41,42,43. Ale żaden z nich nie badał roli HDAC9 w raku jelita grubego.

Dane sugerowały konieczność dalszych ocen tych ciemnych biomarkerów na podstawie ich działań po transkrypcji, np. translowane poziomy białek^44,45.

Pan-rakowe rozkłady ciemnych i tradycyjnych biomarkerów związanych z metabolizmem
Tradycyjne biomarkery związane z metabolizmem zostały przebadane i porównane z ciemnymi biomarkerami w 26 typach raka w zbiorze danych TCGA³⁸. Obie kategorie biomarkerów poddano ocenie statystycznej w celu określenia poziomów istotności we wczesnych (stadia I i II) i późnych (stadia III i IV) stadiach raka. W ocenie wykorzystano testy t Studenta dla wartości p, a następnie skorygowane o wielokrotne testy przy użyciu współczynników fałszywych odkryć (FDR). Szczegółowe dane dla każdego z 26 typów nowotworów znajdują się w Rysunek 8.

Geny dające skorygowane FDR wartości p poniżej 0,05 zostały sklasyfikowane jako tradycyjne biomarkery. W przeciwieństwie do tego, ciemne biomarkery zdefiniowano jako te, które mają skorygowane o FDR wartości p poniżej 0,05 w widoku mqTrans, jednocześnie nie wykazując statystycznie istotnych różnic w poziomach ekspresji.

Rysunek 9 pokazuje ogólny niedobór ciemnych biomarkerów w porównaniu z tradycyjnymi biomarkerami w większości typów raka. Godnymi uwagi wyjątkami są BRCA, MESO i TGCT, które wykazują większą częstość występowania ciemnych biomarkerów. Okazuje się, że różne czynniki, w tym czynniki transkrypcyjne, wzorce metylacji, mutacje genów i warunki środowiskowe, mogą modulować dysregulację transkrypcji tych ciemnych biomarkerów. Dalsza złożoność może wynikać z nakładających się na siebie niekodujących transkryptów RNA, które mogą zakłócać poziomy ekspresji ciemnych biomarkerów. Rozregulowanie transkrypcji niektórych ciemnych biomarkerów było wspierane przez ich zróżnicowane poziomy białka^44,45. Ciemne biomarkery są często pomijane w tradycyjnych badaniach i stanowią intrygujące ścieżki dla przyszłych badań mechanistycznych.

Rysunek 1: Przegląd modułów wyboru HealthModel i funkcji w tym protokole. Zastąp określone algorytmy w puli wyboru funkcji i puli klasyfikatorów, jeśli użytkownik jest zaznajomiony z programowaniem w języku Python. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kompletny przepływ kodu dla tego protokołu. (a) Przygotowanie środowiska Python. Aby rozpocząć, utwórz środowisko wirtualne i zainstaluj niezbędne pakiety. Wyczerpujące instrukcje znajdują się w rozdziale 1. (b) Generowanie funkcji mqTrans. Uzyskaj funkcje mqTrans, wykonując krok po kroku podany kod. Szczegółowe wyjaśnienia znajdują się w sekcji 2. (C) Wybierz funkcje mqTrans. Ta sekcja skupia się na ocenie funkcji mqTrans. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przygotowanie środowiska dla Pythona. (A) Polecenie tworzenia modelu zdrowia. (B) Wprowadź y podczas procesu tworzenia VE. (C) Najpowszechniejsze polecenie aktywacji VE. (D) Polecenie instalacji palnika 1.13.1. (E) Zainstaluj dodatkowe biblioteki dla pakietu torch-geometric. (F) Zainstaluj pakiet geometryczny palnika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Uruchom HealthModel, aby pobrać funkcję mqTrans. (A) Pobierz kod. (B) Przykład pliku danych. Każda kolumna zawiera wszystkie wartości czynnika regulacyjnego, a pierwszą pozycją jest identyfikator genu. Każdy wiersz podaje wartości danej próbki, przy czym pierwszym elementem jest nazwa próbki. (C) Przykład pliku etykiety. Pierwsza kolumna zawiera nazwy próbek, a etykieta klasy każdej próbki jest podana w kolumnie zatytułowanej etykieta. Wartość 0 w kolumnie etykiety oznacza, że ta próbka jest żywa, a 1 oznacza martwą. (D) wyjścia mqTrans. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Uruchom algorytm wyboru funkcji dla funkcji mqTrans. Wyniki algorytmu wyboru cech są wyświetlane użytkownikowi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Maksymalna dokładność zestawu testowego każdego algorytmu wyboru cech. Oś pozioma zawiera listę algorytmów wyboru obiektów, a oś pionowa podaje wartości dokładności. Histogramy pokazują dane eksperymentalne trzech ustawień, tj. mqTrans, mRNA, mRNA+mqTrans. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Top 50 ciemnych biomarkerów z najmniejszymi wartościami p w widoku mqTrans. Kolumna "Ciemny biomarker" zawiera nazwy ciemnych biomarkerów. Kolumny "mRNA.P" i "mqTrans.P" są statystycznymi wartościami p testu t między grupą fenotypową i kontrolną. Kolory tła wartości p są pokolorowane między wartościami p 1,00 (niebieski) i 0,00 (czerwony), a kolor biały reprezentuje wartość p = 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Szczegóły dotyczące 26 nowotworów w Atlasie Genomu Raka (TCGA) na różnych etapach. Kolumny "Kohorta" i "Tkanka chorobowa" opisują grupę pacjentów i tkanki z chorobą dla każdego zestawu danych. Ostatnie cztery kolumny podają liczbę próbek w stadiach rozwojowych odpowiednio I, II, III i IV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Liczba ciemnych i tradycyjnych biomarkerów w 26 nowotworach. Oś pozioma zawiera listę 26 typów raka. Oś pionowa podaje liczbę ciemnych biomarkerów i tradycyjnych biomarkerów dla tych typów raka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy plik kodowania 1: HealthModel-mqTrans-v1-00.tar Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Sekcja 2 (Użyj wstępnie wytrenowanego modelu HealthModel do wygenerowania funkcji mqTrans) protokołu jest najbardziej krytycznym krokiem w ramach tego protokołu. Po przygotowaniu obliczeniowego środowiska roboczego w sekcji 1, sekcja 2 generuje widok mqTrans transkryptomicznego zestawu danych w oparciu o wstępnie wytrenowany duży model referencyjny. Sekcja 3 jest demonstracyjnym przykładem wyboru wygenerowanych cech mqTrans do wykrywania biomarkerów i zadań predykcyjnych. Użytkownicy mogą przeprowadzać inne analizy transkryptomiczne na tym zbiorze danych mqTrans przy użyciu własnych narzędzi lub kodów.

Oryginalna struktura HealthModel może dodatkowo uściślić wstępnie wytrenowany model HealthModel przy użyciu architektury wielozadaniowej, zgodnie z opisem w²⁶. Protokół ten koncentruje się na wykorzystaniu wstępnie wytrenowanego modelu referencyjnego do generowania widoku mqTrans zestawu danych transkryptomicznych.

Domyślny, wstępnie wytrenowany model referencyjny został ustalony na zdrowych próbkach i może nie być dobrym wyborem do niektórych konkretnych zadań, np. badania między rakiem pierwotnym a przerzutowym. Szybkość obliczeń jest również niska w przypadku dużego zestawu danych transkryptomicznych.

Znaczenie tego protokołu polega na zapewnieniu komplementarnego spojrzenia mqTrans na najliczniej dostępny typ danych OMIC, tj. transkryptom. Ciemne biomarkery można ujawnić na podstawie genów o niezróżnicowanej ekspresji, ignorowanych przez konwencjonalną analizę transkryptomiczną. W niedawnym badaniu wykryto siedem ciemnych biomarkerów przerzutowego raka jelita grubego (mCC) na podstawie trzech niezależnych kohort 805 próbek w sumie⁴⁴. Ciemne biomarkery poddano ograniczonym badaniom laboratoryjnym ze względu na ich niezróżnicowane ekspresje. Jednak jeden z wykrytych ciemnych biomarkerów mCC YTHDC2 koduje domenę białka YTH zawierającą 2, której poziomy białka zaobserwowano jako dodatnio skorelowane ze statusem przerzutów ludzkich komórek raka żołądka⁴⁶ i raka jelita grubego⁴⁷. Nowe informacje biologiczne dotyczące ciemnych biomarkerów nadal nie zostały rozwiązane za pomocą technologii in vitro i in vivo.

Ten protokół został zaprojektowany tak, aby był w pełni modułowy. Modele referencyjne wstępnie wytrenowane na innych dużych zbiorach danych, takich jak nowotwory pierwotne, ułatwią badanie przerzutów nowotworowych. Protokół ten będzie również badany pod kątem zastosowań w innych dziedzinach życia, w tym w roślinach, grzybach i mikroorganizmach.

Planuje się, że wydajność obliczeniowa tego protokołu zostanie zwiększona poprzez zrównoleglenie i optymalizację algorytmiczną.

Protokół ten opisuje procedurę przekształcania zestawu danych transkryptomicznych do nowego widoku mqTrans, a przekształcone wartości mqTrans genu ilościowo mierzą zmiany regulacji transkrypcji w porównaniu z próbkami referencyjnymi. Model domyślny został wstępnie wytrenowany na zdrowych transkryptomach i wydany jako referencyjny HealthModel.

Kod źródłowy dwóch dalszych zadań został dostarczony w celu ułatwienia łatwego wykorzystania tego protokołu przez badaczy biomedycznych. Dane eksperymentalne pokazują, że przekształcone cechy mqTrans mogą usprawnić zadania predykcyjne przy użyciu tylko oryginalnych poziomów wyrażeń. Widok mqTrans może również ujawnić utajone powiązania fenotypowe niektórych ciemnych biomarkerów bez różnicowej ekspresji w oryginalnych danych transkryptomicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaconda	Anaconda	wersja 2020.11	Platforma programistyczna Python
Komputer	NIE	DOTYCZY	Nie dotyczy Dowolne komputery ogólnego przeznaczenia spełniają wymagania
Karta graficzna	NIE	DOTYCZY	Dowolne karty graficzne ogólnego przeznaczenia z biblioteką obliczeniową CUDA
pytorch	Pytorch	w wersji 1.13.1	Latarka
programowa geometryczna	Oprogramowanie Pytorch	w wersji 2.2.0