Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Streszczenie

Rak jajnika jest najbardziej śmiercionośnym nowotworem ginekologicznym. Sieć odgrywa kluczową rolę w zapewnianiu wspierającego mikrośrodowiska komórkom przerzutowego raka jajnika, a także sygnałów immunomodulacyjnych, które umożliwiają tolerancję guza. Mamy jednak ograniczone modele, które ściśle naśladują interakcję między komórkami raka jajnika a tkankami bogatymi w tkankę tłuszczową. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i molekularne, za pomocą których sieć zapewnia mikrośrodowisko pronowotworowe, opracowaliśmy unikalny model 3D interakcji komórka-sieć nowotworowa ex vivo. Za pomocą ludzkiej sieci jesteśmy w stanie hodować komórki raka jajnika w tym bogatym w tłuszcz mikrośrodowisku i monitorować czynniki odpowiedzialne za wzrost guza i regulację immunologiczną. Oprócz zapewnienia platformy do badania tego bogatego w tłuszcz mikrośrodowiska guza, model ten stanowi doskonałą platformę do opracowywania i oceny nowych podejść terapeutycznych do celowania w przerzutowe komórki nowotworowe w tej niszy. Proponowany model jest łatwy do wygenerowania, niedrogi i ma zastosowanie w badaniach translacyjnych.

Wprowadzenie

Rak jajnika jest najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym na świecie¹. Ryzyko zachorowania na ten nowotwór w ciągu całego życia wynosi około 1 na 70, przy czym mediana wieku rozpoznania wynosi 63 lata². Pierwotne nowotwory złośliwe jajnika są klasyfikowane histologicznie jako nabłonkowe lub nienabłonkowe. Nabłonkowy rak jajnika (EOC) stanowi ponad 90% nowotworów, a najczęstszym podtypem jest rak surowiczy o wysokim stopniu złośliwości (HGSC), który stanowi około 70%-80% EOC. Obecnie nie ma skutecznych metod badań przesiewowych, które pozwoliłyby na wczesne wykrycie choroby. Tak więc większość pacjentów jest diagnozowana w zaawansowanym stadium (tj. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadium III lub IV) po tym, jak rak rozprzestrzenił się w jamie otrzewnej².

Standardowe leczenie pierwszej linii to operacja cytoredukcyjna w celu usunięcia wszystkich widocznych makroskopowych chorób, a następnie chemioterapia uzupełniająca oparta na platynie, aby zniszczyć wszelkie pozostałości choroby mikroskopowej. Chociaż w ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono wiele postępów w leczeniu raka jajnika, około 70% pacjentek z zaawansowaną chorobą powróci do nałogu w ciągu 3 lat leczenia³. Biorąc pod uwagę ogólnie złe rokowania dla tych pacjentów, trwające i przyszłe badania translacyjne w EOC mają na celu zidentyfikowanie biomarkerów do wczesnego wykrywania, zapobieganie przerzutom, ulepszenie obecnych terapii w celu uniknięcia oporności i opracowanie nowych spersonalizowanych metod leczenia raka.

Uogólnione przerzuty w obrębie jamy otrzewnej i związana z nią chemooporność to dwa główne ograniczenia dla poprawy leczenia pacjentek z rakiem jajnika^4,5. Sieć słoniowa, struktura przypominająca tłuszczowy fartuch, która zwisa z żołądka nad jelitami, jest głównym miejscem przerzutów raka jajnika^6,7. Oprócz funkcji bariery fizycznej, wykazano, że sieć ma zdolności regeneracyjne i angiogenne oraz posiada aktywność immunologiczną, które razem promują unaczynienie, przyspieszają gojenie się ran i ograniczają infekcje⁸. Zawiera wysokie stężenie komórek macierzystych, które mogą różnicować się w różne typy komórek i mogą pomóc w naprawie uszkodzonych tkanek. Sieć może ulec zapaleniu w odpowiedzi na uraz lub infekcję, co wyzwala migrację komórek odpornościowych do miejsca urazu⁹. Te komórki odpornościowe uwalniają czynniki wzrostu i inne cząsteczki, które pomagają w naprawie i regeneracji uszkodzonej tkanki. Komórki odpornościowe, takie jak makrofagi, limfocyty i komórki plazmatyczne, zlokalizowane w sieci są strukturami znanymi jako "mleczne plamki", które są odpowiedzialne za wykrywanie i atakowanie patogenów oraz regulację odporności otrzewnowej. Wykazano również, że sieć odgrywa rolę w indukowaniu tolerancji immunologicznej¹⁰, która jest zdolnością układu odpornościowego do tolerowania własnych antygenów i nie atakowania zdrowych tkanek. Jednak te same działania związane z odpornością są również zaangażowane w patologiczne reakcje, takie jak wzrost guzów omentalnych, przerzuty i ucieczka przed nadzorem immunologicznym^9,11. Wcześniejsze badania z naszego laboratorium i innych wykazały unikalną i aktywną rolę mikrośrodowiska tłuszczowego w hamowaniu przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych oraz w nabywaniu chemooporności^12,13,14. Niestety, mamy ograniczone informacje na temat mechanizmów komórkowych i molekularnych, dzięki którym sieć zapewnia mikrośrodowisko pronowotworowe.

Aby lepiej zrozumieć interakcje między komórkami nowotworowymi a siecią, stworzono system hodowli 3D składający się z ludzkich komórek raka jajnika i eksplantatów sieci pochodzących od pacjentów. Opisany tutaj protokół stanowi nowatorski model ex vivo rakowatości otrzewnej. Model ten naśladuje naturalny postęp nowotworzenia raka jajnika w tej tkance bogatej w tkankę tłuszczową. Proponowany model jest łatwy do wygenerowania, niedrogi i potencjalnie możliwy do zastosowania w badaniach translacyjnych w badaniach nad rakiem jajnika.

Protokół

Poniższy protokół badawczy został sprawdzony i zatwierdzony przez Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Przed zabiegiem uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Rysunek 1 ilustruje trzy ogólne kroki w tym protokole.

1. Przygotowanie tkanki ludzkiej sieci

1. Przygotować pożywkę hodowlaną sieci (DMEM/F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny-streptomycyny) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność 30-40 ml tej pożywki przelać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml lub pojemnika na próbkę chirurgiczną.
2. Pobieranie próbek chirurgicznych z biopsji omentalnej lub operacji omentektomii. Zanurzyć sterylną próbkę w pożywce hodowlanej sieci natychmiast po usunięciu na sali operacyjnej. Jeśli przebieg pracy na to nie pozwala, należy jak najszybciej umieścić próbkę w pożywce do hodowli sieci komórkowej. Przenieść próbkę, umieszczając ją na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
   UWAGA: Wielkość usuniętej próbki sieci określi ilość tkanki nadającej się do obróbki.
3. Próbkę sieci należy przetworzyć w ciągu 1-2 godzin od pobrania za pomocą okapu z przepływem laminarnym. Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia są sterylne lub wysterylizowane.
4. Wyjąć sieć z pojemnika zbiorczego i przenieść ją do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Zanurz próbkę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS) i delikatnie umyj próbkę, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi lub zanieczyszczenia.
5. Pokrój tkankę na kawałki (0,5 cm x 0,5 cm lub 100-200 mg; Rysunek 2A) za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela 10-15 mm. Użyj małych kleszczy chirurgicznych, aby pomóc manipulować tkanką i uniknąć zmiażdżenia sieci włosów. Jeśli do chirurgicznego usunięcia próbki sieci użyto urządzenia energetycznego, należy unikać używania zniekształconej tkanki na uszczelnionej krawędzi.
6. Umieść każdy kawałek pokrojonej sieci w osobnych dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej i wypełnij studzienki 500 μl pożywki hodowlanej sieci lub do objętości wystarczającej do przykrycia sieci bez pozwalania, aby kawałek sieci unosił się nad dnem studzienki (Rysunek 2B).
7. Przechowywać kawałki sieci w świeżych pożywkach hodowlanych w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia.

2. Przygotowanie komórek raka jajnika

1. Hodowla ludzkich komórek raka jajnika w kolbie hodowlanej o średnicy 75^cm2 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do co najmniej 75% zbiegu do dnia pobrania sieci komórkowej.
   UWAGA: Ten protokół wykorzystuje mCherry-dodatnie komórki ludzkiego raka jajnika OCSC1-F2 wcześniej opisane^15,16,17,18. Można go zmodyfikować do dowolnej linii komórek rakowych oznaczonej sygnałem fluorescencyjnym.
2. Przygotować komórki w okapie z przepływem laminarnym natychmiast po pobraniu próbki sieci komórkowej. Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia są sterylne lub wysterylizowane.
3. Dodać 10 ml sterylnego 1x PBS do kolby hodowlanej i umyć komórki, delikatnie kołysząc kolbą. Usuń 1x PBS, a następnie dodaj 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA.
4. Delikatnie kołysać kolbą hodowlaną, aby pokryć wszystkie komórki, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} na nie dłużej niż 5 minut. Postukać w kolbę hodowlaną, aby całkowicie odłączyć komórki, a następnie zneutralizować trypsynę, dodając 3 ml pożywki do hodowli sieci komórkowej.
5. Wymieszać zawiesinę komórkową przez pipetowanie, a następnie przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 24 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 6 ml świeżej pożywki do hodowli sieci komórkowej.
6. Policz komórki za pomocą hemekytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do co najmniej 100 000 komórek na 100-200 μl zawiesiny. Jest to objętość wstrzyknięcia do każdego odciętego kawałka sieci jajowej.
7. Przenieść odpowiednią liczbę komórek do nowej kolby hodowlanej, aby kontynuować pasaż komórkowy.

3. Wstrzyknięcie komórek raka jajnika

1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać zawiesinę krwinek, a następnie przymocować igłę 26 G. Nie należy pobierać zawiesiny komórek za pomocą igły, ponieważ może to spowodować fragmentację komórek.
2. Użyj małych kleszczy chirurgicznych, aby podnieść kawałek przeciętej sieci komórkowej. Przenieść sieć do oddzielnego, działającego sterylnego naczynia w celu ułatwienia wstrzyknięcia. Delikatnie przekłuć sieć końcówką igły i wstrzyknąć niewielką objętość zawiesiny komórkowej do tkanki (Rysunek 2C).
3. Powtórzyć wstrzyknięcie na kilka obszarów sieci do całkowitej objętości co najmniej 100 μl lub 100 000 komórek. Należy zauważyć, że duża część zawiesiny komórkowej może wydawać się gromadzona wokół próbki. Jeśli istnieją obawy co do jakości wstrzyknięcia, należy powtórzyć wstrzyknięcie lub wstrzyknąć większą objętość zawiesiny komórkowej do próbki.
4. Wstrzyknięte próbki sieci należy umieścić z powrotem w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej. Zwróć uwagę, że objętość pożywki hodowlanej sieci jest na poziomie, który pokrywa sieć bez pozwalania jej na unoszenie się na wodzie. Ostrożnie obchodź się z płytką i umieść ją w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 ).}
5. OPCJONALNIE: Użyj Matrigel (macierz błony podstawnej), aby zawiesić tkankę sieci w stałej matrycy, aby umożliwić łatwiejsze wstrzykiwanie i bardziej skoncentrowane dostarczanie zawiesiny komórek.
   1. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić matrycę błony podstawnej w temperaturze 4 °C i wymieszać w stosunku 1:1 z pożywką hodowlaną sieci komórkowej. Mieszaninę z matrycą błony podstawnej należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia. Napełnij puste studzienki wystarczającą ilością mieszanki macierzy błony podstawnej, aby zanurzyć odcięty kawałek sieci komórkowej.
   2. Umieścić próbki w mieszaninie matrycy błony podstawnej, a następnie umieścić 24-dołkową płytkę hodowlaną w inkubatorze (37 °C i 5% CO_{2 )} na 20 minut. Po zestaleniu się mieszaniny kontynuować wstrzykiwanie, jak opisano powyżej.
6. Potwierdź udane wstrzyknięcie za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Upewnij się, że w miejscach wstrzyknięcia jest wizualizowana smuga sygnału fluorescencyjnego (Rysunek 2D). Należy pamiętać, że rzeczywista liczba komórek przyczepionych do sieci po wstrzyknięciu jest nieprzewidywalna.

4. Współhodowla komórek ludzkiej sieci i raka jajnika

1. Zmieniaj pożywkę co 48-72 godziny, dodając 500-2000 μl świeżych pożywek hodowlanych sieci komórkowej. Nie należy pipetować pożywki bezpośrednio na tkankę sieci leków, ponieważ może to spowodować przemieszczenie komórek rakowych. Zwróć uwagę, że jeśli kolor nośnika zmieni się na żółty, zmień media.
   UWAGA: Częstotliwość zmiany pożywki będzie zależeć od objętości użytej pożywki i trajektorii wzrostu komórek rakowych. Gdy komórki rakowe zasieją sieć, to, czy kawałek sieci unosi się na wodzie, nie jest już ważne.
2. OPCJONALNIE: Jeśli zastosowano matrycę z membraną podstawną, matryca zwykle rozpuszcza się do czasu pierwszej wymiany podłoża.
3. Monitoruj wzrost guzów raka jajnika za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Częstotliwość obrazowania zależy od uznania badacza. Przewiduj dowody na istnienie małych guzów o około 14 dni (Rysunek 3A-C). Wyniki mogą się różnić w zależności od jakości wstrzyknięcia.
4. Zakończ eksperyment na podstawie punktu końcowego eksperymentu.
   UWAGA: Wzrost guza i integralność tkanki sieci zaobserwowano w ciągu ostatnich 50 dni.

Wyniki

Pomyślne wprowadzenie komórek raka jajnika do próbek sieci ownetrum było widoczne około 14. dnia (Rysunek 3A-C). W celu umożliwienia dalszych eksperymentów przygotowano i wstrzyknięto co najmniej 24 powtórzenia na każdą pobraną próbkę. Wzrost guza monitorowano, wykonując obrazy fluorescencyjne (Rysunek 3D,E). Obrazy wymagały uważnej interpretacji, ponieważ na dnie każdej studni, poza obszarem przytwierdzenia do ...

Dyskusja

Korzystając z tego protokołu, opracowano przedkliniczny model rakowatości otrzewnej w raku jajnika, stosując połączenie podstawowych technik in vitro i ex vivo. Postępujący wzrost guza zaobserwowano w ciągu 50 dni wspólnej hodowli po wysianiu próbek sieci komórkami ludzkiego raka jajnika mCherry + OCSC1-F2. Metoda ta została opracowana i zoptymalizowana w kilku próbach eksperymentalnych z wykorzystaniem różnych próbek sieci komórkowej. Pomyślny wzrost guza zależał od jakości sieci komórkowej, żywotności...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 ml Strzykawka insulinowa z odłączaną igłą 26 G	BD	329652
10 ml Pipety serologiczne	CELLTREAT	229010B
100 mm Naczynie do hodowli tkankowych	Fisherbrand	FB012924
15 ml Probówka wirówkowa	CELLTREAT	229411
24-dołkowa Płytka hodowlana	Costar	3524
50 ml Probówka wirówkowa	CELLTREAT	229421
75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych	CELLTREAT	229341
Licznik komórek Corning		9819000
Cytation 5 Imager	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-glutamina, +2.438 g/L Sód Wodorowęglan	Gibco	11320033
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	Matryca z membraną podstawną
nr 10 Jednorazowy skalpel ze stali nierdzewnej	Integra-Miltex	4410
Penicylina Streptomycyna	Gibco	15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4 ( 1x)	Mikroskop obrotowy Gibco	10010023
	Echo