Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Osy pasożytnicze to zróżnicowana grupa owadów błonkoskrzydłych, które służą jako nieocenione zasoby do biokontroli szkodników. Aby zapewnić skuteczne pasożytnictwo, pasożytnicze osy wstrzykują jad swoim gospodarzom, aby stłumić ich odporność, modulować rozwój, metabolizm, a nawet zachowanie. Szacuje się, że istnieje ponad 600 000 gatunków, a różnorodność pasożytniczych os przewyższa różnorodność innych jadowitych zwierząt, takich jak węże, ślimaki stożkowe i pająki. Jad osy pasożytniczej jest słabo zbadanym źródłem bioaktywnych cząsteczek o potencjalnych zastosowaniach w zwalczaniu szkodników i medycynie. Jednak zbieranie jadu parazytoidów jest trudne ze względu na brak możliwości zastosowania bezpośredniej lub elektrycznej stymulacji oraz trudności w sekcji ze względu na ich mały rozmiar. Trichogramma to rodzaj maleńkich (~0,5 mm) jajowych os, które są szeroko stosowane do biologicznego zwalczania szkodników Lepidoptera zarówno w rolnictwie, jak i lasach. W tym miejscu przedstawiamy metodę ekstrakcji jadu z T. dendrolimi przy użyciu sztucznych żywicieli. Ci sztuczni żywiciele są tworzeni z folii polietylenowej i roztworów aminokwasów, a następnie zaszczepiani osami Trichogramma na pasożytnictwo. Jad został następnie pobrany i zagęszczony. Metoda ta umożliwia ekstrakcję dużych ilości jadu Trichogramma przy jednoczesnym uniknięciu zanieczyszczenia innych tkanek spowodowanego rozwarstwieniem, co jest częstym problemem w protokołach sekcji zbiorników jadu. To innowacyjne podejście ułatwia badanie jadu Trichogramma, torując drogę do nowych badań i potencjalnych zastosowań.
Wprowadzenie
Osy pasożytnicze to pasożytnicze owady błonkoskrzydłe, które są ważnymi zasobami dla kontroli biologicznej1. Istnieje szeroka gama os parazytoidów, z ponad 600 000 szacowanych gatunków2. Różnorodność pasożytniczych os znacznie przewyższa różnorodność innych jadowitych stawonogów, takich jak węże, ślimaki stożkowe, pająki, skorpiony i pszczoły. Jad jest ważnym czynnikiem pasożytniczym u pasożytniczych os. W celu skutecznego pasożytnictwa jad jest wstrzykiwany do żywiciela, modulując jego zachowanie, odporność, rozwój i metabolizm3. Co więcej, jad pasożytniczych os wykazuje niezwykłą różnorodność w swoich strukturach molekularnych, celach i funkcjach, odzwierciedlając złożoną koewolucję z ich gospodarzami. Tak więc jad parazytoidów jest cennym i niedocenianym zasobem aktywnych cząsteczek do celów owadobójczych lub medycznych4. W przeciwieństwie do jadu węży, ślimaków stożkowych, pająków, skorpionów i pszczół, jad pasożytniczej osy nie może być zbierany przez bezpośrednią stymulację lub stymulację elektryczną5. Obecna metoda ekstrakcji jadu pasożytniczej osy polega na rozbiorze zbiornika jadu. Jednak osy pasożytnicze są często małe, a sekcja os pasożytniczych wymaga wysokich umiejętności technicznych. Dlatego, jeśli uda nam się znaleźć sposób na skuteczne i wygodne zbieranie jadu os pasożytniczych, bardzo pomocne będzie badanie jadu os pasożytniczych.
Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) to rodzaj maleńkich (~0,5 mm długości) parazytoidów (~0,5 mm długości) class<="xref">6. Osy te są jednymi z najczęściej stosowanych środków kontroli biologicznej, szczególnie zwalczanych jajami różnych szkodników z rzędu Lepidoptera zarówno w rolnictwie, jak i w lasach. Na przykład T. dendrolimi, jeden z najczęściej stosowanych gatunków Trichogramma w Chinach, jest szeroko stosowany do zwalczania różnych szkodników rolniczych i leśnych, takich jak Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis i Chilo suppressalis. Wcześniejsze badania wykazały, że osy Trichogramma mogą wstrzykiwać swoje jaja do sztucznych żywicieli7. Sztuczne hosty można tworzyć przy użyciu materiałów takich jak wax8, agar9, Parafilm10 i plastic film11. Roztwór w sztucznych żywicielach, który indukuje wystarczające składanie jaj dla Trichogramma, może być prosty, taki jak aminokwasy lub sole nieorganiczne12. Opierając się na charakterystyce, że T. dendrolimi może pasożytować na sztucznych żywicielach, badanie to zapewnia nową metodę ekstrakcji jadu z pasożytniczych os przy użyciu sztucznych żywicieli. Podejście to ma na celu wyeliminowanie niedociągnięć związanych z niską wydajnością, niską czystością i podatnością na zanieczyszczenia w obecnych technikach ekstrakcji. Za pomocą tej metody można wyekstrahować dużą ilość jadu o wysokiej czystości z T. dendrolimi, co spełnia potrzeby badań naukowych i badań przesiewowych cząsteczek bioaktywnych do celów owadobójczych lub medycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla owadów
- Corcyra cephalonica należy karmić mąką kukurydzianą w temperaturze 26 ± 1°C i wilgotności względnej 40% ± 10%.
- Hoduj szczep T. dendrolimi z owada Jilin w pomieszczeniu, używając jaj Corcyra cephalonica jako żywicieli. Nakarm dorosłe osy 10% sacharozą w probówkach Drosophila w temperaturze 26 ± 1 °C, wilgotności względnej 70% ± 10%, jasne (L): ciemne (D) okres 14 godzin: 10 godzin.
2. Przygotowanie kart jajecznych z folii polietylenowej
- Weź folię z tworzywa sztucznego z polietylenu o długości 16 cm, szerokości 12 cm i grubości 20 μm. Wyciśnij 30 półokrągłych występów o średnicy 2-3 mm i wysokości około 3 mm za pomocą szklanego pręta szlifierskiego zgodnie ze standardowym układem płytek PCR z 96 otworami.
UWAGA: Proces wyciskania 30 półkolistych występów za pomocą szklanego pręta szlifierskiego należy wykonać zwracając uwagę na nacisk, ponieważ zbyt mocne naciśnięcie przebije plastik i zanieczyści wydobyty pręt szlifierski bez jadu. - Zdezynfekuj sprasowaną folię polietylenową z tworzywa sztucznego, wystawiając obie strony na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 1 godzinę.
- Dodaj niewielką ilość 10% alkoholu poliwinylowego do półkolistej powierzchni.
3. Pasożytnictwo Trichogramma dendrolimi
- Po znieczuleniu CO2 umieść samice os T. dendrolimi w pudełku zbiorczym, a liczba os wynosiła ~ 3000.
- Umieść wypukłą stronę foliowej karty jajowej w kierunku pojemnika zbiorczego i zabezpiecz krawędzie gumką.
- Dodać 4 μl roztworu aminokwasów (6 g/l leucyny, 4 g/l fenyloalaniny, 4,25 g/l histydyny) do każdego półkolistego występu. Przykryj go płaską folią polietylenową o długości 16 cm i szerokości 12 cm. Użyj gumowej opaski, aby szczelnie przykryć pojemnik na dwa arkusze plastiku.
- Pozwól osom T. dendrolimi swobodnie pasożytować przez 4-8 godzin i dostarczaj 10% wody sacharozowej przez zwilżoną bawełnę.
4. Zbieranie jadu T. dendrolimi
- Otrzymaj spasożytowany roztwór aminokwasu z wewnętrznego występu karty ze sztucznego jaja i przenieś go do nakrętki probówki o pojemności 1,5 ml.
- Przykryj nakrętkę probówki nylonową siatką 10 μm o średnicy 25 mm, mocno przymocuj nylonową siatkę i probówkę wirówkową. Umieść probówkę wirówkową pionowo do krótkiego wirowania za pomocą mini-wirówki (1360 x g) na 10 s i zbierz przefiltrowany roztwór (~100 μL jadu T. dendromi).
- Zmierzyć stężenie zebranego jadu T. dendrolimi za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicunchoninowego (BCA) (tabela materiałów).
- Przechowywać jad w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.
5. Analizy SDS-PAGE
- Dodać 30 μl jadu T. dendrolimi do 10 μl 4x buforu do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) (tabela materiałów) i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 min.
- Wykonać przebieg żelowy SDS-PAGE przy napięciu 130 V przez 120 minut.
- Zabarwić i odbarwić żel SDS-PAGE za pomocą aparatu do barwienia białek (tabela materiałów).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stężenie białek w reprezentatywnych próbkach jadu zmierzono przy użyciu zestawu do oznaczania białek, a wyniki przedstawiono w Tabeli 1. Wyniki wykazały, że stężenie białek jadu pobranego tą metodą mieściło się w zakresie od 0,35 µg/µL do 0,46 µg/µL, podczas gdy w ujemnej kontroli w postaci roztworu aminokwasów stężenie białek wynosiło jedynie od 0,03 µg/µL do 0,05 µg/µL. Stężenie białek jadu pobranych tą metodą jest znacznie wyższe niż w kontroli ujemnej, co dowodzi, że metoda ta pozwala na efektywne po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy metodę ekstrakcji jadu z T. dendrolimi przy użyciu sztucznych żywicieli. Kluczowe punkty w eksperymencie z zbieraniem jadu są następujące. (1) Podczas przygotowania T. dendrolimi musi być szybko znieczulony odpowiednim stężeniem CO2 . Jeśli stężenie CO2 jest zbyt niskie, nie wystarczy do szybkiego znieczulenia Trichogramma . I odwrotnie, jeśli stężenie jest zbyt wysokie, Trichogramma może umrzeć, zmniejszając ich zdolność do pasożytowan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor nie ma nic do ujawnienia i nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy za wsparcie finansowe od Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hainan (Grant nr 323QN262), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31701843 i 32172483), Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (Grant No. CX(22)3012 i CX(21)3008), Fundacji "Doktor Shuangchuang" prowincji Jiangsu (grant nr 202030472) oraz funduszu startowego Uniwersytetu Rolniczego w Nankinie (grant nr 804018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 μ m Nylon Net | Millipore | NY1002500 | Do filtrowania jaj |
| 10% Alkohol poliwinylowy | Aladdin | P139533 | Do przyciągania T. dendrolimi do składania jaj |
| 10% Woda z sacharozą | Odczynnik chemiczny Sinopharm | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x bufor ładowania LDS | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Skrzynka odbiorcza | Deli | 8555 | Pojemnik na T. dendrolimi pasożytnictwo |
| Przyszłość STRONA 4– 12% (12 dołków) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 aparat do barwienia białek | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Pręt do szlifowania szkła | Applygen | tb6268 | Wypukłości półkoliste |
| L-Leucyna | Solarbio | L0011 | Sztuczne składniki gospodarza |
| L-Histydyna | Aladyna | A2219458 | Sztuczne składniki gospodarza |
| L-fenyloalanina | Solarbio | P0010 | Sztuczne składniki |
| gospodarza Mini-wirówki | Scilogex | D1008 | Wirówka |
| MOPS-SDS bufor uruchomiony | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Zestaw do oznaczania białek Omni-Easy Instant Shanghai | Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | Do oznaczania stężenia białka jadu |
| układ płytek PCR z 96 otworami | Thermo Fisher | AB1400L | Wypukłości półkoliste |
| Folia polietylenowa z tworzywa sztucznego | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Karta ze sztucznymi jajami |
| Wstępnie barwiony marker białkowy (10– 180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Gumowa opaska | Guangzhou qianrui biologia nauka i technologia | 009 | Dokręć folię z tworzywa sztucznego i pojemnik |
| Mata septyczna z gumy silikonowej, 96-dołkowa, okrągły otwór | Sangon Biotech | F504416-0001 | Wypukłości półkoliste |
Bibliografia
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568(1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
