Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model suchego oka szczura z dysfunkcją gruczołów łzowych wywołaną przez skopolaminę

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66036

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Eye Hospital, Jinan University, 2Shenzhen Eye Institute, 3Shenzhen Research Institute, Wuhan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj tworzymy szczurzy model dysfunkcji gruczołów łzowych, aby zapewnić podstawę do badania suchego oka z niedoborem wody wodnistej.

Streszczenie

Suche oko z niedoborem wody wodnistej (ADDE) to rodzaj choroby suchego oka, która może skutkować zmniejszeniem ilości i jakości wydzielania łez. Długotrwałe nieprawidłowe wytwarzanie łez może prowadzić do zaburzeń środowiska powierzchni oka, w tym do uszkodzenia rogówki i stanu zapalnego. W ciężkich przypadkach ADDE może spowodować utratę wzroku, a nawet ślepotę. Obecnie leczenie zespołu suchego oka ogranicza się do kropli do oczu lub fizjoterapii, które mogą jedynie złagodzić objawy dyskomfortu oczu i nie mogą zasadniczo wyleczyć zespołu suchego oka. Aby przywrócić funkcję gruczołu łzowego w suchym oku, stworzyliśmy zwierzęcy model dysfunkcji gruczołów łzowych u szczurów wywołanej przez skopolaminę. Poprzez kompleksową ocenę gruczołu łzowego, rogówki, spojówek i innych czynników, staramy się zapewnić pełne zrozumienie zmian patologicznych ADDE. W porównaniu z obecnym modelem myszy z zespołem suchego oka, ten model zwierzęcy ADDE obejmuje funkcjonalną ocenę gruczołu łzowego, zapewniając lepszą platformę do badania dysfunkcji gruczołów łzowych w ADDE.

Wprowadzenie

Do 2021 roku około 12% osób cierpi na zespół suchego oka1, co czyni go jedną z najczęstszych przewlekłych chorób oczu. Zespół suchego oka można podzielić na dwa typy: suche oko z niedoborem wody wodnistej (ADDE) i suche oko wyparne (EDE)2, w zależności od różnych czynników wpływających na chorobę. ADDE jest dalej podzielone na zespół Sjögrena (SS) i nie-SS, ale większość pacjentów z suchym okiem to pacjenci bez SS w klinicznej3. Przewlekłe objawy suchego oka poważnie wpływają na jakość widzenia pacjentów. Obecnie konwencjonalne leczenie DED polega na zastosowaniu sztucznych łez do smarowania powierzchni oka i fizjoterapii powiek. Jednak zespół suchego oka może w wielu przypadkach nie zapewnić całkowitego wyleczenia. Dlatego badanie patogenezy zespołu suchego oka ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych terapii i leków. Zwierzęce modele zespołu suchego oka stanowią podstawę do dalszych badań.

Istnieje wiele sposobów na konstruowanie zwierzęcych modeli zespołu suchego oka4, w tym zmiana poziomu wydzielania łez poprzez zmianę poziomu hormonów. Na przykład usunięcie jąder szczurów może zmniejszyć wydzielanie androgenów, zwiększyć wydzielanie łez i zmniejszyć stężenie wolnego składnika wydzielniczego (SC) i IgA we łzach5,6. Inną metodą jest wskazanie reakcji autoimmunologicznych w gruczole łzowym poprzez usunięcie nerwów z powierzchni oka, które kontrolują gruczoł. Dodatkowo, bezpośrednie zmniejszenie wydzielania łez można osiągnąć poprzez chirurgiczne usunięcie gruczołu łzowego7. Zmieniające się warunki środowiskowe mogą również przyspieszyć parowanie łez. Na przykład, hodowla zwierząt w warunkach niskiej wilgotności i suchej wentylacji może stworzyć model nadmiernego parowania suchego oka8, który można połączyć z innymi metodami w celu zwiększenia nasilenia suchego oka. Głównymi lekami stosowanymi do wywoływania zespołu suchego oka w modelach eksperymentalnych są atropina i skopolamina9. Jako inhibitory przywspółczulne, oba mogą indukować farmakologiczną blokadę receptorów cholinergicznych (muskarynowych) w gruczole łzowym i hamować wydzielanie łez. W porównaniu z zespołem suchego oka spowodowanym wstrzyknięciem atropiny do mięśni10, skopolamina ma silniejsze działanie hamujące na gruczoły wydzielnicze, dłuższy czas działania leku i słabszy wpływ na mięśnie gładkie serca, jelita cienkiego i oskrzeli. Jest to jeden z najbardziej dojrzałych leków stosowanych u modeli zwierzęcych z zespołem suchego oka.

Różne metody mogą być używane do wywołania suchego oka za pomocą skopolaminy, takie jak wstrzyknięcie podskórne, pompa lekowa lub aplikacja plastrów4,11,12. Aby zmniejszyć częstotliwość podawania leków zwierzętom doświadczalnym, wielu badaczy nakłada plastry transdermalne na ogony myszy lub stosuje pompy do leków. Jednak obie te metody mają ograniczenia. Na przykład wchłanianie plastrów transdermalnych musi uwzględniać indywidualne wchłanianie myszy, co może prowadzić do niespójnego dawkowania leków. Chociaż pompy lekowe mogą dokładnie kontrolować dawkę każdej dawki, nie zawsze są one kompatybilne z podawanym lekiem lub stosowanym stężeniem. Muszą być również umieszczone chirurgicznie – co jest bardziej inwazyjne dla zwierzęcia, wymaga znieczulenia i istnieje możliwość wystąpienia powikłań pooperacyjnych, takich jak rozejście się. Wstrzyknięcie podskórne, choć bardziej kłopotliwe, może zapewnić dokładne dawkowanie przy każdym podaniu i utrzymać spójność w podawaniu leku u różnych szczurów. Jednocześnie ma niższy koszt i nadaje się do przeprowadzania dużej liczby eksperymentów na zwierzętach.

To badanie stosuje wielokrotne podskórne wstrzykiwanie skopolaminy w celu stworzenia modelu szczura z suchym okiem. Analizujemy wskaźniki suchego oka, takie jak wady rogówki, poziom wydzielania łez oraz patologiczna morfologia rogówki, spojówki i gruczołu łzowego. Łącząc stężenie leku, objawy patologiczne i objawy suchego oka, szczegółowo omawiamy model szczura z suchym okiem, dostarczając dokładniejszych danych eksperymentalnych do badania leczenia suchego oka i mechanizmów patologicznych. Szczegółowo opisujemy również proces modelowania dla przyszłych badaczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane zgodnie z tym protokołem są przeprowadzane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Przygotuj 12 zdrowych 6-tygodniowych samic szczurów SPF Wistar o wadze 160 g ± 20 g.
  2. Użyj lampy szczelinowej i oftalmoskopu, aby zbadać stan oczu wszystkich szczurów, upewniając się, że nie ma chorób przedniego odcinka lub siatkówki.
  3. Wychowuj wszystkie szczury przez 1 tydzień z wystarczającą ilością pożywienia i wody.
  4. Losowo podzielono wszystkie szczury na grupy o normalnym stężeniu skopolaminy 2,5 mg / ml, stężeniu leku skopolaminy 5 mg / ml i stężeniu skopolaminy 7,5 mg / ml, po trzy zwierzęta w każdej grupie.

2. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować bromowodorek skopolaminy, rozpuszczając go w 0,9% roztworze chlorku sodu w celu uzyskania roztworu o stężeniach 7,5 mg/ml, 5 mg/ml i 2,5 mg/ml.
  2. Przygotować 0,9% roztwór chlorku sodu bez bromowodorku skopolaminy do użycia jako wstrzyknięcie dla grupy kontrolnej szczurów.

3. Przygotowanie sprzętu i materiałów

  1. Przygotuj mikroskop dla małych zwierząt.
  2. Przygotuj materiały do eksperymentu, w tym jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą (26 G); paski okulistyczne z fluoresceiną sodową; Pasek testowy do łez Schirmera; etanol absolutny; 4% paraformaldehydu; ksylen; neutralny balsam; hematoksylina, eozyna; i zestaw do barwienia kwasem okresowym Schiffa.

4. Wstrzyknięcie podskórne

UWAGA: Ta procedura wymaga pomocy drugiej osoby, która pomoże zabezpieczyć szczury.

  1. Trzymaj ciało szczura stabilnie i chwyć i rozciągnij jego lewe (lub prawe) tylne nogi.
    UWAGA: Asystent może pomóc w trzymaniu zwierzęcia.
  2. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
  3. Włożyć jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą (26 G) u podstawy fałdu skórnego między kciukiem a palcem.
  4. Zassać strzykawkę, odciągając tłok strzykawki. Krew w strzykawce wskazuje na niewłaściwe umieszczenie igły; Wyjąć igłę i zmienić jej położenie.
  5. Podawać 0,9% roztwór chlorku sodu z bromowodorkiem skopolaminy lub bez bromowodorku skopolaminy w ruchu jednostajnym, płynnym.
  6. Wstrzykuje się wszystkim szczurom w różnych stężeniach, przy czym 0,5 ml wstrzykuje się za każdym razem i cztery razy dziennie (o 9:00, 12:00, 15:00 i 18:00) przez kolejne 19 dni, na przemian z lewą i prawą kończyną.
    UWAGA: Grupy są nazwane w następujący sposób:
    Grupa bez bromowodorku skopolaminy: 0 grupa (kontrola)
    Grupa ze skopolaminowodorkiem bromku 2,5 mg/ml: 2,5 grupa
    Grupa z bromowodorkiem skopolaminy 5 mg/ml: 5 grupa
    Grupa ze skopolaminowodorkiem 7,5 mg/ml: grupa 7,5
  7. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj oddech i zachowanie przez 5-10 minut.

5. Test wydzielania łez (test łez Schirmera, STT)

  1. Utwórz zmodyfikowany pasek bibuły filtracyjnej dla szczurów11. Odetnij połowę paska bibuły filtracyjnej używanego dla ludzi wzdłuż linii środkowej (1 mm × 15 mm) i przytnij głowę paska, aby była gładka.
    UWAGA: Przed przeprowadzeniem testu wydzielania łez należy ręcznie przytrzymać ciało szczura, aby zapobiec ruchowi i zapewnić odsłonięcie oczu szczura.
  2. Umieść pasek bibuły filtracyjnej na zewnętrznej 1/3 worka spojówkowego dolnej powieki szczura.
  3. Czas trwania testu wynosi 5 minut. Kontroluj zamknięcie oczu szczura przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Po zmierzeniu użyj pęsety, aby zacisnąć pasek bibuły filtracyjnej w probówce mikrowirówki i zarejestrować objętość łzy, robiąc znak na ściance probówki.
  5. Zmierz wydzielanie łez w dniu 0, dniu 1, dniu 3, dniu 5, dniu 7, dniu 11, dniu 15 i dniu 19.

6. Barwienie fluoresceiną rogówki

  1. Wrzuć 0,5 μl 0,5% roztworu sodu fluoresceiny do dolnego worka spojówkowego każdego szczura.
  2. Obserwuj rogówkę w niebieskim świetle przez 3 minuty po wkropleniu fluoresceiny.
  3. Zapisz barwienie fluorescencyjne rogówki każdego szczura i obserwuj, czy występuje wada rogówki.
  4. Wykonaj barwienie fluoresceiną rogówki w dniu 0, dniu 1, dniu 3, dniu 5, dniu 7, dniu 11, dniu 15 i dniu 19.

7. Obserwacja histologiczna tkanki spojówki

  1. Po zakończeniu opracowywania modelu należy głęboko znieczulić szczury wstrzyknięciem dootrzewnowym 0,4 ml/100 g 10% wodnego wodzianu chloralu, aby złagodzić napięcie zwierząt. Następnie poddaj szczury eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Weź spojówkę opuszkową z tych samych obszarów każdego szczura, o wymiarach około 2 mm x 2 mm.
  3. Natychmiast utrwal tkanki w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny i zanurz w parafinie13.
  4. Wytnij odcinki o grubości 5 μm i zabejcuj hematoksyliną i eozyną (HE)14 i barwnikiem okresowym Schiffa (PAS) (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).

8. Obserwacja histologiczna tkanki rogówki i gruczołów łzowych

  1. Po zakończeniu opracowywania modelu należy poddać szczura eutanazji zgodnie z opisem w kroku 7.1.
  2. Weź rogówkę po prawej stronie każdego szczura i natychmiast zamocuj ją w 4% roztworze paraformaldehydu.
  3. Przetnij naskórek głowowy i tkankę podskórną wzdłuż linii łączącej ucho i zewnętrzny kącik oka, rozszerz nacięcie w obie strony i dalej izoluj żółtawy dodatkowy gruczoł oczodołowy.
  4. Dokładnie usuń sierść szczura i oddziel gruczoł pozaoczodołowy 0,9% roztworem chlorku sodu.
  5. Umieścić izolowane gruczoły zewnątrzoczodołowe w 4% roztworze paraformaldehydu na 24 godziny i zatopić w parafinie.
  6. Wytnij ciągłe odcinki o grubości ~5 μm i wybarwij je HE w przypadku próbek tkanek rogówki i gruczołów zewnątrzoczodołowych.

9. Analiza statystyczna

  1. Korzystaj z odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej danych.
    1. Wykonaj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), aby przeanalizować dane i test najmniejszej istotnej różnicy (LSD) w celu porównania między grupami. Ustaw poziom istotności statystycznej na α = 0,05, gdzie P < 0,05 oznacza istotność statystyczną.
      UWAGA: Do analizy statystycznej danych eksperymentalnych wykorzystano oprogramowanie SPSS 20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test Schirmera I, SIT I
Objętość łez u szczurów mierzono w dniach 0, 3, 5, 7, 11, 15 i 19 po rozpoczęciu eksperymentu. Wyniki eksperymentalne wykazały, że wydzielanie łez w grupach skopolaminy (grupa 2,5, grupa 5, grupa 7,5), w porównaniu z grupą kontrolną (grupa 0), było znacznie zmniejszone, a różnica ta była istotna statystycznie (P < 0,01). Nie stwierdzono istotności statystycznej pomiędzy grupą 2,5, grupą 5 a grupą 7,5 (P > 0,05). Nie zaobserwowano istotnych różnic między poszczególnymi gr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zespół suchego oka z niedoborem wody wodnistej (ADDE) jest ważnym rodzajem zespołu suchego oka, stanowiącym około 1/3 całej populacji suchego oka17, a główną przyczyną ADDE jest patologiczne uszkodzenie gruczołów łzowych i stan zapalny13. W przypadku tego typu suchego oka najczęstszymi metodami leczenia klinicznego są sztuczne łzy w celu złagodzenia objawów lub miejscowe stosowanie sterydów lub cyklosporyny18, podczas gdy istnieje niewiele opcji lecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają potencjalnych konfliktów interesów związanych z lekami i materiałami użytymi w tej procedurze.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) oraz Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór chlorku soduSJZ No.4 FarmaceutycznyH13023201
4% paraformaldehydWuhan Servicebio Technology Co., LtdG1113
Absolutny etanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
Paski okulistyczne z fluoresceiną sodowąTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-YG-I
Hematoksylina i eozynaInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengD006
Neutralny balsamBeijing Solarbio Science & Technology Co., Sp. z o.o. G8590
ParafinaPekin Solarbio Nauka & Technologia Co., Sp. z o.o.YA0012
Zestaw do barwienia kwasem okresowym i SchiffemBeyotime BiotechnologyC0142S
Paski testowe do łez SchirmeraTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-LZ-I
Bromowodorek skopolaminyShanghai Macklin Biochemical Co., LtdS860151
Mikroskop dla małych zwierzątHead Biotechnology Co,. LtdZM191
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.
1000921810023418

Bibliografia

  1. Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
  2. Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).
  3. Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).
  4. Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).
  5. Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
  6. Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
  7. Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
  8. Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
  9. Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
  10. Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
  11. Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
  12. Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
  15. Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).
  16. Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
  17. Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
  18. Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
  19. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).
  20. Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
  21. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Indukcja skopolaminątest wydzielania łezbarwienie rogówkimodel zwierzęcy szczuramorfologia spojówkiocena gruczołów łzowychuszkodzenie powierzchni okazmiany zapalne
Model suchego oka szczura z dysfunkcją gruczołów łzowych wywołaną przez skopolaminę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.