Tutaj tworzymy szczurzy model dysfunkcji gruczołów łzowych, aby zapewnić podstawę do badania suchego oka z niedoborem wody wodnistej.
Artykuł metodologiczny
Model suchego oka szczura z dysfunkcją gruczołów łzowych wywołaną przez skopolaminę
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Suche oko z niedoborem wody wodnistej (ADDE) to rodzaj choroby suchego oka, która może skutkować zmniejszeniem ilości i jakości wydzielania łez. Długotrwałe nieprawidłowe wytwarzanie łez może prowadzić do zaburzeń środowiska powierzchni oka, w tym do uszkodzenia rogówki i stanu zapalnego. W ciężkich przypadkach ADDE może spowodować utratę wzroku, a nawet ślepotę. Obecnie leczenie zespołu suchego oka ogranicza się do kropli do oczu lub fizjoterapii, które mogą jedynie złagodzić objawy dyskomfortu oczu i nie mogą zasadniczo wyleczyć zespołu suchego oka. Aby przywrócić funkcję gruczołu łzowego w suchym oku, stworzyliśmy zwierzęcy model dysfunkcji gruczołów łzowych u szczurów wywołanej przez skopolaminę. Poprzez kompleksową ocenę gruczołu łzowego, rogówki, spojówek i innych czynników, staramy się zapewnić pełne zrozumienie zmian patologicznych ADDE. W porównaniu z obecnym modelem myszy z zespołem suchego oka, ten model zwierzęcy ADDE obejmuje funkcjonalną ocenę gruczołu łzowego, zapewniając lepszą platformę do badania dysfunkcji gruczołów łzowych w ADDE.
Wprowadzenie
Do 2021 roku około 12% osób cierpi na zespół suchego oka1, co czyni go jedną z najczęstszych przewlekłych chorób oczu. Zespół suchego oka można podzielić na dwa typy: suche oko z niedoborem wody wodnistej (ADDE) i suche oko wyparne (EDE)2, w zależności od różnych czynników wpływających na chorobę. ADDE jest dalej podzielone na zespół Sjögrena (SS) i nie-SS, ale większość pacjentów z suchym okiem to pacjenci bez SS w klinicznej3. Przewlekłe objawy suchego oka poważnie wpływają na jakość widzenia pacjentów. Obecnie konwencjonalne leczenie DED polega na zastosowaniu sztucznych łez do smarowania powierzchni oka i fizjoterapii powiek. Jednak zespół suchego oka może w wielu przypadkach nie zapewnić całkowitego wyleczenia. Dlatego badanie patogenezy zespołu suchego oka ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych terapii i leków. Zwierzęce modele zespołu suchego oka stanowią podstawę do dalszych badań.
Istnieje wiele sposobów na konstruowanie zwierzęcych modeli zespołu suchego oka4, w tym zmiana poziomu wydzielania łez poprzez zmianę poziomu hormonów. Na przykład usunięcie jąder szczurów może zmniejszyć wydzielanie androgenów, zwiększyć wydzielanie łez i zmniejszyć stężenie wolnego składnika wydzielniczego (SC) i IgA we łzach5,6. Inną metodą jest wskazanie reakcji autoimmunologicznych w gruczole łzowym poprzez usunięcie nerwów z powierzchni oka, które kontrolują gruczoł. Dodatkowo, bezpośrednie zmniejszenie wydzielania łez można osiągnąć poprzez chirurgiczne usunięcie gruczołu łzowego7. Zmieniające się warunki środowiskowe mogą również przyspieszyć parowanie łez. Na przykład, hodowla zwierząt w warunkach niskiej wilgotności i suchej wentylacji może stworzyć model nadmiernego parowania suchego oka8, który można połączyć z innymi metodami w celu zwiększenia nasilenia suchego oka. Głównymi lekami stosowanymi do wywoływania zespołu suchego oka w modelach eksperymentalnych są atropina i skopolamina9. Jako inhibitory przywspółczulne, oba mogą indukować farmakologiczną blokadę receptorów cholinergicznych (muskarynowych) w gruczole łzowym i hamować wydzielanie łez. W porównaniu z zespołem suchego oka spowodowanym wstrzyknięciem atropiny do mięśni10, skopolamina ma silniejsze działanie hamujące na gruczoły wydzielnicze, dłuższy czas działania leku i słabszy wpływ na mięśnie gładkie serca, jelita cienkiego i oskrzeli. Jest to jeden z najbardziej dojrzałych leków stosowanych u modeli zwierzęcych z zespołem suchego oka.
Różne metody mogą być używane do wywołania suchego oka za pomocą skopolaminy, takie jak wstrzyknięcie podskórne, pompa lekowa lub aplikacja plastrów4,11,12. Aby zmniejszyć częstotliwość podawania leków zwierzętom doświadczalnym, wielu badaczy nakłada plastry transdermalne na ogony myszy lub stosuje pompy do leków. Jednak obie te metody mają ograniczenia. Na przykład wchłanianie plastrów transdermalnych musi uwzględniać indywidualne wchłanianie myszy, co może prowadzić do niespójnego dawkowania leków. Chociaż pompy lekowe mogą dokładnie kontrolować dawkę każdej dawki, nie zawsze są one kompatybilne z podawanym lekiem lub stosowanym stężeniem. Muszą być również umieszczone chirurgicznie – co jest bardziej inwazyjne dla zwierzęcia, wymaga znieczulenia i istnieje możliwość wystąpienia powikłań pooperacyjnych, takich jak rozejście się. Wstrzyknięcie podskórne, choć bardziej kłopotliwe, może zapewnić dokładne dawkowanie przy każdym podaniu i utrzymać spójność w podawaniu leku u różnych szczurów. Jednocześnie ma niższy koszt i nadaje się do przeprowadzania dużej liczby eksperymentów na zwierzętach.
To badanie stosuje wielokrotne podskórne wstrzykiwanie skopolaminy w celu stworzenia modelu szczura z suchym okiem. Analizujemy wskaźniki suchego oka, takie jak wady rogówki, poziom wydzielania łez oraz patologiczna morfologia rogówki, spojówki i gruczołu łzowego. Łącząc stężenie leku, objawy patologiczne i objawy suchego oka, szczegółowo omawiamy model szczura z suchym okiem, dostarczając dokładniejszych danych eksperymentalnych do badania leczenia suchego oka i mechanizmów patologicznych. Szczegółowo opisujemy również proces modelowania dla przyszłych badaczy.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane zgodnie z tym protokołem są przeprowadzane za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
1. Przygotowanie zwierząt
- Przygotuj 12 zdrowych 6-tygodniowych samic szczurów SPF Wistar o wadze 160 g ± 20 g.
- Użyj lampy szczelinowej i oftalmoskopu, aby zbadać stan oczu wszystkich szczurów, upewniając się, że nie ma chorób przedniego odcinka lub siatkówki.
- Wychowuj wszystkie szczury przez 1 tydzień z wystarczającą ilością pożywienia i wody.
- Losowo podzielono wszystkie szczury na grupy o normalnym stężeniu skopolaminy 2,5 mg / ml, stężeniu leku skopolaminy 5 mg / ml i stężeniu skopolaminy 7,5 mg / ml, po trzy zwierzęta w każdej grupie.
2. Przygotowanie roztworu
- Przygotować bromowodorek skopolaminy, rozpuszczając go w 0,9% roztworze chlorku sodu w celu uzyskania roztworu o stężeniach 7,5 mg/ml, 5 mg/ml i 2,5 mg/ml.
- Przygotować 0,9% roztwór chlorku sodu bez bromowodorku skopolaminy do użycia jako wstrzyknięcie dla grupy kontrolnej szczurów.
3. Przygotowanie sprzętu i materiałów
- Przygotuj mikroskop dla małych zwierząt.
- Przygotuj materiały do eksperymentu, w tym jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą (26 G); paski okulistyczne z fluoresceiną sodową; Pasek testowy do łez Schirmera; etanol absolutny; 4% paraformaldehydu; ksylen; neutralny balsam; hematoksylina, eozyna; i zestaw do barwienia kwasem okresowym Schiffa.
4. Wstrzyknięcie podskórne
UWAGA: Ta procedura wymaga pomocy drugiej osoby, która pomoże zabezpieczyć szczury.
- Trzymaj ciało szczura stabilnie i chwyć i rozciągnij jego lewe (lub prawe) tylne nogi.
UWAGA: Asystent może pomóc w trzymaniu zwierzęcia. - Oczyścić miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
- Włożyć jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą (26 G) u podstawy fałdu skórnego między kciukiem a palcem.
- Zassać strzykawkę, odciągając tłok strzykawki. Krew w strzykawce wskazuje na niewłaściwe umieszczenie igły; Wyjąć igłę i zmienić jej położenie.
- Podawać 0,9% roztwór chlorku sodu z bromowodorkiem skopolaminy lub bez bromowodorku skopolaminy w ruchu jednostajnym, płynnym.
- Wstrzykuje się wszystkim szczurom w różnych stężeniach, przy czym 0,5 ml wstrzykuje się za każdym razem i cztery razy dziennie (o 9:00, 12:00, 15:00 i 18:00) przez kolejne 19 dni, na przemian z lewą i prawą kończyną.
UWAGA: Grupy są nazwane w następujący sposób:
Grupa bez bromowodorku skopolaminy: 0 grupa (kontrola)
Grupa ze skopolaminowodorkiem bromku 2,5 mg/ml: 2,5 grupa
Grupa z bromowodorkiem skopolaminy 5 mg/ml: 5 grupa
Grupa ze skopolaminowodorkiem 7,5 mg/ml: grupa 7,5 - Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj oddech i zachowanie przez 5-10 minut.
5. Test wydzielania łez (test łez Schirmera, STT)
- Utwórz zmodyfikowany pasek bibuły filtracyjnej dla szczurów11. Odetnij połowę paska bibuły filtracyjnej używanego dla ludzi wzdłuż linii środkowej (1 mm × 15 mm) i przytnij głowę paska, aby była gładka.
UWAGA: Przed przeprowadzeniem testu wydzielania łez należy ręcznie przytrzymać ciało szczura, aby zapobiec ruchowi i zapewnić odsłonięcie oczu szczura. - Umieść pasek bibuły filtracyjnej na zewnętrznej 1/3 worka spojówkowego dolnej powieki szczura.
- Czas trwania testu wynosi 5 minut. Kontroluj zamknięcie oczu szczura przez cały czas trwania zabiegu.
- Po zmierzeniu użyj pęsety, aby zacisnąć pasek bibuły filtracyjnej w probówce mikrowirówki i zarejestrować objętość łzy, robiąc znak na ściance probówki.
- Zmierz wydzielanie łez w dniu 0, dniu 1, dniu 3, dniu 5, dniu 7, dniu 11, dniu 15 i dniu 19.
6. Barwienie fluoresceiną rogówki
- Wrzuć 0,5 μl 0,5% roztworu sodu fluoresceiny do dolnego worka spojówkowego każdego szczura.
- Obserwuj rogówkę w niebieskim świetle przez 3 minuty po wkropleniu fluoresceiny.
- Zapisz barwienie fluorescencyjne rogówki każdego szczura i obserwuj, czy występuje wada rogówki.
- Wykonaj barwienie fluoresceiną rogówki w dniu 0, dniu 1, dniu 3, dniu 5, dniu 7, dniu 11, dniu 15 i dniu 19.
7. Obserwacja histologiczna tkanki spojówki
- Po zakończeniu opracowywania modelu należy głęboko znieczulić szczury wstrzyknięciem dootrzewnowym 0,4 ml/100 g 10% wodnego wodzianu chloralu, aby złagodzić napięcie zwierząt. Następnie poddaj szczury eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Weź spojówkę opuszkową z tych samych obszarów każdego szczura, o wymiarach około 2 mm x 2 mm.
- Natychmiast utrwal tkanki w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny i zanurz w parafinie13.
- Wytnij odcinki o grubości 5 μm i zabejcuj hematoksyliną i eozyną (HE)14 i barwnikiem okresowym Schiffa (PAS) (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
8. Obserwacja histologiczna tkanki rogówki i gruczołów łzowych
- Po zakończeniu opracowywania modelu należy poddać szczura eutanazji zgodnie z opisem w kroku 7.1.
- Weź rogówkę po prawej stronie każdego szczura i natychmiast zamocuj ją w 4% roztworze paraformaldehydu.
- Przetnij naskórek głowowy i tkankę podskórną wzdłuż linii łączącej ucho i zewnętrzny kącik oka, rozszerz nacięcie w obie strony i dalej izoluj żółtawy dodatkowy gruczoł oczodołowy.
- Dokładnie usuń sierść szczura i oddziel gruczoł pozaoczodołowy 0,9% roztworem chlorku sodu.
- Umieścić izolowane gruczoły zewnątrzoczodołowe w 4% roztworze paraformaldehydu na 24 godziny i zatopić w parafinie.
- Wytnij ciągłe odcinki o grubości ~5 μm i wybarwij je HE w przypadku próbek tkanek rogówki i gruczołów zewnątrzoczodołowych.
9. Analiza statystyczna
- Korzystaj z odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej danych.
- Wykonaj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), aby przeanalizować dane i test najmniejszej istotnej różnicy (LSD) w celu porównania między grupami. Ustaw poziom istotności statystycznej na α = 0,05, gdzie P < 0,05 oznacza istotność statystyczną.
UWAGA: Do analizy statystycznej danych eksperymentalnych wykorzystano oprogramowanie SPSS 20.
- Wykonaj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), aby przeanalizować dane i test najmniejszej istotnej różnicy (LSD) w celu porównania między grupami. Ustaw poziom istotności statystycznej na α = 0,05, gdzie P < 0,05 oznacza istotność statystyczną.
Wyniki
Test Schirmera I, SIT I
Objętość łez u szczurów mierzono w dniach 0, 3, 5, 7, 11, 15 i 19 po rozpoczęciu eksperymentu. Wyniki eksperymentalne wykazały, że wydzielanie łez w grupach skopolaminy (grupa 2,5, grupa 5, grupa 7,5), w porównaniu z grupą kontrolną (grupa 0), było znacznie zmniejszone, a różnica ta była istotna statystycznie (P < 0,01). Nie stwierdzono istotności statystycznej pomiędzy grupą 2,5, grupą 5 a grupą 7,5 (P > 0,05). Nie zaobserwowano istotnych różnic między poszczególnymi grupami pod względem liczby dni (P > 0,05) (Rysunek 1, Tabela 1).
Barwienie rogówki fluoresceiną
Barwienie rogówki fluoresceiną przeprowadzono w dniach 0, 3, 5, 7, 11, 15 i 19 eksperymentu. Wyniki wykazały brak barwienia fluoresceiną w żadnej z grup, co wskazuje, że podczas 20-dniowego eksperymentu z zastosowaniem różnych stężeń skopolaminy nie powstały żadne wyraźne defekty nabłonka rogówki (Rycina 2).
Analiza patomorfologiczna nabłonka rogówki
Po zakończeniu eksperymentu pobrano tkanki rogówki od każdego szczura do barwienia HE, aby zaobserwować morfologię nabłonka rogówki i zmierzyć grubość warstwy nabłonka rogówki. Nabłonek rogówki w grupie kontrolnej składał się z 4-6 warstw uporządkowanych komórek nabłonkowych, z których warstwa podstawna składała się z pojedynczej warstwy regularnie i ściśle ułożonych kolumnowych komórek nabłonkowych. Nabłonek rogówki w grupach podanych skopolaminą w dawkach 2,5, 5 i 7 był znacznie cieńszy niż w grupie kontrolnej, wykazując spłaszczoną i zanikową morfologię komórek oraz zaburzoną strukturę komórkową. W grupie 7,5 zaobserwowano luźne połączenia międzykomórkowe oraz struktury wakuolarne w warstwie podstawnej (wskazane czerwoną strzałką na Rysunku 3). W porównaniu z nabłonkiem rogówki w grupach z zastosowaniem skopolaminy, nabłonek rogówki w grupie kontrolnej wykazał statystyczne różnice w grubości warstwy nabłonka rogówki (Rysunek 4).
Analiza patologiczna gruczołu łzowego
Głównym gruczołem odpowiedzialnym za wydzielanie łez u szczurów jest pozagałkowy gruczoł łzowy15. Podczas obserwacji skrawków gruczołu łzowego odnotowano zmiany w morfologii komórek nabłonka gruczołu łzowego wraz ze wzrostem stężenia skopolaminy, którym towarzyszył stan zapalny i obrzęk tkanki. W grupie kontrolnej nie zaobserwowano takich zmian. Wyniki badania patomorfologicznego sugerują, że zmiany zapalne gruczołu łzowego, obrzęk komórek oraz zanik komórek nabłonka gruczołowego mogą służyć jako wskaźniki funkcjonalnego uszkodzenia gruczołu łzowego16 (Tabela 2). Wskaźniki te mogą być wykorzystane do pomiaru nasilenia zespołu suchego oka w odniesieniu do ilości wydzielanego łez (Rysunek 5).
Analiza wyników barwienia spojówki
Struktura spojówki w grupie kontrolnej jest kompletna, składa się głównie z warstwy powierzchniowej i blaszki właściwej. Warstwa powierzchniowa tworzona jest przez warstwowy nabłonek kolumnowy, gładki i kompletny, z mikrokosmkami na powierzchni komórek. Pomiędzy komórkami nabłonka występowały rozproszone komórki kubkowe o dużej objętości i ziarnistościach śluzowych w cytoplazmie. Warstwa powierzchniowa nabłonka spojówki w trzech grupach otrzymujących skopolaminę była znacznie cieńsza, liczba mikrokosmków i komórek kubkowych była zredukowana, a struktura rozmieszczenia komórek niepełna, z towarzyszącym obrzękiem oraz niewielką ilością komórek zapalnych, co zaobserwowano w barwieniu HE (Rysunek 6).
Poprzez barwienie spojówek metodą PAS obliczono średnią liczbę komórek kubkowych na pole widzenia mikroskopu przy powiększeniu 40x w trzech niezależnych próbkach od każdej myszy, a następnie przedstawiono ją jako średnią ± SD (Rycina 7).
Rysunek 1: Statystyka wartości testu Schirmera w każdej grupie (mm) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Barwienie rogówki szczura fluoresceinianem sodu. W 20-dniowym eksperymencie z zastosowaniem fluoresceinianu sodu nie zaobserwowano żadnych wyników dodatnich w rogówkach wszystkich szczurów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Barwienie i pomiar grubości nabłonka rogówki. W grupie 7,5 zaobserwowano luźne połączenia międzykomórkowe oraz strukturę wakuolarną w warstwie podstawnej (wskazana czerwoną strzałką) Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Statystyka grubości nabłonka rogówki w każdej grupie. W porównaniu z nabłonkiem rogówki w grupach skopolaminy, nabłonek rogówki w normalnej grupie kontrolnej wykazał różnice statystyczne w grubości warstwy nabłonka rogówki. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Wyniki barwienia HE gruczołu łzowego pozagałkowego szczurów. (A) Grupa 0: W polu widzenia gruczoły łzowe wykazują strukturę pęcherzykową i składają się z przewodów oraz gruczołów cewkowych, bez wyraźnych nieprawidłowości w morfologii przewodów, podczas gdy gruczoły cewkowe składają się z stożkowatych komórek gruczołowych z obfitą ilością substancji śluzowych w cytoplazmie; nie stwierdzono wyraźnego obrzęku w tkankach łącznych, wyraźnych nieprawidłowości w naczyniach krwionośnych śródmiąższowych ani wyraźnej nekrozy i infiltracji komórek zapalnych. (B) Grupa 2,5: W polu widzenia obserwuje się sporadyczny zanik komórek nabłonkowych gruczołu łzowego, z zmniejszoną objętością, nieregularnie ukształtowanymi, rozszerzonymi jamami gruczołowymi oraz zmniejszoną ilością substancji śluzowej wewnątrz jamy (wskazana czerwoną strzałką). W zrębie występuje również sporadyczna infiltracja wolnych limfocytów (wskazana niebieską strzałką), jednak nie zaobserwowano wyraźnych nieprawidłowości w morfologii przewodów ani oznak obrzęku. (C) Grupa 5: W polu widzenia komórki nabłonka łzowego były sporadycznie zanikłe i zmniejszone pod względem wielkości, jama gruczołowa była powiększona, ilość substancji śluzowej w jamie była zmniejszona (czerwona strzałka), sporadycznie obserwowano infiltrację wolnych limfocytów w zrębie (niebieska strzałka), a między pęcherzykami gruczołu łzowego nie zaobserwowano wyraźnych nieprawidłowości w morfologii przewodów ani obrzęku tkanki łącznej. (D) Grupa 7,5: W polu widzenia widoczny jest obrzęk; odstępy między gruczołami łzowymi są poszerzone, a ich układ nieregularny (zielona strzałka), komórki nabłonkowe gruczołów łzowych są często zanikłe, ich objętość ulega zmniejszeniu, a kształt staje się nieregularny (żółta strzałka), sporadycznie jama gruczołowa jest powiększona, ilość materii śluzowej w jamie jest zmniejszona (czerwona strzałka), sporadycznie występuje infiltracja wolnych limfocytów (niebieska strzałka), bez wyraźnych nieprawidłowości w morfologii przewodów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Barwienie HE spojówki szczura. W porównaniu z nabłonkiem spojówki w grupie kontrolnej, we wszystkich trzech grupach z nabłonkiem spojówki poddanym działaniu skopolaminy zaobserwowano różny stopień uszkodzeń strukturalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Barwienie PAS spojówki. (A) Szczury z grupy kontrolnej. (B) Szczury z grupy skopolaminy. (C) Gęstość komórek kubkowych w każdej grupie (powiększenie 20x). Czarny pasek = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| test Schirmera I, SIT (wartość średnia, jednostka [mm]) | |||||||
| Grupa | 0 dni | 3 dni | 5 dni | 7 dni | 11 dni | 15 dni | 19 dni |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
Tabela 1: Test Schirmera u szczurów w czterech grupach w różnych punktach czasowych (mm). Po zastosowaniu leku wydzielanie łez u szczurów uległo znacznemu zmniejszeniu.
| Numer | Nekroza | Stan zapalny | Obrzęk | Atrofia nabłonka |
| 0 Grp-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 Grp -3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 Grp -3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 Grp -2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 Grp -3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
Tabela 2: Ocena patologiczna tkanki gruczołu łzowego szczura. Kryteria oceny: 0: W warunkach prawidłowych, biorąc pod uwagę takie czynniki jak wiek, płeć i szczep zwierzęcia, tkanka jest uznawana za prawidłową;
1: Obserwowane zmiany właśnie przekroczyły zakres normy; 2: Można zaobserwować zmiany chorobowe, ale nie są one jeszcze nasilone; 3: Zmiany chorobowe są wyraźne i nadal postępują; 4: Zmiany chorobowe są bardzo nasilone i objęły całą tkankę16.
Dyskusja
Zespół suchego oka z niedoborem wody wodnistej (ADDE) jest ważnym rodzajem zespołu suchego oka, stanowiącym około 1/3 całej populacji suchego oka17, a główną przyczyną ADDE jest patologiczne uszkodzenie gruczołów łzowych i stan zapalny13. W przypadku tego typu suchego oka najczęstszymi metodami leczenia klinicznego są sztuczne łzy w celu złagodzenia objawów lub miejscowe stosowanie sterydów lub cyklosporyny18, podczas gdy istnieje niewiele opcji leczenia uszkodzenia gruczołu łzowego. Dlatego bardzo ważne jest zbadanie wpływu rekonstrukcji funkcji gruczołów łzowych na zespół suchego oka i ustalenie zwierzęcego modelu dysfunkcji gruczołów łzowych. Zastosowaliśmy metodę wielokrotnego stosowania leków w celu zahamowania wydzielania gruczołu łzowego u szczurów i stworzyliśmy model zwierzęcy z przewlekłą dysfunkcją gruczołów łzowych z suchym okiem.
Do skonstruowania tego modelu suchego oka wybraliśmy szczury, który ma więcej zalet w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi19. Na przykład króliki mają większy rozmiar ciała i wymagają większych dawek leków lub częstszych zastrzyków, aby osiągnąć pożądany efekt. Co więcej, króliki są nieco droższe, co oznacza większe koszty eksperymentu. Myszy są również powszechnie wykorzystywane w badaniach okulistycznych, ale są one zwykle używane do konstruowania modeli zespołu Sjögrena20. Modele te koncentrują się na porównaniu zapalenia narządów i infiltracji limfocytów w celu zbadania mechanizmów immunopatologicznych. Myszy mają małe rozmiary ciała, złożoną anatomię gruczołów łzowych i niskie wydzielanie łez, co utrudnia dokładne odzwierciedlenie produkcji łez. Model zwierzęcy szczura jest bardziej odpowiednim modelem suchego oka, ponieważ pozwala na wygodne wstrzykiwanie leków, ma stosunkowo proste warunki żywienia, nadaje się zarówno do badań klinicznych, jak i eksperymentalnych, a także ma zalety pod względem kosztów. Jest to dobry model zwierzęcy dla ADDE.
Zastosowaliśmy bloker receptora cholinergicznego skopolaminę, aby zahamować receptory cholinergiczne w ciele szczura, zmniejszając wydzielanie gruczołów łzowych i zmieniając patologiczną strukturę komórek gruczołów łzowych, co zasadniczo symuluje stan gruczołów łzowych u pacjentów z suchym okiem. W porównaniu z innymi metodami, podejście to lepiej symuluje uszkodzony stan gruczołów łzowych w stanie naturalnym. Inne metody, takie jak stosowanie kropli do oczu z chlorkiem benzalkoniowym21 lub zmiana warunków zewnętrznych, takich jak zmniejszenie wilgotności i zwiększenie parowania powierzchni oka 4,8, zaburzają jedynie środowisko powierzchni oka i nie zmieniają stanu funkcjonalnego gruczołu łzowego. Dlatego nie nadają się do długotrwałych, przewlekłych schorzeń suchego oka.
Mierząc objętość wydzieliny łez u szczurów, ulepszyliśmy paski testowe na łzy Schirmera. Najpierw przecinamy pasek testowy do łez używany przez ludzi wzdłuż linii środkowej. Następnie przycięliśmy górę do okrągłego łuku i delikatnie złożyliśmy ją z powrotem u góry, aby ułatwić łatwe włożenie do dolnego worka spojówkowego szczura. Należy zauważyć, że szczury są aktywne i trudno jest zmierzyć łzy przez 5 minut. Po włożeniu paska do badania łez Schirmera do dolnego worka spojówkowego szczura, ręcznie zamknęliśmy oczy szczura, aby zwiększyć jego komfort i uniknąć zmagań podczas długiego pomiaru łez, co może mieć wpływ na wyniki pomiaru.
Podczas ekstrakcji gruczołu łzowego należy go najpierw zlokalizować. Punkt lokalizacji gruczołu łzowego to punkt środkowy między przednią częścią ucha a wewnętrzną kantuacją. Następnie przetnij tkankę skórną pod futrem, minimalizując wnikanie rozdrobnionego futra i zmniejszając proces obsługi w późniejszym etapie. Podczas procesu ekstrakcji ważne jest również, aby w odpowiednim czasie oczyścić rozdrobnione futro. Szczególnie podczas oddzielania gruczołu łzowego należy użyć soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub soli fizjologicznej, aby wielokrotnie płukać i unikać mieszania z innymi tkankami, które mogą wpłynąć na wyniki cięcia.
Zaletą opracowanego modelu zwierzęcego suchego oka jest to, że protokół korelował różne stężenia leków z różnym stopniem uszkodzenia gruczołów łzowych. Stanowi to eksperymentalną podstawę do badań nad leczeniem dysfunkcji gruczołów łzowych. Udoskonaliliśmy niektóre etapy operacyjne w procesie modelowania, aby zapewnić bardziej szczegółowe materiały referencyjne dla badacza. Ponadto dodaliśmy wskaźniki analityczne dla modelu zwierzęcego suchego oka, obejmujące wskaźniki morfologiczne rogówki, spojówki i gruczołu łzowego, liczenie komórek spojówek i ocenę stopnia uszkodzenia gruczołów łzowych. Oceniliśmy czynność gruczołów łzowych pod kątem stanu zapalnego, obrzęku i atrofii. Wybraliśmy najbardziej kompleksowe, opłacalne i dokładne metody analizy, aby odzwierciedlić stopień zespołu suchego oka i dysfunkcji gruczołów łzowych.
Jednak nasza metoda ma również pewne ograniczenia. Ze względu na długotrwały proces konstruowania modeli zwierzęcych, eksperymentatorzy muszą wielokrotnie wstrzykiwać. Chociaż obecnie istnieją pewne metody zastępujące zastrzyki manualne, takie jak pompki do leków lub plastry transdermalne, nadal występują pewne komplikacje w ich stosowaniu. Naszym kolejnym celem jest zastosowanie lepszych metod w celu zmniejszenia częstotliwości przyjmowania leków, uniknięcia wystąpienia powikłań i zapewnienia dokładności dawkowania. Podsumowując, ulepszyliśmy zwierzęcy model suchego oka spowodowany wstrzyknięciem skopolaminy, zapewniając eksperymentalną podstawę do badań nad dysfunkcją gruczołów łzowych w ADDE.
Oświadczenia
Autorzy nie mają potencjalnych konfliktów interesów związanych z lekami i materiałami użytymi w tej procedurze.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Guangdong Provincial High-level Clinical Key Specialties (SZGSP014) oraz Shenzhen Natural Science Foundation (JCYJ20210324125805012).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% roztwór chlorku sodu | SJZ No.4 Farmaceutyczny | H13023201 | |
| 4% paraformaldehyd | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd | G1113 | |
| Absolutny etanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Paski okulistyczne z fluoresceiną sodową | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-YG-I | |
| Hematoksylina i eozyna | Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng | D006 | |
| Neutralny balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Sp. z o.o. | G8590 | |
| Parafina | Pekin Solarbio Nauka & Technologia Co., Sp. z o.o. | YA0012 | |
| Zestaw do barwienia kwasem okresowym i Schiffem | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| Paski testowe do łez Schirmera | Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd | YN-LZ-I | |
| Bromowodorek skopolaminy | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | S860151 | |
| Mikroskop dla małych zwierząt | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. |
Bibliografia
- Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
- Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133(2015).
- Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309(2014).
- Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102(2021).
- Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
- Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
- Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
- Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
- Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
- Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
- Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
- Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483(2018).
- Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
- Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
- Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
- Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394(2021).
- Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
- Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
Przedruki i uprawnienia
