Artykuł metodologiczny

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66047

⸱

21 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Streszczenie

Ścięgna i więzadła (T/L) są silnymi, hierarchicznie zorganizowanymi strukturami łączącymi układ mięśniowo-szkieletowy. Tkanki te mają ściśle ułożoną macierz zewnątrzkomórkową bogatą w kolagen typu I (ECM) i komórki linii T / L umieszczone głównie w równoległych rzędach. Po urazie T/L wymagają długiego czasu na rehabilitację, co wiąże się z dużym ryzykiem niepowodzenia i często niezadowalającymi wynikami naprawy. Pomimo ostatnich postępów w badaniach nad biologią T/L, jednym z pozostałych wyzwań jest to, że w polu T/L nadal brakuje ustandaryzowanego protokołu różnicowania, który byłby w stanie podsumować proces powstawania T/L in vitro. Na przykład różnicowanie kości i tłuszczu mezenchymalnych komórek prekursorowych wymaga jedynie standardowej dwuwymiarowej (2D) hodowli komórkowej i dodania specyficznych pożywek stymulacyjnych. W celu różnicowania do chrząstki konieczna jest trójwymiarowa (3D) hodowla granulek i suplementacja TGFß. Jednak różnicowanie komórek do ścięgien wymaga bardzo uporządkowanego modelu hodowli 3D, który w idealnym przypadku powinien być również poddawany dynamicznej stymulacji mechanicznej. Ustaliliśmy 3-etapowy model organoidów (ekspansja, stymulacja i dojrzewanie), aby utworzyć strukturę przypominającą pręcik 3D z samodzielnie zmontowanego arkusza komórkowego, który zapewnia naturalne mikrośrodowisko z własnymi czynnikami ECM, autokrynnymi i parakrynnymi. Te przypominające pręciki organoidy mają wielowarstwową architekturę komórkową w bogatym ECM i mogą być dość łatwo obsługiwane w przypadku narażenia na statyczne obciążenia mechaniczne. Tutaj zademonstrowaliśmy 3-etapowy protokół przy użyciu dostępnych na rynku fibroblastów skórnych. Mogliśmy wykazać, że ten typ komórek tworzy wytrzymałe i obfite w ECM organoidy. Opisana procedura może być dodatkowo zoptymalizowana pod względem pożywek hodowlanych i zoptymalizowana pod kątem dynamicznej osiowej stymulacji mechanicznej. W ten sam sposób alternatywne źródła komórek mogą być testowane pod kątem ich potencjału do tworzenia organoidów T/L, a tym samym do różnicowania T/L. Podsumowując, sprawdzone podejście organoidowe 3D T/L może być wykorzystane jako model do podstawowych badań nad ścięgnami, a nawet do inżynierii T/L bez rusztowań.

Wprowadzenie

Ścięgna i więzadła (T/L) są istotnymi elementami układu mięśniowo-szkieletowego, które zapewniają niezbędne wsparcie i stabilność ciała. Pomimo swojej kluczowej roli, te tkanki łączne są podatne na degenerację i urazy, powodując ból i upośledzenie mobilności1. Co więcej, ich ograniczony dopływ krwi i powolna zdolność gojenia mogą prowadzić do przewlekłych urazów, podczas gdy czynniki takie jak starzenie się, powtarzalne ruchy i niewłaściwa rehabilitacja dodatkowo zwiększają ryzyko zwyrodnień i kontuzji2. Konwencjonalne metody leczenia, takie jak odpoczynek, fizjoterapia i interwencje chirurgiczne, nie są w stanie w pełni przywrócić struktury i funkcji T/L. W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy starali się lepiej zrozumieć skomplikowaną naturę T/L, aby znaleźć skuteczne metody leczenia zaburzeń T/L3,4,5. T/L wyróżniają się hierarchicznie zorganizowaną, zdominowaną przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) strukturą, składającą się głównie z włókien kolagenowych typu I i proteoglikanów, cecha trudna do odtworzenia in vitro6. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) modele hodowli komórkowych nie są w stanie uchwycić charakterystycznej trójwymiarowej (3D) organizacji tkanek T/L, ograniczając ich potencjał translacyjny, a także utrudniając innowacyjny postęp w dziedzinie regeneracji T/L.

Ostatnio, rozwój 3D modeli organoidowych zaoferował nowe możliwości rozwoju badań podstawowych i inżynierii tkankowej różnych typów tkanek bez rusztowań7,8,9,10,11,12,13. Na przykład, aby zbadać połączenie mięśniowo-ścięgniste, Larkin i in. 2006 opracowali konstrukcje mięśni szkieletowych 3D wraz z samoorganizującymi się segmentami ścięgien pochodzącymi ze ścięgna ogona szczura10. Co więcej, Schiele i in. 2013, wykorzystując mikroobrabiane kanały wzrostu pokryte fibronektyną, skierowali samoorganizację ludzkich fibroblastów skóry w celu utworzenia włókien komórkowych bez pomocy rusztowania 3D, podejścia, które może uchwycić kluczowe cechy rozwoju ścięgien embrionalnych11. W badaniu przeprowadzonym przez Florida i wsp. 2016 komórki zrębu szpiku kostnego zostały najpierw rozszerzone na linie kości i więzadeł, a następnie wykorzystane do wygenerowania samoorganizujących się jednowarstwowych arkuszy komórkowych, które następnie zaimplementowano w celu stworzenia wielofazowego konstruktu kość-więzadło-kość naśladującego natywne więzadło krzyżowe przednie, model mający na celu lepsze zrozumienie regeneracji więzadeł12. Aby wyjaśnić procesy mechanotransdukcji ścięgien, Mubyana i in. 2018 wykorzystali metodologię bez rusztowań, w której pojedyncze włókna ścięgien zostały stworzone i poddane mechanicznemu obciążeniu protocol13. Organoidy to samoorganizujące się struktury 3D, które naśladują natywną architekturę, mikrośrodowisko i funkcjonalność tkanek. Hodowle organoidów 3D zapewniają bardziej fizjologicznie istotny model do badania biologii tkanek i narządów, a także patofizjologii. Takie modele mogą być również wykorzystywane do indukowania specyficznego dla tkanki różnicowania różnych typów komórek macierzystych/progenitorowych14,15. W związku z tym implementacja modeli 3D organoidów w dziedzinie biologii T/L i inżynierii tkankowej staje się bardzo atrakcyjnym podejściem9,16. Alternatywne źródła komórek mogą być wykorzystywane do składania organoidów i stymulowane w kierunku różnicowania tenogenicznego. Jednym z istotnych typów komórek wykorzystanych do demonstracji w tym badaniu są fibroblasty skórne7,17,18. Komórki te są łatwo dostępne dzięki procedurze biopsji skóry, która jest mniej inwazyjna w porównaniu z nakłuciem szpiku kostnego lub liposukcją i może być dość szybko namnażana do dużej liczby ze względu na ich dobrą zdolność proliferacyjną. W przeciwieństwie do tego, bardziej wyspecjalizowane typy komórek, takie jak fibroblasty rezydujące w T/L, są trudniejsze do wyizolowania i namnażania. W związku z tym fibroblasty skórne zostały również wykorzystane jako punkt wyjścia dla technologii przeprogramowania komórek w kierunku indukowanych pluripotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych19. Poddawanie fibroblastów skóry specyficznym warunkom hodowli 3D i sygnałom sygnalizacyjnym, takim jak transformujący czynnik wzrostu-beta 3 (TGFß3), który, jak doniesiono, działa jako kluczowy regulator różnych procesów komórkowych, w tym tworzenia i utrzymywania T/L, może nasilać ich różnicowanie tenogenne in vitro, prowadząc do ekspresji genów specyficznych dla ścięgien i odkładania się typowych dla T / L ECM20, 21.

Tutaj opisujemy i demonstrujemy wcześniej ustalony i zaimplementowany 3-etapowy (ekspansja 2D, stymulacja 2D i dojrzewanie 3D) protokół organoidowy wykorzystujący dostępne na rynku normalne dorosłe ludzkie fibroblasty skórne (NHDF) jako źródło komórek, oferując cenny model do badania tenogenezy in vitro7. Pomimo faktu, że model ten nie jest równoważny z tkanką T/L in vivo, nadal zapewnia bardziej fizjologicznie istotny system, który można wykorzystać do badania mechanizmów różnicowania komórkowego, naśladowania patofizjologii T/L in vitro oraz ustanawiania spersonalizowanej medycyny T/L i platform badań przesiewowych leków. Co więcej, w przyszłości badania mogą ocenić, czy organoidy 3D nadają się do inżynierii T/L bez rusztowań poprzez dalszą optymalizację, a także można je wykorzystać do opracowania skalowalnych, odpornych mechanicznie konstrukcji, które bardzo przypominają wymiary oraz właściwości strukturalne i biofizyczne natywnych tkanek T/L.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być przeprowadzone przy użyciu technik aseptycznych.

1. Kultura i pre-ekspansja NHDF

  1. Szybko rozmrozić kriofiolkę zawierającą dorosłe kriokonserwowane normalne ludzkie fibroblasty skórne (NHDF, 1 x 106 komórek) w temperaturze 37 °C, aż do momentu, gdy będą prawie rozmrożone.
  2. Powoli dodawać do komórek 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej fibroblastów 2 (gotowy do użycia zestaw zawierający podłoże podstawowe, 2% płodową surowicę cielęcą (FCS), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i insulinę) uzupełnioną 1% penicyliną/streptomycyną (pióro/paciorkowiec) (pożywka NHDF), wstępnie podgrzaną w temperaturze 37 °C.
  3. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 12 ml wstępnie podgrzanej pożywki NHDF.
  5. Przenieść komórki do kolby T-75 i krótko wstrząsnąć w kierunku poprzecznym. Umieścić kolbę T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
  6. Zmieniaj podłoże co 2 dni. Obserwuj NHDF pod mikroskopem, aż osiągną 70% - 80% konfluencji.

2. Rozszerzenie 2D

  1. Wyjąć kolbę T-75 z inkubatora i usunąć pożywkę NHDF. Umyj komórki wstępnie podgrzanym buforem fosforanowym soli fizjologicznej (PBS).
  2. Dodaj 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 do momentu odłączenia komórek od kolby (około 3 min).
  3. Dodaj 6 ml podgrzanej pożywki NHDF, aby zneutralizować działanie trypsyny. Przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1x aminokwasami MEM, 1% pióra / paciorkowca, wstępnie podgrzanymi w temperaturze 37 °C.
  6. Umieść NHDF w 10 cm przylegającym naczyniu do hodowli komórkowych o gęstości 8 x 103 NHDFs/cm2 (w sumie 4,4 x 105 NHDF na 10 cm szalkę). Delikatnie kołysz się w poprzek.
  7. Umieścić 10 cm naczynie do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 dni
  8. Monitoruj komórki pod mikroskopem aż do osiągnięcia 100% zbiegu (ok. 5 dni).

3. Stymulacja 2D

  1. Wyjąć z inkubatora 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych zawierające NHDF (z etapów 2.6 i 2.7). Usunąć pożywkę hodowlaną i umyć komórki wstępnie podgrzanym PBS.
  2. Dodać 10 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS, 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 1% pióra/paciorkowca, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C.
  3. Umieścić szalkę Petriego w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 dni.
  4. Monitoruj NHDF pod mikroskopem przez 14 dni.

4. 3D dojrzewanie

  1. Wyjąć z inkubatora 10-centymetrowe naczynie do hodowli komórkowych i wyjąć pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy.
  2. Delikatnie i szybko odłącz uformowany arkusz komórek od naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Podczas odłączania jednocześnie zwiń arkusz komórki w organoid 3D przypominający pręt.
  3. Podnieść i umieścić organoidy NHDF na 10 cm, nieprzylegającej (do komórek) szalce Petriego. Ten typ naczynia służy do uniknięcia migracji komórek z organoidu do plastiku.
  4. W tym momencie lub dzień po (dzień 0 lub dzień 1 dojrzewania 3D) zbierz niektóre organoidy do dalszych analiz, takich jak mokra masa, ocena histologiczna (preferowane są organoidy z dnia 1, ponieważ stają się bardziej zwarte), izolacja RNA i białka.
  5. Przymocuj krawędzie organoidu za pomocą metalowych kołków w następujący sposób:
    1. Ostrożnie przytrzymaj jedną stronę organoidu pęsetą, a drugą pęsetą delikatnie zastosuj ręczne rozciąganie o około 10% wydłużeniu osiowym. Aby oszacować wydłużenie osiowe o 10%, użyj milimetrowego papieru lub linijki.
    2. Następnie podnieś jedną metalową szpilkę pęsetą i ręcznie dociśnij krawędź organoidu do plastikowego naczynia, aby ją zamocować. Powtórz tę procedurę z drugą szpilką na drugiej krawędzi organoidu.
  6. Dodać 10 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS, 1x aminokwasami MEM, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 ng/ml TGFß3 i 1% pióra/paciorkowca, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C.
  7. Umieść 10 cm naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 dni.
  8. Regularnie monitorować organoidy przez 14 dni.
    UWAGA: Kołki mogą się poluzować, dlatego należy je ponownie naprawić, stosując tę samą technikę, jak opisano w kroku 4.5.
  9. Po 14 dniach usuń pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy z organoidów. Umyj organoidy wstępnie podgrzanym PBS.
  10. Zmierzyć organoidy w mokrej masie w dniu 0 i dniu 14 za pomocą precyzyjnej wagi.
    1. Umieść pustą 10-centymetrową szalkę na wadze i wytaruj wagę do zera, aby upewnić się, że mierzona jest tylko waga organoidów. Całkowicie wyjąć pożywkę hodowlaną z 10-centymetrowej płytki i odmierzyć mokrą masę organoidu jeden po drugim.
      UWAGA: W tym badaniu, w dniu 0, zważono trzy organoidy na dawcę, a w dniu 14 zważono dwa organoidy na dawcę.
  11. Zgodnie z celami badania, niektóre organoidy NHDF należy wdrożyć do dalszych analiz histologicznych lub natychmiast zamrozić je w ciekłym azocie za pomocą sterylnych probówek wolnych od DNA/RNA do późniejszej izolacji DNA, RNA i białka, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  12. W celu przeprowadzenia badania histologicznego umieścić każdy organoid w 5 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) 4% paraformaldehydu w PBS (dostosowanym do neutralnego pH) przez 45 minut na lodzie, a następnie przemyć PBS w temperaturze pokojowej (2 x 5 minut każdy).
  13. Krioprotekcja utrwalonych organoidów za pomocą gradientu sacharozy polega na umieszczeniu organoidów w szklanych słoikach w celu badania histologicznego. Inkubować organoidy w 10% sacharozie w roztworze PBS przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, następnie 20% sacharozy/PBS przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a na koniec 30% sacharozy/PBS inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Roztwory sacharozy należy zmieniać, najpierw pipetując, a następnie napełniając nowym roztworem.
  14. Osadź organoidy w pożywce kriogenicznej.
    1. Umieść miedzianą płytkę na suchym lodzie w styropianowym pudełku i ostudź przez 10 minut.
    2. Następnie umieść plastikową krioformę, wstępnie wypełnioną kriopożywką, na miedzianej płytce i delikatnie dociśnij organoid do dna kriomoldu za pomocą pęsety. Poczekaj, aż kriomedium zostanie całkowicie zamrożone.
    3. W przypadku długich organoidów najpierw przetnij na pół skalpelem i ułóż dwie połówki równolegle do siebie w krioformie. Powtórzyć procedurę dla każdego organoidu, który ma zostać poddany analizie histologicznej.
  15. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu kriosekcji.
  16. Za pomocą kriotomii pociąć organoidy wzdłużnie na odcinki o grubości 10 μm i poddać barwieniu histologicznemu, takiemu jak hematoksylina i eozyna (H&E) przy użyciu standardowego protokołu8.

Wyniki

Model organoidów 3D T/L został wcześniej ustanowiony i zademonstrowany tutaj poprzez implementację komercyjnie zakupionego NHDF (n=3, 3 organoidy na dawcę, NHDF były używane w przejściach 5-8). Przepływ pracy modelu jest podsumowany w Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego hodowli NHDF podczas pre-ekspansji w kolbach T-75 (Rysunek 2A), a także na początku i po 5 dniach hodowli w kroku ekspansji 2D w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych (Rysunek 2B). Rysunek 2C (reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego) pokazuje zbieganie się NHDF podczas stymulacji 2D po 14 dniach hodowli w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych. Następnie arkusze komórek zostały ręcznie odłączone i jednocześnie zwinięte w organoidy 3D przypominające pręty (w dniu 0 długość organoidów wynosi około 6 cm, szerokość około 0,4 cm), które były hodowane pod 10% napięciem statycznym przez 14 dni (Rysunek 3, dzień 0 i dzień 14, reprezentatywne obrazy makroskopowe). Do 14 dnia procesu dojrzewania 3D organoidy wykazywały lśniący biały wygląd, kurczyły się i wydawały się gęstsze niż początkowe organoidy. Mokrą masę organoidów zmierzono w momencie formowania (dzień 0) i ponownie w 14 dniu etapu dojrzewania 3D (Rysunek 4). Zaobserwowano znaczne zmniejszenie mokrej masy, co wskazuje na skurcz i reorganizację strukturalną ECM w organoidach w okresie tego etapu protokołu. Oprócz zmiany masy, w wyniku skurczu, zmniejszyła się również długość organoidu (w 14 dniu długość organoidu wynosi około 3,5 cm, a szerokość około 0,3 cm). W tym procesie metalowe kołki poluzowały się i musiały zostać ponownie naprawione; dlatego podczas 14 dni dojrzewania 3D zalecamy częste monitorowanie organoidów. Aby ocenić morfologię organoidów, uzyskano przekroje podłużne z organoidów NHDF zebranych w 1. i 14. dniu etapu dojrzewania 3D i poddanych barwieniu H&E (Ryc. 5). W pierwszym dniu organoidy wykazywały niepołączone warstwy, składające się głównie z komórek otoczonych niewielkimi ilościami ECM. Ponadto komórki w warstwach organoidów nie były wyrównane wzdłuż podłużnej osi organoidu używanej jako kierunek dla przyłożonego statycznego obciążenia rozciągającego. Jądra NHDF wykazywały okrągły kształt o różnych rozmiarach i kształtach. Analiza H&E organoidów z 14. dnia ujawniła zauważalny wzrost sygnału eozyny, co wskazuje na odkładanie się ECM podczas procesu dojrzewania 3D. W tym momencie organoidy wykazywały zrośnięte warstwy, z obszarami zawierającymi wyrównane komórki. Komórki często znajdowały się w grupach; Jednak w niektórych miejscach były one również zorganizowane w rzędy komórek. Większość jąder miała podobne rozmiary i czasami była wydłużona.

figure-results-1
Rysunek 1: Rysunek przedstawiający model organoidu 3D T/L składający się z 3 etapów: ekspansji 2D, stymulacji 2D i dojrzewania 3D. Początkowo NHDF były wstępnie ekspandowane w kolbie T-75, aż osiągnęły 70%-80% konfluencji. Następnie NHDF hodowano przy użyciu pożywki o niskiej zawartości glukozy Modified Eagles Medium (DMEM) firmy Dulbecco w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej przez 5 dni (ekspansja 2D). Komórki były następnie stymulowane pożywką DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną kwasem askorbinowym przez 14 dni hodowli (stymulacja 2D). Następnie NHDF odłączono od 10-centymetrowej przylegającej płytki, zwinięto w organoid przypominający pręcik 3D, przeniesiono i utrwalono w 10-centymetrowym, nieprzylegającym naczyniu do hodowli komórkowej wypełnionym pożywką DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną kwasem askorbinowym i transformującym czynnikiem wzrostu beta 3 (TGFß3) przez 14 dni (dojrzewanie 3D). Utworzone organoidy 3D mogą być poddawane ocenie mokrej masy, ocenie histologicznej, izolacji RNA i białek oraz innym analizom (np. transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pomiarom biomechanicznym) w różnych punktach czasowych, takich jak dni 0, 1 i 14. Kreskówka została wygenerowana w oprogramowaniu BioRender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego NHDF podczas etapów pre-ekspansji, ekspansji 2D i stymulacji 2D. (A) NHDF podczas wstępnej ekspansji w kolbie T-75. (B) NHDF w 1. i 5. dniu etapu ekspansji 2D w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej. (C) NHDF w 1. i 14. dniu etapu stymulacji 2D w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej. Podziałka liniowa: 200 μm. Zdjęcia wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ogólna morfologia organoidów 3D NHDF. Reprezentatywne obrazy makroskopowe organoidów NHDF w dniach 0 i 14 etapu dojrzewania 3D. Podziałka: 1 cm. Zdjęcia zostały wykonane aparatem w telefonie komórkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza mokrej masy organoidów NHDF 3D. Pomiar mokrej masy organoidów miał miejsce w dniu 0 i dniu 14, czyli na końcu procesu dojrzewania 3D. Wykres przedstawia wartości średnie i odchylenia standardowe (NHDF n = 3, 3 organoidy/dawcę w dniu 0 i 2 organoidy/dawcę w dniu 14 ze względu na 1 organoid/dawcę pobranego do badania histologicznego w dniu 1), każda kropka reprezentuje poszczególne organoidy, podczas gdy każdy kolorowy kształt reprezentuje innego indywidualnego dawcę. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe, a następnie zastosowano niesparowany parametryczny test t. Różnice statystyczne: **p ≤0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza histologiczna organoidów 3D NHDF. Reprezentatywne obrazy wybarwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) skrawków organoidów NHDF podczas procesu dojrzewania 3D w dniach 1 i 14. Prawy obraz - obrazy w małym powiększeniu, lewy obraz - powiększony widok ze wskaźnikami w następujący sposób: żółte strzałki - rozłączone warstwy; żółte groty strzał - jądra o różnych rozmiarach i kształtach; czarne strzałki - stopione warstwy i osadzanie ECM; czarne groty strzał - rzędy komórek, jądra o podobnej wielkości i wydłużeniu; czarne gwiazdy -komórki w grupach. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyniki przedstawione w tym badaniu dostarczają cennych informacji na temat ustanowienia i scharakteryzowania modelu organoidów 3D NHDF do badania tkanek T/L. 3-etapowy protokół doprowadził do powstania organoidów przypominających pręciki 3D, które wykazują typowe cechy niszy T/L. Model ten został wcześniej opisany w Kroner-Weigl et al. 20237 i szczegółowo zademonstrowany tutaj.

Obrazy kontrastu fazowego przedstawione na rysunku 2 pokazały progresję konfluencji NHDF i tworzenia się arkusza podczas etapów ekspansji i stymulacji. Proces dojrzewania 3D przeprowadzono poprzez ręczne zwijanie arkuszy komórek w organoidy przypominające pręciki 3D, które następnie hodowano pod napięciem statycznym przez 14 dni. Organoidy wykazywały lśniący biały wygląd i zwiększoną gęstość do 14 dnia, co sugeruje skurcz i reorganizację strukturalną w obrębie organoidów. Wskazuje to, że okres dojrzewania ma kluczowe znaczenie dla uzyskania bardziej zorganizowanej i naśladującej tkankę T/L struktury.

Co więcej, analiza masy ciała wykazała znaczny spadek mokrej masy organoidów między 0 a 14 dniem, co po raz kolejny wskazuje na znaczny skurcz i reorganizację ECM w organoidach podczas procesu dojrzewania. Co ważne, pomiary mokrej masy mogą się różnić w zależności od eksperymentów ze względu na obchodzenie się z podłożem resztkowym w organoidzie lub w szalkach. Co więcej, organoid może na początku zawierać więcej pożywki, ponieważ, jak omówiono poniżej, w dniu 0 warstwy utworzone przez zwijanie arkusza komórkowego są posegregowane i nie są połączone. Z czasem warstwy łączyły się i stawały się bardziej zwarte, a co za tym idzie, medium mogło być ekstrudowane.

Ocena morfologiczna za pomocą barwienia H&E dostarczyła dodatkowych informacji na temat charakterystyki strukturalnej organoidów. W pierwszym dniu organoidy wykazywały niepołączone warstwy, składające się głównie z komórek z okrągłymi jądrami otoczonymi cienkim okołokomórkowym ECM. Brak wyrównania komórek równolegle do osi obciążenia rozciągającego sugerował, że potrzebne jest dalsze dojrzewanie, aby osiągnąć bardziej zorganizowaną architekturę komórkową i ECM organoidów. Pomimo skurczu i zmniejszenia masy i wymiarów organoidów między 1. a 14. dniem, barwienie H&E wykazało wzrost obszarów eozyno-dodatnich, co sugeruje zwiększone osadzanie ECM. Co więcej, nie było już widocznych warstw, a czasami komórki miały wydłużone jądra i były ustawione w równoległych rzędach komórek. Wskazało to, że komórki w organoidach ulegają samoorganizacji poprzez zmianę własnego układu, a także osadzania, struktury i wyrównania ECM, naśladując w ten sposób zachowanie natywnego tworzenia tkanki T / L.

Ogólnie rzecz biorąc, odkrycia te podkreślają potencjał modelu organoidowego NHDF jako cennego narzędzia do badania biologii T/L, tenogenezy in vitro , a nawet do dalszego rozwoju inżynierii T/L bez rusztowań. Istnieją jednak trzy kluczowe kroki dla pomyślnego obchodzenia się z modelem organoidów 3D: 1) Tworzenie szczelnego arkusza komórek podczas etapu stymulacji 2D protokołu. W przypadku stosowania komórek pierwotnych zależy to głównie od właściwości komórek dawcy; W związku z tym ważne jest, aby równolegle oceniać wielu dawców; 2) Ręczne zwijanie arkusza komórek. Wymaga to szybkiego, ale jednocześnie delikatnego zwijania arkusza komórek za pomocą skrobaka do komórek. Dlatego wskazane jest zaplanowanie początkowych organoidów, aby najpierw przeszkolić tę procedurę; oraz 3) Stabilne zamocowanie szpilek na krawędziach organoidu. To mocowanie zapewnia wydłużenie osiowe organoidu i zapobiega deformacjom, a także zapadaniu się w strukturę przypominającą grudkę. Co więcej, na etapie dojrzewania 3D, ponieważ organoidy przechodzą przebudowę ECM, szpilki mogą się nagle odczepić, dlatego ważne jest, aby często monitorować każdy organoid i ponownie mocować szpilki.

Obecny model nie osiągnął jeszcze poziomu mimikry in vivo tkanki T/L i ma szereg ograniczeń. Na przykład wymaga to dużej liczby komórek na organoid, a także 35 dni na zakończenie procedury, podczas gdy większość protokołów różnicowania, takich jak model 3D chondrogennej osadki, jest ustawiona na 21 dni22. Zaleca się, aby etapy płukania w procedurze protokołu były przeprowadzane przy użyciu fizjologicznie zbilansowanego buforu do mycia, na przykład zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) lub zrównoważonego roztworu soli Earlesa (EBSS), a nie PBS, który może mieć konsekwencje metaboliczne dla pierwotnych komórek ludzkich hodowanych in vitro. Jeśli chodzi o pożywkę hodowlaną stosowaną na etapach stymulacji 2D i dojrzewania 3D w organoidzie, wybrano preparat DMEM plus 10% FBS, ponieważ stanowi on podstawę powszechnie akceptowanych protokołów różnicowania, a także z zamiarem standaryzacji i porównania różnych typów komórek pod kątem ich właściwości organoidogennych23. Na reprodukcję 3-etapowego protokołu organoidowego w różnych warunkach laboratoryjnych może mieć wpływ typ użytej komórki, jakość i pasaż komórek, a także właściwości komórek zależne od dawcy. Różnice w wyposażeniu, zwłaszcza w jakości 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych24 używanych na etapie stymulacji 2D, mogą potencjalnie wpłynąć na odporność tworzenia arkusza komórkowego. Co więcej, ze względu na skurcz ECM podczas dojrzewania 3D, osiowe mocowanie organoidów za pomocą kołków może się poluzować; Dlatego, jak wspomniano powyżej, zaleca się częste monitorowanie. Testowanie i wybieranie różnych kołków pod względem średnicy i wytrzymałości może również zmniejszyć ryzyko odczepieniasię 25. Jednak używanie kołków do ręcznego rozciągania nie jest wytrzymałe i jest podatne na zmienność obsługi; W związku z tym bardzo ważne jest opracowanie w dalszych badaniach mechanizmu zaciskowego do przytrzymywania krawędzi organoidów, co może skutkować nie tylko standaryzacją tego etapu, ale także może umożliwić dynamiczne rozciąganie organoidów. Ogólnie rzecz biorąc, interesujące będzie zbadanie dwóch sposobów modyfikacji modelu organoidów, z których jeden polega na zmniejszeniu skali - w celu zmniejszenia liczby komórek w organoidzie i czasu procedury, co czyni go bardziej przyjaznym dla użytkownika, zwłaszcza w przypadku badań in vitro ; i drugie zwiększenie skali - w celu zwiększenia wymiarów organoidów w celu przetestowania ich zachowania w dużych modelach zwierzęcych jako potencjalnej strategii wymiany ścięgien.

Zademonstrowany tutaj model może stanowić platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju ścięgien, patofizjologii, a być może naprawy i regeneracji, jeśli organoidy zostaną połączone z różnymi typami komórek i poddane mikropęknięciom. Należy wspomnieć, że badanie Kroner-Weigl i in. 20237 zidentyfikowało kilka ograniczeń dotyczących typu komórek NHDF, a mianowicie organoidy utworzone przez NHDF są większe i bardziej komórkowe niż te pochodzące z komórek T / L, co utrudnia kontrolowanie proliferacji i zachowania komórek. Jeśli chodzi o apoptozę komórek, test oparty na końcowym znakowaniu końca dUTP deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL) nie wykazał żadnych dowodów na martwe komórki w całym organoidzie w dniu 147, co sugeruje odpowiednią dyfuzję składników odżywczych, odpadów i tlenu podczas etapu dojrzewania 3D. Co ciekawe, pomimo różnic morfologicznych, pilotażowe badania przesiewowe za pomocą ilościowego PCR szeregu genów związanych z T / L (w tym różnych typów kolagenu, twardówki (SCX), Mohawk (MKX) itp.) sugerowały porównywalną ekspresję genów między organoidami NHDF i T / L7, co powinno być dalej badane, a także powinno zostać zweryfikowane na poziomie białka. W związku z tym dla tego typu komórek wymagana jest dalsza optymalizacja w celu wsparcia różnicowania T/L i może opierać się na dostosowaniu pożywki stosowanej w etapach stymulacji 2D i dojrzewania 3D (np. stężenie w surowicy, czynniki wzrostu, witaminy), wydłużeniu czasu dojrzewania, a nawet poddaniu organoidów dynamicznemu rozciąganiu mechanicznemu. Opracowanie protokołu może jeszcze bardziej poprawić właściwości składowe, strukturalne i funkcjonalne organoidów, umożliwiając w ten sposób modelowi lepsze naśladowanie złożonej niszy tkankowej T/L in vivo . Co więcej, alternatywne źródła komórek mogą być badane pod kątem ich zdolności do tworzenia organoidów T/L i tego, czy mogą ulegać różnicowaniu T/L. Yan i in. 20209, zastosowali model organoidowy 3D, wykorzystując młode/zdrowe i stare/zwyrodnieniowe komórki macierzyste / progenitorowe ścięgien (Y-TSPC i A-TSPC) do zbadania zachowania komórkowego w 3D, a także tego, czy zdolność tworzenia ścięgien zmienia się wraz ze starzeniem się T/L. Stwierdzili, że organoidy A-TSPC 3D wykazują słabą morfologię tkanek, a komórki w nich zawarte mają niższy wskaźnik proliferacji, ale wyższą apoptozę równolegle z podwyższonym poziomem markerów związanych ze starzeniem9. W związku z tym model organoidowy T/L 3D jest obiecującą platformą do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych związanych ze starzeniem się ścięgien, a następnie może być wykorzystywany do testowania nowych terapii farmakologicznych w celu naprawy i regeneracji ścięgien. W innym podejściu Chu i in. 2021 zaimplementowali komórki mieszków włosowych zęba (DFC) w modelu organoidowym 3D w celu oceny ich różnicowania więzadeł. Ten typ komórek tworzył bardzo dobrze zorganizowane organoidy, co sugeruje, że DFC są atrakcyjnym źródłem komórek do różnicowania się w tkance więzadeł przyzębia (PDL), co z kolei może opracować obiecującą strategię terapeutyczną dla zapalenia przyzębia8.

W przyszłości model może stać się jeszcze bardziej złożony dzięki uwzględnieniu różnych typów komórek (np. miofibroblastów, makrofagów), co może dostarczyć nowych informacji na temat specyficznych dla komórek zachowań i przesłuchów komórkowych w organoidach oraz przyczynić się do bardziej wszechstronnego zrozumienia biologii, fizjologii i patofizjologii T/L 8,9,16,26.

Modele 3D organoidów mają kilka zalet w zastosowaniach inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Dokładnie naśladują one skład i organizację komórkową, a także interakcje między komórkami i komórkami-macierzą w tkankach ludzkich, oferując w ten sposób fizjologicznie istotną platformę do badania mechanizmów chorobowych i reakcji na leki27. Organoidy mogą być wykorzystywane jako wysokoprzepustowa platforma przesiewowa do oceny skuteczności, ale także potencjalnych skutków ubocznych różnych leków i stanowią niezawodną i tanią alternatywę dla testów na zwierzętach. Ponadto umożliwiają bezpośrednie porównania między stanami zdrowymi i chorymi, umożliwiając odkrycie kluczowych zmian molekularnych i komórkowych związanych z różnymi patologiami, identyfikację biomarkerów do wczesnego wykrywania choroby, a także ułatwienie lepszego zrozumienia mechanizmów choroby i opracowanie terapii celowanych28,29.

Podsumowując, bardzo szczegółowo zademonstrowaliśmy etapy wcześniej opracowanego modelu organoidowego 3D T/L, który stanowi obiecującą platformę do badania biologii tkanek T/L i procesów tenogennych in vitro różnych typów komórek. Zdecydowanie zachęca się do dalszego wdrażania, optymalizacji i badań nad tym modelem, ponieważ mogą one prowadzić do postępu w strategiach inżynierii T/L bez rusztowań, co z kolei może przyczynić się do poprawy terapii T/L.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

D.D. i S.M.-D. uznają grant BMBF "CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research - transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in threedimensional cellular structures" Propozycja nr 13N15874. D.D. i V.R.A. dziękują za grant EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches" GA Nr. 101034412. Wszyscy autorzy dziękują Pani Beate Geyer za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas askorbinowy   Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Niemcy   A8960
10 cm przylegające naczynie do hodowli komórkowychSigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy 
10 cm nieprzywierająca szalka Petriego Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Niemcy 
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holandia   4583
Norma Cryomold Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Holandia4557
D(+)-Sacharoza AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, NiemcyA2211
DMEM o wysokiej stężeniu glukozy Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Niemcy DMEM-HA
DMEM niski poziom glukozyCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Niemcy   DMEM-LPXA
Płodowa surowica bydlęcaAnprotec, Bruckberg, Niemcy AC-SM-0027
Pożywka wzrostowa fibroblastów 2 PromoCell, Heidelberg, Niemcy   C-23020
H& Zestaw do barwienia EAbcamab245880
Mikroskop odwrócony z kamerą o wysokiej rozdzielczościZeissNAZeiss Axio Observer z  Aminokwasy Axiocam 506
MEM Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Niemcy   NEAA-B
Kołki metalowe EntoSphinx, Pardubice, Czechy 04.31
Prawidłowe ludzkie fibroblasty skórne PromoCell, Heidelberg, Niemcy C-12302
ParaformaldehydAppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy A3813
Penicylina/streptomycyna Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy15140122
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy P4417
TGFß 3 R& D Systems, Wiesbaden, Niemcy   8420-B3
Trypsyna-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Niemcy   TRY-1B
CLS430167CLS430591

Bibliografia

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844(2020).
  3. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
  4. Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
  5. Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299(2022).
  6. Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
  7. Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772(2023).
  8. Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
  9. Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406(2020).
  10. Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
  11. Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
  12. Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
  13. Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
  14. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272(2018).
  17. Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047(2020).
  18. Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
  19. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  20. Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
  21. Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
  22. Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936(2019).
  23. Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
  24. Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
  25. Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
  26. Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
  27. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  28. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  29. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowy model organoidalnyorganoid ci gnaorganoid wi zad ain ynieria tkankowain ynieria bezruszta cowadepozycja macierzystymulacja mechanicznar nicowanie tenogenne

Powiązane artykuły