Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neutrofile to komórki z linii mieloidalnej, które stanowią kluczową część wrodzonego układu odpornościowego. Ostatnia dekada ujawniła dodatkowe kluczowe role, jakie neutrofile odgrywają w patogenezie raka, chorób autoimmunologicznych oraz różnych ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, przyczyniając się do inicjacji i utrwalenia dysregulacji immunologicznej poprzez wiele mechanizmów, w tym tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), które są strukturami kluczowymi w obronie przeciwdrobnoustrojowej. Ograniczenia w technikach ilościowego określania powstawania NET w bezstronny, powtarzalny i skuteczny sposób ograniczyły naszą zdolność do dalszego zrozumienia roli neutrofili w zdrowiu i chorobach. Opisujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę pomiaru neutrofili ulegających powstawaniu NET w czasie rzeczywistym przy użyciu platformy obrazowania żywych komórek w połączeniu z podejściem podwójnego barwnika zależnym od przepuszczalności błony przy użyciu dwóch różnych barwników DNA do obrazowania wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego DNA. Metodologia ta jest w stanie pomóc w ocenie fizjologii neutrofili i testowaniu cząsteczek, które mogą być ukierunkowane na tworzenie NET.
Wprowadzenie
Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) to przypominające sieć struktury chromatyny wydzielane z neutrofili w odpowiedzi na różne bodźce zapalne. NET składają się z DNA, histonów i różnych białek/peptydów przeciwdrobnoustrojowych, które zatrzymują i zabijają zakaźne patogeny oraz wywołują reakcje zapalne1.
Chociaż NET są korzystne dla obrony gospodarza przed patogenami, zwróciły uwagę jako potencjalny czynnik różnych chorób autoimmunologicznych2, thrombosis3, metabolic diseases4, oraz przerzutowego wzrostu nowotworów5. W związku z tym hamowanie tworzenia NET jest potencjalną opcją terapeutyczną dla tych chorób. Jednak pomimo kilku obiecujących cząsteczek ukierunkowanych na NETs, które są w fazie rozwoju6, nadal nie ma zatwierdzonej terapii, która konkretnie wpływa na ten mechanizm. Jest to, przynajmniej częściowo, spowodowane brakiem obiektywnych, bezstronnych, odtwarzalnych i wysokoprzepustowych metod kwantyfikacji tworzenia NET.
Ustaliliśmy i opisaliśmy nową metodę wykorzystującą dwukolorową platformę obrazowania żywych komórek7,8. Obrazy poklatkowe neutrofili barwionych barwnikiem jądrowym przepuszczalnym dla błony i barwnikiem DNA nieprzepuszczalnym dla błony są analizowane przez oprogramowanie, a liczba neutrofili przed i po utworzeniu NET jest liczona w wielu punktach czasowych. Ponieważ integralność błony plazmatycznej jest tracona podczas tworzenia NET przez regulację demontażu Laminy B za pośrednictwem PKCα i CDK4/6 Lamin A/C za pośrednictwem PKCα 9, neutrofile tworzące NET są barwione przez nieprzepuszczalny dla błony barwnik DNA, podczas gdy zdrowe neutrofile nie są. Metoda ta przezwycięża problemy związane z wcześniej opisanymi technikami ilościowego określania powstawania NET i zapewnia bezstronną, wysokowydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET w sposób zautomatyzowany.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Neutrofile od zdrowych ochotników pobrano po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Recenzencką (IRB) Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). Protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etyki badań nad ludźmi NIH.
1. Barwienie neutrofilów i przygotowanie płytki do analizy
- Pobrać krew obwodową po uzyskaniu odpowiedniej pisemnej zgody, zgodnie z wytycznymi danej instytucji, i wyizolować neutrofile dowolną preferowaną metodą. Przykładowo, metoda z użyciem Ficoll-dextranu10,11 jest powszechnie stosowaną metodą izolacji neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej.
UWAGA: Chociaż opisana tutaj metoda wykorzystuje neutrofile ludzkie, podobny protokół można zastosować do analizy neutrofili mysich. - Resuspendować neutrofile w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI; patrz Tabela materiałów) 1640 do stężenia 2,0 x 106 neutrofili/mL i przenieść zawiesinę neutrofili do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.
UWAGA: Zazwyczaj nie dodajemy płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do pożywek hodowlanych, ponieważ albuminy obecne w FBS mogą ograniczać tworzenie NET12, a termostabilna nukleaza w FBS może degradować NET13. - Dodać przepuszczalny przez błony czerwony barwnik DNA (patrz Tabela materiałów) w ilości 1 µL na 1,5 mL zawiesiny neutrofili.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min w ciemności. Centryfugować przy 2500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz.
- Resuspendować neutrofile w 1 mL RPMI, następnie centryfugować przy 2500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i usunąć nadsącz. Powtórzyć 2x (łącznie 3x przemyć).
- Resuspendować neutrofile w 1 mL RPMI i policzyć przy użyciu licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę neutrofili do stężenia 1,5 x 105 neutrofili/mL.
- Dodać 4 µL nieprzepuszczalnego przez błony zielonego barwnika DNA (patrz Tabela materiałów), uprzednio rozcieńczonego 1:100, na 1 mL zawiesiny neutrofili.
- Nanieść do każdego dołka przezroczystej płytki 96-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek (patrz Tabela materiałów) po 100 µL zawiesiny neutrofili. Każdą warunek ustawić w trzech powtórzeniach.
UWAGA: Wykazaliśmy wcześniej7, że w tej metodzie nie ma różnic w tworzeniu i ilościowym określaniu NET, niezależnie od tego, czy neutrofile zostaną umieszczone na płytkach z powłoką z poli-L-lizyny, czy bez niej. W związku z tym zastosowanie płytki przeznaczonej do hodowli tkanek jest wystarczające dla tej metody. - Dodać do odpowiednich dołków 100 µL RPMI zawierającego odczynniki stymulujące z inhibitorem lub bez, bądź każdy inny interesujący odczynnik. Zawsze stosować dołki kontroli pozytywnej, dodając 500 nM mirystyleanu 13-octanu forbolu (PMA) lub 2,5 µM jonoforu wapniowego (A23187); w niniejszym przypadku użyto inhibitora AKT w stężeniu 30 µM.
- Umieścić płytkę w systemie analizy żywych komórek (patrz Tabela materiałów) znajdującym się w inkubatorze z 5% CO2.
UWAGA: Kilka minut po tym kroku na górnej i dolnej powierzchni płytki może pojawić się kondensacja. Może ona utrudniać prawidłowe obrazowanie. Przed rozpoczęciem skanowania dokładnie wytrzeć i usunąć kondensację. Włożyć płytkę do urządzenia, uruchomić oprogramowanie, wprowadzić protokół skanowania, a następnie wytrzeć płytkę bezpośrednio przed pierwszym skanowaniem.
2. Skanowanie płytki w celu wizualizacji neutrofili tworzących NET
- Uruchom oprogramowanie (patrz Tabela materiałów (w celu uzyskania szczegółowych informacji o oprogramowaniu). Uruchom Dodaj naczynie poprzez naciśnięcie znaku + w lewym górnym rogu.
- Wybierz Skanowanie zgodnie z harmonogramemWybierz Nowy.
UWAGA: Po utworzeniu tego elementu należy przeprowadzić ten sam protokół skanowania, wybierając Kopiuj poprzednie oraz wybranie zapisanego protokołu na następnym ekranie. - Wybierz StandardUstaw parametry skanowania w następujący sposób: opcje Cell-by-Cell: żadne; kanały obrazowania: faza, zielony (czas akwizycji: 200 ms), czerwony (czas akwizycji: 400 ms); obiektyw: 20x.
- Wybierz z listy płytkę, która jest używana. Wybierz lokalizację naczynia, w której należy umieścić płytkę na tacy systemu obrazowania żywych komórek.
- Wybierz studzienki, w których znajdują się próbki, i określ liczbę obrazów do wykonania dla każdej studzienki. Na podstawie liczby obrazów na studzienkę wygeneruj szacowany czas skanowania płytki. Zazwyczaj wystarczające są 4 obrazy na studzienkę, jednak liczba ta może się różnić w zależności od warunków i częstotliwości skanowania.
- Wprowadź informacje dla każdej studzienki (np. typ komórek i związek), klikając Utwórz mapę płytki w celu nadania nazwy badaniu.
UWAGA: Mapa płytki może zostać przygotowana i zapisana wcześniej przy użyciu edytora map płytki w oprogramowaniu. Zapisane dane mapy płytki można zaimportować podczas tego kroku. W razie potrzeby można pominąć wprowadzanie informacji o mapie płytki i wykonać tę czynność później. Dane można uzyskać również bez wprowadzania informacji o układzie płytki. Zaleca się jednak wprowadzenie informacji o płytce, aby ułatwić późniejszą analizę. - Na następnym ekranie wybierz Podstawowy analizator jako typ analizy i wybrać Protokół analizy z listy rozwijanej, która wyświetla wcześniej używane definicje analiz (nie protokoły skanowania). Wartości odmieszania widmowego (spectral unmixing) dla kanałów zielonego i czerwonego mogą pozostać na poziomie 0,0%.
UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli jest to pożądane. - Zaplanuj skanowanie. W tym eksperymencie należy skanować co 15–20 minut przez 8 godzin. Ustaw czas rozpoczęcia skanowania, przesuwając biały i szary pasek znajdujący się na górze ekranu.
UWAGA: Należy unikać zbyt częstego skanowania, w przeciwnym razie urządzenie może nie działać prawidłowo z powodu przegrzania. Czas skanowania nie powinien przekraczać 12 h na dobę. W przypadku zbyt częstego skanowania może pojawić się alert. - Sprawdź ustawienia skanowania na następnym ekranie i naciśnij Dodaj do harmonogramu aby rozpocząć skanowanie. Należy poczekać, aż zostanie zeskanowany pierwszy zestaw obrazów, aby potwierdzić, czy wszystko działa prawidłowo.
- Czasami komórki mogą nie być odpowiednio ustawione w ogniskowej. W takim przypadku należy sprawdzić, czy występuje kondensacja (i w razie potrzeby ją usunąć), czy płytka jest prawidłowo umieszczona w tacy lub czy pozycja płytki została poprawnie określona itd. Jeśli komórki nadal unoszą się w zawiesinie i nie opadły na dno studzienki, należy odczekać około 5 min przed rozpoczęciem skanowania.
3. Ustawienie definicji analizy w celu kwantyfikacji NET
- Otwórz badanie (naczynie) do analizy w zakładce View. Naciśnij Launch Analysis po lewej stronie ekranu. Wybierz Create New Analysis Definition.
- Jeśli analiza była przeprowadzana wcześniej, użyj tej samej definicji analizy z niewielkimi zmianami, wybierając Copy Existing Analysis Definition. W takim przypadku przejdź do kroku 3.3. Jeśli używasz analizy bez żadnych zmian, wybierz Use Existing Analysis Definition; nie jest to zalecane, ponieważ poziom fluorescencji może różnić się między badaniami w różne dni i zazwyczaj konieczne są niewielkie korekty.
- Wybierz Basic Analyzer. Użyj wszystkich kanałów obrazu: Phase, Green, Red oraz Overlap.
UWAGA: Chociaż do zliczania NET zazwyczaj używamy masek obiektów zielonych i czerwonych, maska obiektów overlap jest użyteczna, gdy istotne są zanieczyszczenia (debris). W takich przypadkach liczba obiektów overlap będzie używana jako licznik zamiast liczby obiektów zielonych (patrz krok 3.9). Jeśli liczba obiektów overlap zostanie użyta zamiast liczby obiektów zielonych, wszystkie sygnały czerwone muszą zostać poprawnie zliczone. Dostosuj ustawienia sygnału czerwonego tak, aby zliczać wszystkie obiekty czerwone o niskim sygnale na obrazach wykonanych w późniejszych punktach czasowych, ale nie zliczać zanieczyszczeń. - Wybierz 6–8 reprezentatywnych obrazów próbek do trenowania. Dla niniejszego eksperymentu uwzględnij następujące obrazy:
Obrazy wykonane między 0 a 20 min, aby zoptymalizować ustawienia sygnału zielonego i skompensować subtelne sygnały zielone, które mogą być generowane w neutrofilach nietworzących NET
Obrazy maksymalnej ilości NET z kontrolą pozytywną, wykonane między 3 a 6 h (czas zależy od zastosowanej stymulacji), aby zoptymalizować ustawienia sygnału zielonego w celu zdefiniowania neutrofilów tworzących NET
Obrazy wykonane około 1 h w celu zliczenia całkowitej liczby komórek (zbarwionych czerwonym barwnikiem), ponieważ czerwony sygnał jądrowy jest najsilniejszy około 1 h (kiedy wszystkie komórki opadną na dno dołka) i stopniowo słabnie z powodu śmierci komórek.
Obrazy zawierające zanieczyszczenia, aby wykluczyć je z zliczania. - Ustaw definicję analizy. Obiekty czerwone i zielone odpowiadają odpowiednio jądrom wszystkich neutrofili oraz tych, które tworzą NET. Zacznij od następnego przykładu i naciśnij Preview Current lub Preview All, a następnie moduluj każdy parametr, aby zoptymalizować wyniki:
Dla Green: Segmentation- Background subtraction: Top-Hat; Radius: 100 µM; Threshold: 0.3 GCU; Edge split: On; Edge sensitivity: -20; Cleanup -Hole fill: 100 µm2; Adjust size 0 pixels; Filters- Area: min 20 µm2, max 500 µm2; Eccentricity: max 0.97; Mean Intensity: min 1.00
Dla Red: Segmentation- Background subtraction: Top-Hat; Radius: 10 µM; Threshold: 1.0 GCU; Edge split: ON; Edge sensitivity: -50; Cleanup-Hole fill: 50 µm2; Adjust size 0 pixels; Filters- Area: min 20 µm2, max 400 µm2; Mean Intensity: min 1.5.- Jeśli w neutrofilach, które nie powinny tworzyć NET (np. niestymulowane neutrofile w 0 min z jądrami wielopłatowymi), pojawi się nadmierny sygnał zielony, może to wynikać z prześwitu sygnału czerwonego wykrywanego w kanale zielonym. W takim przypadku wróć do kroku 3.1, otwórz Image Layers po lewej stronie ekranu i usuń sygnały czerwone z kanału zielonego za pomocą funkcji Spectral Unmixing.
- Inną opcją jest przygotowanie jednego dołka do pojedynczego barwienia czerwonym barwnikiem jądrowym, aby ustalić, jaka część sygnału czerwonego powinna zostać usunięta z kanału zielonego. Z drugiej strony, prześwit sygnału zielonego do kanału czerwonego zazwyczaj nie wpływa na analizy.
UWAGA: Nie ma znaczenia, czy czułość na sygnał czerwony jest niska i nie wszystkie sygnały czerwone są zarejestrowane na obrazach wykonanych w późniejszych punktach czasowych (np. w punkcie 6 h). Maksymalna liczba zliczonych obiektów czerwonych na każdym obrazie jest uznawana za całkowitą liczbę neutrofili na obrazie i zostanie użyta jako mianownik w kroku 3.9. Zazwyczaj czerwone sygnały jądrowe osiągają szczyt około 1 h i stopniowo słabną z powodu śmierci komórek (Rycina 1B). Dlatego dostosuj ustawienia sygnału czerwonego, aby poprawnie zliczać obiekty czerwone na obrazach z maksymalnymi sygnałami czerwonymi.
- Wybierz czasy skanowania i dołki do analizy. Zazwyczaj należy przeanalizować wszystkie punkty czasowe i dołki. Nadaj etykietę definicji analizy.
- Sprawdź podsumowanie i uruchom analizę. Analiza trwa kilka godzin (czas trwania zależy od liczby punktów czasowych i dołków). Po uruchomieniu nazwa definicji analizy zostanie wyświetlona pod nazwą badania w zakładce View, a po zakończeniu pojawi się pełna data.
- Po zakończeniu otwórz przeanalizowane badanie, dwukrotnie klikając nazwę definicji analizy. Otwórz Layers po lewej stronie ekranu i sprawdź, czy każda komórka jest poprawnie zaznaczona. Jeśli nie jest poprawnie zaznaczona, wróć do kroku 3.1 i powtórz kolejne kroki.
- Kliknij Graph Metrics po lewej stronie ekranu, aby wyeksportować dane. Wybierz Green Count, Red Count lub Overlap Count (Per Image), a następnie wybierz punkty czasowe i dołki do eksportu. W przypadku wyboru grupowania wybierz Plate Map Replicates, jeśli wszystkie dołki zostały poprawnie określone podczas skanowania.
- Wyeksportuj dane. Oblicz procent komórek tworzących NET dla każdego stanu/punktu czasowego za pomocą następującego równania, korzystając z odpowiedniego oprogramowania.
UWAGA: Powodem, dla którego mianownikiem jest maksymalna liczba obiektów czerwonych, jest fakt, że liczba obiektów czerwonych osiąga szczyt około 1 h i stopniowo spada z powodu śmierci komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metoda ta umożliwia uzyskanie obrazów w kontraście fazowym, obrazów z czerwoną fluorescencją (barwnik przenikający przez błonę) oraz obrazów z zieloną fluorescencją (barwnik nieprzenikający przez błonę), wykonanych w każdym punkcie czasowym. Równolegle z procesem tworzenia NET obserwuje się zmiany morfologiczne w obrazach w kontraście fazowym i czerwonej fluorescencji, a po przerwaniu ciągłości błony można zaobserwować zieloną fluorescencję (Rycina 1). W tym teście neutrofile tworzące NET są...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecne metody ilościowego oznaczania NET ex vivo mają kilka wad, które ograniczają naszą zdolność do badania neutrofili, NET i potencjalnych celów terapeutycznych w sposób bezstronny i wysokoprzepustowy10,14. Na przykład bezpośrednie liczenie komórek tworzących NET po barwieniu immunofluorescencyjnym, uważane za złoty standard w oznaczaniu ilościowym NET, jest niskoprzepustowe i zależy od subiektywnego poglądu operatora. Test płytkowy wykrywający fluores...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Sekcji Obrazowania Światłem w Biurze Nauki i Technologii w Narodowym Instytucie Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia (ZIA AR041199).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inhibitor AKT | Calbiochem | 124028 | |
| przezroczysta 96-dołkowa płytka | Corning | 3596 | |
| System analizy żywych komórek | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Nieprzepuszczalny dla błony zielony barwnik DNA | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Granulki neutrofili po zabarwieniu stają się niebieskawe. |
| Można stosować RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI. |
Bibliografia
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595(2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837(2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12(2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
