Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) to przypominające sieć struktury chromatyny wydzielane z neutrofili w odpowiedzi na różne bodźce zapalne. NET składają się z DNA, histonów i różnych białek/peptydów przeciwdrobnoustrojowych, które zatrzymują i zabijają zakaźne patogeny oraz wywołują reakcje zapalne¹.

Chociaż NET są korzystne dla obrony gospodarza przed patogenami, zwróciły uwagę jako potencjalny czynnik różnych chorób autoimmunologicznych², thrombosis³, metabolic diseases⁴, oraz przerzutowego wzrostu nowotworów⁵. W związku z tym hamowanie tworzenia NET jest potencjalną opcją terapeutyczną dla tych chorób. Jednak pomimo kilku obiecujących cząsteczek ukierunkowanych na NETs, które są w fazie rozwoju⁶, nadal nie ma zatwierdzonej terapii, która konkretnie wpływa na ten mechanizm. Jest to, przynajmniej częściowo, spowodowane brakiem obiektywnych, bezstronnych, odtwarzalnych i wysokoprzepustowych metod kwantyfikacji tworzenia NET.

Ustaliliśmy i opisaliśmy nową metodę wykorzystującą dwukolorową platformę obrazowania żywych komórek^7,8. Obrazy poklatkowe neutrofili barwionych barwnikiem jądrowym przepuszczalnym dla błony i barwnikiem DNA nieprzepuszczalnym dla błony są analizowane przez oprogramowanie, a liczba neutrofili przed i po utworzeniu NET jest liczona w wielu punktach czasowych. Ponieważ integralność błony plazmatycznej jest tracona podczas tworzenia NET przez regulację demontażu Laminy B za pośrednictwem PKCα i CDK4/6 Lamin A/C za pośrednictwem PKCα ⁹, neutrofile tworzące NET są barwione przez nieprzepuszczalny dla błony barwnik DNA, podczas gdy zdrowe neutrofile nie są. Metoda ta przezwycięża problemy związane z wcześniej opisanymi technikami ilościowego określania powstawania NET i zapewnia bezstronną, wysokowydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET w sposób zautomatyzowany.

Neutrofile od zdrowych ludzi uzyskano po dostarczeniu świadomej zgody zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB). Protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu etycznego NIH ds. badań na ludziach.

1. Barwienie neutrofili i przygotowanie płytki testowej

1. Pobrać krew obwodową za odpowiednią pisemną świadomą zgodą, zgodnie z wytycznymi każdego instytutu i wyizolować neutrofile dowolną pożądaną metodą. Na przykład metoda Ficoll-dekstranu^10,11 jest powszechnie stosowaną metodą izolacji neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej.
   UWAGA: Chociaż omawiana tutaj metoda wykorzystuje ludzkie neutrofile, neutrofile myszy mogą być również analizowane przy użyciu podobnego protokołu.
2. Zawiesić neutrofile w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI; patrz tabela materiałów) 1640 przy 2,0 x 10⁶ neutrofili/ml i umieścić zawiesinę neutrofili w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Zwykle nie dodajemy płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do pożywki hodowlanej, ponieważ albumina w FBS może zmniejszać tworzenie NET¹², a stabilna termicznie nukleaza w FBS może degradować NETs¹³.
3. Dodać przepuszczalny przez błonę czerwony barwnik DNA (patrz tabela materiałów) w stężeniu 1 μl na 1,5 ml zawiesiny neutrofili
.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności. Wirować przy 2500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
5. Zawiesić neutrofile w 1 ml RPMI, następnie odwirować przy 2500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Powtórzyć 2x (umyć łącznie 3x).
6. Ponownie zawiesić neutrofile w 1 ml RPMI i policzyć za pomocą licznika komórek. Rozcieńczyć zawiesinę neutrofili do 1,5 x 10⁵ neutrofili/ml.
7. Dodać 4 μl wstępnie rozcieńczonego zielonego barwnika DNA w stosunku 1:100 (patrz tabela materiałów) na 1 ml zawiesiny neutrofili
.
8. Umieścić 100 μl zawiesiny neutrofili na basenie na klarowną 96-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur tkankowych (patrz tabela materiałów). Ustaw każdy warunek w triplicate.
   UWAGA: Pokazaliśmy wcześniej⁷, że nie ma różnicy w tworzeniu NET i kwantyfikacji tą metodą, jeśli neutrofile są umieszczane w płytkach z powłoką poli-L-lizynową lub bez. Dlatego do tej metody wystarczające jest użycie płytki poddanej działaniu kultur tkankowych.
9. Dodać 100 μl odczynników stymulujących zawierających RPMI z inhibitorem lub bez, lub dowolny inny odczynnik będący przedmiotem zainteresowania w odpowiednich studzienkach. Zawsze używaj studzienek kontroli pozytywnej, dodając 500 nM 12-mirysianianu 13-octanu (PMA) lub 2,5 μM jonoforu wapnia (A23187), zastosowano tutaj inhibitor AKT 30 μM.
10. Umieścić płytkę w systemie analizy żywych komórek (patrz tabela materiałów), który znajduje się w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2.
    UWAGA: Kilka minut po wykonaniu tego kroku na górze i na dole płytki może pojawić się kondensacja. Może to utrudniać prawidłowe obrazowanie. Dokładnie wytrzyj i usuń kondensację przed rozpoczęciem skanowania. Umieść płytkę w urządzeniu, uruchom oprogramowanie, wprowadź protokół skanowania, a następnie wytrzyj płytkę tuż przed pierwszym skanowaniem.

2. Płytka skanująca do wizualizacji neutrofili tworzących NET

1. Uruchom oprogramowanie (szczegółowe informacje na temat oprogramowania można znaleźć w Tabeli materiałów). Uruchom Dodaj naczynie, naciskając + w lewym górnym rogu.
2. Wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem. Wybierz pozycję Nowy.
   UWAGA: Po utworzeniu uruchom ten sam protokół skanowania, wybierając opcję Kopiuj poprzedni i wybierając zapisany protokół na następnym ekranie.
3. Wybierz opcję Standardowa. Ustaw ustawienia skanowania jako: Opcje komórka po komórce: Brak; Kanały obrazu: Faza, Zielony (Czas akwizycji: 200 ms), Czerwony (Czas akwizycji: 400 ms); Cel: 20x.
4. Wybierz z listy używaną płytę. Wybierz miejsce naczynia, w którym należy umieścić płytkę na tacy systemu obrazowania żywych komórek.
5. Wybierz studzienki, w których znajdują się próbki i zdecyduj, ile zdjęć należy wykonać w każdym dołku. Na podstawie liczby obrazów na studzienkę wygeneruj szacowany czas skanowania płytki. Zwykle wystarczą 4 obrazy na studzienkę; Może się to jednak różnić w zależności od warunków i częstotliwości skanowania.
6. Wprowadź informacje z każdej studzienki (np. typ komórki i związek), klikając Utwórz mapę płyt, aby podać nazwę badania.
   UWAGA: Mapę tablic można przygotować i zapisać z wyprzedzeniem za pomocą edytora mapy tablic w oprogramowaniu. Na tym etapie można zaimportować zapisane dane mapy tablic. W razie potrzeby wprowadzanie informacji o mapie tablic rejestracyjnych można pominąć i wykonać później. Dane można również uzyskać bez wprowadzania informacji o układzie płyt. Zaleca się jednak wprowadzenie informacji o tabliczce, aby ułatwić późniejszą analizę.
7. Na następnym ekranie wybierz Analizator podstawowy jako typ analizy i wybierz Protokół analizy z listy rozwijanej, która pokazuje poprzednio używane definicje analizy (nie protokoły skanowania). Widmowe mieszanie zarówno dla koloru zielonego, jak i czerwonego można pozostawić na poziomie 0,0 %,
   UWAGA: W razie potrzeby ten krok można pominąć.
8. Zaplanuj skanowanie. W przypadku eksperymentu tutaj skanuj co 15-20 minut przez 8 godzin . Ustaw czas rozpoczęcia skanowania, przeciągając biały i szary pasek na górze ekranu.
   UWAGA: Unikaj zbyt częstego skanowania, w przeciwnym razie urządzenie może nie działać dobrze z powodu przegrzania. Czas skanowania nie powinien przekraczać 12 h na 24 h. Jeśli skanowanie jest zbyt częste, może zostać wyświetlony alert.
9. Sprawdź ustawienia skanowania na następnym ekranie i naciśnij Dodaj do harmonogramu, aby rozpocząć skanowanie. Poczekaj, aż początkowy zestaw obrazów zostanie zeskanowany, aby potwierdzić, czy wszystko działa dobrze.
   1. Czasami komórki mogą nie być odpowiednio zogniskowane. W takim przypadku sprawdź, czy występuje kondensacja (i odpowiednio wytrzyj), czy płyta jest prawidłowo ustawiona na tacy lub czy pozycja płyty jest prawidłowo określona itp. Jeśli komórki nadal unoszą się na dnie studzienki i nie osiadły na dnie studzienki, odczekaj około 5 minut przed skanowaniem.

3. Ustawianie definicji analizy w celu ilościowego określenia NET

1. Otwórz badanie (statek) do analizy na karcie Widok. Naciśnij przycisk Uruchom analizę po lewej stronie ekranu. Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy.
   1. Jeśli analiza została przeprowadzona wcześniej, należy użyć tej samej definicji analizy z niewielkimi zmianami, wybierając opcję Kopiuj istniejącą definicję analizy. W takim przypadku przejdź do kroku 3.3. W przypadku korzystania z analizy bez żadnych zmian wybierz opcję Użyj istniejącej definicji analizy; Nie jest to zalecane, ponieważ poziom fluorescencji może się różnić w zależności od testu w różnych dniach i zwykle konieczne są drobne korekty.
2. Wybierz pozycję Analizator podstawowy. Użyj wszystkich kanałów obrazu: Faza, Zielony, Czerwony i Nakładanie.
   UWAGA: Chociaż zwykle używamy zielonych i czerwonych masek obiektów do liczenia NET, maska nakładającego się obiektu jest przydatna, gdy chodzi o zanieczyszczenia. W takich przypadkach liczba nakładających się obiektów będzie używana jako licznik zamiast zielonej liczby obiektów (patrz krok 3.9). Jeśli zamiast liczby obiektów zielonych używana jest liczba obiektów nakładających się, wszystkie sygnały czerwone muszą być zliczane poprawnie. Dostosuj ustawienie sygnału czerwonego, aby zliczać wszystkie czerwone obiekty z niskim czerwonym sygnałem na zdjęciach zrobionych w późniejszych punktach czasowych, ale nie liczyć szczątków.
3. Wybierz 6–8 reprezentatywnych przykładowych obrazów do treningu. Na potrzeby eksperymentu dołącz następujące obrazy:
   Zdjęcia wykonane w czasie od 0 do 20 minut w celu optymalizacji ustawienia zielonego sygnału w celu skompensowania subtelnych zielonych sygnałów, które mogą być generowane w neutrofilach nietworzących NET
   Obrazy maksymalnej liczby NET z kontrolą pozytywną, wykonane w ciągu 3-6 godzin (czas różni się w zależności od zastosowanej stymulacji) w celu optymalizacji ustawienia zielonego sygnału w celu zdefiniowania neutrofili tworzących NET
   Obrazy wykonane około 1 godziny w celu zliczenia całkowitej liczby komórek (zabarwionych czerwonym barwnikiem), ponieważ czerwony sygnał jądrowy jest najsilniejszy około 1 godziny (kiedy wszystkie komórki osiadły na dnie studzienki) i stopniowo zmniejsza się z powodu śmierci komórki.
   Obrazy zawierające szczątki, aby wykluczyć je z liczenia.
4. Ustaw definicję analizy. Obiekty czerwone i zielone odpowiadają jądrom wszystkich neutrofili oraz tych, które tworzą NET. Zacznij od poniższego przykładu i naciśnij Podgląd bieżący lub Podgląd wszystkiego, a następnie moduluj każdy parametr, aby zoptymalizować wyniki:
   Dla zielonego: Segmentacja- Odejmowanie tła: Cylinder; Promień: 100 μM; Próg: 0,3 GCU; Podział krawędzi: Wł.; Czułość krawędzi: -20; Oczyszczanie -Wypełnienie otworu: 100 μm²; Dostosuj rozmiar 0 pikseli; Filtry- Obszar: min 20 μm², max 500 μm²; Mimośród: max 0,97; Średnia intensywność: min 1,00 < br / > Dla czerwonego: Segmentacja- Odejmowanie tła: Cylinder; Promień: 10 μM; Próg: 1,0 GCU; Podział krawędzi: WŁ.; Czułość krawędzi: -50; Wypełnienie otworu czyszczącego: 50 μm²; Dostosuj rozmiar 0 pikseli; Filtry- Obszar: min 20 μm², max 400 μm²; Średnia intensywność: min 1,5.
   1. Jeśli nadmierny sygnał zielony pojawi się w neutrofilach, które nie powinny tworzyć NET (np. neutrofile niestymulowane po 0 minutach, które mają zrazikowane jądra), może to być spowodowane przepełnieniem czerwonego sygnału wykrytego w kanale zielonym. W takim przypadku wróć do kroku 3.1, otwórz Warstwy obrazu po lewej stronie ekranu i usuń czerwone sygnały z kanału zielonego za pomocą Spectral Unmixing.
   2. Inną opcją jest ustawienie jednej studzienki do pojedynczego barwienia czerwonym barwnikiem jądrowym, aby wyjaśnić, ile czerwonego sygnału należy usunąć z kanału zielonego. Z drugiej strony, zwykle sygnał zielony wpadający do kanału czerwonego nie ma wpływu na analizy.
      UWAGA: Nie ma znaczenia, czy czułość na sygnał czerwony jest niska i nie wszystkie sygnały czerwone są rejestrowane na zdjęciach wykonanych w późniejszych punktach czasowych (np. 6 godzin). Maksymalna liczba czerwonych obiektów na każdym obrazie jest traktowana jako całkowita liczba neutrofili na obrazie i zostanie użyta jako mianownik w kroku 3.9. Zazwyczaj jądrowe czerwone sygnały osiągają szczyt około 1 godziny i stopniowo zanikają z powodu śmierci komórki (Rysunek 1B). Dlatego dostosuj ustawienie sygnału czerwonego, aby poprawnie zliczać czerwone obiekty na obrazach z maksymalnymi czerwonymi sygnałami.
5. Wybierz czasy skanowania i dołki do analizy. Zwykle należy przeanalizować wszystkie punkty czasowe i studnie. Podaj etykietę do definicji analizy.
6. Sprawdź podsumowanie i uruchom analizę. Zakończenie analizy zajmuje kilka godzin (czas trwania zależy od liczby punktów czasowych i odwiertów). Po uruchomieniu nazwa definicji analizy zostanie wyświetlona pod nazwą badania w zakładce Widok, a po jego zakończeniu zostanie wyświetlona pełna data.
7. Po jego zakończeniu należy otworzyć analizowane badanie, klikając dwukrotnie nazwę definicji analizy. Otwórz Warstwy po lewej stronie ekranu i sprawdź, czy każda komórka jest poprawnie oznaczona. Jeśli nie jest prawidłowo zaznaczony, wróć do kroku 3.1 i powtórz kolejne kroki.
8. Kliknij pozycję Graph Metrics (Metryki wykresu) po lewej stronie ekranu, aby wyeksportować dane. Wybierz opcję Liczba zielonych, Liczba czerwieni lub Liczba nakładania się (na obraz), a następnie wybierz punkty czasowe i dołki do wyeksportowania. W przypadku grupowania wyboru wybierz opcję Replikuje mapę płyt, jeśli wszystkie dołki są poprawnie określone podczas skanowania.
9. Eksportuj dane. Oblicz procent komórek tworzących NET dla każdego warunku/punktu czasowego za pomocą poniższego równania za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
   
   UWAGA: Powodem, dla którego mianownikiem jest maksymalna liczba czerwonych obiektów, jest to, że liczba czerwonych obiektów osiąga szczyt w około 1 godzinie i stopniowo maleje z powodu śmierci komórki.

Ta metoda dostarcza kontrastu fazowego, obrazy czerwonej fluorescencji (barwnik przepuszczalny dla membrany) i zielonej fluorescencji (barwnik nieprzepuszczalny dla membrany) wykonane w każdym punkcie czasowym. Wraz z procesem tworzenia NET obserwuje się zmiany morfologiczne w kontrastach fazowych i czerwonych obrazach fluorescencyjnych, a po przerwaniu błony można zaobserwować zieloną fluorescencję (Rysunek 1). W tym teście neutrofile tworzące NET są na ogół okrągłe, zamiast tworzyć strukturę przypominającą sieć. Dzieje się tak, ponieważ rozdzielczość maszyny nie jest wystarczająco wysoka, aby uchwycić drobną strukturę przypominającą wstęgę, a nieprzepuszczalny dla membrany zielony barwnik plami chromatynę, zanim zostanie uwolniony po naruszeniu membrany. Wcześniej pokazaliśmy7, że NET mogą być wizualizowane za pomocą obrazowania konfokalnego na 96-dołkowych płytkach pobranych po 4 godzinach inkubacji.

Gdy definicja analizy jest odpowiednio ustawiona, wszystkie neutrofile na obrazie są oznaczone jako czerwony obiekt, a neutrofile tworzące NET są oznaczone jako zielony obiekt (Rysunek 2). Maszyna zlicza liczbę czerwonych i zielonych obiektów w każdym punkcie czasowym. Przebieg czasowy powstawania NET jest wizualizowany poprzez wykreślenie procentu neutrofili tworzących NET w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3). Potencjalne cząsteczki, które są ukierunkowane na tworzenie NET (np. inhibitor AKT) mogą być testowane w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu tej metodologii.

Rysunek 1: Zmiany morfologiczne w neutrofilach przechodzących tworzenie NET. (A) Ludzkie neutrofile krwi obwodowej, które były stymulowane 2,5 μM jonoforem wapnia przez 3 godziny. (B) Reprezentatywne widoki pojedynczej komórki kontrastu fazowego, kanału czerwonego (barwnik jądrowy przepuszczalny dla błony), kanału zielonego (barwnik DNA nieprzepuszczalny dla błony) i obrazu połączonego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy pokazujące programowe rozpoznawanie neutrofili i NET. Neutrofile od zdrowych ochotników stymulowano 2,5 μM jonoforem wapnia przez 1 godzinę. Wyświetlane są nałożone obrazy obrazowania z kontrastem fazowym oraz każdy sygnał lub maska. Jądra zostały wybarwione (A) przepuszczalnym przez błonę czerwonym barwnikiem, a oprogramowanie rozpoznało i policzyło (B) jądra oznaczone na niebiesko, podczas gdy NET zostały wybarwione (C) nieprzepuszczalnym dla błony zielonym barwnikiem, a oprogramowanie oznaczyło je jako (D) fioletowe. Jeśli wystąpi (E) nadmierne wykrywanie lub (F) niedostateczne wykrywanie, może być konieczna zmiana parametru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przebieg w czasie procentu neutrofili tworzących NET. Neutrofile były stymulowane przez 12-mirystynian 13-octanu (PMA) o stężeniu 25 nM lub jonoforu wapnia o stężeniu 2,5 μM w celu indukcji NET lub pozostawiono niestymulowane w RPMI. Dodanie inhibitora 30 μM AKT miało na celu zablokowanie tworzenia się NET. Obrazy były uzyskiwane przez oprogramowanie co 20 minut przez 6 godzin. Procent komórek tworzących NET obliczono, dzieląc liczbę zielonych obiektów (= liczbę komórek tworzących NET) przez liczbę czerwonych obiektów (= liczbę wszystkich neutrofili). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.