Artykuł metodologiczny

Analiza mikrotomografii komputerowej kolana u starszych świnek morskich Dunkin-Hartley po wstrzyknięciu dostawowym

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66053

⸱

2 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, 2Department of Biomedical Science, The University of Alabama at Birmingham, 3Department of Comparative Medicine, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Świnki morskie Dunkin-Hartley są uznanym modelem zwierzęcym do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów. Takie badania mogą być korzystne dla zastrzyków dostawowych z różnych powodów, w tym badania nad nowymi lekami lub leczenie choroby. Opisano metodologię iniekcji dostawowych do kolana u świnek morskich, a następnie analizę mikrotomografii komputerowej oceniającą zmiany związane z zapaleniem stawów kolanowych.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest pomoc badaczom w przeprowadzaniu techniki dostawowego wstrzykiwania kolana u świnek morskich pod kontrolą palpacyjną i oceny za pomocą mikrotomografii komputerowej. Świnki morskie Dunkin-Hartley są solidnymi modelami do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów, ponieważ spontanicznie rozwija się u nich choroba zwyrodnieniowa stawów kolanowych. Dostawowe podawanie leków jest powszechną metodą badania skutków działania badanego leku in vivo. U ludzi środki terapeutyczne podawane we wstrzyknięciu dostawowym mogą przynieść ulgę w bólu i opóźnić dalszy postęp choroby zwyrodnieniowej stawów. Podobnie jak w przypadku każdego gatunku, wprowadzenie igły do przestrzeni stawowej może spowodować obrażenia, które mogą skutkować bólem, kulawizną lub infekcją. Takie zdarzenia niepożądane mogą zagrozić dobrostanowi zwierząt, zakłócić wyniki badania i wymagać dodatkowych zwierząt, aby osiągnąć cele badania. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiednich technik iniekcji, aby zapobiec powikłaniom, szczególnie w badaniach podłużnych, które wymagają wielokrotnych, powtarzających się wstrzyknięć dostawowych. Stosując przedstawioną metodologię, pięć świnek morskich otrzymało obustronne iniekcje do kolana w znieczuleniu ogólnym. Siedem dni po wstrzyknięciu zwierzęta zostały humanitarnie poddane eutanazji w celu analizy ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów. Po znieczuleniu lub zastrzykach do kolana nie wystąpiły żadne zdarzenia niepożądane, w tym utykanie, ból lub infekcja. Analiza rentgenowska mikrotomografii komputerowej kolana może wykryć zmiany patologiczne związane z chorobą zwyrodnieniową stawów. Dane z tomografii mikrokomputerowej wskazują, że choroba zwyrodnieniowa stawów jest cięższa u starszych zwierząt, na co wskazuje zwiększona gęstość mineralna kości i grubość beleczkowania wraz z wiekiem. Wyniki te są zgodne ze zmianami histologicznymi i zmodyfikowanymi wynikami Mankina, ustalonym i szeroko stosowanym systemem punktacji do oceny nasilenia zapalenia stawów u tych samych zwierząt. Protokół ten może być wykorzystany do udoskonalenia iniekcji dostawowych u świnek morskich.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) dotyka 32,5 miliona dorosłych Amerykanów. Jest to spowodowane postępującą utratą chrząstki stawowej, łagodnym stanem zapalnym tkanek w stawach i wokół nich oraz tworzeniem się osteofitów i torbieli kostnych1,2. Objawy zwykle objawiają się w późniejszych stadiach choroby, przy czym obecne leczenie zapewnia jedynie ulgę paliatywną, a także ma ogólnoustrojowe skutki uboczne. Brak leków modyfikujących przebieg choroby wynika ze słabego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby3. W związku z tym istnieje krytyczna i ciągła potrzeba medyczna w zakresie ulepszonych środków do leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów.

Dostępnych jest kilka zwierzęcych modeli choroby zwyrodnieniowej stawów, które badają różne składniki procesów chorobowych4. Chociaż istnieje kilka modeli chirurgicznych, w tym przecięcie więzadła krzyżowego przedniego i destabilizacja łąkotki przyśrodkowej, są one inwazyjne i wymagają wysokiego poziomu umiejętności technicznych5. Modele indukowane chemicznie są stosunkowo mniej inwazyjnymi procedurami, zwykle stosowanymi do badania mechanizmów bólu zwyrodnieniowego stawów6. Jednym z takich szeroko stosowanych modeli mysich jest indukcja choroby zwyrodnieniowej stawów przez dostawowe wstrzyknięcie do kolana jodooctanu sodu (MIA). Model ten generuje powtarzalny, solidny i szybki fenotyp podobny do bólu, który można stopniować, zmieniając dawkę MIA7. Szczegóły techniczne indukowania tego modelu zostały już wcześniej opisane7. Przełożenie tej techniki na większe gryzonie, takie jak świnki morskie, jest trudne ze względu na ich różnice anatomiczne. Niektóre różnice obejmują zwiększoną muskulaturę otaczającą sąsiednie kości i przestrzeń stawową u świnki morskiej oraz przegubową kość strzałkową i piszczelową w porównaniu z dystalnym zrośninięciem obserwowanym u myszy8. Świnki morskie Dunkin-Hartley, powszechnie dostępny szczep świnki morskiej, są uznanym modelem zwierzęcym choroby zwyrodnieniowej stawów, ponieważ naturalnie rozwijają tę chorobę, oferując tym samym solidny model do badania wpływu nowych terapii podawanych w iniekcji dostawowej na postęp choroby9. Świnki morskie Dunkin-Hartley zaczynają rozwijać chorobę zwyrodnieniową stawów w wieku trzech miesięcy, przy czym samce wykazują przyspieszony rozwój i cięższy fenotyp10. U świnek morskich choroba zwyrodnieniowa stawów postępuje wraz z wiekiem, a po 12 miesiącach związana z nią patologia jest widoczna w obrazowaniu11. Spontaniczne modele choroby zwyrodnieniowej stawów, takie jak model Dunkina-Hartleya, nie wymagają żadnej interwencji w celu wywołania choroby zwyrodnieniowej stawów, a tym samym rekapitulują rozwój i progresję fenotypu choroby u ludzi, zapewniając w ten sposób potężny model translacyjny10. Co więcej, spontaniczny rozwój choroby zwyrodnieniowej stawów pozwala na kontrolę wewnętrzną, gdy nowe terapie są podawane jednostronnie w jedno kolano danego zwierzęcia. Ta wewnętrzna kontrola minimalizuje skutki zmienności między zwierzętami podczas analizy danych i może pomóc w zmniejszeniu ogólnej liczby zwierząt.

Analiza mikrotomografii komputerowej rentgenowskiej (μCT) to potężne narzędzie, które pozwala na ilościową ocenę ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów12. μCT polega na skanowaniu wielu obrazów rentgenowskich o wysokiej rozdzielczości, uzyskanych z obracającej się próbki lub obracającego się źródła i detektora promieniowania rentgenowskiego13. Następnie trójwymiarowe (3D) dane wolumetryczne są rekonstruowane w postaci ułożonych w stos wycinków obrazu14. Ponieważ zmineralizowana kość ma doskonały kontrast w μCT, ta modalność może być używana do oceny cech 3D i wykonywania analiz ilościowych zmian związanych z OA15,16,17. μCT ma kilka zalet w porównaniu z szerzej stosowanymi narzędziami, w tym histopatologią i analizą chodu. W przeciwieństwie do oceny histologicznej jednego lub kilku odcinków tkanek, μCT skanuje cały staw i oferuje bardziej holistyczną ocenę zmian chorobowych w chorobie zwyrodnieniowej stawów18. Podczas gdy analiza chodu może dostrzec objawowe zmiany w funkcjonowaniu stawów w czasie, zmiany w stawach rozwijają się na długo przed zmianami funkcjonalnymi związanymi z chorobą zwyrodnieniową stawów. μCT może zapewnić bardziej czułą miarę rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów przed wystąpieniem kulawizny. Dwa szczególnie istotne pomiary ilościowe obejmują gęstość mineralną kości i grubość beleczkowania, ponieważ oba te czynniki zwiększają się wraz z postępem OA19,20. Pomocne może być podzielenie analizy na płytkę podchrzęstną i kość beleczkową, ponieważ mają one różne cechy, aby uzyskać bardziej wiarygodne pomiary i porównania.

Ogólnym celem tej metody jest pomoc naukowcom w skutecznym wykonywaniu zastrzyków dostawowych świnkom morskim. W przedstawionym protokole wykorzystano pięciomiesięczne (n=2), dziewięcio- (n=1) i 12-miesięczne (n=2) nienaruszone samce świnek morskich Dunkin-Hartley; Procedury można ekstrapolować na inne szczepy świnek morskich i w wieku wymagającym zastrzyków dostawowych do kolana. W spontanicznych modelach choroby zwyrodnieniowej stawów, takich jak model Dunkina-Hartleya, postęp choroby i odpowiedź na seryjne leczenie są często monitorowane przez długie okresy czasu, od tygodni do miesięcy9. Ten rozszerzony protokół skutkuje wielokrotnymi wstrzyknięciami dostawowymi, dlatego ważne jest, aby mieć odpowiednią technikę wstrzykiwania, aby zapobiec zdarzeniom niepożądanym, w tym bólowi, kulawiznie lub infekcjom, z których wszystkie mogą wpływać na dobrostan zwierząt i zakłócać wyniki badań, jednocześnie wymagając dodatkowych zwierząt w badaniu. W przedstawionym protokole opisano metodykę iniekcji dostawowych u świnek morskich oraz późniejszą analizę danych z μCT.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny. W badaniu zastosowano zasadę 3R.

1. Preparaty do iniekcji dostawowych

  1. Pozwól świnkom morskim Dunkin-Hartley zaaklimatyzować się w obiekcie przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Wykorzystano 5- (n=2), 9- (n=1) i 12- (n=2) miesięczne samce świnek morskich. Samce wykazują przyspieszony rozwój i cięższy fenotyp choroby zwyrodnieniowej stawów.
  2. Ogol okolice kolan elektryczną maszynką do golenia.
    UWAGA: Uważaj na sutki przyśrodkowo.
  3. Znieczulić świnkę morską w komorze izofluranowej, dostarczając 3-5% izofluranu w mieszaninieO2 (natężenie przepływu 2,5 l/min), a następnie przenieść świnkę morską do stożka nosowego podłączonego do obwodu znieczulenia bez ponownego oddychania. Dostosuj izofluran, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia podczas wstrzyknięcia, zwykle przy natężeniu przepływu tlenu 0,5-1 l/min i 1-3% izofluranu.
    UWAGA: Iniekcje dostawowe powodują łagodny, chwilowy ból. Zwierzęta są znieczulane podczas zabiegu, aby zapobiec odczuwaniu bolesnych bodźców i poprawić dokładność iniekcji. W prezentowanym badaniu podawanie leków przeciwbólowych, w tym niesteroidowych leków przeciwzapalnych, zaburzałoby postęp choroby zwyrodnieniowej stawów21. Ze względu na chwilowy ból, zapewnione znieczulenie i możliwość zmylenia modelu przez leki przeciwbólowe, leki przeciwbólowe nie były podawane, chyba że zwierzęta wykazywały skutki uboczne, w tym utykanie i oznaki bólu w badaniu palpacyjnym stawu po wstrzyknięciu. Badacze powinni rozważyć zastosowanie leków przeciwbólowych do rutynowych wstrzyknięć. Leki przeciwbólowe są zalecane, gdy występują działania niepożądane. Schematy leczenia przeciwbólowego powinny być omówione z lekarzem weterynarii i zatwierdzone przez IACUC przed rozpoczęciem badań.
  4. Upewnij się, że świnka morska znajduje się na odpowiedniej głębokości znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  5. Umieść sterylny lubrykant do oczu na obu oczach, aby zapobiec wysuszeniu i obrażeniom.
  6. Rozcieńczyć betadynę sterylną wodą do 10%.
  7. Rozcieńczyć 200-procentowy etanol sterylną wodą do 70% etanolu.
  8. Przygotować roztwory do wstrzykiwań w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylność. W przedstawionym protokole do wstrzyknięcia obu kolan użyto sterylnego nośnika (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem). Rozwiązania mogą być zmieniane w zależności od celów badawczych.
    UWAGA: Należy upewnić się, że świeże roztwory do wstrzykiwań zostały rozcieńczone bezpośrednio przed sesją wstrzykiwań, aby zapewnić sterylność. Wszelkie niewykorzystane roztwory należy wyrzucić po zakończeniu każdej sesji wstrzykiwania.
  9. Napełnij sterylne strzykawki insulinowe jednorazowego użytku roztworami do wstrzykiwań. Zadbaj o to, aby wykorzystać jak najmniejszą objętość, aby zapobiec przeciążeniu przestrzeni stawowej objętością. W niniejszym badaniu użyto 50 μl.
  10. Umieść świnkę morską i stożek nosowy na czystej powierzchni z poduszką grzewczą zapewniającą wsparcie termiczne i wyściółką pod głową, aby ją lekko podnieść.
  11. Załóż fartuch chirurgiczny, siatkę na włosy, sterylne rękawiczki i maskę podczas wykonywania procedury wstrzykiwania.
  12. Wlej 10% betadyny na wacik i przetrzyj obie okolice kolan.
  13. Wlej 70% etanolu na wacik i przetrzyj obie okolice kolan.
  14. Powtórz 1.12 i 1.13 jeszcze dwa razy.
    UWAGA: W celach demonstracyjnych odpowiedni film pokazuje jednokrotne czyszczenie kolana i miejsca wstrzyknięcia za pomocą 10% betadyny i 70% etanolu. Miejsce wstrzyknięcia zostało następnie oczyszczone ruchami okrężnymi jeszcze dwa razy, naprzemiennie z tymi roztworami. W celu uzyskania techniki aseptycznej zaleca się trzy seryjne peelingi z naprzemiennymi roztworami do szorowania i alkoholem.

2. Wstrzyknięcie dostawowe

  1. Umieść świnkę morską w pozycji leżącej na plecach przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Załóż nową parę sterylnych rękawiczek i zbadaj palpacyjnie staw kolanowy.
    UWAGA: W prezentowanym protokole i filmie zastosowano autoklawizowane rękawice nitrylowe. Do techniki aseptycznej należy używać sterylnych rękawic, w tym autoklawowanych rękawic nitrylowych lub rękawic chirurgicznych.
  3. Ręcznie zegnij kolano pod kątem 90°.
  4. Przesuń palec dystalnie do rzepki, aby zlokalizować rowek dystalnego aspektu przestrzeni stawowej, zginając i prostując kończynę tylną.
    UWAGA: Rzepka może być badana palpacyjnie w tej pozycji jako mała, mocna struktura znajdująca się bezpośrednio nad przestrzenią stawową. Kość piszczelowa może być wyczuwalna jako struktura kostna dystalna do rzepki. Po ustaleniu położenia kości piszczelowej i rzepki, staw, wyczuwalny jako rowek, znajduje się między nimi, dystalnie do rzepki i proksymalnie do kości piszczelowej.
  5. Ostrożnie wbić igłę insuliny w linię środkową dystalną do rzepki w przestrzeni stawowej. Igłę należy wprowadzić 1-2 mm poniżej skóry, aby wejść do przestrzeni stawowej.
    UWAGA: Największe okno dostępu do przestrzeni stawowej, gdy kolano jest zgięte, znajduje się w przedniej części kończyny w linii środkowej, bezpośrednio dystalnie do rzepki. Wstrzykiwanie w linii środkowej w kierunku od przodu do tyłu pomoże w dokładnym wstrzyknięciu do przestrzeni stawowej bez wnikania w struktury kostne. Dokładne wstrzyknięcie do przestrzeni stawowej można osiągnąć przy użyciu podejścia bocznego do przyśrodkowego, chociaż okno dostępu jest węższe, zwłaszcza gdy kolano jest zgięte.
  6. Powoli wstrzyknąć 50 μl roztworu do stawu. Upewnić się, że igła łatwo się wprowadza, a zawartość jest wstrzykiwana bez oporu.
    UWAGA: Upewnij się, że nie wkładasz igły zbyt głęboko, ponieważ może to spowodować uszkodzenie stawów lub kości i spowodować niepożądane zapalenie i/lub ból. Jeśli rowek odpowiadający przestrzeni stawowej nie zostanie znaleziony, igła może przebić kość udową, rzepkę lub piszczel. Dlatego korzystne jest pewne badanie palpacyjne rowka odpowiadającego przestrzeni stawowej, aby zapobiec iniekcjom okołostawowym lub urazom związanym z penetracją struktur kostnych. Jeśli w miejscu wstrzyknięcia pod skórą pojawi się pęcherzyk, oznacza to, że wstrzyknięcie było zbyt płytkie i płyn dostał się do przestrzeni podskórnej. W zależności od właściwości zastosowanego środka, lek może dostać się do przestrzeni stawowej poprzez dyfuzję lub może być potrzebna kolejna próba wstrzyknięcia.
  7. Po zakończeniu wyrzuć igłę do pojemnika na ostre przedmioty.
    UWAGA: W celach praktycznych i treningowych wstrzyknij płyn zawierający barwnik w przestrzeń stawową zwłok gryzonia lub świnki morskiej podobnej wielkości. Następnie należy wyciąć staw, aby potwierdzić lokalizację wstrzyknięcia.
  8. Masuj kolano, zginając i rozciągając staw kilka razy, aby ułatwić dyfuzję leku w przestrzeni stawowej.
  9. Powtórz kroki 2,1-2,5 raz na przeciwległej kończynie z 1x roztworem PBS.

3. Rekonwalescencja po wstrzyknięciu dostawowym

  1. Wyłącz izofluran i utrzymuj 100% przepływ tlenu, aż zwierzę odzyska przytomność.
  2. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby uzyskać wsparcie termiczne do czasu rozpoczęcia chodzenia.
  3. Nałóż okład z lodu na kolano na 30 s z ręcznikiem papierowym jako barierę, aby zmniejszyć obrzęk po wstrzyknięciu.
  4. Oceń chód zwierzęcia podczas chodzenia przed powrotem do domu.
    UWAGA: W przypadku zauważenia jakichkolwiek nieprawidłowości chodu uzasadnione mogą być leki przeciwbólowe i leczenie wspomagające. Wskazane jest ponowne zbadanie ich chodu kilka godzin po wyzdrowieniu ze znieczulenia, aby zapewnić normalną mobilność.

4. Skan mikrotomografii komputerowej (μCT)

  1. W celu pobrania tkanek należy ustalić chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia ze 100% mieszaniną tlenu i 5% izofluranu.
  2. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przy braku odpowiedzi na bodziec szczypania palca u nogi. Humanitarna eutanazja zwierzęcia poprzez podanie dożylnie ≥ 150 mg/kg pentobarbitalu zgodnie z polityką instytucjonalną i zatwierdzonym protokołem stosowania na zwierzętach.
    UWAGA: W przedstawionym protokole każda z pięciu świnek morskich otrzymała po jednym zastrzyku w oba kolana. Zwierzęta zostały znieczulone i humanitarnie poddane eutanazji tydzień po wstrzyknięciu.
  3. Zbierz obie tylne kończyny, odcinając skórę od otaczających mięśni.
  4. Następnie rozłącz tylną kończynę za pomocą Rongeurs w środkowej części kości udowej i bliżej kostki.
    UWAGA: Zastosowane łóżko skanujące i uchwyt na próbki nie były w stanie pomieścić całej tylnej kończyny dorosłej świnki morskiej. Duże uchwyty na próbki są dostępne w handlu dla większych rozmiarów próbek.
  5. Umieść tkanki w obojętnym buforowanym roztworze formaliny na 72 godziny w celu utrwalenia przed wykonaniem μCT.
  6. Otwórz oprogramowanie do skanowania μCT i umieść próbkę z formaliną w kompatybilnym pojemniku, który zmieści się w folderze na próbki μCT, zachowując jednocześnie tkankę w polu widzenia.
  7. Kalibruj urządzenie μCT pod kątem ekspozycji na ciemne i jasne pole zgodnie z zaleceniami producenta.
  8. Zeskanuj próbkę za pomocą filtra Al+Cu przy 18 μm. Użyj kroku obrotu 0,7°, aby uzyskać 360° z kamerą offsetową.
    UWAGA: Skan zostanie automatycznie zapisany.

5. Przetwarzanie obrazu do oceny parametrów mikroarchitektonicznych kości

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do rekonstrukcji μCT do rekonstrukcji obrazów μCT.
  2. Wybierz folder z oprogramowaniem i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć oprogramowanie.
  3. Wybierz jeden plasterek z obrazów μCT, klikając plasterek obrazu.
  4. Wybierz miejsce docelowe pliku rekonstrukcji. Wybierz pozycję Przeglądaj i utwórz nowy folder o nazwie Recon. Wybranym formatem pliku powinno być BMP(8).
  5. Sprawdź kompensację niewspółosiowości.
    UWAGA: Zazwyczaj oszacowanie jest bliskie poprawnemu, ale można je dostosować ręcznie, aby przesunąć nakładające się obrazy tak, aby prawa i lewa krawędź były wyrównane tak blisko, jak to możliwe.
  6. W obszarze Ustawienia zastosuj algorytmy Wygładzania, Hartowania Belki, Obrotu CS i Artefaktów pierścienia.
    UWAGA: Pomocne może być wybranie obrazu podglądu, aby określić przejrzystość przed rekonstrukcją. Ustawienie dostrajania może być również pomocne w określeniu, które ustawienia są najlepsze.
  7. Wybierz opcję Uruchom, aby rozpocząć przetwarzanie rekonstrukcji.

6. Zbieranie danych mikroarchitektonicznych ze zrekonstruowanych obrazów

  1. Pobierz i zainstaluj przeglądarkę Dataviewer.
  2. Wybierz VOI i zorientuj próbkę tak, aby wyrównała się w pionie, aby ułatwić analizę w późniejszym czasie.
  3. Zapisz edytowany VOI jako nowy folder.
  4. Pobierz i zainstaluj CTAnalyser do analizy właściwości kości parametrów mikroarchitektonicznych.
    UWAGA: Darmowa wersja CTAnalyser ma ograniczoną funkcjonalność, dlatego zaleca się uzyskanie pełnej licencji.
  5. Podziel analizę na płytkę podchrzęstną i kość beleczkową, zapisując je jako oddzielny zakres obrazów.
    UWAGA: Dzielenie analizy nie jest konieczne, ale ponieważ płytka podchrzęstna i kość beleczkowa mają różne cechy, oddzielne analizy mogą pomóc w solidnych pomiarach i porównaniach.
  6. Wybierz zakres obrazów do analizy, zaczynając od płytki podchrzęstnej, klikając wycinek obrazu, od którego chcesz zacząć.
  7. Wybierz obszar zainteresowania dla każdego obrazu, aby upewnić się, że obejmuje on kość, klikając kartę obszaru zainteresowania.
  8. Wybierz kartę Zaznaczanie binarne. Dopasuj histogram tak, aby tło i kość były całkowicie oddzielone.
  9. Wybierz kartę Gęstość mineralna kości (BMD). Zapisz te dane w nowym folderze danych analizy.
  10. Wybierz opcję Przetwarzanie niestandardowe i przejdź do zakładki Wewnętrzne.
  11. Najpierw wykonaj Thresholding i wybierz Automatic Otsu, a następnie Run.
  12. Następnie wybierz opcję Usuń plamki i wybierz Usuń czarne plamki, a następnie Uruchom.
  13. Powtórz usuwanie plamek i wybierz Usuń białe plamki, a następnie Uruchom.
  14. Wybierz opcję Analiza 3D, a następnie wybierz Wartości podstawowe i Wartości dodatkowe.
  15. Powtórz kroki 6.2.2-6.4.5, aby zresetować obraz do analizy kości beleczkowej.
    UWAGA: Upewnij się, że plik wyjściowy znajduje się w nowym folderze z tym samym plikiem, co dane BMD.

Wyniki

Przed wykonaniem wstrzyknięć dopracsowych u żywych zwierząt, powyższy protokół przećwiczono na trzech trupich szczurach, aby zapewnić prawidłowe miejsce wstrzyknięcia. Podczas sesji ćwiczeń 50 µL 70% barwnika nowym błękitem metylenowym wstrzyknięto do obu stawów kolanowych, stosując opisaną powyżej metodologię. Odpowiada to sześciu ćwiczeniowym wstrzyknięciom. Po wstrzyknięciach staw kolanowy wypreparowano, wykonując nacięcie przez przednią stronę przestrzeni stawowej, dystalnie względem rzepki i przez więzadło rzepki, aby zwizualizować przestrzeń stawową i zweryfikować miejsce osadzenia barwnika. Ponieważ nowy błękit metylenowy jest roztworem o intensywnie niebieskim kolorze, miejsce osadzenia barwnika można ocenić makroskopowo. Reprezentatywne zdjęcia z wstrzyknięć u trupów zamieszczono na Rysunku 1. Rysunek 1A pokazuje obecność barwnika w przestrzeni stawowej, co świadczy o prawidłowym miejscu i technice wstrzyknięcia. Podczas tych sesji ćwiczeń staw kolanowy został pomyślnie nakłuty we wszystkich sześciu próbach (100% skuteczności). W celach demonstracyjnych przykłady nieprawidłowego miejsca wstrzyknięcia zamieszczono na Rysunku 1B-C. Jeśli wstrzyknięcie zostanie wykonane w przestrzeni podskórnej, ciecz nagromadzi się, powodując powstanie pęcherzyka pod skórą, co widać na Rysunku 1B. Jeśli przestrzeń stawowa nie zostanie nakłuta, w stawie kolanowym nie będzie obecnego barwnika, co pokazano na Rysunku 1C.

Każde z 5 świniatek poddano jednorazowej procedurze obustronnego wstrzykiwania 1x fosforanu buforowanego soli w ramach eksperymentu pilotażowego, aby zapewnić wykonalność iniekcji i późniejszych analiz µCT zmian w OA związanych z wiekiem. Zwierzęta były oceniane wizualnie co najmniej raz dziennie po zabiegu pod kątem ogólnego stanu zdrowia i wystąpienia zdarzeń niepożądanych. Żadne (0%) z tych zwierząt nie doświadczyło zdarzeń niepożądanych związanych z wstrzyknięciem, takich jak ból, kulawizna czy infekcja. Siedem dni po iniekcji zwierzęta wprowadzono w stan znieczulenia chirurgicznego i humanitarnie uśmiercono w celu pobrania stawów kolanowych i przeprowadzenia późniejszych analiz µCT.

Jak opublikowano wcześniej, analiza µCT może być wykorzystana do oceny zmian w kolanach świni domestica, w tym do pomiaru ilościowych zmian związanych z nasileniem OA w czasie22,23. W przedstawionym badaniu µCT wykorzystano do weryfikacji zmian OA u świnek morskich w różnym wieku. Wyniki te mogą służyć jako dane bazowe dla przyszłych badań oceniających nowe metody leczenia mające na celu opóźnienie progresji OA. Opisana powyżej metodologia pozwoli na standaryzację analiz µCT w przyszłych badaniach. Blaszka podchrzestna (Rysunek 2A) oraz kość beleczkowata (Rysunek 2B) charakteryzują się drastycznie różnymi właściwościami kostnymi. W związku z tym obszary te są analizowane oddzielnie, aby uzyskać bardziej wiarygodny wynik tydzień po wstrzyknięciu.

Mineralna gęstość kości (BMD) jest wyższa u 12-miesięcznych świstaków w porównaniu z osobnikami w wieku 5 i 9 miesięcy (Rycina 3). Średnia BMD płytki podchrzestnej wynosiła odpowiednio 0,898 g/cm3, 0,952 g/cm3 i 0,588 g/cm3 u świstaków w wieku odpowiednio 12, 9 i 5 miesięcy. Wykazuje to 1,53-krotny wzrost BMD podchrzestnej u 12-miesięcznych świstaków w porównaniu z 5-miesięcznymi. Średnia BMD kości beleczkowatej wynosiła odpowiednio 0,825 g/cm3, 0,839 g/cm3 i 0,427 g/cm3 u świstaków w wieku odpowiednio 12, 9 i 5 miesięcy. Reprezentuje to 1,93-krotny wzrost BMD beleczkowatej u 12-miesięcznych świstaków w porównaniu z 5-miesięcznymi. Ogólnie BMD wzrasta u świstaków rasy Dunkin-Hartley wraz z wiekiem od 5 do 12 miesięcy (Rycina 3).

Odnotowano również różnice w grubości beleczek kostnych u świnek morskich w różnym wieku (Rycina 4). Średnia grubość beleczek kostnych była 1,38 raza większa u osobników 12-miesięcznych (0,558 mm) w porównaniu z 9-miesięcznymi (0,403 mm), a także 2,48 raza większa u 12-miesięcznych (0,558 mm) w porównaniu ze świnkami morskimi 5-miesięcznymi (0,225 mm). Zatem średnia grubość beleczek kostnych wzrasta u świnek morskich rasy Dunkin-Hartley wraz z wiekiem od 5 do 12 miesięcy.

Zmiany histologiczne oraz zmodyfikowane oceny według skali Mankina, zwalidowane i szeroko stosowane podejście do oceny zmian OA w 2D, potwierdzają wyniki µCT (Rysunek 5). Zmodyfikowane oceny według skali Mankina wzrosły wraz z wiekiem świstaków (Rysunek 5A). Histologicznie objawy OA, w tym utrata proteoglikanów, hipokomórkowość i szczeliny, zwiększają swoją częstotliwość występowania w miarę starzenia się świstaków od 5. do 12. miesiąca życia (Rysunek 5B-D).

Procedura chirurgiczna na zwierzęciu laboratoryjnym, przewodnik krok po kroku z przedstawionym procesem nacięcia i szycia.
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy prawidłowych i nieprawidłowych miejsc wstrzyknięcia. (A) Disekcja kolana szczura z obecnością barwnika nowego błękitu metylenowego w przestrzeni stawowej. Po lewej stronie kolana dołączono skalę jako punkt odniesienia. (B) Kolano wykazujące powierzchowne wstrzyknięcie, w wyniku którego w przestrzeni podskórnej utworzył się pęcherzyk. (C) Disekcja kolana z panelu B potwierdzająca brak nowego błękitu metylenowego w przestrzeni stawowej. Po prawej stronie kolana dołączono skalę jako punkt odniesienia. Na wszystkich obrazach góra odpowiada kierunkowi kranialnemu, a dół kierunkowi kaudalnemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

MRI mikrostruktury kości, regiony A i B zakodowane kolorami, analiza przekroju, skala 2,5 mm.
Rycina 2: Segmentacja pól pomiarowych dla blaszki podchrzestnej i kości beleczkowej. Blaszka podchrzestna wykazuje inne właściwości niż kość beleczkowa. Analiza tych obszarów osobno pozwala na porównania między różnymi regionami w trakcie postępu OA. Region A (czerwony) przedstawia widok koronalny segmentu blaszki podchrzestnej wykorzystanego do analizy. Region B (zielony) przedstawia widok koronalny segmentu kości beleczkowej wykorzystanego do analizy. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres słupkowy gęstości mineralnej kości; porównanie kości podchrzestnej i beleczkowej w 5., 9. i 12. miesiącu.
Rysunek 3: Zmiany gęstości mineralnej kości u starzejących się świni GUIK Dunkin-Hartley. Oceniono gęstość mineralną kości (BMD) u świni GUIK w wieku 5 (n=2), 9 (n=1) i 12 (n=2) miesięcy. Pomiary wykonano w obrębie blaszki podchrzestnej oraz kości beleczkowej w dwóch różnych pomiarach. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres słupkowy grubości beleczek kostnych; miesiące 5, 9, 12; pokazuje wzrost gęstości kości; analiza danych.
Rycina 4: Zmiany grubości beleczek kostnych u starzejących się świniaków Dunkin-Hartley. Pomiary grubości beleczek wykonano u świniaków w wieku 5 (n=2), 9 (n=1) i 12 (n=2) miesięcy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres zmodyfikowanej punktacji Mankina i obrazy histologiczne chrząstki; analiza degeneracji; badanie zależne od czasu.
Rycina 5: Analiza histologiczna zmian OA u świnek morskich rasy Dunkin-Hartley. (A) Zmodyfikowane punktacje Mankina dla próbek histologicznych od świnek morskich w wieku 5 (n=2), 9 (n=1) i 12 miesięcy (n=2). Zmodyfikowaną punktację Mankina obliczono poprzez zsumowanie indywidualnych ocen struktury chrząstki, komórkowości, linii tidemark oraz formowania się osteofitów. (B) Reprezentatywny obraz histologiczny barwiony błękitem toluidyny od 5-miesięcznej świnki morskiej. (C) Reprezentatywny obraz histologiczny barwiony błękitem toluidyny od 9-miesięcznej świnki morskiej. czarny * = utrata proteoglikanów. D. Reprezentatywny obraz histologiczny barwiony błękitem toluidyny od 12-miesięcznej świnki morskiej. czarny * = szczeliny; biały * = hipokomórkowość. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Pomimo ostatnich postępów w objawowym leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów, występuje całkowity brak środków terapeutycznych, które zapobiegałyby wystąpieniu lub opóźniały postęp choroby zwyrodnieniowej stawów24. Obecnie jedynym lekarstwem na ciężką chorobę zwyrodnieniową stawów jest wymiana stawów, która jest kosztowna, inwazyjna i może prowadzić do zachorowalności i śmiertelności pacjentów25. W związku z tym istnieje pilna potrzeba kontynuowania badań na zwierzęcych modelach choroby zwyrodnieniowej stawów i ciągłego rozwoju nowych metod terapeutycznych. Dostępnych jest kilka modeli zwierzęcych do badania różnych składników choroby zwyrodnieniowej stawów, w tym modele spontaniczne i indukowane chemicznie lub chirurgicznie. Wstrzykiwanie substancji chemicznych, podobnie jak w mysim modelu MIA, jest niezbędne do badania bólu, ale nie pozwala badaczom śledzić postępu rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów i interweniować w pożądanych punktach czasowych przez całyprzebieg choroby. Metody chirurgiczne wymagają inwazyjnych procedur i nie są w stanie wiernie odzwierciedlić inicjacji choroby zwyrodnieniowej stawówu ludzi 27. Świnki morskie Dunkin-Hartley naturalnie rozwijają chorobę zwyrodnieniową stawów, co czyni je powszechnie dostępnym spontanicznym modelem choroby zwyrodnieniowejstawów 28. Ten spontaniczny model jest idealny do badań translacyjnych nad mechanistycznym rozwojem choroby zwyrodnieniowej stawów, ponieważ nie wymaga interwencji i zawiera zmiany patologiczne, które odzwierciedlają te u ludzi6. Wcześniej opublikowane prace wykorzystywały zastrzyki dostawowe do testowania wpływu nowych terapii na postęp spontanicznej choroby zwyrodnieniowej stawów u świnek morskich Dunkin-Hartley 29,30,31.

Chociaż iniekcje dostawowe u myszy zostały już wcześniej opisane, różnice anatomiczne stanowią dodatkowe wyzwanie dla tej procedury u świnek morskich7. Chociaż zastrzyki dostawowe są integralną częścią badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów u świnek morskich, procedura ta nie została jeszcze systematycznie szczegółowo opisana. Za pomocą opisanej metodologii zwracamy uwagę na kluczowe kwestie dotyczące udoskonalenia iniekcji dostawowych u świnek morskich, zmniejszając w ten sposób możliwość wystąpienia powikłań związanych z zabiegiem. Częste działania niepożądane po wstrzyknięciach dostawowych u ludzi obejmują ból, obrzęk, septyczne zapalenie stawów i neuropatię, które należy traktować jako potencjalne powikłania podczas wykonywania zastrzyków u świnek morskich32. Z naszego doświadczenia wynika, że skutki uboczne, w tym utykanie i ból podczas badania palpacyjnego stawu, mogą wystąpić, gdy igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko w przestrzeń stawową i/lub zetknie się ze strukturą kostną podczas wstrzyknięcia. Posiadanie zwłok, na których można było ćwiczyć nasze zastrzyki przed wykonaniem ich na żywych zwierzętach, pomogło zapewnić dokładniejsze zastrzyki. Udoskonalając naszą technikę, aby zapewnić płytką głębokość wstrzyknięcia, nie zaobserwowaliśmy żadnych skutków ubocznych po dostawowych iniekcjach kolana. W związku z tym właściwa technika iniekcji ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia dobrostanu zwierząt, szczególnie w przypadku badań wymagających wielokrotnych wstrzyknięć przez wiele miesięcy. Kluczowe kroki w procedurze obejmują stosowanie techniki aseptycznej; wystarczające przeszkolenie przed wykonaniem procedur przetrwania; osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, aby zapobiec odczuwaniu bólu i ruchowi po wstrzyknięciu; oraz zapewnienie odpowiedniej głębokości iniekcji, aby uniknąć kontaktu z dystalnymi i okołostawowymi iniekcjami kostnymi, które mogą wymagać ponownego podania związku.

Aby systematycznie oceniać zmiany związane z chorobą zwyrodnieniową stawów, opisujemy analizy μCT, w tym odwzorowania obrazów 3D, pozwalające na wizualizację, segmentację, znakowanie i obiektywne pomiary dotkniętej tkanki. Opisane metody okazały się skuteczne i wydajne w systematycznej ocenie zmian stawowych i kostnych w chorobie zwyrodnieniowej stawów w czasie. Nasze wyniki μCT pokazują, że 12-miesięczne świnki morskie Dunkin-Hartley mają cięższą chorobę zwyrodnieniową stawów niż 5-miesięczne świnki morskie, na co wskazuje zwiększona gęstość mineralna kości i zwiększona grubość beleczkowania. Wykazano nasilenie się choroby zwyrodnieniowej stawów w czasie, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami w tym modelu choroby zwyrodnieniowej stawów, w tym z analizami μCT, w których oceniano gęstość mineralną kości i grubość beleczkowania13. Dotychczasowe badania i przedstawione reprezentatywne wyniki wskazują na wzrost BMD i grubości beleczkowania w czasie, mierzony za pomocą μCT22,23. Ponadto nasza ocena histologiczna kolan w dwóch wymiarach potwierdza wiarygodność danych μCT. Histologicznie objawy choroby zwyrodnieniowej stawów są bardziej wyraźne u 9- i 12-miesięcznych świnek morskich w porównaniu ze zwierzętami 5-miesięcznymi. Zmiany histologiczne związane z chorobą zwyrodnieniową stawów obejmują utratę proteoglikanów, szczeliny i hipokomórkowość. 10 Każdą z tych cech można zaobserwować u starszych świnek morskich. Dodatkowo, starsze świnki morskie mają wyższe zmodyfikowane wyniki Mankina, szeroko stosowaną i zwalidowaną metodę oceny ciężkości choroby zwyrodnieniowejstawów 10. Podczas gdy nasze analizy histologiczne wykazują oczekiwane zmiany w chorobie zwyrodnieniowej stawów, μCT zapewnia bardziej dogłębną ocenę zmian w chorobie zwyrodnieniowej stawów niż przegląd histologiczny, ponieważ skanuje całą próbkę, a nie jeden lub kilka odcinków tkanki18. Ponadto zapewnia bardziej obiektywne pomiary zakresu zmian kostnych zarówno w 2-, jak i 3-wymiarowych18. Badacze powinni zapoznać się z istniejącymi wytycznymi przy ocenie zmian histologicznych choroby zwyrodnieniowej stawów, takimi jak wytyczne Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Chorobą Zwyrodnieniową Stawów10. Badacze powinni rozważyć dodatkowe testy pomocnicze, w tym analizy chodu, w celu dogłębnej charakterystyki rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów34. Podczas gdy analiza chodu może ujawnić zmiany funkcjonalne w czasie, zmiany w chorobie zwyrodnieniowej stawów rozwijają się na długo przed wystąpieniem kulawizny, co sprawia, że μCT jest bardziej czułą miarą zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów we wczesnych stadiach choroby.

Chociaż świnki morskie Dunkin-Hartley stanowią solidny model do badania progresji choroby zwyrodnieniowej stawów i efektów nowych terapii, model ten ma swoje ograniczenia. Modele spontaniczne zazwyczaj wymagają dłuższego okresu badań w porównaniu z szybkim rozwojem zmian po chirurgicznej lub chemicznie indukowanej chorobie zwyrodnieniowej stawów35. Może to skutkować zwiększonymi kosztami i czasem trwania badania. Jak opisano wcześniej, początek choroby zwyrodnieniowej stawów różni się u zwierząt w tym samym wieku, co może wymagać oceny zmian związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów36. Pomimo tej zmienności, naukowcy mogą spodziewać się, że u wszystkich świnek morskich Dunkin-Hartley rozwinie się choroba zwyrodnieniowa stawów począwszy od 3 miesięcy, wykazując zmiany w kości podchrzęstnej i beleczkowej, a następnie postępujące zmiany w chorobie zwyrodnieniowej stawów w wieku10,19 lat. Badacze mogą zmniejszyć efekt zmienności międzyzwierzęcej, stosując leczenie na jedną kończynę u każdego zwierzęcia, pozwalając kończynie przeciwległej służyć jako kontrola wewnętrzna. Chociaż wykracza to poza zakres przedstawionej metodologii, zastrzyki pod kontrolą ultradźwięków mogą pomóc w dalszej poprawie dokładności iniekcji i są stosowane u świnek morskich37. Proponowane badanie opisuje wykonalność iniekcji pod kontrolą palpacyjną, bez wykorzystania tej metody obrazowania, techniki szeroko stosowanej w tej dziedzinie37. Chociaż μCT jest potężnym narzędziem do analizy patologii i struktury kości, dostępność oprogramowania obsługującego rozbudowane funkcje analityczne może wprowadzić zmienność między użytkownikami w analizach38. W niniejszym badaniu średnica łóżka skanującego μCT wynosiła 6,35 cm, co uniemożliwiało obrazowanie całej świnki morskiej lub stawu in situ. Na rynku dostępne są większe nasadki do łóżek, które mogą ułatwić obrazowanie całych zwierząt. Chociaż oprogramowanie jest ogólnie przyjazne dla użytkownika i oferuje kilka sugerowanych ustawień, korzystne może być ręczne edytowanie ustawień w celu uzyskania wyższej rozdzielczości i dokładności. Wraz z rozwojem technik automatycznych, w tym uczenia maszynowego, te ręczne korekty mogą zostać zastąpione nowymi, automatycznymi technikami oprogramowania w celu zwiększenia standaryzacji39. Chociaż prezentowany manuskrypt opisuje instrukcje krok po kroku dotyczące używanego μCT i odpowiedniego oprogramowania, te same analizy można przeprowadzić za pomocą innych marek i oprogramowania; Badacze powinni zapoznać się z odpowiednimi instrukcjami obsługi, aby zoptymalizować i ustandaryzować analizy obrazów podczas korzystania z różnych maszyn i/lub oprogramowania. Aby zmniejszyć zmienność, ważne jest, aby zachować te same ustawienia we wszystkich próbkach. Subiektywność analiz obrazowych może być dodatkowo zredukowana poprzez powtórzenie analiz wielu zaślepionych eksperymentatorów.

Głównym celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przeprowadzania trudnych technicznie procedur u świnek morskich i późniejszych analiz μCT związanych z tym zmian w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Standaryzacja technik i analiz danych pomoże zminimalizować koszty i zwiększyć wydajność.

Podziękowania

Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez South Carolina SmartState® Endowed Chair in Drug Discovery Endowment funds (PMW), MUSC Division of Laboratory Animal Resources oraz MUSC Drug Discovery Core. Publikacja ta była również wspierana przez National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantów o numerach TL1 TR001451 i UL1 TR001450, a także National Institute of Dental & Craniofacial Research of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer R01DE029637.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701środek sterylizujący
3D. Oprogramowanie SUITEOprogramowanie analityczne Brukerμ-CT
Peeling chirurgiczny BetadineAvrio Health67618-151-16środek sterylizujący
Strzykawka insulinowa z igłąUlticare91008do wykonywania iniekcji
IsofluranePiramal803249znieczulenie zwierzęcia
Neutralna buforowana formalinaFisher Scientific23-427098Napraw oprogramowanie
NreconBrukerμ-CT
buforowana fosforanemCytivaSH30258.01środek kontrolny i rozcieńczający
SkyScan 1176Brukerdo skanowania próbek 
do rekonstrukcji tkanek Sól fizjologiczna

Bibliografia

  1. Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, socioeconomic, and geographic disparities in the epidemiology of knee and hip osteoarthritis. Rheum Dis Clin North Am. 47 (1), 1-20 (2021).
  2. Mandl, L. A. Osteoarthritis year in review 2018: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 27 (3), 359-364 (2019).
  3. Assirelli, E., et al. Complement expression and activation in osteoarthritis joint compartments. Front Immunol. 11, 535010(2020).
  4. Lampropoulou-Adamidou, K., et al. Useful animal models for the research of osteoarthritis. Eur J Orthop Surg Traumatol. 24 (3), 263-271 (2014).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  6. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  7. Pitcher, T., Sousa-Valente, J., Malcangio, M. The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse. J Vis Exp. (111), e53746(2016).
  8. de Araujo, F. A., et al. morphology of the hind limbs in two caviomorph rodents. Anat Histol Embryol. 42 (2), 114-123 (2013).
  9. Veronesi, F., Salamanna, F., Martini, L., Fini, M. Naturally occurring osteoarthritis features and treatments: systematic review on the aged guinea pig model. Int J Mol Sci. 23 (13), (2022).
  10. Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 S35-S52 (2010).
  11. Wang, S., et al. The osteoarthritis natural progress and changes in intraosseous pressure of the guinea pig model in different degeneration stages. Orthop Surg. 14 (11), 3036-3046 (2022).
  12. Boyde, A. The bone cartilage interface and osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 109 (3), 303-328 (2021).
  13. Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620(2021).
  14. Clark, D. P., Badea, C. T. Advances in micro-CT imaging of small animals. Phys Med. 88, 175-192 (2021).
  15. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  16. Yang, D., et al. Involvement of CD147 in alveolar bone remodeling and soft tissue degradation in experimental periodontitis. J Periodontal Res. 52 (4), 704-712 (2017).
  17. Ruegsegger, P., Koller, B., Muller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcif Tissue Int. 58 (1), 24-29 (1996).
  18. Boca, C., et al. Comparison of micro-CT imaging and histology for approximal caries detection. Sci Rep. 7 (1), 6680(2017).
  19. Ren, P., et al. Biochemical and morphological abnormalities of subchondral bone and their association with cartilage degeneration in spontaneous osteoarthritis. Calcified Tissue International. 109 (2), 179-189 (2021).
  20. Wang, X., et al. Stage-specific and location-specific cartilage calcification in osteoarthritis development. Ann Rheum Dis. 82 (3), 393-402 (2023).
  21. Magni, A., et al. Management of osteoarthritis: expert opinion on NSAIDs. Pain Ther. 10 (2), 783-808 (2021).
  22. Wang, T., Wen, C. Y., Yan, C. H., Lu, W. W., Chiu, K. Y. Spatial and temporal changes of subchondral bone proceed to microscopic articular cartilage degeneration in guinea pigs with spontaneous osteoarthritis. Osteoarthr Cartil. 21 (4), 574-581 (2013).
  23. Gao, J., Ren, P., Gong, H. Morphological and mechanical alterations in articular cartilage and subchondral bone during spontaneous hip osteoarthritis in guinea pigs. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1080241(2023).
  24. Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Eng Part C Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
  25. Hunter, D. J. Pharmacologic therapy for osteoarthritis--the era of disease modification. Nat Rev Rheumatol. 7 (1), 13-22 (2011).
  26. Schuelert, N., McDougall, J. J. Grading of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis reveals a concentration-dependent sensitization of nociceptors in the knee joint of the rat. Neurosci Lett. 465 (2), 184-188 (2009).
  27. Yao, X., et al. Chondrocyte ferroptosis contribute to the progression of osteoarthritis. J Orthop Translat. 27, 33-43 (2021).
  28. Huebner, J. L., Hanes, M. A., Beekman, B., TeKoppele, J. M., Kraus, V. B. A comparative analysis of bone and cartilage metabolism in two strains of guinea-pig with varying degrees of naturally occurring osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 758-767 (2002).
  29. Ringe, J., et al. CCL25-Supplemented hyaluronic acid attenuates cartilage degeneration in a guinea pig model of knee osteoarthritis. J Orthop Res. 37 (8), 1723-1729 (2019).
  30. Chouhan, D. K., et al. Multiple platelet-rich plasma injections versus single platelet-rich plasma injection in early osteoarthritis of the knee: An experimental study in a guinea pig model of early knee osteoarthritis. Am J Sports Med. 47 (10), 2300-2307 (2019).
  31. Patel, S., Mishra, N. P., Chouhan, D. K., Nahar, U., Dhillon, M. S. Chondroprotective effects of multiple PRP injections in osteoarthritis by apoptosis regulation and increased aggrecan synthesis- Immunohistochemistry based Guinea pig study. J Clin Orthop Trauma. 25, 101762(2022).
  32. Cheng, J., Abdi, S. Complications of joint, tendon, and muscle injections. Tech Reg Anesth Pain Manag. 11 (3), 141-147 (2007).
  33. Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat Med. 17 (12), 1674-1679 (2011).
  34. Santangelo, K. S., Kaeding, A. C., Baker, S. A., Bertone, A. L. Quantitative gait analysis detects significant differences in movement between osteoarthritic and nonosteoarthritic guinea pig strains before and after treatment with flunixin meglumine. Arthritis. 2014, 503519(2014).
  35. McCoy, A. M. Animal models of osteoarthritis: comparisons and key considerations. Vet Pathol. 52 (5), 803-818 (2015).
  36. Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Dis Model Mech. 8 (1), 17-30 (2015).
  37. Vazquez-Portalatin, N., Breur, G. J., Panitch, A., Goergen, C. J. Accuracy of ultrasound-guided intra-articular injections in guinea pig knees. Bone Joint Res. 4 (1), 1-5 (2015).
  38. Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatr Dis Treat. 14, 1705-1713 (2018).
  39. Jonsson, T. Micro-CT and deep learning: Modern techniques and applications in insect morphology and neuroscience. Front Insect Sci. 3, (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model choroby zwyrodnieniowej stawówgęstość mineralna kościgrubość beleczek kostnychzmodyfikowana skala Mankinatechnika aseptycznaanaliza blaszki podchrzęstnejdobrostan zwierząt
Analiza mikrotomografii komputerowej kolana u starszych świnek morskich Dunkin-Hartley po wstrzyknięciu dostawowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.