Tutaj prezentujemy protokół tworzenia defektu w tkance trzonu kości udowej szczura. Model ten może oceniać wydajność biomateriału pod wpływem stresu biomechanicznego i badać mechanizmy regeneracji kości związane z osteogenezą błoniastą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie modelu ubytku ubytku ubytku w kości korowej kości udowej szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poważne wady kości lub skomplikowane złamania mogą powodować poważne komplikacje, takie jak brak zrostu lub niedostateczne gojenie się kości. Inżynieria tkankowa, która polega na zastosowaniu komórek, rusztowań i cytokin, jest uważana za obiecujące rozwiązanie w zakresie regeneracji kości. W związku z tym różne modele zwierzęce, które symulują ubytki kostne, odgrywają kluczową rolę w badaniu potencjału terapeutycznego inżynierii tkankowej w leczeniu kości. W tym badaniu ustaliliśmy pudełkowy model korowego ubytku kostnego w środkowej części kości udowej szczurów, który może służyć jako idealny model do oceny funkcji biomateriałów w promowaniu gojenia kości. Ten pudełkowy ubytek kości korowej został wywiercony za pomocą ustnej rękojeści o niskiej prędkości i ukształtowany za pomocą igły tokarki. Natychmiast przeprowadzono pooperacyjną analizę mikrotomografii komputerowej, która potwierdziła pomyślne ustalenie ubytku kostnego w jamie skrzynkowej. Kości udowe po stronie operowanej szczurów zostały następnie pobrane w wielu punktach czasowych po operacji (0 dni, 2 tygodnie, 4 tygodnie i 6 tygodni). Proces gojenia się defektu każdej próbki oceniano za pomocą mikrotomografii komputerowej, barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienia trichromem Massona. Wyniki te wykazały wzorzec gojenia zgodny z kostnieniem błoniastym, przy czym gojenie zasadniczo zakończyło się po 6 tygodniach. Kategoryzacja procesu gojenia w tym modelu zwierzęcym zapewnia skuteczną metodę in vivo do badania nowych biomateriałów i leków, które celują w kostnienie błoniaste podczas gojenia ubytków tkanki kostnej.
Wprowadzenie
Złamana i uszkodzona kość często wynika z urazów, nowotworów, stanów zapalnych i wad wrodzonych1,2. Chociaż tkanka kostna u młodych, zdrowych osób zazwyczaj posiada silne zdolności regeneracyjne3, wady przekraczające rozmiar krytyczny lub przeszkody w gojeniu spowodowane chorobami ogólnoustrojowymi (np. cukrzyca, osteoporoza i infekcje) mogą nadal prowadzić do powikłań, takich jak nieciągłość kości lub zaburzenia gojenia4. Aby sprostać temu wyzwaniu klinicznemu, powszechnie stosuje się przeszczepy kostne lub biomateriały w celu zastąpienia poważnie uszkodzonej kości lub rekonstrukcji dużych segmentów kości. Zabiegi te mają jednak ograniczenia. Na przykład, chociaż uważany za złoty standard, autologiczny przeszczep kości cierpi z powodu ograniczonej podaży dawcy i potencjalnych powikłań w miejscu dawczym5,6. Przeszczepy allogeniczne wiążą się również z pewnymi zagrożeniami, takimi jak odrzucenie przeszczepu o podłożu immunologicznym, potencjalne przenoszenie chorób oraz negatywny wpływ na właściwości biomechaniczne i biologiczne przeszczepu7.
Ostatnie lata przyniosły gwałtowny wzrost badań skupiających się na mechanizmach leczenia wad kostnych. Zastosowanie alternatywnych biomateriałów i postęp w inżynierii tkankowej stały się ważnymi tematami w dziedzinie regeneracji kości8. Zanim te biomateriały będą mogły zostać zastosowane w terapii u ludzi, muszą zostać przetestowane in vitro i in vivo, aby zapewnić ich skuteczność i bezpieczeństwo. Jednak zmniejszona złożoność środowisk in vitro oraz brak odpowiedzi immunologicznych i zapalnych ograniczają ocenę różnych biomateriałów in vitro. W związku z tym konieczne jest stworzenie modeli zwierzęcych dla różnych typów ubytków tkanki kostnej9. Modele zwierzęce umożliwiają ocenę biomateriałów w różnych warunkach obciążenia, ułatwiają zrozumienie cech kości specyficznych dla danego gatunku oraz dostarczają wglądu w podobieństwo między modelami zwierzęcymi a sytuacjami klinicznymi u ludzi. Zalety te są niezbędne do badania interakcji między kością a rusztowaniem i przekładania wyników badań na praktykę kliniczną9,10.
Obecnie, modele zwierzęce mechanicznego uszkodzenia kości są powszechnie używane do walidacji działania biomateriałów, przy czym modele ubytków kostnych czaszki i segmentowe modele ubytków kostnych są najczęściej stosowanymi metodami11. Segmentalne modele ubytków kostnych, często wykorzystywane do naśladowania ciężkiego urazu kości długiej lub piszczelowego kończącego się brakiem zrostu kostnego, są korzystne ze względu na ich jednolite wymiary i określone pozycje anatomiczne, upraszczając radiologiczną lub histologiczną ocenę tworzenia się nowej kości i rewaskularyzacji. Modele te wymagają jednak metalowych implantów w celu ustabilizowania obustronnych segmentów złamania i wymagają złożonego procesu gojenia obejmującego zarówno kostnienie śródchrzęstne, jak i śródbłoniaste12. Z drugiej strony, modele ubytków kości kalwarycznej stały się podstawowym narzędziem przesiewowym do oceny biomateriałów ze względu na ich standaryzowane średnice ubytków, wygodny dostęp chirurgiczny oraz wspomagającą funkcję opony twardej i tkanek miękkich13. Chociaż są one szeroko stosowane do modelowania wewnątrzbłoniastego tworzenia się kości w klinicznie istotnych scenariuszach, nie nadają się do oceny gojenia kości w warunkach obciążenia biomechanicznego ze względu na ich nienośny charakter podczas procesu gojenia14.
Aby rozwiązać te ograniczenia, stworzyliśmy model ubytku kości korowej w tkance trzonu kości udowej szczurów. Wykorzystując mikrotomografię komputerową (CT), trójwymiarową rekonstrukcję (3D) i barwienie histopatologiczne (Hematoksylina i eozyna [HE] oraz Masson), przeanalizowaliśmy proces gojenia się tego modelu w warunkach hemostazy. Naszym celem jest zaoferowanie nowych spostrzeżeń na temat oceny wydajności biomateriału w warunkach obciążenia biomechanicznego oraz do badania bioinżynierii i mechanizmu regeneracji kości w odniesieniu do kostnienia śródbłoniastego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Do badań wykorzystano szczury Sprague-Dawley (samice, masa ciała 300 g).
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Przygotowanie instrumentu
- Patrz Rysunek 1A dla narzędzi chirurgicznych używanych w tym badaniu: golarka elektryczna, nożyczki do tkanek, nożyczki okulistyczne, kleszcze okulistyczne, jednorazowy skalpel, separator okostnej, ustna rękojeść o niskiej prędkości, sonda doustna, jednorazowy odkurzacz irygacyjny, uchwyt na igłę, szew 3.0.
- Przygotuj sondę ustną i zaznacz duży zakrzywiony koniec sondy markerem zgodnie ze średnicą wady (Rysunek 1B). Na tej podstawie można określić wielkość ubytku podczas zabiegu.
- Przed użyciem wysterylizuj wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne używane do wykonania zabiegu. Zapakuj żądane materiały w złożoną szmatkę lub papier pakowy i zaklej je taśmą autoklawu do sterylizacji parowej (125-135°C przez 20-25 min).
- Przygotowanie pola operacyjnego: Zdezynfekować stół operacyjny i otoczenie wokół stołu, spryskując go 75% alkoholem. Stwórz sterylny obszar o wymiarach około 60 cm x 90 cm z autoklawowanymi obłożami na stole operacyjnym .
- Przygotowanie znieczulenia
- Znieczulenie szczurów dootrzewnowo 10% chlorowodorkiem ketaminy (50-100 mg / kg) i 2% ksylazyną 2 mg / kg). Stosować podskórne wstrzyknięcie karprofenu (5 mg/kg) w przypadku analgezji przedoperacyjnej i śródoperacyjnej. Zbadaj głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania palców u stóp. Po znieczuleniu nałóż sterylną maść do oczu na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu i uszkodzeniom rogówki.
2. Zabieg chirurgiczny
- Umieść szczura w bocznej pozycji leżącej na sterylnym stole operacyjnym i usuń włosy kończyn dolnych za pomocą golarki elektrycznej.
- Użyj 5% roztworu jodoforu i 75% alkoholu do dezynfekcji tkanki skórnej w obszarze operacyjnym .
- Zlokalizuj bliższą i dalszą część kości udowej i wykonaj 2,5 cm nacięcie wzdłuż długiej osi kości udowej, aby przeciąć tkankę skórną szczura.
- Oddziel warstwę skóry od powięzi za pomocą kleszczy okulistycznych i nożyczek do tkanek i odsłoń boczne podejście do kości udowej przez biceps femoris i boczne mięśnie udowe.
- Zlokalizuj przecięcie dwóch przegród mięśniowych (biała linia tkanki) i ostrożnie oddziel jednorazowym ostrzem chirurgicznym wzdłuż granicy mięśnia, aż do osiągnięcia powierzchni kości udowej.
UWAGA: W przypadku używania jednorazowego ostrza do oddzielenia mięśnia, ważne jest, aby oddzielić go wzdłuż przegrody mięśniowej i uważać, aby nie spowodować uszkodzenia naczyń w tkance miękkiej. Początkujący i osoby niezaznajomione z anatomią muszą używać kleszczy okulistycznych i separatorów okostnej w rozwarstwieniu między dwiema masami mięśniowymi.
- Zastosuj separator okostnej, aby tępo oddzielić mięśnie powierzchni kości udowej i odsłonić środek trzonu kości udowej.
- Za pomocą sterylnego markera zaznacz obszar miejsca wady na środkowej powierzchni trzonu kości udowej, znajdujący się w górnej części bocznego 1/3 skośnego grzebienia głowy kości udowej.
- Użyj ustnej rękojeści wolnoobrotowej z wiertłem kulkowym w zwolnionym tempie o średnicy 1.2 mm, aby wywiercić mały otwór prostopadły do powierzchni kości w zaznaczonym miejscu, niszcząc okostną i korę kostną o głębokości wystarczająco głębokiej, aby dotrzeć do jamy szpiku kostnego. Na tym poziomie głębokości wiercenia zwiększ rozmiar otworu równolegle do tej głębokości we wszystkich kierunkach, przycinając w celu uzyskania kształtu wnęki skrzynkowej.
- Użyj oznakowanej sondy doustnej równolegle do krawędzi defektu, aby określić średnicę i morfologię wady w trakcie i po przygotowaniu.
- Zamknij warstwy mięśni i skóry odpowiednio wchłanialnymi szwami monofilamentowymi 3-0 i zdezynfekuj obszar operacyjny 5% jodoforem od wewnątrz na zewnątrz.
3. Opieka pooperacyjna
- Po zabiegu należy podać podskórnie karprofen (5 mg/kg) i umieścić szczura na poduszce grzewczej o stałej temperaturze do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia. Kiedy szczur odzyska przytomność, delikatnie przenieś go do klatki, w której znajduje się sucha, autoklawizowana ściółka.
- Kontynuuj analgezję przez 24 godziny i monitorowanie pooperacyjne przez 1 tydzień po zabiegu.
4. Pobieranie i analiza próbek
- Ludzka eutanazja szczura po operacji poprzez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu 100-200 mg / kg dootrzewnowo. Ostrożnie oddzielić tkankę mięśniową i powięziową na powierzchni kości udowej i całkowicie usunąć kość udową po stronie operowanej. Zbierz próbki po 0 dniach (Rysunek 2A, B), 2 tygodnie, 4 tygodnie i 6 tygodni po operacji.
- Utrwal próbki kości udowej w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny. Przeanalizuj strukturę kości udowej za pomocą mikrotomografii komputerowej. Ustaw parametry skanowania w następujący sposób: potencjał lampy rentgenowskiej, 70 kVp; filtr, AL 0,5 mm; natężenie promieniowania rentgenowskiego, 0,2 mA; wielkość woksela, 17 μm; i czas integracji, 1 × 300 ms. Rekonstrukcja obrazów modeli 3D przy użyciu danych bitmapowych.
- Odwapnić próbki w 10% EDTA przez 8 tygodni przed odwodnieniem próbek kości udowej w stopniowanej serii rozcieńczeń etanolu. Następnie osadź próbki w wosku parafinowym 15.
- Pociąć osadzone próbki na skrawki parafiny o wielkości 5 μm od płaszczyzny strzałkowej.
- Skrawki barwienia za pomocą zestawu do barwienia hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz zestawu do barwienia Massona. Obserwuj gojenie się obszaru ubytku za pomocą histopatologii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole z powodzeniem stworzyliśmy model ubytku w kości udowej szczura w formie pustego prostopadłościanu o wymiarach 4,5 mm x 1,5 mm poprzez wiercenie. W celu analizy procesu gojenia pobrano tkankę kości udowej po stronie operowanej w 0. dniu, 2. tygodniu, 4. tygodniu i 6. tygodniu po zabiegu, co stanowi kluczowe punkty czasowe dla kostnienia chrzęstnego, kostnienia błoniastego oraz przebudowy kości podczas procesu gojenia urazów kości udowej u szczurów2<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedkliniczne modele zwierzęce są niezbędne do badania gojenia się kości i wpływu biomateriałów na regenerację kości. Protokół ten ilustruje model ubytku w jamie skrzynkowej kości udowej odwzorowujący proces tworzenia kości śródbłoniastej związany z kliniczną regeneracją kości. Obszar ubytku został śródoperacyjnie ustandaryzowany za pomocą wstępnie oznaczonej sondy ustnej. Wyniki mikrotomografii komputerowej i barwienia histopatologicznego wykazały postępujące gojenie w ciągu 6 tygodni, z pogrubieniem okostnej i tworzen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkie oryginalne dane i obrazy są zawarte w tym artykule. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane z grantów Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) i 82100982 (F. L.), oraz wspierane przez Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wiertarka kulkowa wolnoobrotowa 1,2 mm | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | Do przygotowania ubytków ubytków w pudełku |
| 3.0 szew | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak | Do szycia ran |
| 4% paraformaldehydu | Biosharp | BL539A | Do mocowania próbek kości udowej |
| Waciki | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | Do sterylizacji skóry i czyszczenia pola operacyjnego |
| Patyczki bawełniane | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | Do dezynfekcji skóry |
| Szlifierka dla techników dentystycznych | Marathon | N3-140232 | Do przygotowania ubytków w pudełku |
| Skalpel jednorazowy | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | Do tworzenia nacięć skórnych, a także do ostrego oddzielania tkanki mięśniowej |
| Golarka elektryczna | JASE | BM320210 | Usuwanie tkanki włosowej z obszaru operacyjnego |
| Zestaw do barwienia Hematoksyliną i Eozyną | Biosharp | C1005 | Do analizy histologicznej próbek |
| Masson' s Zestaw bejc trichromowych | Solarbio | G1340 | Do analizy histologicznej próbek |
| Micro CT | Scanco medical ag | µ CT 45 | Do analizy gojenia się ubytków w próbkach kości udowej |
| Uchwyt igły | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Do | igieł do przytrzymywania szwów |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | Do analizy wyników barwienia HE i barwienia Massonem |
| Kleszcze okulistyczne | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Do | zaciskania skóry, tkanki mięśniowej |
| Nożyczki okulistyczne | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Do | tworzenia dostępu do nacięcia skóry |
| Rękojeść ustna o niskiej prędkości | Marathon | Y221101003 | Do przygotowania ubytków jamy skrzynkowej |
| Sonda doustna | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | Do pomiaru średnicy defektów |
| Separator okostnej | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Do | oddzielania tkanki mięśniowej |
| Sprague– Szczury Dawley | Byrness Weil Biotech Ltd | Brak Do | ustalenia ubytku kości udowej pudełkowatej jamy |
| Nożyczki do tkanek | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Brak Do | tworzenia podejścia z nacięciem skóry |
Bibliografia
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193(2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66(2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084(2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977(2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
