Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technologia edycji genomu jest powszechnie stosowana do produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt, w tym szczurów. Cytoplazmatyczne lub projądrkowe wstrzykiwanie matryc naprawczych DNA i odczynników CRISPR-Cas jest najczęstszą metodą dostarczania do zarodków. Jednak ten rodzaj mikromanipulacji wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu, jest pracochłonny i wymaga pewnego poziomu umiejętności technicznych. Co więcej, techniki mikroiniekcji często skutkują niższą przeżywalnością zarodka ze względu na mechaniczne obciążenie zarodka. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną metodę dostarczania dużych matryc do naprawy DNA, które działają w połączeniu z edycją genomu CRISPR-Cas9 bez konieczności mikroiniekcji. Protokół ten łączy dostarczanie DNA za pośrednictwem AAV jednoniciowych matryc dawcy DNA wraz z dostarczaniem rybonukleoproteiny CRISPR-Cas9 (RNP) za pomocą elektroporacji w celu modyfikacji zarodków 2-komórkowych. Korzystając z tej nowatorskiej strategii, udało nam się wyprodukować ukierunkowane modele szczurów typu knock-in, w których inserowane są sekwencje DNA o wielkości od 1,2 do 3,0 kb ze skutecznością od 42% do 90%.
Wprowadzenie
Rozwój narzędzi do edycji genomu opartych na CRISPR przyspieszył naszą zdolność do efektywnego generowania nowych i bardziej wyrafinowanych genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Jednoprowadnicowy RNA, wraz z nukleazą Cas9, jest łączony w celu utworzenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP), które celują w interesujące sekwencje DNA w genomie i powodują dwuniciowe pęknięcia DNA. Ponieważ mechanizmy naprawy DNA komórkowego są podatne na błędy, podczas procesu naprawy wprowadzane są inserpcje i delecje (INDEL), które mogą zakłócić funkcję genu docelowego. Gdy dochodzi do jednoczesnego dostarczania pożądanej zmodyfikowanej sekwencji DNA (matrycy naprawczej) wraz ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Missouri (protokół ACUC nr 25580) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi w Przewodniku po wykorzystaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi (Guide for the Use and Care of Laboratory Animals).
1. Dostarczanie matrycy do naprawy DNA za pośrednictwem AAV
- Zaprojektuj konstrukt DNA tak, aby zawierał pożądaną sekwencję knock-in pomiędzy dwoma ramionami homologii. Typowa długość ramion homologii wynosi 300-500 bp. Upewnij się, że cały matryca do naprawy DNA (ramion....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem, następuje skuteczna dostawa matrycy naprawy DNA za pomocą AAV, co umożliwia wysoce efektywną HDR po elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek kompleksami RNP CRISPR-Cas9. Jak pokazano na filmie, prawidłowy proces elektroporacji objawia się powstawaniem pęcherzyków na każdej z elektrod (Ryc. 2C), a impedancja pozostaje w zakresie od 0,100 do 0,300 kΩ. Po elektroporacji często zdarza się, że zarodki pęcznieją, wypełniając przestrzeń okoł.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System edycji genomu CRISPR-Cas zrewolucjonizował dziedzinę inżynierii genetycznej, umożliwiając wydajną produkcję zarówno prostych, jak i złożonych, dostosowanych modyfikacji genetycznych u różnych gatunków zwierząt. Częste udoskonalenia i ulepszenia w technikach związanych z edycją genomu zwiększają jego wszechstronność. Tutaj opisaliśmy nowe podejście wykorzystujące dostarczanie DNA za pośrednictwem ssAAV wraz z elektroporacją 2-komórkowych zarodków odczynników CRISPR-Cas9 do 2-komórkowych zarodków gryzoni. Wykazaliśm.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Nolanowi Davisowi za pomoc w filmowaniu i edycji wideo.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przewody z zaciskami krokodylkowymi do elektrod | NepaGene | C117 | |
| Olej mineralny | MilliporeSigma | M5310 | |
| NepaGene21 Super Electroporator | NepaGene | NEPA21 | |
| Platynowe elektrody płytkowe na szkle szkiełkowym | NepaGene | CUY501P1-1.5 | |
| PURedit Cas9 Białko | MiliporeSigma | PECAS9 | |
| sgRNA (modyfikowane chemicznie) | Synthego | N/A | |
| ssAAV1 lub ssAAV6 pakowana matryca naprawy DNA | Vectorbuilder | N/A |
Bibliografia
- Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
- Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
