Artykuł metodologiczny

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66069

⸱

15 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

Streszczenie

Technologia edycji genomu jest powszechnie stosowana do produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt, w tym szczurów. Cytoplazmatyczne lub projądrkowe wstrzykiwanie matryc naprawczych DNA i odczynników CRISPR-Cas jest najczęstszą metodą dostarczania do zarodków. Jednak ten rodzaj mikromanipulacji wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu, jest pracochłonny i wymaga pewnego poziomu umiejętności technicznych. Co więcej, techniki mikroiniekcji często skutkują niższą przeżywalnością zarodka ze względu na mechaniczne obciążenie zarodka. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną metodę dostarczania dużych matryc do naprawy DNA, które działają w połączeniu z edycją genomu CRISPR-Cas9 bez konieczności mikroiniekcji. Protokół ten łączy dostarczanie DNA za pośrednictwem AAV jednoniciowych matryc dawcy DNA wraz z dostarczaniem rybonukleoproteiny CRISPR-Cas9 (RNP) za pomocą elektroporacji w celu modyfikacji zarodków 2-komórkowych. Korzystając z tej nowatorskiej strategii, udało nam się wyprodukować ukierunkowane modele szczurów typu knock-in, w których inserowane są sekwencje DNA o wielkości od 1,2 do 3,0 kb ze skutecznością od 42% do 90%.

Wprowadzenie

Rozwój narzędzi do edycji genomu opartych na CRISPR przyspieszył naszą zdolność do efektywnego generowania nowych i bardziej wyrafinowanych genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Jednoprowadnicowy RNA, wraz z nukleazą Cas9, jest łączony w celu utworzenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP), które celują w interesujące sekwencje DNA w genomie i powodują dwuniciowe pęknięcia DNA. Ponieważ mechanizmy naprawy DNA komórkowego są podatne na błędy, podczas procesu naprawy wprowadzane są inserpcje i delecje (INDEL), które mogą zakłócić funkcję genu docelowego. Gdy dochodzi do jednoczesnego dostarczania pożądanej zmodyfikowanej sekwencji DNA (matrycy naprawczej) wraz z odczynnikami do edycji genomu, wstawienie szablonu naprawczego w regionie zawierającym pęknięcie dwuniciowego DNA następuje w procesie zwanym naprawą ukierunkowaną na homologię (HDR). Jest to skuteczna strategia generowania modeli zwierzęcych z ukierunkowanymi insercjami/podstawieniami DNA (knock-in). Jednym z ograniczeń jest to, że sekwencje knock-in są często duże, co jak wykazano, zmniejsza wydajność edycji genów, co utrudnia generowanie pożądanego modelu1. Strategie mające na celu zwiększenie wydajności knock-in obejmowały linearyzację zarówno dwuniciowych matryc naprawczych DNA (dsDNA), jak i jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz chemiczną modyfikację szablonów naprawy DNA2,3,4. Ponadto podjęto próby mikroiniekcji projądrowej wraz ze związkami stymulującymi HDR, zastosowania impulsów elektrycznych w połączeniu z mikroiniekcją oraz mikroiniekcji w czasie do zarodków 2-komórkowych5,6,7. Pomimo sukcesu niektórych z tych podejść, włączenie sekwencji DNA większych niż 1,0 kb pozostaje wyzwaniem technicznym.

Elektroporacja, która jest powszechną metodą wprowadzania odczynników do hodowlanych linii komórkowych, stanowi alternatywę dla mikroiniekcji do dostarczania składników CRISPR-Cas9 do zarodków. Elektroporacja zarodków, po raz pierwszy zademonstrowana na zarodkach szczurów8, od tego czasu jest z powodzeniem stosowana jako metoda dostarczania u myszy9,10,11,12,13, pigs14,15 i innych modelowych organizmach zwierzęcych16,17,18. Zarodki, zawieszone w pożywce zawierającej odczynniki CRISPR-Cas9, umieszcza się w kuwecie lub na szkiełku podstawowym między dwiema elektrodami i poddaje bezpośrednim impulsom prądu elektrycznego. Tworzy to przejściowe otwory w osłonie przejrzystej i błonie plazmatycznej zarodka, przez które składniki CRISPR-Cas9 dostają się do zarodków. Zazwyczaj impulsy elektryczne "poring" średniego poziomu są używane do tworzenia tymczasowych otworów, po których następują "impulsy przeniesienia" elektryczne niższego poziomu, które ułatwiają ruch ujemnie naładowanych składników edycji genomu. Elektroporacja zarodków jest wydajna, ma wysoką przepustowość i jest łatwa do wykonania. Jednakże, podczas gdy wykazano, że elektroporacja zarodków jest bardzo skuteczna we wprowadzaniu małych (<200 pz) szablonów naprawczych ssDNA, istnieje niewiele doniesień o udanej elektroporacji większych (>1,0 kb) szablonów naprawczych13,19. To ograniczenie wielkości stanowi poważne ograniczenie elektroporacji zarodków w celu generowania modeli zwierzęcych typu knock-in wymagających dużych wkłuć.

W kontekście terapii genowej, wirusy związane z adenowirusami (AAV) od dawna są używane jako nośniki do dostarczania materiału genetycznego ze względu na ich efektywną zakaźność in vivo zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek, brak patogeniczności i rzadką integrację genomową20,21. Ostatnio więcej badań połączyło AAV z technologią CRISPR-Cas9 w celu wprowadzenia szablonów naprawy DNA i odczynników CRISPR22,23,24. Takie podejście pozwala na dostarczanie większych matryc do naprawy DNA bez konieczności stosowania technik mikroiniekcji.

Ścieżka HDR jest bardziej aktywna w późnych fazach S i G2 cyklu komórkowego25,26. W badaniach przeprowadzonych in vitro znaczny wzrost skuteczności knock-in osiągnięto poprzez dostarczenie RNP CRISPR-Cas9 i matryc naprawy DNA do komórek zsynchronizowanych z G2 lub poprzez ograniczenie obecności białka Cas9 do późnych faz S i G2 przy użyciu białka fuzyjnego Cas9-Geminina2. Co więcej, dochodzi do dużej aktywacji genomu zygotycznego (ZGA), która występuje podczas rozszerzonej fazy G2 zarodka w stadium 2-komórkowym, co jest związane z otwartym stanem chromatyny. Spekuluje się, że zapewnia to RNP CRISPR-Cas9 i matrycom naprawczym większy dostęp do genomowego DNA.

Naszym celem było rozwinięcie wszystkich tych obserwacji, poprzez połączenie podejścia AAV z elektroporacją zarodków w celu wprowadzenia RNP CRISPR-Cas9 na etapie rozwoju zarodka w 2 komórek. Strategia ta wykorzystuje większą zdolność AAV do dostarczania matryc do naprawy DNA, techniczną łatwość elektroporacji i bardziej optymalny punkt czasowy dla dostępności genomu 2 komórek podczas rozwoju zarodka, aby stworzyć skuteczną metodę ukierunkowanej inżynierii genetycznej insercji DNA. Jak podkreślono w niniejszym protokole, nasza zoptymalizowana metoda pozwala na produkcję ukierunkowanych modeli szczurów typu knock-in, w których wprowadzono sekwencje DNA o wielkości od 1,2 do 3,0 kb bez konieczności stosowania technik mikroiniekcji.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Missouri (protokół ACUC nr 25580) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi w Przewodniku po wykorzystaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi (Guide for the Use and Care of Laboratory Animals).

1. Dostarczanie matrycy do naprawy DNA za pośrednictwem AAV

  1. Zaprojektuj konstrukt DNA tak, aby zawierał pożądaną sekwencję knock-in pomiędzy dwoma ramionami homologii. Typowa długość ramion homologii wynosi 300-500 bp. Upewnij się, że cały matryca do naprawy DNA (ramiona homologii + pożądana sekwencja knock-in) jest flankowana przez odwrócone powtórzenia końcowe (ITRs) poprzez klonowanie do odpowiedniego szkieletu plazmidowego i pakowanie do rekombinowanego ssAAV1 lub ssAAV6 (serotypy 1 lub 6).
    UWAGA: Jeśli sekwencja docelowa sgRNA znajduje się w matrycy do naprawy DNA, ważne jest wprowadzenie mutacji cichych w celu przerwania tej sekwencji, co zapobiegnie edycji prawidłowo ukierunkowanego allelu za pomocą CRISPR-Cas9.
    OSTRZEŻenie: Rekombinowane wektory wirusowe AAV są nieintegrujące i sklasyfikowane jako BSL-1. Do pipetowania i manipulowania embrionami narażonymi na działanie wirusa stosuje się standardowe techniki aseptyczne.
  2. Dodaj zmodyfikowany ssAAV1 lub ssAAV6 (zapakowany z matrycą do naprawy DNA) do 30 µL pożywki KSOM-R27,28 do końcowego stężenia 3 × 107 kopii genomu (GC)/µL pod warstwą oleju mineralnego w szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  3. Umieść zygoty z widocznymi prątami w pożywce KSOM-R zawierającej zmodyfikowany ssAAV.
    UWAGA: Stosując ten protokół, nie ma potrzeby ścieńczania błony przejrzystej, ponieważ serotypy AAV 1 i 6 są w stanie łatwo przez nią przenikać, co zapewnia efektywne dostarczenie matrycy do naprawy DNA.
  4. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i maksymalnej wilgotności przez 18-20 h, aby umożliwić wystarczającą transdukcję wirusową.

2. Przygotowanie do elektroporacji

  1. Następnego dnia, w sterylnej probówce wolnej od RNaz, przygotować mieszaninę do elektroporacji zawierającą 100 ng/µL sgRNA oraz 100 ng/µL białka Cas9 rozcieńczonych w medium Opti-MEM. Delikatnie wymieszać.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu umożliwienia formowania się kompleksów RNP.
  3. W czasie inkubacji włączyć elektroporator i podłączyć przewody do elektrody z szkiełka przedmiotowego o przerwie 1,5 mm.
  4. Ustawić parametry elektroporacji zgodnie z opisem w Tabeli 1.

3. Elektroporacja zarodka w stadium 2 komórek

  1. Ostrożnie nanieś pipetą 5 µL mieszaniny do elektroporacji CRISPR pomiędzy dwie elektrody na szkiełku przedmiotowym, dbając o to, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  2. Wyjmij zarodek w stadium 2 komórek z roztworu AAV. Ułóż zarodki w stadium 2 komórek w mieszaninie, nie dopuszczając do ich kontaktu z krawędziami elektrod. Ma to na celu uniknięcie lizy.
  3. Naciśnij przycisk Ohm, aby zmierzyć impedancję. Upewnij się, że impedancja mieści się w zakresie od 0,100 do 0,300 kΩ. Objętość reakcji wpływa na impedancję (dodanie objętości zmniejsza impedancję, a jej odjęcie zwiększa impedancję).
  4. Naciśnij Start. Proces trwa kilka sekund.
  5. Bezzwłocznie po elektroporacji wyjmij zarodki i przemyj je 3 razy w świeżych kroplach po 30 µL pożywki KSOM-R.
  6. Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i maksymalną wilgotnością do hodowli in vitro w kroplach po 500 µL pożywki KSOM-R pod warstwą oleju mineralnego. Alternatywnie, przenieś zarodki chirurgicznie do pseudociążnej samicy szczura w 1,5 dniu po kopulacji (dpc), aby uzyskać żywe potomstwo.

Proces edycji genów; dostarczanie DNA rAAV, elektroporacja zarodka, CRISPR, model gryzoni; schemat.
Rysunek 1: Schemat procedury dostarczania DNA za pomocą AAV oraz elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek w celu edycji genomu metodą CRISPR-Cas9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, następuje skuteczna dostawa matrycy naprawy DNA za pomocą AAV, co umożliwia wysoce efektywną HDR po elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek kompleksami RNP CRISPR-Cas9. Jak pokazano na filmie, prawidłowy proces elektroporacji objawia się powstawaniem pęcherzyków na każdej z elektrod (Ryc. 2C), a impedancja pozostaje w zakresie od 0,100 do 0,300 kΩ. Po elektroporacji często zdarza się, że zarodki pęcznieją, wypełniając przestrzeń okołojolkową wewnątrz błony przejrzystej (Ryc. 3). Obrzęk ten powinien ustąpić po kilku godzinach hodowli. Po elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek często obserwuje się również niewielki odsetek (do 20%) przypadków fuzji komórkowej (Ryc. 3). Fuzji komórkowej można potencjalnie uniknąć poprzez dokładne ustawienie elektrod w osi poziomej zamiast w osi pionowej (Ryc. 2B). Zazwyczaj jednak po prostu odrzucamy wszystkie zlane zarodki po zakończeniu procesu elektroporacji.

Nasza technika dostarczania DNA za pomocą AAV z elektroporacją kompleksów RNP CRISPR-Cas9 w embrionach w stadium 2 komórek okazała się bardzo skuteczna w generowaniu szczurzych modeli typu knock-in z celowanymi insercjami. Testując naszą metodę w embrionach szczura i przesiewając hodowane blastocysty pod kątem insercji zmodyfikowanego, krótkiego sztucznego intronu zawierającego miejsca loxP, zauważyliśmy, że ponad 60% blastocyst posiadało prawidłowo celowany allel knock-in na podstawie analizy sekwencjonowania następnej generacji (NGS) (Ryc. 4). Ponadto, testując naszą metodę w celu wytworzenia żywych szczurów typu knock-in, zaprojektowaliśmy projekt wprowadzenia sekwencji kodującej rekombinazę Cre celowanej w miejsce startowe ATG genu Drd2 u szczura. Matryca donora DNA zapakowana w AAV składała się z sekwencji ITR wymaganych do pakowania AAV, 5' ramienia homologii (o długości 422 bp), sekwencji Cre-pA (o długości 1 339 bp) oraz 3' ramienia homologii (o długości 477 bp) (Ryc. 5A). Z 11 urodzonych potomków 10 było pozytywnych w analizie PCR pod kątem prawidłowej insercji sekwencji Cre-pA w miejsce startowe ATG genu Drd2 szczura (Ryc. 5B-D). Celowana insercja została później potwierdzona analizą sekwencji DNA. Podsumowując wyniki z 7 różnych projektów, osiągnęliśmy średnią skuteczność knock-in na poziomie 76% u zwierząt założycieli, co ustalono na podstawie analizy PCR na stykach ramion homologii oraz weryfikacji sekwencji DNA (Tabela 2).

Napięcie [V]Długość impulsu [msek]Interwał impulsu [msec]Liczba impulsówSzybkość rozpadu [%]Polarność
Impuls porujący403.550410+
Impulsy transferowe55050540+/-

Tabela 1: Parametry elektroporacji.Upewnij się, że funkcja ograniczenia prądu (Current Limit) jest włączona podczas elektroporacji.

Schemat układu mikrofluidycznego przedstawiający proces tworzenia kropli w kanałach na potrzeby badań nad dynamiką płynów.
Rycina 2: Proces elektroporacji embrionu w stadium 2 komórek. (A) Elektroda na szkiełku przedmiotowym. (B) Embriony zawieszone w odczynnikach do edycji genomu CRISPR-Cas9 i załadowane do elektrody na szkiełku przedmiotowym przed elektroporacją. (C) Tworzenie się pęcherzyków powietrza na każdej elektrodzie podczas elektroporacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fuzja komórkowa, obrzęk zarodka; obraz mikroskopowy przedstawiający wczesne stadia rozwoju.
Rysunek 3: Wygląd zarodka po elektroporacji. Fuzja komórkowa jest obserwowana w maksymalnie 20% zarodków dwukomórkowych po elektroporacji. Komórki zarodkowe mogą również ulegać obrzękowi wewnątrz błony przejrzystej, wypełniając przestrzeń perivitelline. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy wydajności knock-in; procent zmodyfikowanych blastocyst w zależności od grup traktowania; AAV+EP wykazuje najwyższą wydajność.
Rysunek 4: Wydajność knock-in przy dostarczaniu DNA za pomocą AAV i elektroporacji embrionów w stadium 2 komórek w hodowlanych blastocystach szczura. Dane przedstawiono jako procent blastocyst wykazujących prawidłowy allel knock-in wykryty za pomocą sekwencjonowania następnej generacji (NGS). N=28 blastocyst (grupa kontrolna – sama hodowla), N=37 blastocyst (grupa kontrolna – sama elektroporacja (EP)) oraz N=35 blastocyst (grupa AAV+EP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat edycji genów z celowaniem w Drd2, integracją donora ssAAV6; zawiera wyniki elektroforezy żelowej.
Rycina 5: Utworzenie modelu szczura z knock-in Drd2-Cre. (A) Celowanie w gen Drd2 szczura. Kompleks RNP został zaprojektowany tak, aby celować w ekson 2, który zawiera miejsce startu regionu kodującego. Matryca donora AAV zawierała wirusowe sekwencje odwróconych powtórzeń końcowych (ITR), ramiona homologii (HA) 5' i 3' genu Drd2 oraz gen Cre z sekwencją polyA. Pomyślna integracja matrycy donora wprowadza gen Cre (knock-in) 3' w stosunku do miejsca startu w eksonie 2. Powoduje to umieszczenie genu Cre pod kontrolą promotora Drd2 przy jednoczesnym wyłączeniu (knock-out) genu Drd2. Położenie starterów PCR użytych do potwierdzenia pomyślnego knock-in jest wskazane fioletowymi strzałkami. (B) Analiza PCR potencjalnie edytowanych genetycznie zwierząt (ścieżki B10-C8) ze starterami obejmującymi ramiona homologii 5'. Ścieżka C9: typ dziki (kontrola negatywna); ścieżka C10: brak matrycy (kontrola negatywna). Oczekiwana wielkość amplikonu dla zwierząt z pozytywnym knock-in wynosi 601bp. (C) Analiza PCR potencjalnie edytowanych genetycznie zwierząt (ścieżki D8-E6) ze starterami obejmującymi ramiona homologii 3'. Ścieżka E7: typ dziki; ścieżka E8: kontrola bez matrycy. Oczekiwana wielkość amplikonu dla zwierząt z pozytywnym knock-in wynosi 676bp. (D) Detekcja genu Cre. Oczekiwana wielkość amplikonu wynosi 381bp. Ścieżki C7-D5: potencjalne osobniki założycielskie; ścieżka D6: typ dziki; ścieżka D7: kontrola bez matrycy. Reakcje PCR analizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej z markerami wyrównawczymi 15bp-3kb (oznaczone na zielono). Marker wielkości DNA QX jest pokazany po lewej stronie każdego obrazu, a wielkość piku odpowiada wielkości amplikonu PCR w parach zasad (bp). Rycina została zmodyfikowana za zgodą autorów publikacji24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Opis projektuProcent potomstwa z pozytywnym wynikiem knock-in (%)
Oprm1-P2A-Flp (insercja 1,7 kb) 5/5 (100%)
Drd2-Cre (insercja 1,3 kb)10/11 (91%)
Triml2-P2A-Cre (insert 1,3 kb)9/16 (56%)
Cxcl15-iCre (insercja 1,3 kb)6/6 (100%)
Opn4-P2A-Cre (insercja 1,2 kb)6/8 (75%)
Vipr1-FLEX-EGFP (insert o długości 1,4 kb) 5/12 (42%)
Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (insert 3,1 kb)5/7 (71%)

Tabela 2: Wskaźniki sukcesu modelu knock-in

Dyskusja

System edycji genomu CRISPR-Cas zrewolucjonizował dziedzinę inżynierii genetycznej, umożliwiając wydajną produkcję zarówno prostych, jak i złożonych, dostosowanych modyfikacji genetycznych u różnych gatunków zwierząt. Częste udoskonalenia i ulepszenia w technikach związanych z edycją genomu zwiększają jego wszechstronność. Tutaj opisaliśmy nowe podejście wykorzystujące dostarczanie DNA za pośrednictwem ssAAV wraz z elektroporacją 2-komórkowych zarodków odczynników CRISPR-Cas9 do 2-komórkowych zarodków gryzoni. Wykazaliśmy, że jest to skuteczny sposób na produkcję ukierunkowanych modeli zwierzęcych typu knock-in.

Główną zaletą stosowania AAV jest to, że umożliwia dostarczanie większych matryc naprawczych DNA do zarodków bez konieczności stosowania technik mikroiniekcji. Dostarczanie za pośrednictwem AAV pomaga również w pewnym stopniu obejść ograniczenia rozmiaru matrycy DNA związane z samą elektroporacją. Istnieje jednak kilka ważnych kwestii związanych z korzystaniem z AAV. Osłonka przejrzysta, stwardniała matryca glikoproteinowa otaczająca zapłodnioną komórkę jajową, służy jako fizyczna bariera, która często komplikuje dostarczanie kwasów nukleinowych. Przerzedzenie osłonki przejrzystej jest powszechną techniką stosowaną w celu lepszego dostępu do zarodka. Jednak niektóre badania wykazały, że rozwój zarodka jest utrudniony przez zakażenie wyższymi dawkami (1 × 107 GC/μL do 1 ×10 9 GC/μL) AAV w zarodkach, w których osłonka przejrzysta była ścieńczona przed zakażeniem AAV22. Istnieją jednak pewne serotypy AAV, które mogą dyfundować przez osłonę przejrzystą29. Nasz protokół nie obejmuje rozrzedzania osłonki przejrzystej i wykorzystuje AAV z serotypami 1 i 6 w stężeniu 3 × 107 GC/μl, aby osiągnąć wskaźniki knock-in wyższe niż wcześniej opublikowane raporty. Nie zauważyliśmy zmniejszonego rozwoju zarodków w tych warunkach.

Wysoka skuteczność knock-in osiągnięta przez elektroporację zarodków 2-komórkowych jest najprawdopodobniej spowodowana wydłużoną fazą G2 u zarodków na tym etapie rozwoju, co sprawia, że jest to optymalny etap rozwoju, w którym można przeprowadzić elektroporację. Jednak jednym z potencjalnych powikłań jest obserwowana fuzja komórkowa obserwowana w niektórych zarodkach dwukomórkowych podczas procesu elektroporacji. Obserwacja ta nie jest zaskakująca, biorąc pod uwagę, że procedury elektrooporowe są powszechnie stosowane do łączenia komórek ssaków, a fuzji można potencjalnie uniknąć poprzez staranne wyrównanie osi poziomej, a nie pionowej między elektrodami30,31. Co więcej, gdy edycja genomu następuje na późniejszym etapie rozwoju, takim jak 2-komórka, a nie 1-komórka, istnieje większy potencjał zwiększonej mozaikowości. Stosując nasze podejście do elektroporacji 2-komórkowej, zaobserwowaliśmy niewielki wzrost mozaicyzmu w porównaniu z iniekcją projądrową (86% dla podejścia AAV i 67% dla podejścia PNI) na etapie 1-komórkowym, ale nadal byliśmy w stanie osiągnąć transmisję zmodyfikowanego allelu w linii zarodkowej u wszystkich badanych zwierząt założycielskich. Innym potencjalnym problemem jest możliwość tandemowej integracji konkatenerów matryc DNA pochodzących z AAV. Chociaż nie przeprowadziliśmy sekwencjonowania z długim odczytem dla modeli opisanych w tym protokole, potwierdziliśmy pojedynczą integrację matryc DNA dla wszystkich modeli przy użyciu zmienności liczby kopii kropelkowo-cyfrowego PCR (ddPCR).

Wreszcie, podczas gdy nasza metoda obejmowała dostarczanie AAV sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania, powinno być możliwe zastosowanie innych podejść do dostarczania DNA za pośrednictwem wirusów i niewirusów w połączeniu z elektroporacją zarodków w celu skutecznej manipulacji genetycznej zarodków. Podsumowując, połączenie dostarczania DNA za pośrednictwem ssAAV i elektroporacji RNP CRISPR-Cas9 do zarodków w stadium 2-komórkowym jest wydajną i łatwą do dostosowania metodą wydajnego generowania modeli szczurów typu knock-in.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Nolanowi Davisowi za pomoc w filmowaniu i edycji wideo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przewody z zaciskami krokodylkowymi do elektrodNepaGeneC117
Olej mineralnyMilliporeSigmaM5310
NepaGene21 Super Electroporator NepaGeneNEPA21
Platynowe elektrody płytkowe na szkle szkiełkowymNepaGeneCUY501P1-1.5
PURedit Cas9 BiałkoMiliporeSigmaPECAS9
sgRNA (modyfikowane chemicznie)SynthegoN/A
ssAAV1 lub ssAAV6 pakowana matryca naprawy DNAVectorbuilderN/A

Bibliografia

  1. Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
  2. Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
  3. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  4. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
  5. Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67(2020).
  6. Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
  7. Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
  8. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382(2014).
  9. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  10. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
  11. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  12. Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891(2018).
  13. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474(2018).
  14. Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40(2020).
  15. Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
  16. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069(2020).
  17. Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482(2021).
  18. Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
  19. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).
  20. Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
  21. Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
  22. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  23. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  24. Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451(2023).
  25. Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
  26. Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
  27. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  28. Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
  29. Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
  30. Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
  31. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie DNA za pomoc AAVraty w modelach knock innaprawa ukierunkowana przez homologielektroporacja rybonukleoproteinmatryca naprawy DNAcelowana insercja DNA

Powiązane artykuły