Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66069

⸱

15 marca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia zoptymalizowane podejście do produkcji genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Wirus związany z adenowirusem (AAV) służy do dostarczania matrycy naprawy DNA, a elektroporacja służy do dostarczania odczynników CRISPR-Cas9 w celu zakończenia procesu edycji genomu w zarodku 2-komórkowym.

Streszczenie

Technologia edycji genomu jest powszechnie stosowana do produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt, w tym szczurów. Cytoplazmatyczne lub projądrkowe wstrzykiwanie matryc naprawczych DNA i odczynników CRISPR-Cas jest najczęstszą metodą dostarczania do zarodków. Jednak ten rodzaj mikromanipulacji wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu, jest pracochłonny i wymaga pewnego poziomu umiejętności technicznych. Co więcej, techniki mikroiniekcji często skutkują niższą przeżywalnością zarodka ze względu na mechaniczne obciążenie zarodka. W tym protokole opracowaliśmy zoptymalizowaną metodę dostarczania dużych matryc do naprawy DNA, które działają w połączeniu z edycją genomu CRISPR-Cas9 bez konieczności mikroiniekcji. Protokół ten łączy dostarczanie DNA za pośrednictwem AAV jednoniciowych matryc dawcy DNA wraz z dostarczaniem rybonukleoproteiny CRISPR-Cas9 (RNP) za pomocą elektroporacji w celu modyfikacji zarodków 2-komórkowych. Korzystając z tej nowatorskiej strategii, udało nam się wyprodukować ukierunkowane modele szczurów typu knock-in, w których inserowane są sekwencje DNA o wielkości od 1,2 do 3,0 kb ze skutecznością od 42% do 90%.

Wprowadzenie

Rozwój narzędzi do edycji genomu opartych na CRISPR przyspieszył naszą zdolność do efektywnego generowania nowych i bardziej wyrafinowanych genetycznie modyfikowanych modeli szczurów. Jednoprowadnicowy RNA, wraz z nukleazą Cas9, jest łączony w celu utworzenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP), które celują w interesujące sekwencje DNA w genomie i powodują dwuniciowe pęknięcia DNA. Ponieważ mechanizmy naprawy DNA komórkowego są podatne na błędy, podczas procesu naprawy wprowadzane są inserpcje i delecje (INDEL), które mogą zakłócić funkcję genu docelowego. Gdy dochodzi do jednoczesnego dostarczania pożądanej zmodyfikowanej sekwencji DNA (matrycy naprawczej) wraz z odczynnikami do edycji genomu, wstawienie szablonu naprawczego w regionie zawierającym pęknięcie dwuniciowego DNA następuje w procesie zwanym naprawą ukierunkowaną na homologię (HDR). Jest to skuteczna strategia generowania modeli zwierzęcych z ukierunkowanymi insercjami/podstawieniami DNA (knock-in). Jednym z ograniczeń jest to, że sekwencje knock-in są często duże, co jak wykazano, zmniejsza wydajność edycji genów, co utrudnia generowanie pożądanego modelu1. Strategie mające na celu zwiększenie wydajności knock-in obejmowały linearyzację zarówno dwuniciowych matryc naprawczych DNA (dsDNA), jak i jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz chemiczną modyfikację szablonów naprawy DNA2,3,4. Ponadto podjęto próby mikroiniekcji projądrowej wraz ze związkami stymulującymi HDR, zastosowania impulsów elektrycznych w połączeniu z mikroiniekcją oraz mikroiniekcji w czasie do zarodków 2-komórkowych5,6,7. Pomimo sukcesu niektórych z tych podejść, włączenie sekwencji DNA większych niż 1,0 kb pozostaje wyzwaniem technicznym.

Elektroporacja, która jest powszechną metodą wprowadzania odczynników do hodowlanych linii komórkowych, stanowi alternatywę dla mikroiniekcji do dostarczania składników CRISPR-Cas9 do zarodków. Elektroporacja zarodków, po raz pierwszy zademonstrowana na zarodkach szczurów8, od tego czasu jest z powodzeniem stosowana jako metoda dostarczania u myszy9,10,11,12,13, pigs14,15 i innych modelowych organizmach zwierzęcych16,17,18. Zarodki, zawieszone w pożywce zawierającej odczynniki CRISPR-Cas9, umieszcza się w kuwecie lub na szkiełku podstawowym między dwiema elektrodami i poddaje bezpośrednim impulsom prądu elektrycznego. Tworzy to przejściowe otwory w osłonie przejrzystej i błonie plazmatycznej zarodka, przez które składniki CRISPR-Cas9 dostają się do zarodków. Zazwyczaj impulsy elektryczne "poring" średniego poziomu są używane do tworzenia tymczasowych otworów, po których następują "impulsy przeniesienia" elektryczne niższego poziomu, które ułatwiają ruch ujemnie naładowanych składników edycji genomu. Elektroporacja zarodków jest wydajna, ma wysoką przepustowość i jest łatwa do wykonania. Jednakże, podczas gdy wykazano, że elektroporacja zarodków jest bardzo skuteczna we wprowadzaniu małych (<200 pz) szablonów naprawczych ssDNA, istnieje niewiele doniesień o udanej elektroporacji większych (>1,0 kb) szablonów naprawczych13,19. To ograniczenie wielkości stanowi poważne ograniczenie elektroporacji zarodków w celu generowania modeli zwierzęcych typu knock-in wymagających dużych wkłuć.

W kontekście terapii genowej, wirusy związane z adenowirusami (AAV) od dawna są używane jako nośniki do dostarczania materiału genetycznego ze względu na ich efektywną zakaźność in vivo zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek, brak patogeniczności i rzadką integrację genomową20,21. Ostatnio więcej badań połączyło AAV z technologią CRISPR-Cas9 w celu wprowadzenia szablonów naprawy DNA i odczynników CRISPR22,23,24. Takie podejście pozwala na dostarczanie większych matryc do naprawy DNA bez konieczności stosowania technik mikroiniekcji.

Ścieżka HDR jest bardziej aktywna w późnych fazach S i G2 cyklu komórkowego25,26. W badaniach przeprowadzonych in vitro znaczny wzrost skuteczności knock-in osiągnięto poprzez dostarczenie RNP CRISPR-Cas9 i matryc naprawy DNA do komórek zsynchronizowanych z G2 lub poprzez ograniczenie obecności białka Cas9 do późnych faz S i G2 przy użyciu białka fuzyjnego Cas9-Geminina2. Co więcej, dochodzi do dużej aktywacji genomu zygotycznego (ZGA), która występuje podczas rozszerzonej fazy G2 zarodka w stadium 2-komórkowym, co jest związane z otwartym stanem chromatyny. Spekuluje się, że zapewnia to RNP CRISPR-Cas9 i matrycom naprawczym większy dostęp do genomowego DNA.

Naszym celem było rozwinięcie wszystkich tych obserwacji, poprzez połączenie podejścia AAV z elektroporacją zarodków w celu wprowadzenia RNP CRISPR-Cas9 na etapie rozwoju zarodka w 2 komórek. Strategia ta wykorzystuje większą zdolność AAV do dostarczania matryc do naprawy DNA, techniczną łatwość elektroporacji i bardziej optymalny punkt czasowy dla dostępności genomu 2 komórek podczas rozwoju zarodka, aby stworzyć skuteczną metodę ukierunkowanej inżynierii genetycznej insercji DNA. Jak podkreślono w niniejszym protokole, nasza zoptymalizowana metoda pozwala na produkcję ukierunkowanych modeli szczurów typu knock-in, w których wprowadzono sekwencje DNA o wielkości od 1,2 do 3,0 kb bez konieczności stosowania technik mikroiniekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Missouri (protokół ACUC nr 25580) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi w Przewodniku po wykorzystaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi (Guide for the Use and Care of Laboratory Animals).

1. Dostarczanie matrycy do naprawy DNA za pośrednictwem AAV

  1. Zaprojektuj konstrukt DNA tak, aby zawierał pożądaną sekwencję knock-in pomiędzy dwoma ramionami homologii. Typowa długość ramion homologii wynosi 300-500 bp. Upewnij się, że cały matryca do naprawy DNA (ramiona homologii + pożądana sekwencja knock-in) jest flankowana przez odwrócone powtórzenia końcowe (ITRs) poprzez klonowanie do odpowiedniego szkieletu plazmidowego i pakowanie do rekombinowanego ssAAV1 lub ssAAV6 (serotypy 1 lub 6).
    UWAGA: Jeśli sekwencja docelowa sgRNA znajduje się w matrycy do naprawy DNA, ważne jest wprowadzenie mutacji cichych w celu przerwania tej sekwencji, co zapobiegnie edycji prawidłowo ukierunkowanego allelu za pomocą CRISPR-Cas9.
    OSTRZEŻenie: Rekombinowane wektory wirusowe AAV są nieintegrujące i sklasyfikowane jako BSL-1. Do pipetowania i manipulowania embrionami narażonymi na działanie wirusa stosuje się standardowe techniki aseptyczne.
  2. Dodaj zmodyfikowany ssAAV1 lub ssAAV6 (zapakowany z matrycą do naprawy DNA) do 30 µL pożywki KSOM-R27,28 do końcowego stężenia 3 × 107 kopii genomu (GC)/µL pod warstwą oleju mineralnego w szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  3. Umieść zygoty z widocznymi prątami w pożywce KSOM-R zawierającej zmodyfikowany ssAAV.
    UWAGA: Stosując ten protokół, nie ma potrzeby ścieńczania błony przejrzystej, ponieważ serotypy AAV 1 i 6 są w stanie łatwo przez nią przenikać, co zapewnia efektywne dostarczenie matrycy do naprawy DNA.
  4. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i maksymalnej wilgotności przez 18-20 h, aby umożliwić wystarczającą transdukcję wirusową.

2. Przygotowanie do elektroporacji

  1. Następnego dnia, w sterylnej probówce wolnej od RNaz, przygotować mieszaninę do elektroporacji zawierającą 100 ng/µL sgRNA oraz 100 ng/µL białka Cas9 rozcieńczonych w medium Opti-MEM. Delikatnie wymieszać.
  2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu umożliwienia formowania się kompleksów RNP.
  3. W czasie inkubacji włączyć elektroporator i podłączyć przewody do elektrody z szkiełka przedmiotowego o przerwie 1,5 mm.
  4. Ustawić parametry elektroporacji zgodnie z opisem w Tabeli 1.

3. Elektroporacja zarodka w stadium 2 komórek

  1. Ostrożnie nanieś pipetą 5 µL mieszaniny do elektroporacji CRISPR pomiędzy dwie elektrody na szkiełku przedmiotowym, dbając o to, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  2. Wyjmij zarodek w stadium 2 komórek z roztworu AAV. Ułóż zarodki w stadium 2 komórek w mieszaninie, nie dopuszczając do ich kontaktu z krawędziami elektrod. Ma to na celu uniknięcie lizy.
  3. Naciśnij przycisk Ohm, aby zmierzyć impedancję. Upewnij się, że impedancja mieści się w zakresie od 0,100 do 0,300 kΩ. Objętość reakcji wpływa na impedancję (dodanie objętości zmniejsza impedancję, a jej odjęcie zwiększa impedancję).
  4. Naciśnij Start. Proces trwa kilka sekund.
  5. Bezzwłocznie po elektroporacji wyjmij zarodki i przemyj je 3 razy w świeżych kroplach po 30 µL pożywki KSOM-R.
  6. Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i maksymalną wilgotnością do hodowli in vitro w kroplach po 500 µL pożywki KSOM-R pod warstwą oleju mineralnego. Alternatywnie, przenieś zarodki chirurgicznie do pseudociążnej samicy szczura w 1,5 dniu po kopulacji (dpc), aby uzyskać żywe potomstwo.

Proces edycji genów; dostarczanie DNA rAAV, elektroporacja zarodka, CRISPR, model gryzoni; schemat.
Rysunek 1: Schemat procedury dostarczania DNA za pomocą AAV oraz elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek w celu edycji genomu metodą CRISPR-Cas9. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, następuje skuteczna dostawa matrycy naprawy DNA za pomocą AAV, co umożliwia wysoce efektywną HDR po elektroporacji zarodków w stadium 2 komórek kompleksami RNP CRISPR-Cas9. Jak pokazano na filmie, prawidłowy proces elektroporacji objawia się powstawaniem pęcherzyków na każdej z elektrod (Ryc. 2C), a impedancja pozostaje w zakresie od 0,100 do 0,300 kΩ. Po elektroporacji często zdarza się, że zarodki pęcznieją, wypełniając przestrzeń okoł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

System edycji genomu CRISPR-Cas zrewolucjonizował dziedzinę inżynierii genetycznej, umożliwiając wydajną produkcję zarówno prostych, jak i złożonych, dostosowanych modyfikacji genetycznych u różnych gatunków zwierząt. Częste udoskonalenia i ulepszenia w technikach związanych z edycją genomu zwiększają jego wszechstronność. Tutaj opisaliśmy nowe podejście wykorzystujące dostarczanie DNA za pośrednictwem ssAAV wraz z elektroporacją 2-komórkowych zarodków odczynników CRISPR-Cas9 do 2-komórkowych zarodków gryzoni. Wykazaliśm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Nolanowi Davisowi za pomoc w filmowaniu i edycji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przewody z zaciskami krokodylkowymi do elektrodNepaGeneC117
Olej mineralnyMilliporeSigmaM5310
NepaGene21 Super Electroporator NepaGeneNEPA21
Platynowe elektrody płytkowe na szkle szkiełkowymNepaGeneCUY501P1-1.5
PURedit Cas9 BiałkoMiliporeSigmaPECAS9
sgRNA (modyfikowane chemicznie)SynthegoN/A
ssAAV1 lub ssAAV6 pakowana matryca naprawy DNAVectorbuilderN/A

Bibliografia

  1. Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction. Fac Rev. 9, 20(2020).
  2. Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair. Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).
  3. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  4. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).
  5. Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67(2020).
  6. Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).
  7. Kurihara, T., et al. DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons. Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).
  8. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4, 6382(2014).
  9. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  10. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).
  11. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  12. Troder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), e0196891(2018).
  13. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Sci Rep. 8 (1), 474(2018).
  14. Tanihara, F., et al. Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes. BMC Biotechnol. 20 (1), 40(2020).
  15. Tanihara, F., et al. Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes. Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).
  16. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Front Genet. 11, 570069(2020).
  17. Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes. Front Genet. 12, 648482(2021).
  18. Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos. Data Brief. 21, 316-320 (2018).
  19. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).
  20. Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing. Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).
  21. Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications. Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).
  22. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  23. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  24. Davis, D. J., et al. Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation. Front Genome Ed. 5, 1256451(2023).
  25. Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle. Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).
  26. Takata, M., et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).
  27. Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro. Theriogenology. 151, 81-85 (2020).
  28. Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro. Theriogenology. 198, 69-74 (2023).
  29. Romeo, C., et al. AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs. Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).
  30. Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells. Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).
  31. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dostarczanie DNA za pomocą AAVraty w modelach knock-innaprawa ukierunkowana przez homologięelektroporacja rybonukleoproteinmatryca naprawy DNAcelowana insercja DNA
CRISPR-Cas9 Edycja genomu zarodków szczurów przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i elektroporacją zarodków 2-komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.