Tutaj prezentujemy kombinację skutecznych metod ograniczania szczurów i nakłuwania żył podobojczykowych, które umożliwiają szybkie, bezpieczne i wielokrotne pobieranie krwi u szczurów bez znieczulenia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek krwi z żyły podobojczykowej u przytomnych szczurów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje kilka sprawdzonych metod uzyskiwania powtarzających się próbek krwi od szczurów, z których najczęściej stosowanymi są pobieranie próbek z żył ogonowych bocznych bez znieczulenia i pobieranie próbek z żyły szyjnej w znieczuleniu. Jednak większość z tych metod wymaga pomocy i sprzętu anestezjologicznego, a czasami stwarza trudności w zakresie pobierania krwi lub złej jakości próbek krwi. Ponadto te metody pobierania krwi pochłaniają dużo czasu i zasobów ludzkich, gdy wymagane jest wielokrotne pobieranie próbek krwi w przypadku dużej liczby szczurów. W badaniu przedstawiono technikę powtarzalnego pobierania próbek krwi u szczurów nieznieczulonych przez jednego biegłego osobnika. Wysoce zadowalające próbki krwi można uzyskać poprzez nakłucie żyły podobojczykowej. Metoda wykazała imponujący ogólny wskaźnik sukcesu wynoszący 95%, przy medianie czasu od unieruchomienia szczurów do zakończenia pobierania krwi wynoszącej zaledwie 2 minuty. Co więcej, wykonywanie kolejnych pobrań krwi w wyznaczonym zakresie nie wyrządza szczurom żadnej szkody. Metodę tę warto promować przy pobieraniu krwi, zwłaszcza w badaniach farmakokinetycznych na dużą skalę.
Wprowadzenie
Szczury są jednymi z najpowszechniejszych zwierząt doświadczalnych i istnieje wiele sposobów na uzyskanie próbek krwi. W przypadku eksperymentów polegających na pojedynczym pobraniu krwi na końcowym etapie, wystarczającą ilość krwi można uzyskać poprzez punkcję serca lub pobranie krwi z aorty brzusznej1. Jednak niektóre badania wymagają wielokrotnego pobierania krwi od szczurów do rutynowej analizy krwi lub analizy biochemicznej, zwłaszcza w badaniach farmakokinetycznych i toksykologicznych, gdzie wielokrotne pobieranie krwi jest wymagane w celu określenia wchłaniania, dystrybucji i metabolizmu leków2.
Obecnie, mimo że pobieranie krwi z żyły ogonowej jest najczęstszą metodą pobierania próbek krwi od szczurów, mimo że nie wymaga znieczulenia, metoda ta może być trudna przy wielokrotnym pobieraniu, a objętość pobranej krwi jest stosunkowo mała3,4. Dodatkowo, chociaż krew może być pobrana z żył odpiszczelowych i prącia, ilość pobieranej krwi jest ograniczona i wymagane jest znieczulenie1,5. Ponadto próbki krwi pobrane ze splotu żylnego podżuchwowego, a także żył podjęzykowych, szyjnych i podobojczykowych dostarczają próbek wyższej jakości, ale zazwyczaj wymagają znieczulenia lub pomocy wielu osób1,6,7,8,9. Wreszcie, pobranie krwi w zatokach/kanałach zaoczodołowych nie tylko wymaga znieczulenia, ale może również potencjalnie spowodować obrażenia i stres u szczurów9.
Jakość próbek krwi zazwyczaj pobieranych z głównych żył jest zazwyczaj na najwyższym poziomie1. Obecnie niektóre badania wykazały, że ciągłe mikropobieranie próbek przez żyłę szyjną jest bardzo odpowiednią metodą do badań toksykologicznych na szczurach, chociaż metoda ta zwykle wymaga cewnikowania żyły szyjnej10,11,12. Dlatego warto zbadać, w jaki sposób uzyskać wysokiej jakości próbki krwi zgodnie z zasadą 3R badań na zwierzętach bez interwencji chirurgicznej. Celem pracy było przedstawienie metody efektywnego pobierania krwi z żyły podobojczykowej u szczurów. Technika ta umożliwia szybkie pobranie zadowalających próbek za pomocą procedury przeprowadzanej przez jedną osobę bez konieczności znieczulenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie było zgodne z wytycznymi przedstawionymi w 8. wydaniu Przewodnika po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych13. Badania uzyskały aprobatę Komisji Etycznej Drugiego Szpitala Uniwersyteckiego w Lanzhou i zostały udokumentowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.014. Dwanaście zdrowych szczurów rasy Wistar (sześć samców o wadze 290-330 g i sześć samic o wadze 250-280 g) w wieku 12-16 tygodni umieszczono w Laboratorium Zwierząt GLP Uniwersytetu w Lanzhou na 3 dni przed właściwym eksperymentem. Zastosowane klatki dla szczurów były typu R5 o wymiarach 545 mm x 395 mm x 200 mm i były wyposażone w autoklawizowany materiał ściółkowy. Wszystkie szczury miały zapewniony nieograniczony dostęp zarówno do jedzenia, jak i wody. W laboratorium utrzymywała się średnia wilgotność na poziomie 25%, średnia temperatura 24 °C i cykl światła, który zmieniał się między dniem a nocą (7:00 rano/19:00). Po zakończeniu badania wszystkie zwierzęta zostały humanitarnie poddane eutanazji przy użyciu przedawkowania izofluranu. Aby uzyskać wyczerpujące informacje na temat materiałów i narzędzi wykorzystanych w tym badaniu, zapoznaj się z tabelą materiałów.
1. Obliczanie wielkości próby i selekcja zwierząt
- Wybierz metodę równania zasobów15, aby oszacować wielkość próbki zwierzęcia za pomocą równania (1).
E = Całkowita liczba zwierząt − Całkowita liczba grup (1)
Gdzie E jest stopniem swobody analizy wariancji (ANOVA) i mieści się w zakresie od 10 do 20,
UWAGA: W tym badaniu 12 zwierząt podzielono na dwie grupy A i B (trzy samce i trzy samice w grupie). - Zdefiniuj podstawowy wynik tego badania jako wskaźnik powodzenia i czas potrzebny na wielokrotne pobieranie próbek krwi przez jedną osobę.
- Zdefiniuj drugorzędowe miary wyników jako zmiany w masie ciała szczura, spożyciu pokarmu i wody, a także częstość występowania zdarzeń niepożądanych (takich jak złamania obojczyka, krwiaki podskórne, odma opłucnowa i śmiertelność).
- Zdefiniuj pomyślne pobranie krwi jako spełnienie następujących kryteriów: i) mniej niż trzy nakłucia podczas jednego pobrania krwi; (ii) łączny czas (od unieruchomienia szczurów do zakończenia pobierania krwi) nieprzekraczający 5 minut; oraz iii) osiągnięcie docelowej objętości krwi przy jednoczesnym uzyskaniu czystego osocza. Każde odchylenie od tych kryteriów należy uznać za niepowodzenie w doborze próby.
2. Krępowanie zwierząt i pobieranie krwi
UWAGA: Próbki krwi od szczurów grupy A i B zostały pobrane przez dwóch doświadczonych badaczy, którzy pobrali co najmniej 100 próbek krwi. Próbki krwi pobrano od obu grup szczurów łącznie 96 razy w ciągu 4 dni. Ta metoda pobierania krwi nie wymaga znieczulenia ani dodatkowych urządzeń krępujących dla szczurów. Wymaga to jednak biegłych technik obsługi.
- O godzinie 8:00 rano w dniu poprzedzającym pobranie próbek krwi (dzień 1) należy przydzielić każdego szczura do jego indywidualnej klatki, podczas gdy jego pokarm i woda są ważone. Następnie poproś innego badacza, który nie zwracał uwagi na pomiary, aby rejestrował wagę szczurów, spożycie pokarmu i spożycie wody każdego dnia o 8:00 rano od pierwszego dnia.
- Aby postępować zgodnie z tym protokołem, najpierw pobieraj krew o godzinie 10:00, a następnie o godzinie 22:00 każdego dnia, pobierając na przemian 0,15 ml krwi z żył podobojczykowych po obu stronach.
UWAGA: Ilość krwi do pobrania została określona na podstawie maksymalnej objętości, jaką szczur o najniższej wadze mógł tolerować w ciągu tygodnia. - Przepłukać strzykawkę heparyną sodową (25 j./ml) i zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
- Delikatnie pogłaszcz skórę grzbietu szczura i kilkakrotnie szczyp go w szyję, aby pomóc szczurowi się zrelaksować (wideo 1).
- Używając kciuka i palca wskazującego ręki niedominującej, chwyć i mocno unieś skórę szyi szczura (Rysunek 1A i Wideo 1).
- Przy koordynacji z ręką dominującą, użyj pozostałych trzech palców i dłoni ręki niedominującej, aby zabezpieczyć skórę grzbietu szczura i unieruchomić jego przednie kończyny (Rysunek 1B, C i Wideo 2).
UWAGA: Jeśli szczur opiera się lub walczy, procedurę tę można powtórzyć kilka razy, aby pomóc szczurowi przyzwyczaić się do obchodzenia się z nim. Następujące kroki są kluczem do udanego pobrania krwi. - Używając palca wskazującego ręki niedominującej, delikatnie dociśnij skórę głowy szczura, podczas gdy pozostałe palce wraz z dłonią pomagają w obracaniu stawu barkowego na zewnątrz. Podczas tego procesu użyj dominującej ręki, aby całkowicie wyprostować staw barkowy szczura (Rysunek 1D-F i Wideo 2).
- Chwyć mocno szczura ręką niedominującą, aby wyrównać głowę i ciało szczura w linii prostej (Rysunek 1G, H). Następnie użyj dominującej ręki, aby zlokalizować pozycję obojczyka i potwierdzić miejsce nakłucia (Rysunek 1I, Wideo 2 i Wideo 3).
UWAGA: Golenie szczura nie jest konieczne. W Rysunek 1, golenie zostało wykonane tylko po to, aby w większym stopniu pokazać pozycję obojczyka i nakłucia. Podczas krępowania szczurów, zwłaszcza szczurów >350 g, pozwolenie szczurowi na oparcie stóp na twardej powierzchni pomoże utrzymać ich masę ciała. Dodatkowo krępujący powinien monitorować częstość oddechów każdego szczura podczas pobierania krwi, aby upewnić się, że ograniczenie nie jest zbyt ciasne, co może spowodować niewydolność oddechową. - Trzymając strzykawkę równolegle do ciała szczura w dominującej ręce, z końcówką igły skierowaną do góry i łuską strzykawki skierowaną w stronę eksperymentatora, utrzymuj kąt około 15° z linią środkową ciała szczura. Wbij igłę 0,5 cm poniżej wcięcia obojczyka (na styku bliższej trzeciej części obojczyka i mostka), upewniając się, że igła pozostaje równoległa do ciała szczura (Rysunek 1J i Wideo 3).
UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na kąt i głębokość wprowadzenia igły, aby uniknąć przebicia naczynia krwionośnego lub niezamierzonego uszkodzenia sąsiednich naczyń. - Delikatnie wyjąć strzykawkę nieznacznie, aby wytworzyć podciśnienie, któremu często towarzyszy namacalne uczucie przebicia po wejściu do naczynia krwionośnego (szczególnie widoczne podczas początkowego pobierania krwi). Utrzymuj tę pozycję i pobieraj 0,1-1,0 ml krwi ze stałą prędkością w razie potrzeby (zgodnie z wytycznymi IACUC około 4-5,3 ml/kg krwi tygodniowo1) (Rysunek 1K i Wideo 3).
- Jeśli po wkłuciu nie ma krwi, spróbuj delikatnie wyregulować kąt i głębokość igły lub delikatnie obrócić strzykawkę (Wideo 3). Jeśli trzy kolejne próby po tej samej stronie nie powiodą się, zatamuj całe krwawienie, a następnie przełącz się na przeciwną stronę w celu nakłucia.
UWAGA: Szybkie nakłucie skóry jest wskazane, aby szczur nie walczył z powodu dyskomfortu. - Zastosuj bawełniany wacik do hemostazy i włóż szczura z powrotem do klatki (wideo 4).
- Przetwarzaj próbki krwi zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.
3. Przetwarzanie próbek krwi
- Wyrzucić igłę strzykawki do pojemnika na ostre przedmioty. Pobraną krew przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, uprzednio przepłukanej heparyną. Umieścić probówkę w wirówce, ustawić ją na 4 °C i 1 200 x g, a następnie wirować przez 10 minut w celu oddzielenia osocza. Przenieść surowicę za pomocą pipety Pasteura o pojemności 1,0 ml do czystej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Aby zapobiec hemolizie spowodowanej ciśnieniem, w razie potrzeby zdejmij końcówkę igły. Podczas aspiracji osocza należy unikać pobierania komórek krwi z dna probówki. Czasami na powierzchni strzykawki może gromadzić się sierść szczura; Uważaj, aby nie dopuścić do przedostania się futra do tuby, ponieważ może to prowadzić do zakrzepów.
4. Analiza statystyczna
- Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± odchylenie standardowe i przetestuj je pod kątem jednorodności wariancji.
- Użyj dokładnego testu Fishera, aby porównać wskaźniki sukcesu między grupami.
- Użyj niezależnego testu t dla dwóch prób, aby porównać ogólne średnie między dwiema grupami.
- Użyj analizy wariancji (ANOVA) do ciągłych pomiarów, takich jak czas pobierania krwi, masa ciała, spożycie pokarmu i spożycie wody. Rozważmy, że P < 0,05 jest statystycznie istotne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wysokiej jakości próbki osocza charakteryzują się bladożółtą barwą, klarownością i przejrzystością, bez czerwonego zabarwienia lub skrzepów, co przedstawiono na Rysunku 2A. Rysunek 2B pokazuje odpowiednio hemolizę (lewa strona) lub koagulację (prawa strona) będącą wynikiem nieprawidłowych procedur. W ciągu 96 sesji pobierania krwi w ciągu 4 dni, średnie czasy pojedynczego pobrania krwi dla grup A i B wynosiły odpowiednio 119,87 ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż pobieranie krwi z żyły ogonowej jest najczęstszą metodą wielokrotnego pobierania krwi u szczurów, mogą na nią wpływać leki anestezjologiczne, a ze względu na mały rozmiar żyły ogonowej ilość krwi, którą można pobrać w jednym przypadku, jest ograniczona, co prowadzi do dłuższego czasu pobierania krwi 4,5. Chociaż systemy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) w połączeniu z mikropróbkowaniem kapilarnym (CMS) ż...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani niefinansowych, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Projekt Planu Cuiying Drugiego Szpitala Uniwersyteckiego w Lanzhou (Grant No. PR0121015) oraz Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Research (grant nr 0412D2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,75% soli fizjologicznej | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | — — | Przygotowany roztwór sodu heparyny |
| 1 ml pipety Pasteura | Biosharp | BS-XG-01-NS | |
| Strzykawka 1 ml do pobierania krwi (26 G, 0,45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co., Ltd. | Pobieranie krwi 0,45 * 12RWLB | |
| 1,5 ml probówka Eppendorf | Biosharp | BS-15-M | Przechowywanie i pobieranie krwi |
| 75% alkoholu medycznego | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | — — | Dezynfekcja miejsca pobierania krwi szczurów |
| Uchwyt probówki wirówkowej | Biosharp | BS-05/15-SM60 | — — |
| Waga elektroniczna | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Ważenie |
| heparyny sodowej do wstrzykiwań | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | — — | Przepłukać strzykawkę i probówkę EP; rozcieńczyć solą fizjologiczną do 25 j./ml |
| Wirówka niskotemperaturowa | HuNan Xiang Yi Wirówka Instrument Co., Ltd. | H1750R | Oddzielanie surowicy |
Bibliografia
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513(2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513(2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167(2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66075
