Trójwymiarowe akustyczne urządzenie montażowe do masowej produkcji sferoid komórkowych

3D modele hodowli in vitro, które dostarczają więcej cech strukturalnych i morfologicznych podobnych do in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi modelami hodowli 2D, zostały uznane za obiecujące systemy w różnych zastosowaniach biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa, modelowanie chorób i badania przesiewowe leków1^,2,3. Jako jeden z typów modelu hodowli 3D, sferoidy komórkowe zazwyczaj odnoszą się do agregacji komórek, tworząc sferoidalne struktury 3D charakteryzujące się wzmocnionymi interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz^4,5,6. W związku z tym wytwarzanie sferoid komórkowych stało się potężnym narzędziem umożliwiającym różnorodne badania biologiczne.

Różne techniki, w tym wiszące krople⁷, nieprzylepne płytki⁸, lub urządzenia mikrostudzienne⁹, zostały opracowane w celu uzyskania sferoid. Zasadniczo metody te zwykle ułatwiają składanie komórek poprzez wykorzystanie sił fizycznych, takich jak siła grawitacji, przy jednoczesnej minimalizacji interakcji między komórkami a podłożem. Jednak często obejmują one pracochłonne procesy, mają niską produktywność i stanowią wyzwanie dla kontrolowania rozmiaru sferoidów^10,11. Co ważne, produkcja sferoid o pożądanej wielkości i jednorodności w wystarczającej ilości ma ogromne znaczenie dla zaspokojenia określonych zastosowań biologicznych. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, fale akustyczne, jako jeden z rodzajów techniki sterowanej siłą zewnętrzną^12,13,14, wykazały potencjał do masowej produkcji sferoid komórkowych o wysokiej jakości i przepustowości, w oparciu o zasadę zwiększania agregacji komórek przez siły zewnętrzne^15,16,17,18. W przeciwieństwie do sił elektromagnetycznych lub magnetycznych, techniki manipulacji komórkami oparte na akustyce są nieinwazyjne i bezznacznikowe, umożliwiając tworzenie sferoidów o doskonałej biokompatybilności^19,20.

Zazwyczaj urządzenia oparte na falach akustycznych na powierzchni stojącej (SAW) i masowych falach akustycznych (BAW) zostały opracowane do generowania sferoid, wykorzystując węzły akustyczne (AN) wytwarzane przez odpowiednie stojące pola akustyczne^21,22,23. W szczególności akustyczne urządzenia montażowe oparte na BAW, z zaletami wygodnej produkcji, łatwej obsługi i doskonałej skalowalności, zyskały uwagę przy wytwarzaniu sferoid komórkowych^24,25. Niedawno opracowaliśmy łatwe urządzenie do montażu akustycznego oparte na BAWs, które ma możliwość generowania sferoid o wysokiej przepustowości²⁶. Proponowane urządzenie składa się z kwadratowej komory z polimetakrylanu metylu (PMMA) z trzema przetwornikami tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) ustawionymi odpowiednio w płaszczyźnie X/Y/Z. Taki układ umożliwia stworzenie trójwymiarowego wzoru tablicy punktowej lewitujących węzłów akustycznych (LAN) do sterowania montażem komórek. W porównaniu z wcześniej zgłaszanymi urządzeniami opartymi na BAW lub SAWs, które mogą tworzyć tylko tablicę 1D lub 2D ANs^27,28,29, obecne urządzenie umożliwia 3D kropkową tablicę sieci LAN do szybkiego tworzenia agregacji komórek w roztworze żelatyny metakryloylowej (GelMA). Następnie, po trzech dniach hodowli, agregaty komórkowe dojrzewały do postaci sferoid o wysokiej żywotności w fotoutwardzalnych rusztowaniach GelMA. Wreszcie, z rusztowań GelMA można było łatwo uzyskać dużą liczbę sferoid o jednolitych rozmiarach do dalszych zastosowań.

1. Wykonanie akustycznego urządzenia montażowego 3D

1. Zacznij od przygotowania czterech arkuszy PMMA o grubości 1 mm poprzez cięcie laserowe³⁰, a następnie przystąp do sklejania ich ze sobą, tworząc kwadratową komorę o wewnętrznej szerokości 21 mm i wysokości 10 mm.
2. Następnie przymocuj kolejny arkusz PMMA o grubości 1 mm do dna komory, aby służył jako uchwyt na biotusz.
3. Ostrożnie przymocuj trzy przetworniki tytanianu cyrkonianu ołowiu (PZT) (każdy o długości 20 mm, szerokości 10 mm, grubości 0.7 mm i pierwotnej częstotliwości rezonansowej 3 MHz, patrz Tabela materiałów) odpowiednio na zewnątrz trzech ortogonalnych ścianek komory. Upewnij się, że dolny przetwornik PZT jest wyśrodkowany pod komorą.
4. przewody do dwóch obszarów przewodzących każdego przetwornika PZT.
5. Na koniec przymocuj urządzenie do pustej podstawy, aby zapobiec kontaktowi dolnego PZT z innymi blatami.

2. Konfiguracja systemu montażu akustycznego

1. Zacznij od zamontowania urządzenia akustycznego na stoliku mikroskopowym, co pozwoli na obserwację wnętrza komory z widokiem z góry.
2. Mikroskop cyfrowy należy umieścić po stronie urządzenia, która jest wolna od przetworników PZT, umożliwiając obserwację wnętrza komory z widokiem z boku.
3. Niezależnie podłącz przewody z trzech przetworników PZT szeregowo do trzech wzmacniaczy mocy i trzech kanałów wyjściowych generatorów funkcyjnych (patrz Tabela materiałów).
4. Zaprogramuj ustawienia w generatorach funkcyjnych dla każdego przetwornika PZT, określając parametry, takie jak przebieg sinusoidalny, częstotliwość i amplituda.
5. Aby zapewnić sterylizację, napełnij komorę urządzenia akustycznego 75% alkoholem przez 5 minut, a następnie dokładnie wyczyść sterylnym roztworem PBS. Następnie należy naświetlić komorę światłem UV w czystej ławie przez co najmniej 1 godzinę.

3. Procedura hodowli komórkowej i zbioru

1. Rozpocznij od hodowli komórek C3A, ludzkiej linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego, w kolbie do hodowli komórek T25 przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (patrz tabela materiałów).
2. Gdy komórki C3A osiągną około 80% konfluencji, przeprowadź pasaż komórkowy w następujący sposób: najpierw dwukrotnie umyj dno kolby hodowlanej PBS. Następnie dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, aby ułatwić oddzielenie komórek. Zatrzymaj proces trypsynizacji, dodając 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
3. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.

4. Przygotowanie biotuszu

1. Przygotować 6% (w/v) roztwór GelMA zawierający 0,5% (w/v) fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) przez rozpuszczenie 0,3 g GelMA i 0,025 g LAP (patrz tabela materiałów) w 5 ml buforowego roztworu fosforanowego (PBS). Pozostawić mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 47 °C na 1 godzinę.
2. Przed zmieszaniem z komórkami przepuścić roztwór GelMA przez filtr 0,22 μm (patrz tabela materiałów) w celu sterylizacji.
3. Zawiesić wspomniany powyżej osad komórkowy (krok 3.3) w pożywce do hodowli komórkowych. Zabarwić niewielką objętość komórek 0,4% roztworem błękitu trypanowego, a następnie użyć czystego hemocytometru do zliczania komórek.
4. Wymieszać odpowiednią ilość komórek C3A, obliczoną na podstawie gęstości komórek uzyskanej powyżej, ze sterylizowanym roztworem GelMA, aby przygotować biotusz o gęstości komórek 2 × 10⁶ komórek/ml.
5. W celu wizualizacji zmontowanych sferoid komórkowych należy wstępnie wybarwić komórki C3A poprzez inkubację z 2 μM cell trackerem (barwnik DiO, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie przed użyciem należy trzykrotnie umyć oznakowane komórki świeżą pożywką do hodowli komórek.

5. Montaż sferoid ogniw za pomocą urządzenia akustycznego

1. Odpipetować więcej niż 1 ml biotuszu do wysterylizowanej komory. Upewnij się, że odległość twarzą w twarz między powierzchnią cieczy a dnem komory jest całkowitą wielokrotnością połowy długości fali akustycznej.
   UWAGA: Odległość tę można kontrolować, regulując ilość dodawanego biotuszu. Długość fali akustycznej (λ) można oszacować za pomocą wzoru λ = c/f, gdzie c oznacza prędkość dźwięku w ośrodku, a f jest częstotliwością przetwornika PZT.
2. Włącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy, aby zainicjować uruchamianie każdego przetwornika PZT.
   UWAGA: Zaleca się, aby najpierw uruchomić każdy przetwornik PZT indywidualnie, aby uzyskać optymalny wzór komórkowy linii równoległej. Można to osiągnąć, przeprowadzając przemiatanie częstotliwości z krokiem o wielkości 0,001 MHz w pobliżu pierwotnej częstotliwości rezonansowej dla każdego przetwornika PZT. Następnie należy jednocześnie zastosować te optymalne sygnały do wszystkich trzech przetworników PZT, aby uzyskać oczekiwany wzór komórkowy 3D-dot. Przed zastosowaniem każdego sygnału wejściowego upewnij się, że komórki są równomiernie rozproszone w biotuszu poprzez delikatne mieszanie.
3. Usieciuj biotusz za pomocą niebieskiego światła (405 nm, 60 mW/cm², 30 s), aby stworzyć rusztowanie hydrożelowe 3D, które otacza agregaty komórkowe zmontowane akustycznie. Następnie wyłącz generator funkcyjny i wzmacniacz mocy.
4. Ostrożnie przenieś rusztowanie hydrożelowe 3D z komory na szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki (np. 2 mm × 2 mm × 2 mm) za pomocą czystej brzytwy.
5. Dodać pożywkę do hodowli komórkowej.
   UWAGA: Pamiętaj, aby codziennie zmieniać pożywkę hodowlaną.

6. Odzyskiwanie sferoid komórkowych

1. Zacznij od obserwacji tworzenia się sferoid w różnych warstwach rusztowań za pomocą odwróconego mikroskopu.
2. Po 3 dniach hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie dokładnie umyć rusztowania hydrożelowe PBS.
3. Inkubować rusztowania z więcej niż 2 ml buforu do lizy GelMA w rozcieńczeniu 1:200 z pożywką do hodowli komórkowych przez 30 minut w inkubatorze komórkowym. Ten krok ma na celu rozpuszczenie rusztowań hydrożelowych.
4. Przenieść roztwór z poprzedniego etapu do probówki, a następnie odwirować go przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad sferoidalny komórki.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce hodowlanej do dalszych zastosowań.

7. Analiza żywotności sferoidów

1. Ocenić żywotność sferoid komórkowych zarówno w rusztowaniach hydrożelowych, jak i w odzyskanych sferoidach, używając zestawu do barwienia żywych/martwych (patrz tabela materiałów).
2. Próbki inkubować w różnych punktach czasowych hodowli z 1 ml roztworu PBS zawierającego 1 μl Calcein-AM i 2 μl jodku propidyny (PI) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
3. W przypadku próbek znajdujących się w rusztowaniach hydrożelowych należy je dwukrotnie przemyć bezpośrednio PBS. W przypadku odzyskanych sferoid należy odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania sferoidalnej osadki i umyć ją dwukrotnie przed obserwacją.
4. Obserwuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i uchwyć obrazy fluorescencyjne.
5. Oblicz stosunek obszaru barwionego Calcein-AM do całkowitego obszaru barwionego zarówno Calcein-AM, jak i PI za pomocą ImageJ, aby określić żywotność sferoidy.

To badanie zaprojektowało urządzenie do montażu akustycznego 3D do masowej produkcji sferoid komórkowych. Urządzenie akustyczne składało się z kwadratowej komory z dwoma przetwornikami PZT przymocowanymi do płaszczyzny X i Y na zewnętrznej powierzchni komory oraz jednym przetwornikiem PZT na dnie komory (Rysunek 1A,B). Trzy kanały wyjściowe z dwóch generatorów funkcyjnych zostały podłączone do trzech wzmacniaczy mocy, aby wygenerować trzy niezależnie sinusoidalne sygnały do uruchamiania przetworników PZT (Rysunek 1C).

Optymalnymi częstotliwościami rezonansowymi używanymi do uruchamiania trzech przetworników PZT podłączonych do płaszczyzn X/Y/Z komory były odpowiednio 3,209 MHz, 3,283 MHz i 3,215 MHz. Optymalna amplituda dla wszystkich trzech przetworników PZT wynosiła 10 międzyszczytowych napięć wyjściowych (Vpp), mierzonych oscyloskopem. Rysunek 2A ilustruje mechanizm działania agregatów komórkowych generowanych za pomocą urządzenia do montażu akustycznego 3D. Po podaniu sygnału komórki są kierowane do węzłów akustycznych pod wpływem siły promieniowania akustycznego (ARF). Aby uwidocznić sferoidy komórek, komórki zostały wstępnie wybarwione 2 μM DiO (zielona fluorescencja). Po akustycznym złożeniu komórek, użyto mikroskopu konfokalnego do obserwacji akustycznie zmontowanych agregatów komórkowych 3D. Zaobserwowano, że te agregaty komórek są ułożone w regularny wzór 3D-dot z jednolitymi zielonymi sygnałami fluorescencyjnymi (Rysunek 2B). Różne widoki z góry obrazów w jasnym polu wykazały również, że uformowane agregaty w każdej warstwie były ułożone we wzór tablicy punktowej 2D (Rysunek 2C).

Zaobserwowano wzrost agregatów komórkowych w hydrożelu w różnych punktach czasowych. Wyniki pokazały, że zmontowane agregaty stopniowo integrowały się i tworzyły ciasne sferoidy do 3 dnia, czemu towarzyszył wzrost średnicy sferoidy (Rysunek 3A,B). Przeprowadzono barwienie żywe/martwe w celu oceny żywotności sferoid komórkowych. Dobrą żywotność komórek (>90%) osiągnięto przed 3. dniem, podczas gdy żywotność nieznacznie spadła po tygodniu hodowli (Rysunek 3C,D).

Do odzyskiwania sferoidów, bufor do lizy GelMA został użyty do dysocjacji hydrożelowych rusztowań, uwalniając zamknięte sferoidy komórkowe (Rysunek 4A). W związku z tym, po trzech dniach uprawy, małe kawałki rusztowań hydrożelowych traktowano buforem do lizy GelMA w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Uwolnione sferoidy zachowały dobrą morfologię sferyczną z wąskim rozkładem wielkości, wraz z ekspresją albuminy i pożądaną żywotnością (Figura 4B-D).

Rysunek 1: Akustyczne urządzenie montażowe 3D. (A) Schemat przedstawiający widok z góry urządzenia do montażu akustycznego 3D, składającego się z komory PMMA połączonej z trzema przetwornikami PZT. (B) Fotografia przedstawiająca rzeczywiste urządzenie do montażu akustycznego 3D. (C) Fotografia przedstawiająca akustyczne urządzenie montażowe 3D połączone z dwoma generatorami funkcyjnymi i trzema wzmacniaczami mocy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Akustycznie zmontowane agregaty komórek. (A) Schemat ilustrujący mechanizm działania agregatów komórkowych generowanych przez urządzenie do montażu akustycznego 3D, gdzie komórki są kierowane do węzłów akustycznych przez siłę promieniowania akustycznego. (B) Obrazy konfokalne przedstawiające akustycznie zmontowane agregaty komórek 3D z różnych perspektyw. (C) Obrazy w jasnym polu przedstawiające uformowane agregaty komórkowe w różnych warstwach rusztowania hydrożelowego. Podziałka reprezentuje 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wzrost agregatów komórkowych w sferoidy w rusztowaniu GelMA. (A) Obrazy jasnego pola pokazujące tworzenie się zwartych sferoid komórkowych po 3-dniowym okresie hodowli. (B) Kwantyfikacja rozmiarów sferoidów. (C) Żywe/martwe barwienie sferoid w rusztowaniu hydrożelowym po tygodniu hodowli. (D) Kwantyfikacja żywotności sferoidalnej komórki. Podziałka reprezentuje 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Odzyskiwanie akustycznie wytworzonych sferoid komórkowych. (A) Ilustracja przedstawiająca etapy odzyskiwania sferoid komórkowych wytwarzanych akustycznie. (B) Obrazy w jasnym polu przedstawiające odzyskane sferoidy w różnych powiększeniach. Podziałka skali odpowiada 250 μm. (C) Analiza żywotności i funkcjonalności odzyskanych sferoid. Podziałka skali odpowiada 100 μm. (D) Rozkład wielkości sferoid po pobraniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.