Artykuł metodologiczny

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66084

⸱

23 lutego 2024

 ,  , 
1Laboratory of Biochemistry and Toxicology, Federal University of Pampa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest przezroczystym, niepasożytniczym nicieniem o prostej biologii, co czyni go doskonałym narzędziem do nauczania nauk biologicznych poprzez barwienie komórek lub ich zawartość molekularną. Barwnik Lugola (roztwór jodu i potasu) jest szeroko stosowany w biochemii do barwienia zapasów glikogenu. W tym kontekście można zaobserwować różnice między zwierzętami karmionymi i zagłodzonymi poza skutkami różnych warunków, takich jak różna dieta i poziom tlenu. Erioglaucyna to niebieski barwnik, który wskazuje na utratę bariery jelitowej. Gdy bariera jelitowa jest nienaruszona, niebieski barwnik plami się w świetle; Jednak gdy ta integralność zostanie zakłócona, barwnik przecieka do jamy ciała. Korzystając z mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu, nauczyciele mogą zademonstrować zmiany fizjologiczne i biochemiczne lub mogą skłonić uczniów do zadania pytania naukowego oraz postawienia hipotezy i przetestowania ich hipotezy za pomocą tych testów. Niniejszy protokół opisuje dwie techniki barwienia u C. elegans, które mogą być łatwo przeprowadzone przez studentów.

Wprowadzenie

Nauczanie nauk biologicznych w szkole średniej to ciągłe wyzwanie. Warto zauważyć, że dostęp i wykorzystanie technologii przyniosły ważne postępy w procesie nauczania-uczenia się, jednak narzędzia takie jak chatboty oparte na sztucznej inteligencji utrudniają racjonalizację i poszukiwanie dowodów ze względu na uzyskane łatwe (a czasem błędne) odpowiedzi1. Z tego powodu zastosowanie metody naukowej z praktycznymi eksperymentami w podejściu opartym na dociekaniu w klasie jest ważną strategią rozwijania lub stymulowania krytycznego myślenia, kreatywności i umiejętności technicznych u uczniów2.

W tym kontekście, wolno żyjący nicień Caenorhabditis elegans został z powodzeniem wykorzystany w eksperymentach do celów nauczania3 ze względu na jego szczególne zalety: Nie jest pasożytem, a Escherichia coli używana do karmienia ma poziom bezpieczeństwa biologicznego-1, co zmniejsza zagrożenie biologiczne prawie do zera; ma elegancki i policzalny ruch lokomocji, który jest interesujący dla studentów do obserwacji; i jest przezroczysty, który umożliwia obserwację narządów, ale także barwienie pigmentami, które mogą wskazywać na obecność biomolekuł lub występowanie zmian fizjologicznych4. W związku z tym możliwe jest stawianie hipotez i testowanie w klasie prostych postulatów związanych z biochemią i zmianami fizjologicznymi, takimi jak starzenie się.

Glikogen jest węglowodanem magazynującym, utworzonym przez długi i rozgałęziony łańcuch cząsteczek glukozy utworzonych przez reszty glukozylowe z (1→4)-α glikozydowymi wiązaniami liniowymi i (1→6)-α wiązaniami glikozydowymi w punktach rozgałęzień i jest szczególnie ważny dla skurczu mięśni, różnicowania komórek i utrzymania glikemii5. Glikogen jest syntetyzowany po karmieniu w wyniku aktywacji insuliny enzymu syntazy glikogenu. Podczas ćwiczeń lub postu odpowiednio epinefryna lub glukagon aktywują fosforylazę glikogenu, a tym samym rozkładają polisacharyd, aby dostarczyć glukozo-6-fosforan do komórek mięśniowych lub uwolnić wolną glukozę, aby obejść hipoglikemię6,7. Zmiany w poziomach glikogenu wpływają na różnicowanie komórek, sygnalizację, regulację redoks i macierzystość w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, w tym raka8. U C. elegans glikogen znajduje się głównie w mięśniach przełyku, tkance podskórnej, jelicie, neuronach i głównie w mięśniach ścian ciała9. Zawartość glikogenu można zmierzyć za pomocą roztworu jodu Lugola, ponieważ jod wiąże się w spiralne cewki, tworząc kompleks jod-glikogen, dając widoczny ostry niebiesko-lub brązowo-kolor, który został z powodzeniem wykorzystany do wykazania zawartości glikogenu w C. elegans10. Wykazano, że akumulacja glikogenu spowodowana karmieniem wysokim poziomem glukozy może skrócić żywotność robaka, przyspieszając w ten sposób proces starzenia11,12. Ponadto zaburzenia metaboliczne, inne hormony i narażenie na ksenobiotyki mogą również zmienić metabolizm glikogenu13,14. Dlatego eksperymenty nad zawartością glikogenu w C. elegans są dość interesujące, ponieważ różne czynniki mogą zaburzać jego metabolizm i mogą stymulować dyskusję w klasie na temat podstawowej biochemii związanej z tematami przekrojowymi, takimi jak ćwiczenia, diety, choroby i starzenie się.

Starzenie się to zależny od czasu spadek funkcjonalności spowodowany uszkodzeniem komórek. Uszkodzenie to może być związane ze stresem oksydacyjnym, zanikiem telomerów, utratą proteostazy, stanem zapalnym, a nawet z akumulacją nierozpuszczalnych ciał poliglukozanowych15, żeby wymienić tylko kilka. Jedną z cech charakterystycznych starzenia się jest zmniejszenie integralności jelit, związane z kilkoma przewlekłymi schorzeniami, które występują w ciągu życia organizmu16. Utrzymanie homeostazy jelitowej zależy od integralności nabłonka jelitowego, który jest wspierany przez białka połączeniowe tworzące barierę fizyczną i łączące sąsiednie komórki nabłonka. Gdy dochodzi do uszkodzenia tego nabłonka, następuje wyciek zawartości światła do śródmiąższu17. Opierając się na tym mechanizmie, test smerfny został wykorzystany do sprawdzenia integralności jelit w kilku modelach zwierzęcych, ponieważ ten niebieski barwnik Erioglaucine sól disodowa nie przenika przez błonę jelitową, pozostając w klasie lumen18. Kiedy robaki są zarażone patogenem, skażone niektórymi toksynami lub starzeją się, zmieniając integralność śródmiąższową, barwnik przekracza barierę i rozprzestrzenia się po całym robaku, który staje się cały niebieski. Test ten pozwala na dyskusję na temat fizjologii starzenia się i eksperymentowanie nad czynnikami, które mogą przyspieszyć lub opóźnić ten proces poprzez wystawienie robaków na różne warunki. Przedstawione tutaj protokoły szczegółowo opiszą te dwie metody oparte na barwnikach, które można łatwo zastosować w klasie, aby zainicjować i zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z biochemią i fizjologią.

Pierwsza część protokołu pokazuje jego przydatność do jakościowej i ilościowej analizy zawartości glikogenu w modelu C. elegans10. Celem drugiej części protokołu jest ocena integralności jelita C. elegans. Technika ta pozwala na monitorowanie starzenia się C. elegans poprzez ocenę integralności błon jelitowych. Ponadto pozwala ocenić, czy substancja przyspiesza lub opóźnia starzenie się i czy jakiekolwiek substancje mają potencjał toksyczny dla bariery jelitowej19.

Szczep C. elegans użyty do niniejszego badania był dzikim typem Bristol N2. Jednakże procedura może być powtórzona przy użyciu szczepów, które wykazują porównywalne tempo wzrostu, lub metoda musi być dostosowana w zależności od potrzeby wymiany sprzętu, biorąc pod uwagę, że pełnią one taką samą lub podobną funkcję, lub w zależności od użytego szczepu, ponieważ niektóre szczepy mają szczególne wymagania dotyczące konserwacji i/lub czułości; informacje te można uzyskać z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub WormBase webstrona. Zmiany te nie powinny mieć wpływu na odtwarzalność metody.

Protokół

UWAGA: Bakterie Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) oraz szczepy typu dzikiego Bristol N2 można pozyskać z CGC na Uniwersytecie Minnesoty w USA lub poprzez darowiznę z laboratorium zajmującego się C. elegans. Dla bezpieczeństwa badaczy niezbędne jest stosowanie środków ochrony indywidualnej. Chociaż stężenia odczynników takich jak podchloryn i wodorotlenek sodu są niskie, konieczne jest noszenie zalecanego sprzętu OŚI, zgodnie z opisem w manuskrypcie, aby zminimalizować wszelkie potencjalne ryzyko związane z tymi chemikaliami.

1. Zawartość glikogenu

  1. Przygotowanie płytek testowych
    1. Przygotuj sześć szalek z agarem NGM o wymiarach 60 mm x 15 mm20 (10 ml agaru pożywki wzrostowej dla nicieni, NGM, zgodnie z opisem w Tabela uzupełniająca 1) na szczep nicieni i pozostawić do wyschnięcia przez 1 dzień w temperaturze pokojowej. Płytki należy trzymać zamknięte, aby zapobiec kontaminacji.
    2. Dodaj 200 µL z E. coli pożywka płynna OP50 (o gęstości optycznej OD600 ≈ 0,600) na płytkę, aby w komorze z laminarnym przepływem powietrza zaszczepić łącznie cztery płytki NGM o wymiarach 60 mm x 15 mm dla każdego szczepu. Zamknięte płytki należy inkubować w 37 °C przez 1 dzień przed użyciem.
      UWAGA: Przygotuj sześć płytek (krok 1.1), ale zaszczep tylko 4 z nich za pomocą E. coli bakterie OP50. Pozostałe dwie płytki zarezerwować w 4 °C do późniejszego wykorzystania podczas poddawania nicieni warunkom głodzenia. Analizę tę można przeprowadzić w dwóch powtórzeniach.
    3. W dniu przeprowadzenia testu dodać 200 µL 0,025 M D-glukozy na dwie płytki z agarem NGM (6 mm x 15 mm) dla każdego szczepu, na których uprzednio naniesiono *E. coli* bakterie OP50. Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      UWAGA: Płytki z agarem NGM zaszczepione E. coli Bakterie OP50 można również suszyć w pobliżu lamp alkoholowych jako alternatywę dla stosowania komory z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Synchronizacja
    1. Na około 3 dni przed synchronizacją przenieść 3–4 fragmenty (3 cm x 3 cm) z podłoża agarowego NGM służącego do utrzymywania hodowli z C. elegans Bristol N2 (typ dziki) na różnych etapach rozwoju (około 500 nicieni na fragment) na nową płytkę (150 mm x 90 mm), która została uprzednio zasiana za pomocą *E. coli* bakterie OP50.
    2. Umieść nową płytkę z nicieniami w kontrolowanym środowisku w temperaturze 20 °C i utrzymywać wilgotność >95% przez 3 dni (72 h pozwala większości nicieni osiągnąć stadium dorosłych osobników zapłodnionych).
      UWAGA: Temperatura hodowli może wymagać dostosowania w zależności od C. elegans stosowany szczep / stosowane szczepy.
    3. Za pomocą pipety Pasteura przenieś nicienie z przygotowanej płytki do wody destylowanej (H₂O)2O i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
    4. Odczekać do sedymentacji nicieni pod wpływem grawitacji (około 15 min), a następnie usunąć nadsącz. Powtórzyć ten proces 3 razy w celu usunięcia bakterii. Po ostatnim przemyciu zredukować objętość do 5 mL.
    5. Dodać 10 ml roztworu wybielającego (Tabela uzupełniająca 1) następnie energicznie wstrząsnąć ręcznie przez około 6 min.
    6. Niezwłocznie po zakończeniu wstrząsania należy dopełnić probówki buforem M9 do objętości 50 ml.
    7. Wirować przy 1400 x g Przez 3 min usuwaj supernatant do objętości 5 mL, a następnie ponownie dodaj 45 mL buforu M9. Powtórz ten proces 4 razy.
    8. Po ostatnim przemyciu należy zmniejszyć objętość do 15 ml i utrzymać ją w kontrolowanej temperaturze (20 °C) i wilgotności (>95%) przez około 14 h.
      UWAGA: Proces synchronizacji można zastąpić pozyskaniem jaj poprzez składanie ich przez samice: Przenieś około 20 dorosłych, zapłodnionych nicieni na płytkę NGM (6 mm x 15 mm) uprzednio wysianą z 200 µL z E. coli OP50. Pozostawć nicienie na jedną dobę w celu zniesienia jaj. Następnie usunąć zapłodnione nicienie i odczekać do momentu wyklucia się larw.
  3. Przygotowanie nicieni
    1. Za pomocą automatycznej pipety dodać 10 µL zsynchronizowanych nicieni (krok 1.2.8) na szkiełko mikroskopowe i policzyć liczbę nicieni. Obliczyć objętość, jaką należy odpipetować, aby uzyskać od 500 do 1000 nicieni/µL.
    2. Przenieś 500–1000 zsynchronizowanych nicieni w stadium L1 (krok 1.2.8) na agarowe płytki NGM (150 mm x 90 mm, Tabela uzupełniająca 1) zasiane E. coli bakterie OP50 jako źródło pożywienia, aż do osiągnięcia przez nie stadium larwalnego L4 w 20 °C.
      UWAGA: Przenoszenie nicieni można przeprowadzać za pomocą pipety automatycznej. W przypadku braku pipety automatycznej należy użyć szklanej pipety Pasteura, a objętość można kontrolować, korzystając z oznaczeń na mikroprobówkach lub szklanych pipetach miarkowych.
    3. Po 48 h synchronizacji20pobrać larwy w stadium L4 z płytek, używając buforu M9 (Tabela uzupełniająca 1), za pomocą plastikowej pipety Pasteura do czystej probówki stożkowej 50 mL i przemyć je trzykrotnie świeżym buforem M9 lub powtarzać przemywanie do czasu, aż wszystkie pozostałe E. coli Bakterie OP50 zostają całkowicie usunięte (w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Etap płukania jest istotny, ponieważ niektóre nicienie będą głodować podczas procedury.
  4. Przeprowadzanie analizy
    1. Przenieś 500–1000 nicieni w stadium L4 (krok 1.3.1) z każdej z nowo przygotowanych wcześniej (kroki 1.1.2 i 1.1.3) płytek z agarem NGM (60 mm x 15 mm). Przechowuj je w 20 °C przez 48 h aż do dnia badania. Taki harmonogram pozwoli na utworzenie trzech grup eksperymentalnych w następujący sposób, w dwóch powtórzeniach (Rycina 1):
      A- (głodzenie): nicienie będą rosły na standardowych płytkach z agarem NGM bez E. coli bakterie OP50;
      B- (standardowe): nicienie będą rosły na standardowych płytkach z agarem NGM zaszczepionych E. coli bakterie OP50;
      C- (wysoka zawartość glukozy): nicienie będą rosły na płytkach z agarem NGM zaszczepionych E. coli bakterie OP50 zawierające 0,025 M D-glukozy.
    2. W dniu testu (po 48 h): zebrać nicienie i trzykrotnie krótko przemyć je w buforze M9 (kroki 1.2.2 i 1.2.3)
      UWAGA: Na tym etapie należy przygotować szalki z agarem NGM z dodatkiem D-glukozy (krok 1.3) i odstawić je do momentu przeniesienia nicieni.
      1. Barwienie jodem: przygotować 5% (v/v) roztwór Lugola (roztwór jodu i jodku potasu), wykorzystując świeży bufor M9.
        UWAGA: Roztwór jodowy Lugola można nabyć od lokalnych dostawców odczynników lub w aptekach, w związku z czym jego stężenie początkowe może być zróżnicowane. W razie potrzeby należy obliczyć ilość składników tak, aby uzyskać roztwór o stężeniu 5% (v/v).
    3. Przenieś około 100 µL przemytych nicieni (krok 4.2) z każdej grupy do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml zawierającej rozcieńczony roztwór Lugola (5% v/v). Za pomocą pipety automatycznej przenieś w proporcji 1:5 100 µL robaków do 400 µL roztworu Lugola, a następnie delikatnego mieszania w mieszalniku przez 5 min.
      UWAGA: W przypadku braku mieszadła dopuszczalne jest ostrożne potrząsanie mikroprobówkami ręcznie.
    4. Natychmiast po upływie tych 5 min należy odwirować mikroprobówkę 1,5 ml (nicienie + roztwór Lugola) przy 1400 x g przez 3 min.
      UWAGA: Jeśli analiza jest przeprowadzana na nicieniach w stadium L4 lub późniejszym, zamiast wirowania można zastosować sedymentację grawitacyjną. Należy pozostawić otwarte mikroprobówki w statywach na blacie przez 10 min, aż wszystkie nicienie osiądą na dnie mikroprobówki.
    5. Odessać supernatant i przemyć nicienie 1,0 ml świeżego buforu M9. Powtarzać płukanie do momentu usunięcia z roztworu całego pozostałego jodu (minimum 3x).
    6. Po ostatnim etapie płukania należy usunąć nadsącz, pozostawiając resztkę o objętości około 100 µLNależy wykorzystać to do delikatnego resuspenderowania nicieni oraz do analizy mikroskopowej.
    7. Przenieś około 50 µL przenieść resuspensję z nicioniami na szkiełka przedmiotowe i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi. Obserwować obrazy w jasnym polu za pomocą stereomikroskopu (powiększenie 1,5x).
      UWAGA: W przypadku braku stereomikroskopu można użyć zwykłego mikroskopu, a obrazy można zarejestrować za pomocą aparatu w telefonie komórkowym (przy powiększeniu 3,4x) z wykorzystaniem adaptera. Aby zapobiec błędom wynikającym z różnic w oświetleniu, jasności lub ekspozycji, kluczowe jest zachowanie spójnych ustawień aparatu w telefonie dla wszystkich zdjęć.
  5. Inspekcja danych
    1. Dane ilościowe: Oblicz zawartość glikogenu na podstawie barwienia jodem organizmów nicieni.
      1. Zapisz obrazy z mikroskopu stereoskopowego zawierające minimum 10 nicieni na grupę w formacie pliku .jpeg w celu ich dalszego przetwarzania. W tym celu pobierz bezpłatne oprogramowanie ImageJ. Szczegóły znajdują się w Plik uzupełniający 1, Rysunek uzupełniający 1, Rysunek uzupełniający 2.
      2. Otwórz obraz w formacie .jpeg za pomocą oprogramowania ImageJ (które można pobrać bezpłatnie ze strony https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Kliknij wLinia przerywana i obrysuj nicienia (po jednym nicieniu). Kliknij w Analizuja następnie wybierz Pomiar w celu uzyskania ilościowego pomiaru barwienia. Dane zostaną przedstawione w tabeli jako średnia. Średnia oznacza dane obliczone na podstawie gęstości barwienia w przeliczeniu na powierzchnię nicienia.
    2. Dane jakościowe: Uzyskać obrazy każdej z grup przy użyciu stereomikroskopu i wizualnie porównać barwienie nicieni. W razie potrzeby stworzyć system oceny w celu analizy barwienia: 0 – bezbarwne; 1 – słabo zabarwione; 2 – zabarwione i 3 – silnie zabarwione. Przy użyciu stereomikroskopu i licznika ręcznego ręcznie przeliczyć około 10 nicieni na grupę (minimum).

Schemat procesu barwienia Lugolem z płytkami z agarem NGM i mikroskopem do obserwacji nicieni.
Rycina 1: Schemat badania całkowitej zawartości glikogenu w C. elegans. Schemat przeprowadzonego eksperymentu w celu oznaczenia zawartości glikogenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Ocena przepuszczalności jelitowej

  1. Przygotowanie nicieni
    1. Około 14 h po synchronizacji (krok 1.2.8), przenieś 500-1000 nicieni (krok 1.3.1 i UWAGA) w pierwszym stadium larwalnym (L1) na każdą nową płytkę agarową NGM (60 mm x 15 mm), przygotowaną wcześniej, i przechowuj je w temperaturze 20 °C do dnia testu. Taki harmonogram pozwoli na utworzenie dwóch grup eksperymentalnych w następujący sposób (Rysunek 2):
      A- (młode): nicienie będą rosły na płytkach agarowych NGM zaszczepionych bakteriami E. coli OP50 aż do 4. stadium larwalnego (L4);
      B- (stare): nicienie będą rosły na płytkach agarowych NGM zaszczepionych bakteriami E. coli OP50 aż do 7mej doby dorosłości.
      UWAGA: Nicienie utrzymywane do 7mej doby dorosłości muszą być codziennie płukane buforem M9 i przenoszone na nowe płytki agarowe NGM (60 mm x 15 mm) z 200 µL wcześniej zaszczepionych bakterii E. coli OP50 w celu wymiany pokarmu i usunięcia potomstwa. Młodsze nicienie wypływają podczas dekantacji i mogą zostać oddzielone poprzez usunięcie supernatantu. Odsetek tzw. „smurf worms” (nicieni niebieskich) wzrasta wraz z wiekiem. Niemniej jednak ocena przepuszczalności jelit może być przeprowadzona na każdym stadium i w każdym wieku, w zależności od celu badania.
  2. Przeprowadzenie analizy
    1. W dniu testu zbierz nicienie w stadium L4 (2 dni po kroku 2.1.1) oraz dorosłe nicienie w 7mej dobie (obecnie w 9tej dobie) za pomocą buforu M9 (Tabela uzupełniająca 1) i przenieś je do oznakowanych mikroproverek 1,5 mL.
    2. Wiruj przy 1400 x g przez 3 min, usuń supernatant, dodaj 1,0 mL buforu M9 i delikatnie wymieszaj. Powtórz ten proces 3x, aby usunąć bakterie. Po ostatnim przemyciu zredukuj objętość do 500 µL.
    3. Za pomocą automatycznej pipety nanieś 10 µL osadu z nicieniami na szkiełko mikroskopowe i policz liczbę nicieni. Oblicz objętość, którą należy pobrać, aby uzyskać stężenie 100 nicieni/µL.
    4. Barwienie na „smurfy”: przygotuj 25% roztwór soli sodowej erioglaucyny (Tabela uzupełniająca 1) w wodzie destylowanej. W razie potrzeby użyj vortexa w celu lepszego rozpuszczenia.
    5. W nowych, wcześniej zidentyfikowanych mikroproverkach, za pomocą automatycznej pipety, dodaj objętość zawierającą 100 nicieni, 100 µL 25% roztworu soli sodowej erioglaucyny, 200 µL E. coli OP50 i uzupełnij buforem M9 do objętości końcowej 500 µL.
      UWAGA: Objętości soli sodowej erioglaucyny, E. coli oraz liczba nicieni są stałe. Objętość buforu M9 jest zmienna i służy do doprowadzenia objętości końcowej do 500 µL.
    6. Inkubuj przez 3 h z wytrząsaniem w mieszalniku, chroniąc przed światłem, w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jeśli mieszalnik jest niedostępny, ostrożnie potrząsaj mikroproverkami ręcznie co 15 min.
    7. Po 3 h wiruj mikroproverkę 1,5 mL przy 1400 x g przez 3 min. Usuń 1,0 mL supernatantu i przemyj nicienie 1,0 mL buforu M9.
    8. Powtarzaj przemywanie, aż z roztworu zostanie usunięta pozostała sól sodowa erioglaucyny. Po ostatnim etapie płukania usuń supernatant, pozostawiając resztkę około 250 µL. Wykorzystaj ją do ostrożnego resuspensowania nicieni i przygotowania ich do analizy mikroskopowej.
    9. Przenieś około 50 nicieni z resuspensowanego roztworu na szkiełka mikroskopowe i przykryj je nakrywekami. Inkubuj szkiełka w zamrażarce w temperaturze -20 °C przez 10 min, aby sparaliżować nicienie.
      UWAGA: Alternatywną metodą paraliżowania nicieni jest dodanie 10 µL roztworu hydroponiczlorku lewamisolu (10 mM; Tabela uzupełniająca 1) przed przykryciem nakrywekami.
    10. Zaobserwuj i policz całkowitą liczbę nicieni oraz liczbę nicieni całkowicie zabarwionych, korzystając z pola jasnego w stereomikroskopie (przy powiększeniu 1,5x). Zdjęcia można wykonać aparatem w telefonie komórkowym (przy 3,4x) połączonym za pomocą adaptera. Aby zapobiec błędom wynikającym z różnic w świetle/jasności/ekspozycji, kluczowe jest zachowanie spójnych ustawień aparatu dla wszystkich zdjęć.
  3. Analiza danych
    1. Dane jakościowe: Uzyskaj obrazy z stereomikroskopu dla każdej grupy (L4 i 7ma doba dorosłości) i wizualnie porównaj zabarwienie nicieni.
    2. Policz całkowitą liczbę nicieni oraz liczbę „smurf worms” (nicieni niebieskich) za pomocą stereomikroskopu.
    3. Wyraź wyniki jako procent nicieni niebieskich, porównując młode nicienie (L4, jako grupa kontrolna) i stare nicienie (7ma doba dorosłości):
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      Gdzie A = całkowita liczba nicieni
      B = liczba nicieni niebieskich

Przygotowanie Caenorhabditis elegans do mikroskopii; płytki NGM, E. coli OP50, metoda wirowania.
Rycina 2: Schemat ogólnego testu przepuszczalności jelitowej u C. elegans. (A) Przygotowanie C. elegans. (B) Barwienie solą sodową Erioglaucyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Oznaczenie zawartości glikogenu stanowi niezawodną i szybką metodę przesiewową dla różnych warunków testowych, takich jak badania porównawcze różnych szczepów, które mogą wpływać na syntezę lub degradację glikogenu. W niniejszym badaniu nicie w stadium L4 zostały poddane trzem odrębnym warunkom testowym: grupom głodówki, karmienia oraz wzbogaconej w glukozę. Analizę przeprowadzono trzykrotnie, przy czym każda z warunków była powtórzona dwukrotnie w każdym oznaczeniu; reprezentatywny obraz przedstawiono w Rysunek 3Po każdym badaniu nicienie barwione roztworem jodyny Lugola były obserwowane pod stereomikroskopem, a następnie dokonano jakościowego porównania grup pod kątem intensywności barwienia nicieni. W obserwacji wizualnej nicienie z grupy głodzącej (starvation) wykazywały mniej intensywne barwienie w porównaniu z nicieniami karmionymi E. coli OP50 (standardowe), a także te karmione E. coli OP50 i D-glukoza (wysoka zawartość glukozy). Ponadto nicienie karmione E. coli OP50 i D-glukozą (wysoka zawartość glukozy) wykazywały najintensywniejsze barwienie.

Nicienie L4 Bristol N2 na NGM: warunki głodówki, standardowe oraz wysokiego stężenia glukozy; wyniki mikroskopowe.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy z analizy zawartości glikogenu. Poziomy glikogenu u C. elegans oceniono za pomocą barwienia jodem. Obrazy mikroskopowe przedstawiają reprezentatywne nicienie C. elegans poddane działaniu warunków (A) głodówki, (B) standardowych lub (C) wysokiego stężenia glukozy przez 48 h. Nicienie zabarwiono poprzez zanurzenie ich w roztworze jodyny Lugola/buforu M9 (1%) przez 5 min, zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki przepuszczalności jelitowej wykazują różnicę w barwieniu młodych nicieni (L4) z nienaruszonym jelitem oraz starych nicieni (7th dnia dorosłości) z uszkodzonymi błonami jelitowymi w wyniku starzenia (Rysunek 4). Jelito C. elegans jest tkanką o kluczowym znaczeniu dla zdrowia, ponieważ odgrywa krytyczną rolę w procesach trawienia i metabolizmu oraz służy jako centrum sygnalizacyjne w odpowiedzi na stres i regulacji starzenia się organizmu21U młodych nicieni jelito C. elegans składa się z silnej bariery, która zapobiega wyciekowi treści jelitowej. Jednak w miarę starzenia się tych nicieni funkcja bariery jelitowej ulega osłabieniu i staje się bardziej podatna na uszkodzenia z powodu postępującej degradacji komórek i mikrokosmków oraz akumulacji bakterii w starzejącym się jelicie21,22Kiedy młode C. elegans po wchłonięciu barwnika, soli disodowej erioglaucyny, jelito nicienia zostaje zabarwione (Rysunek 4A). Z drugiej strony można zauważyć, że u starszych nicieni wystąpiła ekstrawazacja barwnika, który przeniknął do całego ciała zwierzęcia, co wskazuje na uszkodzenie błony jelitowej (Rysunek 4B).

Etapy rozwoju C. elegans, L4 i 7. dzień dorosłości; obraz mikroskopowy; analiza skali 150 µm.
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz barwienia C. elegans solą disodową erioglaucyny.Obraz mikroskopowy przedstawia C. elegans z nienaruszoną jelitami (stadium L4) oraz nicienie z przerwaniem ciągłości jelit (7th dzień dorosłości). Nicienie barwiono poprzez zanurzenie w 25% roztworze soli disodowej erioglaucyny przez 3 h, zgodnie z krokiem 2.2.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Zrzut ekranu z programu ImageJ przedstawiający wybór konturu C. elegans. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Zrzut ekranu z programu ImageJ przedstawiający obliczanie średniej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Składy pożywek, buforów i kultur. Skład różnych pożywek, buforów i kultur wykorzystanych w niniejszym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowy opis oprogramowania ImageJ służącego do ilościowego oznaczania zawartości glikogenu w nicieniach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podsumowując, protokół ten zapewnia jakościową ocenę zawartości glikogenu w poszczególnych robakach C. elegans przy użyciu barwienia Lugola: prostego, solidnego i szybkiego testu. Barwienie Lugola jest bezznacznikowym i nieinwazyjnym podejściem, które ułatwia pozyskiwanie danych molekularnych w rozdzielczościach subkomórkowych, umożliwiając monitorowanie wahań zawartości glikogenu w obrębie pojedynczych robaków10. Co więcej, zaletą testu jest opłacalność ze względu na minimalne wymagania sprzętowe. Do uchwycenia obrazów potrzebny jest tylko mikroskop lub mikroskop stereoskopowy, który można łatwo uzyskać za pomocą aparatu w telefonie komórkowym, o ile te same ustawienia światła/jasności/ekspozycji dla wszystkich zdjęć. Ponadto pewne dostosowania proceduralne mogą zwiększyć skuteczność tego protokołu. Bardziej złożony sprzęt laboratoryjny, taki jak okap przepływowy i wirówka, można zastąpić lampami alkoholowymi i sedymentacją grawitacyjną. Te alternatywy sprawiają, że metoda jest jeszcze bardziej przyjazna dla budżetu i dostępna dla szerokiego grona badaczy. Oprócz badaczy, nauczyciele mogą również wykorzystać ten test do celów edukacyjnych w szkołach, aby zilustrować zmiany związane z magazynowaniem glikogenu i jego biosyntezą.

Chociaż konwencjonalne testy enzymatyczne mogą określić ilościowo poziom glikogenu, barwienie Lugola jest obiecujące jako czuła, dokładna, opłacalna i wysokoprzepustowa metoda oceny zapasów glikogenu w C. elegans. W naszym badaniu dane ujawniły zauważalne różnice w barwieniu między trzema warunkami, co sugeruje potencjalną korelację między warunkami karmienia a intensywnością barwienia. Innymi słowy, wskazuje na różnice w zawartości glikogenu między różnymi grupami żywieniowymi, ponieważ intensywność barwienia jest wprost proporcjonalna do zawartości glikogenu. Dzięki tym wstępnym obserwacjom i dowodom uczniowie mogą dociekać i badać, czy różne czynniki, takie jak różne pokarmy, napoje lub odczynniki chemiczne, mogą również wpływać na zawartość glikogenu w nicieniach.

Jedną z wad tego podejścia jest poleganie na procedurach manualnych i subiektywnej interpretacji. Subiektywny charakter oceny barwienia, w której wyniki są przypisywane na podstawie obserwacji wizualnej, może prowadzić do zmienności między różnymi analitykami, potencjalnie wprowadzając wahania w interpretacji wyników.

W niniejszym raporcie przedstawiono również ocenę integralności jelit C. elegans przy użyciu barwnika Erioglaucine disodowej soli. Możliwe jest oszacowanie utraty funkcji bariery jelitowej u C. elegans poprzez karmienie robaków niebieskim barwnikiem, który nie jest wchłaniany przez naskórek. Ten test umożliwia sprawdzenie, czy barwnik nie wycieka z jelita, test znany jako test smerfny, ponieważ zwierzęta zmieniają kolor na niebieski jak kreskówka Smerfy23. Metodologia ta została wcześniej zastosowana do Drosophila melanogaster i Danio rerio przy użyciu podobnej metody oceny jelitowej24,25. W przypadku C. elegans zastosowaliśmy tę samą zasadę techniki z solą disodową erioglaucyny, uważaną za prostą i powtarzalną technikę weryfikacji integralności jelit C. elegans19,26.

Protokół ten może być wykorzystany do oceny indukcji lub opóźnienia starzenia się nicieni, a także do weryfikacji potencjału toksycznego substancji w jelicie C. elegans w łatwy i szybki sposób, bez konieczności stosowania skomplikowanej aparatury, co sprawia, że metoda jest ekonomicznie opłacalna19,27. Oprócz wykorzystania w badaniach naukowych, nauczyciele mogą również stosować ten test do celów edukacyjnych w instytucjach edukacyjnych w celu zbadania zmian w przepuszczalności jelit C. elegans. Za pomocą prostego testu można zbadać hipotezy dotyczące starzenia się i wpływu odczynników chemicznych na barierę jelitową nicieni.

Test może być dostosowany do wykorzystania innych szczepów i stadiów larwalnych C. elegans zgodnie z celem badania, o ile zamienniki pełnią tę samą lub podobną funkcję w celu utrzymania odtwarzalności metody. Aby analiza zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby starzejące się robaki były barwione przez 3 godziny, jak wspomniano w protokole. Następnie mycie w celu usunięcia nadmiaru barwnika jest krytycznym krokiem w metodzie i należy je wykonać ostrożnie, aby robaki nie zostały usunięte wraz z supernatantem. W przypadku oceny substancji jednym z ograniczeń stwierdzonych w protokole jest trudność w znalezieniu łatwo dostępnej kontroli pozytywnej, która powoduje lizę błony jelitowej nicieni.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

D.S.A dziękuje za dofinansowanie od Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brazylia), grant numer #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brazylia), numer grantu, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Kod Finansowy 001 dla N.S.J i A.C.S)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówki 1,5 ml Lokalni dostawcy-Inkubator
37 stopniKS 4000i 97014-816
Rurka stożkowa 50 mlLokalni dostawcy-6
cm płytki Petriego Lokalni dostawcy-Agar
bakteriologicznyDinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (typ dziki)Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)-
CaCL2Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.10035-04-8
CholesterolSigma-Aldrich Brasil Ltda57-88-5
D-(+)-Glukoza bezwodna Neon50-99-7
Destylowany H2OLokalni dostawcy-Erioglaucine
sól disodowaSigma-Aldrich Brasil Ltda3844-45-9
Escherichia coli OP50Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)-
Inkubator
Firma Panasonic Healthcare z Ameryki Północnej, MIR-254-PA.-
KH2PO4Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7778-77-0
Chlorowodorek lewamizoluRIPERCOL L 150F-Lugol
roztwórSigma-Aldrich Brasil LtdaL6146
MgSO4SynthS1063-01-AH
mikrowirówek5425R Eppendorf SE, Niemcy
Na2HPO4Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7558-79-4
NaClDinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7647-14-5
NystatynaSigma-Aldrich Brasil LtdaN6261
Pepton bakteriologicznyi ecyrkulacyjny; xodo cientí fica91079-38-8
Mikroskop stereoskopowyLeica S8 Apo Mikroskop stereoskopowy (Sã o Paulo, Brazylia)
Siarczan streptomycynyEstreptomax-
Mylabor z kapturem przepływowymWirówka do

Bibliografia

  1. Thorp, H. H. ChatGPT is fun, but not an author. Science. 379 (6630), 313(2023).
  2. Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).
  3. Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi. Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).
  4. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a smurf? - Ageing and beyond... In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio Protoc. 8 (3), e2722(2018).
  5. Ellingwood, S. S., Cheng, A. Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases. J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).
  6. Cori, C. F., Cori, G. T. Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid. J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).
  7. Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase. J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).
  8. Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease. FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).
  9. Liu, Q., et al. Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans. Carbohydr Polym. 237, 116181(2020).
  10. Cherkas, A., et al. Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C. elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).
  11. Gusarov, I., et al. Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress. Nat Commun. 8, 15868(2017).
  12. Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).
  13. Frazier, H. N. 3rd, Roth, M. B. Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments. Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).
  14. da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats. Life Sci. 322, 121660(2023).
  15. Gusarov, I., Nudler, E. Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging. Bioessays. 40 (9), e1800033(2018).
  16. Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging. Nutrients. 14 (5), 949(2022).
  17. Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders. Int J Mol Sci. 23 (22), 14463(2022).
  18. Dambroise, E., et al. Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death. Sci Rep. 6, 23523(2016).
  19. Laranjeiro, R., et al. Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans.WormBook. , 1-11 (2006).
  21. McGhee, J. D. The C. elegans intestine. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).
  22. McGee, M. D., et al. Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C. elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).
  23. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).
  24. Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).
  25. Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster. Nutrients. 14 (14), 2875(2022).
  26. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).
  27. Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles. Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie Lugolembarwnik Erioglaucynaprzepuszczalność jelitowaobrazowanie stereomikroskopowepodłoże wzrostowe dla nicienizsynchronizowane nicieniebariera jelitowa
Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.