Artykuł metodologiczny

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/66084

⸱

23 lutego 2024

 ,  , 
1Laboratory of Biochemistry and Toxicology, Federal University of Pampa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest przezroczystym, niepasożytniczym nicieniem o prostej biologii, co czyni go doskonałym narzędziem do nauczania nauk biologicznych poprzez barwienie komórek lub ich zawartość molekularną. Barwnik Lugola (roztwór jodu i potasu) jest szeroko stosowany w biochemii do barwienia zapasów glikogenu. W tym kontekście można zaobserwować różnice między zwierzętami karmionymi i zagłodzonymi poza skutkami różnych warunków, takich jak różna dieta i poziom tlenu. Erioglaucyna to niebieski barwnik, który wskazuje na utratę bariery jelitowej. Gdy bariera jelitowa jest nienaruszona, niebieski barwnik plami się w świetle; Jednak gdy ta integralność zostanie zakłócona, barwnik przecieka do jamy ciała. Korzystając z mikroskopu stereoskopowego lub mikroskopu, nauczyciele mogą zademonstrować zmiany fizjologiczne i biochemiczne lub mogą skłonić uczniów do zadania pytania naukowego oraz postawienia hipotezy i przetestowania ich hipotezy za pomocą tych testów. Niniejszy protokół opisuje dwie techniki barwienia u C. elegans, które mogą być łatwo przeprowadzone przez studentów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauczanie nauk biologicznych w szkole średniej to ciągłe wyzwanie. Warto zauważyć, że dostęp i wykorzystanie technologii przyniosły ważne postępy w procesie nauczania-uczenia się, jednak narzędzia takie jak chatboty oparte na sztucznej inteligencji utrudniają racjonalizację i poszukiwanie dowodów ze względu na uzyskane łatwe (a czasem błędne) odpowiedzi1. Z tego powodu zastosowanie metody naukowej z praktycznymi eksperymentami w podejściu opartym na dociekaniu w klasie jest ważną strategią rozwijania lub stymulowania krytycznego myślenia, kreatywności i umiejętności technicznych u uczniów2.

W tym kontekście, wolno żyjący nicień Caenorhabditis elegans został z powodzeniem wykorzystany w eksperymentach do celów nauczania3 ze względu na jego szczególne zalety: Nie jest pasożytem, a Escherichia coli używana do karmienia ma poziom bezpieczeństwa biologicznego-1, co zmniejsza zagrożenie biologiczne prawie do zera; ma elegancki i policzalny ruch lokomocji, który jest interesujący dla studentów do obserwacji; i jest przezroczysty, który umożliwia obserwację narządów, ale także barwienie pigmentami, które mogą wskazywać na obecność biomolekuł lub występowanie zmian fizjologicznych4. W związku z tym możliwe jest stawianie hipotez i testowanie w klasie prostych postulatów związanych z biochemią i zmianami fizjologicznymi, takimi jak starzenie się.

Glikogen jest węglowodanem magazynującym, utworzonym przez długi i rozgałęziony łańcuch cząsteczek glukozy utworzonych przez reszty glukozylowe z (1→4)-α glikozydowymi wiązaniami liniowymi i (1→6)-α wiązaniami glikozydowymi w punktach rozgałęzień i jest szczególnie ważny dla skurczu mięśni, różnicowania komórek i utrzymania glikemii5. Glikogen jest syntetyzowany po karmieniu w wyniku aktywacji insuliny enzymu syntazy glikogenu. Podczas ćwiczeń lub postu odpowiednio epinefryna lub glukagon aktywują fosforylazę glikogenu, a tym samym rozkładają polisacharyd, aby dostarczyć glukozo-6-fosforan do komórek mięśniowych lub uwolnić wolną glukozę, aby obejść hipoglikemię6,7. Zmiany w poziomach glikogenu wpływają na różnicowanie komórek, sygnalizację, regulację redoks i macierzystość w różnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, w tym raka8. U C. elegans glikogen znajduje się głównie w mięśniach przełyku, tkance podskórnej, jelicie, neuronach i głównie w mięśniach ścian ciała9. Zawartość glikogenu można zmierzyć za pomocą roztworu jodu Lugola, ponieważ jod wiąże się w spiralne cewki, tworząc kompleks jod-glikogen, dając widoczny ostry niebiesko-lub brązowo-kolor, który został z powodzeniem wykorzystany do wykazania zawartości glikogenu w C. elegans10. Wykazano, że akumulacja glikogenu spowodowana karmieniem wysokim poziomem glukozy może skrócić żywotność robaka, przyspieszając w ten sposób proces starzenia11,12. Ponadto zaburzenia metaboliczne, inne hormony i narażenie na ksenobiotyki mogą również zmienić metabolizm glikogenu13,14. Dlatego eksperymenty nad zawartością glikogenu w C. elegans są dość interesujące, ponieważ różne czynniki mogą zaburzać jego metabolizm i mogą stymulować dyskusję w klasie na temat podstawowej biochemii związanej z tematami przekrojowymi, takimi jak ćwiczenia, diety, choroby i starzenie się.

Starzenie się to zależny od czasu spadek funkcjonalności spowodowany uszkodzeniem komórek. Uszkodzenie to może być związane ze stresem oksydacyjnym, zanikiem telomerów, utratą proteostazy, stanem zapalnym, a nawet z akumulacją nierozpuszczalnych ciał poliglukozanowych15, żeby wymienić tylko kilka. Jedną z cech charakterystycznych starzenia się jest zmniejszenie integralności jelit, związane z kilkoma przewlekłymi schorzeniami, które występują w ciągu życia organizmu16. Utrzymanie homeostazy jelitowej zależy od integralności nabłonka jelitowego, który jest wspierany przez białka połączeniowe tworzące barierę fizyczną i łączące sąsiednie komórki nabłonka. Gdy dochodzi do uszkodzenia tego nabłonka, następuje wyciek zawartości światła do śródmiąższu17. Opierając się na tym mechanizmie, test smerfny został wykorzystany do sprawdzenia integralności jelit w kilku modelach zwierzęcych, ponieważ ten niebieski barwnik Erioglaucine sól disodowa nie przenika przez błonę jelitową, pozostając w klasie lumen18. Kiedy robaki są zarażone patogenem, skażone niektórymi toksynami lub starzeją się, zmieniając integralność śródmiąższową, barwnik przekracza barierę i rozprzestrzenia się po całym robaku, który staje się cały niebieski. Test ten pozwala na dyskusję na temat fizjologii starzenia się i eksperymentowanie nad czynnikami, które mogą przyspieszyć lub opóźnić ten proces poprzez wystawienie robaków na różne warunki. Przedstawione tutaj protokoły szczegółowo opiszą te dwie metody oparte na barwnikach, które można łatwo zastosować w klasie, aby zainicjować i zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z biochemią i fizjologią.

Pierwsza część protokołu pokazuje jego przydatność do jakościowej i ilościowej analizy zawartości glikogenu w modelu C. elegans10. Celem drugiej części protokołu jest ocena integralności jelita C. elegans. Technika ta pozwala na monitorowanie starzenia się C. elegans poprzez ocenę integralności błon jelitowych. Ponadto pozwala ocenić, czy substancja przyspiesza lub opóźnia starzenie się i czy jakiekolwiek substancje mają potencjał toksyczny dla bariery jelitowej19.

Szczep C. elegans użyty do niniejszego badania był dzikim typem Bristol N2. Jednakże procedura może być powtórzona przy użyciu szczepów, które wykazują porównywalne tempo wzrostu, lub metoda musi być dostosowana w zależności od potrzeby wymiany sprzętu, biorąc pod uwagę, że pełnią one taką samą lub podobną funkcję, lub w zależności od użytego szczepu, ponieważ niektóre szczepy mają szczególne wymagania dotyczące konserwacji i/lub czułości; informacje te można uzyskać z Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub WormBase webstrona. Zmiany te nie powinny mieć wpływu na odtwarzalność metody.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Bakterie Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) i szczepy Bristol N2 typu dzikiego można pozyskać z CGC, University of Minnesota, USA lub z darowizny z laboratorium C. elegans. Ze względu na bezpieczeństwo badaczy konieczne jest stosowanie środków ochrony osobistej. Chociaż stężenia odczynników, takich jak podchloryn i wodorotlenek sodu, są niskie, konieczne jest noszenie zalecanych środków ochrony osobistej, jak podkreślono w manuskrypcie, aby zminimalizować potencjalne ryzyko związane z tymi chemikaliami.

1. Zawartość glikogenu

  1. Przygotowanie płytek testowych
    1. Przygotuj sześć płytek agarowych NGM o wymiarach 60 mm x 15 mm20 (10 ml agaru z podłożem do hodowli nicieni, NGM, zgodnie z opisem w Tabeli Uzupełniającej 1) na szczep robaka i pozostaw je do wyschnięcia na 1 dzień w temperaturze pokojowej. Utrzymuj płytki zamknięte, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    2. Dodać 200 μl płynnej kultury E. coli OP50 (o gęstości optycznej = 0,600, w przybliżeniu przy długości fali 600 nm) na płytkę, aby zaszczepić w sumie cztery płytki NGM o wymiarach 60 mm x 15 mm na szczep w kapturze przepływowym. Pozostawić zamknięte płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 dzień przed użyciem.
      UWAGA: Przygotuj sześć płytek (krok 1.1), ale tylko 4 zaszczep bakteriami E. coli OP50. Pozostałe dwie płytki należy odłożyć w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania podczas umieszczania robaków w warunkach głodu. Analiza ta może być przeprowadzana w dwóch egzemplarzach.
    3. W dniu testu dodaj 200 μl 0,025 M D-Glucose do dwóch (6 mm x 15 mm) płytek agarowych NGM na szczep, które zostały wcześniej wysiane bakteriami E. coli OP50. Pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w okapie przepływowym.
      UWAGA: Płytki agarowe NGM wysiane bakteriami E. coli OP50 można również suszyć w pobliżu lamp alkoholowych jako alternatywę dla używania okapu przepływowego.
  2. synchronizacja
    1. Na około 3 dni przed synchronizacją przenieś 3-4 kawałki (3 cm x 3 cm) z agaru do konserwacji NGM z C. elegans Bristol N2 (typ dziki) na różnych etapach (około 500 robaków na kawałek) na nową płytkę (150 mm x 90 mm), która została wcześniej obsiana bakteriami E. coli OP50.
    2. Umieść nową płytkę z robakami w kontrolowanym środowisku w temperaturze 20 °C i utrzymuj wilgotność >95% przez 3 dni (72 godziny pozwalają większości robaków osiągnąć stan ciężkości dorosłej).
      UWAGA: Może być konieczne dostosowanie temperatury wzrostu w zależności od użytej odmiany (szczepów) >C. elegans.
    3. Za pomocą pipety Pasteura zebrać robaki z przygotowanej płytki z destylowanymH2Oi przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    4. Poczekaj na sedymentację robaków grawitacyjnie (około 15 minut), a następnie usuń supernatant. Powtórz ten proces 3 razy, aby wyeliminować bakterie. Po ostatnim praniu zmniejsz objętość do 5 ml.
    5. Dodać 10 ml roztworu wybielającego (tabela uzupełniająca 1) i energicznie wstrząsać rękami przez około 6 minut.
    6. Natychmiast po zakończeniu wytrząsania napełnić probówki do pojemności 50 ml buforem M9.
    7. Wirować przy 1400 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant do 5 ml, a następnie ponownie dodać 45 ml buforu M9. Powtórz ten proces 4 razy.
    8. Po ostatnim praniu zmniejsz objętość do 15 ml i utrzymuj ją w kontrolowanej temperaturze (20 °C) i wilgotności (>95%) przez około 14 h.
      UWAGA: Proces synchronizacji można zastąpić uzyskaniem komórek jajowych przez składanie jaj: Przenieś około 20 dorosłych ciężarnych robaków na płytkę NGM (6 mm x 15 mm) uprzednio wysianą 200 μl >E. coli OP50. Pozwól robakom złożyć jaja przez 1 dzień. Następnie usuń ciężarne robaki i poczekaj, aż wyklują się jaja.
  3. Przygotowanie robaków
    1. Za pomocą pipety automatycznej dodać 10 μl zsynchronizowanych robaków (krok 1.2.8) do szkiełka mikroskopowego i policzyć liczbę robaków. Oblicz, jaką objętość należy odpipetować, aby uzyskać 500-1000 robaków/μl.
    2. Przenieść 500-1000 zsynchronizowanych robaków L1 (krok 1.2.8) na płytki agarowe NGM (150 mm x 90 mm, tabela uzupełniająca 1) wysiane bakteriami E. coli OP50 jako źródłem pożywienia, aż osiągną stadium larw 4 (L4) w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Robaki można przenosić za pomocą pipety automatycznej. Jeśli pipeta automatyczna nie jest dostępna, użyj szklanej pipety Pasteura, a objętości można kontrolować za pomocą etykiet z mikroprobówkami lub szklanych pipet z podziałką.
    3. Po 48 godzinach synchronizacji20: za pomocą plastikowej pipety Pasteura pobrać larwy L4 z płytek z buforem M9 (Tabela uzupełniająca 1), za pomocą plastikowej pipety Pasteura do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przemyć je 3x świeżym buforem M9 lub powtórzyć płukanie, aż wszystkie pozostałe bakterie E. coli OP50 zostaną całkowicie usunięte (w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Etap mycia jest ważny, ponieważ niektóre robaki doświadczą głodu podczas zabiegu.
  4. Uruchamianie testu
    1. Przenieś 500-1000 robaków L4 (krok 1.3.1) z każdej z nowych płytek agarowych NGM (60 mm x 15 mm) wcześniej przygotowanych (kroki 1.1.2 i 1.1.3). Przechowywać je w temperaturze 20 °C przez 48 godzin do dnia badania. Rezultatem tego harmonogramu będą trzy grupy eksperymentalne w następujący sposób, w zduplikowanych (Rysunek 1):
      A- (głód): robaki będą rosły na zwykłych płytkach agarowych NGM bez bakterii E. coli OP50;
      B- (regularne): robaki będą rosły na zwykłych płytkach agarowych NGM obsianych bakteriami E. coli OP50;
      C- (wysoka glukoza): robaki będą rosły na płytkach agarowych NGM wysianych bakteriami E. coli OP50 i zawierających 0,025 M D-glukozy.
    2. W dniu testu (po 48 godzinach): zbierz robaki i poddaj je trzykrotnemu krótkiemu płukaniu w buforze M9 (kroki 1.2.2 i 1.2.3)
      UWAGA: Tutaj przygotuj płytki agarowe NGM z dodatkiem D-glukozy (krok 1.3) i odłóż je na bok, aż nadejdzie czas na dodanie robaków.
      1. Barwienie jodem: przygotować 5% (v/v) płyn Lugola (roztwór jodu/jodku potasu) przy użyciu świeżego buforu M9.
        UWAGA: Płyn Lugola Jodu można uzyskać u lokalnych dostawców odczynników lub aptek, dlatego początkowe stężenie może się różnić. W razie potrzeby oblicz, aby otrzymać 5% (v/v) roztwór.
    3. Przenieść około 100 μl przemytych robaków (krok 4.2) z każdej grupy do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej rozcieńczony płyn Lugola (5% v/v). Za pomocą pipety automatycznej w proporcji 1:5 przenieś 100 μl robaków do 400 μl płynu Lugola, a następnie delikatnie mieszaj w mieszalniku przez 5 min.
      UWAGA: Jeśli mikser nie jest dostępny, można ostrożnie potrząsnąć mikroprobówkami ręcznie.
    4. Zaraz po tych 5 minutach odwirować 1,5 ml mikroprobówki (robaki + płyn Lugola) przy 1400 x g przez 3 min.
      UWAGA: Jeśli ten test jest wykonywany na robakach w stadium L4 lub wyższym, możliwe jest uzyskanie sedymentacji grawitacyjnej zamiast użycia wirówki. Pozostaw mikroprobówki otwarte w stojakach na blacie na 10 minut, aż wszystkie robaki osiądą na dnie mikroprobówki.
    5. Usunąć supernatant i umyć robaki 1,0 ml świeżego buforu M9. Powtarzaj mycie, aż cały pozostały jod zostanie usunięty z roztworu (minimum 3x).
    6. Po ostatnim etapie płukania usunąć supernatant, z wyjątkiem pozostałości około 100 μl. Użyj go do delikatnego ponownego zawieszenia robaków i do analizy mikroskopowej.
    7. Przenieść około 50 μl zawieszonego roztworu robaka na szkiełka mikroskopowe i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi. Obserwuj obrazy w jasnym polu za pomocą mikroskopu stereoskopowego (przy powiększeniu 1,5x).
      UWAGA: Jeśli mikroskop stereoskopowy jest niedostępny, można użyć zwykłego mikroskopu, a obrazy można rejestrować za pomocą aparatu w telefonie komórkowym (o powiększeniu 3,4x) za pomocą adaptera. Aby zapobiec błędom związanym ze światłem/jasnością/ekspozycją, ważne jest, aby wszystkie ustawienia aparatu w telefonie komórkowym pozostały spójne dla wszystkich zdjęć.
  5. Inspekcja danych
    1. Dane ilościowe: Oblicz zawartość glikogenu na podstawie barwienia jodem robaków.
      1. Zapisz obrazy z mikroskopu stereoskopowego zawierające co najmniej 10 robaków na grupę jako plik .jpeg do dalszego przetwarzania. W tym celu pobierz bezpłatne oprogramowanie ImageJ. Szczegółowe informacje znajdują się w pliku uzupełniającym 1, rysunku uzupełniającym 1, rysunku uzupełniającym 2.
      2. Otwórz obraz .jpeg za pomocą oprogramowania ImageJ (które można pobrać bezpłatnie ze strony https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Kliknij Linia segmentowa i obrysuj robaka (po jednym robaku na raz). Kliknij pozycję Analizuj, a następnie wybierz opcję Zmierz, aby uzyskać kwantyfikację plamy. Dane zostaną wyświetlone w tabeli jako średnia. Średnia oznacza dane obliczone na podstawie gęstości barwienia na obszar robaka.
    2. Dane jakościowe: Uzyskaj obrazy z mikroskopu stereoskopowego każdej grupy i wizualnie porównaj barwienie robaków. W razie potrzeby stwórz system punktacji, aby przeanalizować barwienie: 0 bezbarwny; 1 lekko poplamiony; 2 poplamione i 3 mocno poplamione. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ręcznie policz około 10 robaków na grupę (minimum) za pomocą licznika ręcznego.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat badania ogólnej zawartości glikogenu u C. elegans. Schemat doświadczenia przeprowadzonego w tym miejscu w celu przeprowadzenia testu zawartości glikogenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ocena przepuszczalności jelit

  1. Przygotowanie robaków
    1. Około 14 godzin po synchronizacji (krok 1.2.8) przenieść 500-1000 robaków (krok 1.3.1 i UWAGA) w pierwszym stadium larwalnym (L1) na każdą nową płytkę agarową NGM (60 mm x 15 mm) wcześniej przygotowaną i przechowywać je w temperaturze 20 °C do dnia badania. Ten harmonogram doprowadzi do powstania dwóch grup eksperymentalnych w następujący sposób (Rysunek 2):
      A- (młode): robaki będą rosły na płytkach agarowych NGM obsianych bakterią E. coli OP50 aż do stadium larwalnego 4 (L4);
      B- (stary): robaki będą rosły na płytkach agarowych NGM obsianych bakterią E. coli OP50 do7 dnia dorosłości.
      UWAGA: Robaki utrzymywane do7 dnia dorosłości muszą być codziennie myte buforem M9 i przenoszone na nowe płytki agarowe NGM (60 mm x 15 mm) z 200 μl bakterii E. coli OP50 uprzednio wysianych w celu zastąpienia pokarmu i usunięcia potomstwa. Młodsze robaki unoszą się podczas dekantacji i można je oddzielić przez usunięcie supernatantu. Odsetek robaków smerfnych wzrasta wraz z wiekiem. Jednak ocenę przepuszczalności jelit można przeprowadzić na każdym etapie i w każdym wieku, w zależności od celu badania.
  2. Uruchamianie testu
    1. W dniu testu zbierz robaki L4 (2 dni po kroku 2.1.1) i robaki dorosłe 7 dnia (teraz w 9 dniu) z buforem M9 (tabela uzupełniająca 1) i przenieś do znakowanych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Wirować przy 1400 x g przez 3 minuty, usunąć supernatant, dodać 1,0 ml M9 i delikatnie wymieszać. Powtórz ten proces 3 razy, aby usunąć bakterie. Po ostatnim praniu zmniejsz objętość do 500 μL.
    3. Za pomocą pipety automatycznej dodaj 10 μl osadu robaka do szkiełka mikroskopowego i policz liczbę robaków. Oblicz objętość do pipetowania, aby uzyskać 100 robaków/μl.
    4. Barwienie Smerfów: przygotować 25% roztwór soli disodowej erioglaucyny (Tabela uzupełniająca 1) przy użyciu wody destylowanej. W razie potrzeby użyj wiru dla lepszej rozpuszczalności.
    5. Do nowych, wcześniej zidentyfikowanych mikroprobówek, za pomocą pipety automatycznej, dodać objętość zawierającą 100 robaków, 100 μl 25% roztworu soli disodowej erioglucyny, 200 μl E. coli OP50 i uzupełnić buforem M9 do końcowej objętości 500 μL.
      UWAGA: Objętości sodu Erioglauciny, E. coli i liczba robaków są stałe. Objętość bufora M9 jest zmienna i może być wykorzystana do doprowadzenia końcowej objętości do 500 μl.
    6. Inkubować przez 3 godziny z mieszaniem w mieszalniku, chronić przed światłem, w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jeśli mikser nie jest dostępny, ostrożnie potrząsaj mikroprobówkami rękami co 15 minut.
    7. Po 3 godzinach odwirować mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml o sile 1400 x g przez 3 minuty. Usunąć 1,0 ml supernatantu i przemyć robaki 1,0 ml buforu M9.
    8. Powtarzać mycie, aż pozostały roztwór soli disodowej erioglaucyny zostanie usunięty z roztworu. Po ostatnim etapie płukania usunąć supernatant, z wyjątkiem pozostałości około 250 μl. Użyj go, aby ostrożnie zawiesić robaki i przetworzyć je do analizy mikroskopowej.
    9. Przenieść około 50 robaków z zawieszonym roztworem robaka na szkiełka mikroskopowe i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi. Inkubować szkiełka mikroskopowe w lodówce w temperaturze -20 °C przez 10 minut, aby sparaliżować robaki.
      UWAGA: Inną alternatywą dla sparaliżowania robaków jest dodanie 10 μl roztworu chlorowodorku lewamizolu (10 mM ; Tabela uzupełniająca 1) i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi.
    10. Obserwuj i policz całkowitą liczbę robaków i całkowicie zabarwionych robaków za pomocą jasnego pola w stereomikroskopie (przy 1,5x). Obrazy można uzyskać z aparatu w telefonie komórkowym (o powiększeniu 3,4x) sprzężonego z adapterem. Aby zapobiec błędom związanym ze światłem/jasnością/ekspozycją, ważne jest, aby wszystkie ustawienia aparatu w telefonie komórkowym pozostały spójne dla wszystkich zdjęć.
  3. Inspekcja danych
    1. Dane jakościowe: Uzyskaj obrazy z mikroskopu stereoskopowego każdej grupy (L4 i 7dzień dorosłości) i wizualnie porównaj barwienie robaków.
    2. Policz całkowitą liczbę robaków i liczbę robaków smerfnych (niebieskich robaków) za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    3. Wyraź wyniki jako procent robaków smerfnych, porównując młode robaki (L4, jako grupa kontrolna) i stare robaki (7 dzień dorosłości):
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      gdzie, A = całkowita liczba robaków
      B = liczba smerfnych robaków

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat testu ogólnej przepuszczalności jelit u C. elegans. (A) Preparat C. elegans. (B) Barwienie solą disodową erioglaucyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test zawartości glikogenu zapewnia solidną i szybką metodę do badania różnych warunków testowania, takich jak badania porównawcze różnych szczepów, które mogą wpływać na syntezę lub degradację glikogenu. W tym badaniu robaki L4 poddano trzem różnym warunkom testowym: grupom na czczo, karmieniu i wzbogaconym w glukozę. Test przeprowadzono trzykrotnie, przy czym każdy warunek powtórzono dwukrotnie w każdym teście; reprezentatywny obraz jest wyświetlany w Rysunek 3. Po każdym teście obserwowano za pomocą stereomikroskopu robaki barwione roztworem jodu Lugola i dokonywano jakościowego porównania między grupami pod względem barwienia robaków. Jeśli chodzi o obserwację wzrokową, robaki w grupie na czczo (głód) wykazywały mniej intensywne plamie w porównaniu z robakami karmionymi E. coli OP50 (regularnie), a także tymi karmionymi E. coli OP50 i D-glukozą (wysoki poziom glukozy). Dodatkowo robaki karmione E. coli OP50 i D-glukozą (wysoka glukoza) wykazywały najbardziej intensywne barwienie.

figure-results-1
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy z testu zawartości glikogenu. Poziom glikogenu w C. elegans oceniano za pomocą barwienia jodem. Obrazy mikroskopowe przedstawiają reprezentatywne robaki C. elegans poddane (A) głodzeniu, (B) regularnym lub (C) wysokim poziomom glukozy przez 48 godzin. Robaki barwiono zanurzając je w roztworze płynu Lugola z jodem/buforem M9 (1%) na 5 minut, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki przepuszczalności jelit pokazują różnicę w barwieniu młodych robaków (L4) z nienaruszonym jelitem i starych robaków (7 dzień dorosłości) z uszkodzonymi błonami jelitowymi z powodu starzenia się (Rysunek 4). Jelito C. elegans jest tkanką o kluczowym znaczeniu dla zdrowia, ponieważ odgrywa kluczową rolę w trawieniu i metabolizmie oraz służy jako centrum sygnalizacyjne dla reakcji na stres i regulacji starzenia21. U młodych robaków jelito C. elegans stanowi silną barierę, która zapobiega wyciekowi treści jelitowej. Jednak wraz z wiekiem robaki funkcja bariery jelitowej zmniejsza się i staje się bardziej wrażliwa na zakłócenia spowodowane postępującą degradacją komórek i mikrokosmków oraz akumulacją bakterii w jelicie starzejącym się21,22. Kiedy młode C. elegans spożywają barwnik Erioglaucine sól disodową, jelito nicienia jest barwione (Ryc. 4A). Z drugiej strony można zaobserwować, że starzejące się robaki wykazywały wynaczynienie barwnika, przenikając całe ciało robaka, co wskazuje na uszkodzenie błony jelitowej (Ryc. 4B).

figure-results-2
Rysunek 4: Reprezentatywny obraz C. elegans barwionego solą disodową erioglaucyny. Obraz mikroskopowy przedstawia C. elegans z nienaruszonym jelitem (stadium L4) i robaki z pękniętym jelitem (7 dzień dorosłości). Robaki barwiono przez zanurzenie w 25% roztworze soli disodowej eriogłaucyny na 3 godziny, zgodnie z krokiem 2.2.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Zrzut ekranu ImageJ do wyboru konturu C. elegans. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Zrzut ekranu ImageJ do obliczania średniej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przepisy na pożywki, i kultury. Skład różnych pożywek, i kultur używanych w obecnym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowy opis oprogramowania ImageJ do ilościowego określania zawartości glikogenu u robaków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, protokół ten zapewnia jakościową ocenę zawartości glikogenu w poszczególnych robakach C. elegans przy użyciu barwienia Lugola: prostego, solidnego i szybkiego testu. Barwienie Lugola jest bezznacznikowym i nieinwazyjnym podejściem, które ułatwia pozyskiwanie danych molekularnych w rozdzielczościach subkomórkowych, umożliwiając monitorowanie wahań zawartości glikogenu w obrębie pojedynczych robaków10. Co więcej, zaletą testu jest opłacalność ze względu na minimalne wymagania sprzętowe. Do uchwycenia obrazów potrzebny jest tylko mikroskop lub mikroskop stereoskopowy, który można łatwo uzyskać za pomocą aparatu w telefonie komórkowym, o ile te same ustawienia światła/jasności/ekspozycji dla wszystkich zdjęć. Ponadto pewne dostosowania proceduralne mogą zwiększyć skuteczność tego protokołu. Bardziej złożony sprzęt laboratoryjny, taki jak okap przepływowy i wirówka, można zastąpić lampami alkoholowymi i sedymentacją grawitacyjną. Te alternatywy sprawiają, że metoda jest jeszcze bardziej przyjazna dla budżetu i dostępna dla szerokiego grona badaczy. Oprócz badaczy, nauczyciele mogą również wykorzystać ten test do celów edukacyjnych w szkołach, aby zilustrować zmiany związane z magazynowaniem glikogenu i jego biosyntezą.

Chociaż konwencjonalne testy enzymatyczne mogą określić ilościowo poziom glikogenu, barwienie Lugola jest obiecujące jako czuła, dokładna, opłacalna i wysokoprzepustowa metoda oceny zapasów glikogenu w C. elegans. W naszym badaniu dane ujawniły zauważalne różnice w barwieniu między trzema warunkami, co sugeruje potencjalną korelację między warunkami karmienia a intensywnością barwienia. Innymi słowy, wskazuje na różnice w zawartości glikogenu między różnymi grupami żywieniowymi, ponieważ intensywność barwienia jest wprost proporcjonalna do zawartości glikogenu. Dzięki tym wstępnym obserwacjom i dowodom uczniowie mogą dociekać i badać, czy różne czynniki, takie jak różne pokarmy, napoje lub odczynniki chemiczne, mogą również wpływać na zawartość glikogenu w nicieniach.

Jedną z wad tego podejścia jest poleganie na procedurach manualnych i subiektywnej interpretacji. Subiektywny charakter oceny barwienia, w której wyniki są przypisywane na podstawie obserwacji wizualnej, może prowadzić do zmienności między różnymi analitykami, potencjalnie wprowadzając wahania w interpretacji wyników.

W niniejszym raporcie przedstawiono również ocenę integralności jelit C. elegans przy użyciu barwnika Erioglaucine disodowej soli. Możliwe jest oszacowanie utraty funkcji bariery jelitowej u C. elegans poprzez karmienie robaków niebieskim barwnikiem, który nie jest wchłaniany przez naskórek. Ten test umożliwia sprawdzenie, czy barwnik nie wycieka z jelita, test znany jako test smerfny, ponieważ zwierzęta zmieniają kolor na niebieski jak kreskówka Smerfy23. Metodologia ta została wcześniej zastosowana do Drosophila melanogaster i Danio rerio przy użyciu podobnej metody oceny jelitowej24,25. W przypadku C. elegans zastosowaliśmy tę samą zasadę techniki z solą disodową erioglaucyny, uważaną za prostą i powtarzalną technikę weryfikacji integralności jelit C. elegans19,26.

Protokół ten może być wykorzystany do oceny indukcji lub opóźnienia starzenia się nicieni, a także do weryfikacji potencjału toksycznego substancji w jelicie C. elegans w łatwy i szybki sposób, bez konieczności stosowania skomplikowanej aparatury, co sprawia, że metoda jest ekonomicznie opłacalna19,27. Oprócz wykorzystania w badaniach naukowych, nauczyciele mogą również stosować ten test do celów edukacyjnych w instytucjach edukacyjnych w celu zbadania zmian w przepuszczalności jelit C. elegans. Za pomocą prostego testu można zbadać hipotezy dotyczące starzenia się i wpływu odczynników chemicznych na barierę jelitową nicieni.

Test może być dostosowany do wykorzystania innych szczepów i stadiów larwalnych C. elegans zgodnie z celem badania, o ile zamienniki pełnią tę samą lub podobną funkcję w celu utrzymania odtwarzalności metody. Aby analiza zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby starzejące się robaki były barwione przez 3 godziny, jak wspomniano w protokole. Następnie mycie w celu usunięcia nadmiaru barwnika jest krytycznym krokiem w metodzie i należy je wykonać ostrożnie, aby robaki nie zostały usunięte wraz z supernatantem. W przypadku oceny substancji jednym z ograniczeń stwierdzonych w protokole jest trudność w znalezieniu łatwo dostępnej kontroli pozytywnej, która powoduje lizę błony jelitowej nicieni.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S.A dziękuje za dofinansowanie od Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brazylia), grant numer #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brazylia), numer grantu, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Kod Finansowy 001 dla N.S.J i A.C.S)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówki 1,5 ml Lokalni dostawcy-Inkubator
37 stopniKS 4000i 97014-816
Rurka stożkowa 50 mlLokalni dostawcy-6
cm płytki Petriego Lokalni dostawcy-Agar
bakteriologicznyDinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (typ dziki)Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)-
CaCL2Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.10035-04-8
CholesterolSigma-Aldrich Brasil Ltda57-88-5
D-(+)-Glukoza bezwodna Neon50-99-7
Destylowany H2OLokalni dostawcy-Erioglaucine
sól disodowaSigma-Aldrich Brasil Ltda3844-45-9
Escherichia coli OP50Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)-
Inkubator
Firma Panasonic Healthcare z Ameryki Północnej, MIR-254-PA.-
KH2PO4Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7778-77-0
Chlorowodorek lewamizoluRIPERCOL L 150F-Lugol
roztwórSigma-Aldrich Brasil LtdaL6146
MgSO4SynthS1063-01-AH
mikrowirówek5425R Eppendorf SE, Niemcy
Na2HPO4Dinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7558-79-4
NaClDinâ mika Quí mika Współczesnaâ nea Sp. z o.o.7647-14-5
NystatynaSigma-Aldrich Brasil LtdaN6261
Pepton bakteriologicznyi ecyrkulacyjny; xodo cientí fica91079-38-8
Mikroskop stereoskopowyLeica S8 Apo Mikroskop stereoskopowy (Sã o Paulo, Brazylia)
Siarczan streptomycynyEstreptomax-
Mylabor z kapturem przepływowymWirówka do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorp, H. H. ChatGPT is fun, but not an author. Science. 379 (6630), 313(2023).
  2. Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).
  3. Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi. Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).
  4. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a smurf? - Ageing and beyond... In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio Protoc. 8 (3), e2722(2018).
  5. Ellingwood, S. S., Cheng, A. Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases. J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).
  6. Cori, C. F., Cori, G. T. Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid. J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).
  7. Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase. J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).
  8. Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease. FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).
  9. Liu, Q., et al. Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans. Carbohydr Polym. 237, 116181(2020).
  10. Cherkas, A., et al. Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C. elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).
  11. Gusarov, I., et al. Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress. Nat Commun. 8, 15868(2017).
  12. Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).
  13. Frazier, H. N. 3rd, Roth, M. B. Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments. Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).
  14. da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats. Life Sci. 322, 121660(2023).
  15. Gusarov, I., Nudler, E. Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging. Bioessays. 40 (9), e1800033(2018).
  16. Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging. Nutrients. 14 (5), 949(2022).
  17. Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders. Int J Mol Sci. 23 (22), 14463(2022).
  18. Dambroise, E., et al. Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death. Sci Rep. 6, 23523(2016).
  19. Laranjeiro, R., et al. Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans.WormBook. , 1-11 (2006).
  21. McGhee, J. D. The C. elegans intestine. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).
  22. McGee, M. D., et al. Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C. elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).
  23. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).
  24. Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).
  25. Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster. Nutrients. 14 (14), 2875(2022).
  26. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).
  27. Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles. Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie Lugolembarwnik Erioglaucynaprzepuszczalno jelitowaobrazowanie stereomikroskopowepod o e wzrostowe dla nicienizsynchronizowane nicieniebariera jelitowa

Powiązane artykuły