Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.
Artykuł metodologiczny
Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interakcje białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w zjawiskach biologicznych, takich jak organizacja komórkowa, wewnątrzkomórkowa transdukcja sygnału i regulacja transkrypcji. W związku z tym zrozumienie IPP jest ważnym punktem wyjścia do dalszych badań nad funkcją białka docelowego. W tym badaniu proponujemy prostą metodę określenia wiązania dwóch białek docelowych poprzez wprowadzenie wektorów ekspresyjnych ssaków do komórek HEK-293 przy użyciu metody polietyleneniminy, lizę komórek w domowym buforze do lizy białek i ściąganie białek docelowych na żelu powinowactwa do znacznika epitopu. Ponadto PPI między różnymi białkami połączonymi ze znacznikiem epitopu można potwierdzić poprzez użycie przeciwciał powinowactwa przeciwko każdemu znacznikowi zamiast żelu powinowactwa znacznika epitopu. Protokół ten może być również wykorzystany do weryfikacji różnych IPP, w tym ekstraktów jądrowych, z innych linii komórkowych. Dlatego może być stosowana jako podstawowa metoda w różnych eksperymentach PPI. Białka ulegają degradacji w wyniku wydłużonego czasu i powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Dlatego liza komórek, immunoprecypitacja i immunoblotting powinny być wykonywane tak płynnie, jak to możliwe.
Wprowadzenie
Białka odgrywają główną rolę we wszystkich funkcjach komórkowych, w tym w przetwarzaniu informacji, metabolizmie, transporcie, podejmowaniu decyzji i organizacji strukturalnej. Białka pośredniczą w swoich funkcjach poprzez fizyczną interakcję z innymi cząsteczkami. Interakcje białko-białko (PPI) są ważne dla pośredniczenia w funkcjach komórkowych, takich jak pośredniczenie w transdukcji sygnału, wyczuwanie środowiska, przekształcanie energii w ruch fizyczny, regulacja aktywności enzymów metabolicznych i sygnałowych oraz utrzymywanie organizacji komórkowej1. W związku z tym PPI mogą być używane do wyjaśniania nieznanych funkcji2. Metody wykrywania IPP można podzielić na trzy typy: in vitro, in vivo i in silico. Do wykrywania PPI in vitro wykorzystano koimmunoprecypitację (co-IP), chromatografię powinowactwa, tandemowe oczyszczanie powinowactwa, matryce białkowe, wyświetlanie fagów, komplementację fragmentów białek, krystalografię rentgenowską i spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego < sup class="xref">3. Wśród tych metod co-IP jest szeroko stosowany ze względu na swoją prostotę.
Znacznik fuzji FLAG składa się z ośmiu aminokwasów (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), w tym miejsca rozszczepienia enterokinazy, i został specjalnie zaprojektowany do chromatografii immunoaffinity4. Białka znakowane DYKDDDDK są rozpoznawane i wychwytywane za pomocą przeciwciała anty-DYKDDDDK. W związku z tym są one skutecznie ściągane w dół za pomocą DYKDDDDK wiążącego koraliki agarozowe5, aby w prosty sposób potwierdzić ich wiązanie z określonymi białkami. Immunoprecypitację można przeprowadzić w różnych komórkach, a szeroki zakres IPP można potwierdzić za pomocą przeciwciał przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania. Immunoprecypitacja i elucja peptydów za pomocą kulek agarozowych anty-DYKDDDDK zostały wcześniej zgłoszone5.
Tutaj oferujemy prostą metodę immunoprecypitacji, w której plazmid kodujący białko oznaczone tagiem DYKDDDDK jest przejściowo wprowadzany do komórek HEK-293 w celu potwierdzenia związku dwóch interesujących białek. Niektóre przeciwciała DYKDDDDK mogą wiązać się zarówno z N-końcem, jak i C-końcem białek fuzyjnych, ale nie inne6. Dlatego, aby uniknąć nieporozumień, należy wybrać przeciwciało, które rozpoznaje znacznik połączony zarówno z N-końcem, jak i C-końcem. Podczas wstawiania znacznika epitopu może być możliwe uniknięcie zmian konformacyjnych w białku poprzez wstawienie od 3 do 12 par zasad między znacznikiem epitopu a białkiem docelowym. Jednak wstawiona sekwencja powinna być parą zasad w wielokrotnościach 3, aby uniknąć przesunięcia ramki.
Protokół
Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu.
1. Przygotowanie roztworów i
- Bufor do lizy białek: Przygotuj bufor do lizy białek zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7 (Tabela 1).
- Bufor do lizy białek + inhibitor proteazy (PI): Dodać inhibitor proteazy (patrz tabela materiałów) do wyżej przygotowanego buforu (krok 1.1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Bufor do próbki: Zmieszać 900 μl 4 x bufor do próbek Laemmli (patrz tabela materiałów) i 100 μl 2-merkaptoetanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z monolaurynianem polioksyetylenosorbitolu (20) (PBS-P): Zmieszać 1,998 l PBS i 2 ml monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20) (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- 1x Bufor Tris/Glycine/SDS: Wymieszaj 450 ml DDW i 50 ml 10x Tris/Glycine/SDS. Przygotować w temperaturze pokojowej w dniu użycia.
2. Transfekcja plazmidu
- Hodowla komórek HEK-293 w 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem do subkonfluencji (80% -95%) przy użyciu zmodyfikowanego podłoża orła Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (10 000 jednostek/ml penicyliny G i 10 000 μg/ml streptomycyny) (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj 1-10 μg plazmidu7 do transfekcji na talerz i przygotuj mieszankę transfekcyjną. Dodać 150 mM NaCl do końcowej objętości 250 μl na naczynie. Zwiruj i odkręć mieszaninę.
- Dodać 60 μl 1 mg/ml polietyleneniminy (PEI, patrz tabela materiałów) na talerz, a następnie 150 mM NaCl do końcowej objętości 250 μl roztworu PEI.
- Dodaj roztwór PEI do mieszanki transfekcyjnej, aby uzyskać mieszany roztwór. Natychmiast wiruj (z maksymalną prędkością przez 3-5 s, następnie wykonaj to samo) i wiruj w dół.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. W tym czasie zmień pożywkę komórek HEK-293.
- Rozsyp 500 μl / naczynie zmieszanego roztworu na naczynie z komórkami HEK-293 i inkubuj przez noc (13-14 godzin).
- Wykonaj wymianę medium następnego dnia.
3. Liza komórek i przygotowanie próbki
UWAGA: Aby uniknąć degradacji białka, kolejne kroki powinny być wykonywane bez konserwacji lub zamrażania i rozmrażania próbki tak bardzo, jak to możliwe.
- Około 48 godzin po transfekcji przemyć komórki trzykrotnie lodowatym PBS, dodać 500 μl/naczynie buforu do lizy białek + PI i zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i pipety w probówce z niską adsorpcją białka na lodzie.
- Wirować co 5 minut i inkubować próbki na lodzie przez 10 minut.
- Wirować przy 16 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść go do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej adsorpcji białka. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
- Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu do pomiaru stężenia białka zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
- Oddziel 200-1000 μg tej samej ilości białka w każdej próbce, a następnie dodaj bufor do lizy białek + PI, aby dostosować całkowitą objętość do 500-1000 μL.
UWAGA: Poniższe czynności są wykonywane na lodzie.
4. Przygotowanie gnojowicy
UWAGA: Przygotuj zawiesinę 1:1 żelu białkowego G i żelu powinowactwa do znaczników epitopów dzień przed lub w dniu immunoprecypitacji.
- Przygotowanie żelu białkowego G
- Za pomocą końcówki z odciętym końcem dobrze wymieszać, a następnie oddzielić żel białkowy G (patrz tabela materiałów) tak, aby przygotować 20 μl kulek na próbkę.
- Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C i umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Dodać 1 ml buforu do lizy białek + PI do żelu białkowego G przygotowanego w kroku 4.1.2 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
- Powtórz krok 4.1.3 trzy razy.
- Dodaj równą objętość buforu do lizy białek do żelu białkowego G, aby uzyskać zawiesinę żelu białkowego G w stosunku 1:1. Zawiesina żelu białkowego G może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez około 1 dzień.
- Przygotowanie żelu powinowactwa do znaczników epitopowych
- Za pomocą końcówki z odciętym końcem dobrze wymieszaj, a następnie oddziel żel powinowactwa znacznika epitopu (patrz Tabela materiałów) tak, aby przygotować 10-15 μl kulek na próbkę.
- Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Dodać 1 ml buforu do lizy białek + PI do żelu powinowactwa do znaczników epitopu przygotowanego w kroku 4.2.2 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Powtórz krok 4.2.3 dwukrotnie.
- Dodać 500 μl 0,1 M glicyny (pH 3,5) do żelu powinowactwa do znaczników epitopów przygotowanym w kroku 4.2.4 i wymieszać, stukając i odwracając. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia wolnych przeciwciał znacznika epitopu. W ciągu 20 minut po dodaniu glicyny, odwirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i wyrzucić supernatant.
- Dodać 500 μl buforu do lizy białek + PI do żelu powinowactwa do znaczników epitopów przygotowanym w kroku 4.2.5 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
- Powtórz krok 4.2.6 trzy razy.
- Dodaj równą objętość buforu do lizy białek do żelu powinowactwa do znaczników epitopów, aby przygotować zawiesinę żelu powinowactwa do znaczników epitopów w stosunku 1:1. Zawiesina żelu powinowactwa do znaczników epitopowych może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez około 1 dzień.
5. Wstępne oczyszczanie za pomocą żelu białkowego G i wychwytywanie kompleksów białkowych za pomocą żelu powinowactwa do znacznika epitopu
- Zmieszać zawiesinę białka G w stosunku 1:1 (przygotowaną w kroku 4) za pomocą pipety wyposażonej w odciętą końcówkę i dodawać jednorazowo 40 μl do próbki.
- Obracać próbkę przez 1 godzinę na rotatorze (patrz tabela materiałów) przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C).
- Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C i umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały.
- Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej adsorpcji białek.
- Oddzielić próbkę do wprowadzenia od próbki w kroku 5.4 i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
- Do próbki dodać 20-30 μl żelowej zawiesiny epitopu w proporcji 1:1.
- Obracać na rotatorze przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C) przez 2 godziny.
- Dodać bufor próbki do wsadu przygotowanego w kroku 5.5, aby rozcieńczyć go do 4x i podgrzewać w temperaturze 98 °C przez 10 minut. Wejście można zapisać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Ze względu na możliwość degradacji białka w wyniku zamrażania i rozmrażania, kolejne etapy należy wykonywać bez zachowania białka w jak największym stopniu.
6. Mycie i elucja wytrąconych białek
- Ustaw temperaturę bloku grzewczego na 98 °C.
- Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Dodaj 1 ml buforu do lizy białek + PI i wymieszaj, stukając i odwracając. Obracać na rotatorze przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C) przez 5 min. Odwirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
- Powtórz krok 6.3 5-10 razy.
- Dodać 10 μl buforu próbki do próbki przygotowanej w kroku 6.4. Gotować w temperaturze 98 °C przez 10 min.
- Wirować przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s.
- Umieść kolumnę w nowej probówce o niskiej adsorpcji białek i przenieś żel do kolumny za pomocą pipety z naciętą końcówką. Kolumna służy do uniknięcia zanieczyszczenia żelu.
- Wirować przy 9 730 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać przepływ. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Jeśli degradacja próbki jest problemem, następujące badanie immunoblottingu należy przeprowadzić bez zamrażania.
7. Immunoblotting
UWAGA: Procedury immunoblottingu są oparte na poprzednich raportach7,8.
- Załadować całe próbki do żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE, patrz tabela materiałów).
UWAGA: W razie potrzeby należy użyć żeli o dużej studzience, tak aby można było przenieść całą próbkę. Używano tu żeli ze studzienkami o pojemności 50 μl. - Umieść żele w komorze do elektroforezy i dodaj 1x bufor Tris/Glycine/SDS (patrz Tabela materiałów) do odpowiedniej objętości wokół żeli.
- Żele elektroforetyczne o napięciu 100 V i 400 mA.
- Przenieść na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF, patrz tabela materiałów).
- Zablokować błonę PVDF 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS-P na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj membranę trzykrotnie PBS-P na wytrząsarce na najwyższych obrotach przez 5 minut. Następnie wykonaj tę samą procedurę podczas mycia.
- Inkubować przez noc na wytrząsarce z pierwszorzędowym przeciwciałem (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
- Następnego dnia przemyć membranę trzykrotnie PBS-P.
- Inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Jeśli masa cząsteczkowa białka docelowego jest zbliżona do łańcucha ciężkiego IgG, który ma masę cząsteczkową około 50 kDa, można zastosować przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla łańcucha lekkiego, aby uniknąć nakładania się pasma docelowego na łańcuch ciężki IgG. W badaniu tym wykorzystano przeciwciała specyficzne dla łańcucha lekkiego7 lub Veriblot jako odczynnik do wykrywania IP (patrz Tabela materiałów). - Zidentyfikuj pasma białek z substratami luminescencyjnymi peroksydazy. Membranę można zapisać w PBS po dwukrotnym umyciu jej PBS-P.
- Stripować przez 10 minut roztworem do usuwania izolacji (patrz Tabela materiałów).
- Umyć trzykrotnie i zablokować 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS-P. Następny protokół jest taki sam, jak w kroku 7.6 i następnych.
Wyniki
Adipocyty termogeniczne, znane również jako adipocyty brązowe i beżowe, wykazują potencjalne działanie przeciwotyłościowe oraz przeciwdziałające nietolerancji glukozy. PRDM16 (zawierający domenę PR (homologiczną do PRD1-BF1-RIZ1)) jest kofaktorem transkrypcyjnym, który odgrywa istotną rolę w określaniu tożsamości adipocytów termogenicznych9,10.
EHMT1 (euchromatyczna N-metylotransferaza histonyzowej lizyny 1), znana również jako GLP, katalizuje przede wszystkim mono- i dimetylację lizyny 9 histonu H3 (H3K9) z wykorzystaniem kofaktora S-adenozylometioniny11. Wcześniejszy raport wskazał, że EHMT1 jest niezbędną metylotransferazą w kompleksie PRDM16, który kontroluje los termogenicznych komórek tłuszczowych poprzez metylację histonów12,13. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że poziomy ekspresji PRDM16 i EHMT1 są istotnie skorelowane z poziomami genów termogenicznych w ludzkiej okołnerkowej brunatnej tkance tłuszczowej (BAT), co sugeruje, że zarówno PRDM16, jak i EHMT1 odgrywają istotne role w rozwoju ludzkiej BAT8.
Aby zademonstrować skuteczność niniejszego protokołu jako metody potwierdzania oddziaływań białko-białko (PPI), dokonano transfekcji komórek HEK-293 białkami DYKDDDDK-PRDM16 oraz HA-EHMT1, a następnie przeprowadzono immunoprecypitację DYKDDDDK-PRDM16 zgodnie z powyższym protokołem. PRDM16 z etykietą DYKDDDDK oraz EHMT1 z etykietą HA wprowadzono do miejsc klonowania ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3.1 (patrz Tabela materiałów). Analiza immunoblotting potwierdziła oddziaływanie między DYKDDDDK-PRDM16 a HA-EHMT1 w grupach transfektowanych DYKDDDDK-PRDM16 i HA-EHMT1 (Rycina 2).
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie koimmunoprecypitacji. Tutaj przedstawiono schemat protokołu. Prawa strona ukazuje przebieg pracy w protokole, natomiast lewa strona zawiera graficzną reprezentację reakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: PRDM16 wiąże się z EHMT1. Komórki HEK-293 transfektowano wektorem (kontrola negatywna), DYKDDDDK-PRDM16 lub DYKDDDDK-PRDM16 i HA-EHMT1. Następnie przeprowadzono ko-immunoprecypitację z użyciem żelu powinowactwa do znacznika DYKDDDDK, a następnie analizę immunoblottingową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| bufor do lizy białek 250 ml (0.22 μm filtracja, przechowywać w 4 °C) | ||
| ml | Stężenie końcowe | |
| 1 M Tris pH 8,0 | 12.5 | 50 mM |
| 5 M NaCl | 7.5 | 150 mM |
| 0,5 M kwas etylendiaminotetraoctowy | 0.5 | 1 mM |
| Glicerol | 25 | 10% |
| Eter oktylofenylu polioksyetylenu(10) | 2.5 | 1% |
| podwójnie destylowana woda | 202 | |
| Suma | 250 | |
Tabela 1: Skład buforu do lizy białek.
Dyskusja
Ten protokół jest prawie taki sam jak poprzednio opisane protokoły 5,7,14,15. Ważnym punktem tego protokołu jest to, że nigdy nie zatrzymujemy eksperymentu od etapu lizy komórek do etapu immunoprecypitacji. Degradacja białek utrudnia wykrywanie PPI. Wydłużony przebieg czasowy i powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania powodują degradację białek. Elektroforeza w SDS-PAGE powinna być również wykonywana w tym samym dniu immunoprecypitacji, nie tylko w celu zminimalizowania degradacji białek, ale także w celu maksymalizacji wykrywania IPP.
W adipocytach termogenicznych interakcja między EHMT1 i PRDM16 została opisana w poprzednim badaniu13. Kompleks EHMT1 - PRDM16 reguluje los i termogenezę komórek adipocytów brunatnych13. EHMT1 sprawia, że PRDM16 stabilizuje się poprzez przerwanie interakcji PRDM16 - białka wiążącego białko amyloidowe (APPBP) 2,16. Ta stabilizacja PRDM16 jest regulowana przez cullin(CUL) 2-APPBP2 i EHMT116.
W tym badaniu wykorzystano komórki HEK-293, ponieważ komórki HEK-293 są szeroko stosowane w produkcji rekombinowanych białek17. Można wykorzystać inne linie komórkowe, które są łatwe do transfekcji plazmidami, takie jak komórki Cos-7 i komórki Hela. PEI został użyty do transfekcji, ponieważ PEI jest bardziej ekonomiczny i prostszy w porównaniu z konwencjonalną lipofekcją.
Wstępne oczyszczanie, rotacja w żelu powinowactwa do znaczników epitopowych i mycie są szczególnie ważnymi etapami tej metody. Wstępne oczyszczanie może usunąć białka, które wiążą się niespecyficznie z żelem. Ponadto czas rotacji z żelem powinowactwa do znacznika epitopu jest ważny, ponieważ zbyt długi czas może spowodować wykrycie białka niespecyficznego, a niewystarczający czas może utrudnić wykrycie białek docelowych.
Należy zwrócić uwagę na następujące punkty. Ogniwa HEK-293 łatwo się odłączają; Dlatego podczas przygotowywania próbek należy używać naczyń pokrytych kolagenem. Roztwór PEI jest cytotoksyczny; Dlatego pożywkę należy wymienić po transfekcji bez opuszczania komórek przez dłuższy czas. Jeśli IPP nie zostaną zaobserwowane, ilość transfekowanych plazmidów może być niewystarczająca i/lub ilość białka wprowadzonego do IP może być niska. Ponadto, jeśli liczba prań jest nadmierna, interakcje mogą zostać pominięte. Aby temu zaradzić, można rozważyć następujące działania: zwiększenie ilości plazmidu wprowadzanego do komórek HEK-293, zwiększenie ilości białka wykorzystywanego do IP oraz zmniejszenie liczby płukań. Ponadto, jeśli w końcowym płukaniu pozostanie zbyt dużo supernatantu, wyleje się on ze studzienek żelu dodecylosiarczanu sodu-poliakrylamidu. Jeśli zaobserwuje się niespecyficzne prążki, ilość plazmidu/białka użytego do IP może być zbyt wysoka lub liczba lub intensywność płukania może być niewystarczająca. Można im zaradzić, zmniejszając ilość plazmidu/białka używanego do IP, zwiększając liczbę prań lub zwiększając moc mycia poprzez zwiększenie stężenia soli w buforze myjącym.
Powszechnie stosowane detergenty, takie jak eter oktylofenylowy polioksyetylenowy (10), mogą zakłócać funkcjonalnie istotne IPP18. Łagodniejsze detergenty mogą zwiększać odzysk funkcjonalnie ważnych kompleksów, podczas gdy mogą powodować niedopuszczalny poziom niespecyficznych interakcji z powodu niepełnej rozpuszczalności. Bufor do lizy białek zastosowany w niniejszym badaniu zawiera 1% polioksyetyleno(10) eteru oktylofenylowego. Ten bufor lizuje białka cytoplazmatyczne z dużą ilością białek nadeksprymowanych przez transfekowane plazmidy. Gdy immunoprecypitacja jest przeprowadzana na próbkach przygotowanych przez oddzielenie jąder i cytoplazmy, tło jest zmniejszone w porównaniu z próbkami przygotowanymi w procesie lizy całych komórek i można zidentyfikować wyraźne pasma docelowe17. Jeśli immunoprecypitacja jest przeprowadzana z białkami w jądrze, białka jądrowe można ekstrahować za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji jądrowej lub niszcząc i usuwając cytoplazmę za pomocą buforu o niskiej zawartości soli zawierającego detergent, a następnie ekstrahując białka jądrowe za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli19. Czas rozwoju immunoblottingu powinien być dostosowany nie tylko w celu uniknięcia tła, ale także w celu wykrycia pewnych prążków.
Ta metoda miała kilka ograniczeń. Po pierwsze, użyliśmy wskaźnika PPI, który jest wysoce prawdopodobny do wykrycia. Po drugie, ponieważ ekspresja każdego genu zależy od kombinacji plazmidów, można uzyskać niewystarczającą ilość białka, a zatem interakcja może nie zostać wykryta.
Podsumowując, przy użyciu tej metody IPP można potwierdzić ekonomicznie i łatwo porównać ze spektrometrią mas. PPI między różnymi białkami połączonymi ze znacznikiem epitopu można również potwierdzić za pomocą przeciwciał powinowactwa przeciwko każdemu znacznikowi zamiast żelu powinowactwa znacznika epitopu. Podobne metody immunoprecypitacji można przeprowadzić w innych typach komórek, wprowadzając plazmid wyrażający dowolne białko połączone ze znacznikiem DYKDDDDK. Co więcej, zastosowanie endogennych przeciwciał zamiast żelu do powinowactwa do znaczników epitopowych umożliwia potwierdzenie endogennych IPP w różnych typach komórek.
Oświadczenia
Oświadczamy, że żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów w związku z niniejszym opracowaniem.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) oraz MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH8,0)Gen | nippon | 311-90075 | |
| 10% Prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 50 &mikro; L | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Skrobak do komórek M | Sumitomo Bakelit | MS-93170 | |
| Naczynie na kolagen I 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, suplement GlutaMAX | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glicerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) MAb królika #3724 | Sygnalizacja komórkowa | C29F4 | |
| Laemmli Bufor próbki | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell do mini żeli prefabrykowanych | Biorad | 1658004JA | |
| Przeciwciało monoklonalne ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszy | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | Ten artykuł | Nie dotyczy | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | Ten papier | Nie | |
| wektora pcDNA3.1 | Ten papier | N/A | |
| PEI MAX - Stopień transfekcji Liniowy Chlorowodorek polietyleniny | PSI | 24765 | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | Thermo scientific | 23227 | |
| Eter polioksyetylenowo-(10) oktylofenylowy | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polioksyetylen(20) Monolaurynian sorbitanu | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Białko G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Białko LoBind Rurki | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| odtłuszczone mleko | Morinaga | 0652842 | |
| Roztwór do usuwania izolacji | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Pakiet transferowy Trans-Blot Turbo Mini PVDF | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Baza Trizma | Sigma | T1503-1KG | |
| Testowana przez USDA płodowa surowica bydlęca (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-aktyna (13E5) Królik mAb #4970 | Sygnalizacja komórkowa | 4970S |
Bibliografia
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143(2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674(2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243(2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).
Przedruki i uprawnienia
