Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66085

⸱

5 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Internal Medicine, Graduate School of Biomedical & Health Sciences, Hiroshima University

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Streszczenie

Interakcje białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w zjawiskach biologicznych, takich jak organizacja komórkowa, wewnątrzkomórkowa transdukcja sygnału i regulacja transkrypcji. W związku z tym zrozumienie IPP jest ważnym punktem wyjścia do dalszych badań nad funkcją białka docelowego. W tym badaniu proponujemy prostą metodę określenia wiązania dwóch białek docelowych poprzez wprowadzenie wektorów ekspresyjnych ssaków do komórek HEK-293 przy użyciu metody polietyleneniminy, lizę komórek w domowym buforze do lizy białek i ściąganie białek docelowych na żelu powinowactwa do znacznika epitopu. Ponadto PPI między różnymi białkami połączonymi ze znacznikiem epitopu można potwierdzić poprzez użycie przeciwciał powinowactwa przeciwko każdemu znacznikowi zamiast żelu powinowactwa znacznika epitopu. Protokół ten może być również wykorzystany do weryfikacji różnych IPP, w tym ekstraktów jądrowych, z innych linii komórkowych. Dlatego może być stosowana jako podstawowa metoda w różnych eksperymentach PPI. Białka ulegają degradacji w wyniku wydłużonego czasu i powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Dlatego liza komórek, immunoprecypitacja i immunoblotting powinny być wykonywane tak płynnie, jak to możliwe.

Wprowadzenie

Białka odgrywają główną rolę we wszystkich funkcjach komórkowych, w tym w przetwarzaniu informacji, metabolizmie, transporcie, podejmowaniu decyzji i organizacji strukturalnej. Białka pośredniczą w swoich funkcjach poprzez fizyczną interakcję z innymi cząsteczkami. Interakcje białko-białko (PPI) są ważne dla pośredniczenia w funkcjach komórkowych, takich jak pośredniczenie w transdukcji sygnału, wyczuwanie środowiska, przekształcanie energii w ruch fizyczny, regulacja aktywności enzymów metabolicznych i sygnałowych oraz utrzymywanie organizacji komórkowej1. W związku z tym PPI mogą być używane do wyjaśniania nieznanych funkcji2. Metody wykrywania IPP można podzielić na trzy typy: in vitro, in vivo i in silico. Do wykrywania PPI in vitro wykorzystano koimmunoprecypitację (co-IP), chromatografię powinowactwa, tandemowe oczyszczanie powinowactwa, matryce białkowe, wyświetlanie fagów, komplementację fragmentów białek, krystalografię rentgenowską i spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego < sup class="xref">3. Wśród tych metod co-IP jest szeroko stosowany ze względu na swoją prostotę.

Znacznik fuzji FLAG składa się z ośmiu aminokwasów (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), w tym miejsca rozszczepienia enterokinazy, i został specjalnie zaprojektowany do chromatografii immunoaffinity4. Białka znakowane DYKDDDDK są rozpoznawane i wychwytywane za pomocą przeciwciała anty-DYKDDDDK. W związku z tym są one skutecznie ściągane w dół za pomocą DYKDDDDK wiążącego koraliki agarozowe5, aby w prosty sposób potwierdzić ich wiązanie z określonymi białkami. Immunoprecypitację można przeprowadzić w różnych komórkach, a szeroki zakres IPP można potwierdzić za pomocą przeciwciał przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania. Immunoprecypitacja i elucja peptydów za pomocą kulek agarozowych anty-DYKDDDDK zostały wcześniej zgłoszone5.

Tutaj oferujemy prostą metodę immunoprecypitacji, w której plazmid kodujący białko oznaczone tagiem DYKDDDDK jest przejściowo wprowadzany do komórek HEK-293 w celu potwierdzenia związku dwóch interesujących białek. Niektóre przeciwciała DYKDDDDK mogą wiązać się zarówno z N-końcem, jak i C-końcem białek fuzyjnych, ale nie inne6. Dlatego, aby uniknąć nieporozumień, należy wybrać przeciwciało, które rozpoznaje znacznik połączony zarówno z N-końcem, jak i C-końcem. Podczas wstawiania znacznika epitopu może być możliwe uniknięcie zmian konformacyjnych w białku poprzez wstawienie od 3 do 12 par zasad między znacznikiem epitopu a białkiem docelowym. Jednak wstawiona sekwencja powinna być parą zasad w wielokrotnościach 3, aby uniknąć przesunięcia ramki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu.

1. Przygotowanie roztworów i

  1. Bufor do lizy białek: Przygotuj bufor do lizy białek zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem7 (Tabela 1).
  2. Bufor do lizy białek + inhibitor proteazy (PI): Dodać inhibitor proteazy (patrz tabela materiałów) do wyżej przygotowanego buforu (krok 1.1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Bufor do próbki: Zmieszać 900 μl 4 x bufor do próbek Laemmli (patrz tabela materiałów) i 100 μl 2-merkaptoetanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z monolaurynianem polioksyetylenosorbitolu (20) (PBS-P): Zmieszać 1,998 l PBS i 2 ml monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20) (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. 1x Bufor Tris/Glycine/SDS: Wymieszaj 450 ml DDW i 50 ml 10x Tris/Glycine/SDS. Przygotować w temperaturze pokojowej w dniu użycia.

2. Transfekcja plazmidu

  1. Hodowla komórek HEK-293 w 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem do subkonfluencji (80% -95%) przy użyciu zmodyfikowanego podłoża orła Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny (10 000 jednostek/ml penicyliny G i 10 000 μg/ml streptomycyny) (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotuj 1-10 μg plazmidu7 do transfekcji na talerz i przygotuj mieszankę transfekcyjną. Dodać 150 mM NaCl do końcowej objętości 250 μl na naczynie. Zwiruj i odkręć mieszaninę.
  3. Dodać 60 μl 1 mg/ml polietyleneniminy (PEI, patrz tabela materiałów) na talerz, a następnie 150 mM NaCl do końcowej objętości 250 μl roztworu PEI.
  4. Dodaj roztwór PEI do mieszanki transfekcyjnej, aby uzyskać mieszany roztwór. Natychmiast wiruj (z maksymalną prędkością przez 3-5 s, następnie wykonaj to samo) i wiruj w dół.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut. W tym czasie zmień pożywkę komórek HEK-293.
  6. Rozsyp 500 μl / naczynie zmieszanego roztworu na naczynie z komórkami HEK-293 i inkubuj przez noc (13-14 godzin).
  7. Wykonaj wymianę medium następnego dnia.

3. Liza komórek i przygotowanie próbki

UWAGA: Aby uniknąć degradacji białka, kolejne kroki powinny być wykonywane bez konserwacji lub zamrażania i rozmrażania próbki tak bardzo, jak to możliwe.

  1. Około 48 godzin po transfekcji przemyć komórki trzykrotnie lodowatym PBS, dodać 500 μl/naczynie buforu do lizy białek + PI i zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i pipety w probówce z niską adsorpcją białka na lodzie.
  2. Wirować co 5 minut i inkubować próbki na lodzie przez 10 minut.
  3. Wirować przy 16 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść go do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej adsorpcji białka. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
  4. Oznaczyć stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu do pomiaru stężenia białka zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  5. Oddziel 200-1000 μg tej samej ilości białka w każdej próbce, a następnie dodaj bufor do lizy białek + PI, aby dostosować całkowitą objętość do 500-1000 μL.
    UWAGA: Poniższe czynności są wykonywane na lodzie.

4. Przygotowanie gnojowicy

UWAGA: Przygotuj zawiesinę 1:1 żelu białkowego G i żelu powinowactwa do znaczników epitopów dzień przed lub w dniu immunoprecypitacji.

  1. Przygotowanie żelu białkowego G
    1. Za pomocą końcówki z odciętym końcem dobrze wymieszać, a następnie oddzielić żel białkowy G (patrz tabela materiałów) tak, aby przygotować 20 μl kulek na próbkę.
    2. Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C i umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
    3. Dodać 1 ml buforu do lizy białek + PI do żelu białkowego G przygotowanego w kroku 4.1.2 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
    4. Powtórz krok 4.1.3 trzy razy.
    5. Dodaj równą objętość buforu do lizy białek do żelu białkowego G, aby uzyskać zawiesinę żelu białkowego G w stosunku 1:1. Zawiesina żelu białkowego G może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez około 1 dzień.
  2. Przygotowanie żelu powinowactwa do znaczników epitopowych
    1. Za pomocą końcówki z odciętym końcem dobrze wymieszaj, a następnie oddziel żel powinowactwa znacznika epitopu (patrz Tabela materiałów) tak, aby przygotować 10-15 μl kulek na próbkę.
    2. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
    3. Dodać 1 ml buforu do lizy białek + PI do żelu powinowactwa do znaczników epitopu przygotowanego w kroku 4.2.2 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
    4. Powtórz krok 4.2.3 dwukrotnie.
    5. Dodać 500 μl 0,1 M glicyny (pH 3,5) do żelu powinowactwa do znaczników epitopów przygotowanym w kroku 4.2.4 i wymieszać, stukając i odwracając. Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia wolnych przeciwciał znacznika epitopu. W ciągu 20 minut po dodaniu glicyny, odwirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i wyrzucić supernatant.
    6. Dodać 500 μl buforu do lizy białek + PI do żelu powinowactwa do znaczników epitopów przygotowanym w kroku 4.2.5 i wymieszać, stukając i odwracając. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
    7. Powtórz krok 4.2.6 trzy razy.
    8. Dodaj równą objętość buforu do lizy białek do żelu powinowactwa do znaczników epitopów, aby przygotować zawiesinę żelu powinowactwa do znaczników epitopów w stosunku 1:1. Zawiesina żelu powinowactwa do znaczników epitopowych może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez około 1 dzień.

5. Wstępne oczyszczanie za pomocą żelu białkowego G i wychwytywanie kompleksów białkowych za pomocą żelu powinowactwa do znacznika epitopu

  1. Zmieszać zawiesinę białka G w stosunku 1:1 (przygotowaną w kroku 4) za pomocą pipety wyposażonej w odciętą końcówkę i dodawać jednorazowo 40 μl do próbki.
  2. Obracać próbkę przez 1 godzinę na rotatorze (patrz tabela materiałów) przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C).
  3. Wirować przy 12 000 x g przez 20 s w temperaturze 4 °C i umieścić kulki na lodzie na 1 minutę, aby kulki się wyrównały.
  4. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej adsorpcji białek.
  5. Oddzielić próbkę do wprowadzenia od próbki w kroku 5.4 i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Do próbki dodać 20-30 μl żelowej zawiesiny epitopu w proporcji 1:1.
  7. Obracać na rotatorze przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C) przez 2 godziny.
  8. Dodać bufor próbki do wsadu przygotowanego w kroku 5.5, aby rozcieńczyć go do 4x i podgrzewać w temperaturze 98 °C przez 10 minut. Wejście można zapisać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Ze względu na możliwość degradacji białka w wyniku zamrażania i rozmrażania, kolejne etapy należy wykonywać bez zachowania białka w jak największym stopniu.

6. Mycie i elucja wytrąconych białek

  1. Ustaw temperaturę bloku grzewczego na 98 °C.
  2. Wirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C i odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  3. Dodaj 1 ml buforu do lizy białek + PI i wymieszaj, stukając i odwracając. Obracać na rotatorze przez około 30 s na cykl w komorze chłodniczej (4 °C) przez 5 min. Odwirować przy 5 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, odczekać 1 minutę na lodzie, aby kulki się wyrównały, i odrzucić supernatant.
  4. Powtórz krok 6.3 5-10 razy.
  5. Dodać 10 μl buforu próbki do próbki przygotowanej w kroku 6.4. Gotować w temperaturze 98 °C przez 10 min.
  6. Wirować przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s.
  7. Umieść kolumnę w nowej probówce o niskiej adsorpcji białek i przenieś żel do kolumny za pomocą pipety z naciętą końcówką. Kolumna służy do uniknięcia zanieczyszczenia żelu.
  8. Wirować przy 9 730 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać przepływ. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Jeśli degradacja próbki jest problemem, następujące badanie immunoblottingu należy przeprowadzić bez zamrażania.

7. Immunoblotting

UWAGA: Procedury immunoblottingu są oparte na poprzednich raportach7,8.

  1. Załadować całe próbki do żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE, patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W razie potrzeby należy użyć żeli o dużej studzience, tak aby można było przenieść całą próbkę. Używano tu żeli ze studzienkami o pojemności 50 μl.
  2. Umieść żele w komorze do elektroforezy i dodaj 1x bufor Tris/Glycine/SDS (patrz Tabela materiałów) do odpowiedniej objętości wokół żeli.
  3. Żele elektroforetyczne o napięciu 100 V i 400 mA.
  4. Przenieść na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF, patrz tabela materiałów).
  5. Zablokować błonę PVDF 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS-P na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj membranę trzykrotnie PBS-P na wytrząsarce na najwyższych obrotach przez 5 minut. Następnie wykonaj tę samą procedurę podczas mycia.
  7. Inkubować przez noc na wytrząsarce z pierwszorzędowym przeciwciałem (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
  8. Następnego dnia przemyć membranę trzykrotnie PBS-P.
  9. Inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli masa cząsteczkowa białka docelowego jest zbliżona do łańcucha ciężkiego IgG, który ma masę cząsteczkową około 50 kDa, można zastosować przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla łańcucha lekkiego, aby uniknąć nakładania się pasma docelowego na łańcuch ciężki IgG. W badaniu tym wykorzystano przeciwciała specyficzne dla łańcucha lekkiego7 lub Veriblot jako odczynnik do wykrywania IP (patrz Tabela materiałów).
  10. Zidentyfikuj pasma białek z substratami luminescencyjnymi peroksydazy. Membranę można zapisać w PBS po dwukrotnym umyciu jej PBS-P.
  11. Stripować przez 10 minut roztworem do usuwania izolacji (patrz Tabela materiałów).
  12. Umyć trzykrotnie i zablokować 5% odtłuszczonym mlekiem w PBS-P. Następny protokół jest taki sam, jak w kroku 7.6 i następnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Adipocyty termogeniczne, znane również jako adipocyty brązowe i beżowe, wykazują potencjalne działanie przeciwotyłościowe oraz przeciwdziałające nietolerancji glukozy. PRDM16 (zawierający domenę PR (homologiczną do PRD1-BF1-RIZ1)) jest kofaktorem transkrypcyjnym, który odgrywa istotną rolę w określaniu tożsamości adipocytów termogenicznych9,10.

EHMT1 (euchromatyczna N-metylotransferaza histonyzowej lizyny 1), znana również jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół jest prawie taki sam jak poprzednio opisane protokoły 5,7,14,15. Ważnym punktem tego protokołu jest to, że nigdy nie zatrzymujemy eksperymentu od etapu lizy komórek do etapu immunoprecypitacji. Degradacja białek utrudnia wykrywanie PPI. Wydłużony przebieg czasowy i powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania powodują degradację białek. Elektroforeza w SDS-PAGE powinna być równi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Oświadczamy, że żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów w związku z niniejszym opracowaniem.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) oraz MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA (pH8,0)Gennippon311-90075
10% Prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 50 &mikro; LBiorad4561034
10x Tris/Glycine/SDSBiorad1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab SheepGE HealthcareNA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab DonkeyGE HealthcareNA934-1ML
Skrobak do komórek MSumitomo BakelitMS-93170
Naczynie na kolagen I 100 mmIWAKI4020-010
cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche4693132001
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXInvitrogen10565042
D-PBS (-)FUJIFILM Wako045-29795
GlicerolFUJIFILM Wako072-00626
GlycineFUJIFILM Wako077-00735
HA-Tag (C29F4) MAb królika #3724Sygnalizacja komórkowaC29F4
Laemmli Bufor próbkiBio-Rad Laboratories161-0747
Kolumny chromatograficzne Micro Bio-SpinBiorad7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell do mini żeli prefabrykowanychBiorad1658004JA
Przeciwciało monoklonalne ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszySigmaF3165
NaClFUJIFILM Wako191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16Ten artykułNie dotyczy
pcDNA3.1-HA-EHMT1Ten papierNie
wektora pcDNA3.1Ten papierN/A
PEI MAX - Stopień transfekcji Liniowy Chlorowodorek polietyleninyPSI24765
Roztwór penicyliny i streptomycynyFUJIFILM Wako168-23191
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo scientific23227
Eter polioksyetylenowo-(10) oktylofenylowyFUJIFILM Wako168-11805
Polioksyetylen(20) Monolaurynian sorbitanuFUJIFILM Wako167-11515
Białko G Sepharose 4 Fast Flow Lab PacksCytiva17061801
Białko LoBind Rurkieppendorf30108442
ROTATOR RT-5TAITECRT-5
odtłuszczone mlekoMorinaga0652842 
Roztwór do usuwania izolacjiFUJIFILM Wako193-16375
Pakiet transferowy Trans-Blot Turbo Mini PVDFBiorad1704156B03
Trans-Blot Turbo SystemBioradN/A
Baza TrizmaSigmaT1503-1KG
Testowana przez USDA płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30910.03
VeriblotAbcamab131366
β-aktyna (13E5) Królik mAb #4970Sygnalizacja komórkowa4970S
dotyczy

Bibliografia

  1. Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
  2. Yanagida, M. Functional proteomics; current achievements. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).
  3. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).
  4. Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  5. Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
  6. Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
  7. Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143(2023).
  8. Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).
  9. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  10. Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
  11. Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
  12. Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674(2023).
  13. Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
  14. Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).
  15. Cristea, I. M., Chait, B. T. Affinity purification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  16. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  17. Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243(2009).
  18. Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
  19. Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Test immunoprecypitacjikomórki HEK 293bufor do lizy białekżel z białkiem Gssacze wektory ekspresyjnewestern blottingprzeciwciało powinowactwaSDS-PAGE
Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.